JPS6225994A - Hlaタイプ分け用モノクロ−ナル抗体 - Google Patents
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
- C07K16/2833—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against MHC-molecules, e.g. HLA-molecules
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔発明の分野〕
ヒトの主要組織適合遺伝子複合体(MMC)はヒト白血
球抗原(HLA)と称され、そして第6染色体の短腕上
に連鎖する遺伝子座によシコードされている。クラスI
−HLA抗原はHE、A−A、B及びC遺伝子座によっ
てコードされ、他方クラス■抗原はHLA−DR,DP
及びDQC遺伝子座よシコードされる。
球抗原(HLA)と称され、そして第6染色体の短腕上
に連鎖する遺伝子座によシコードされている。クラスI
−HLA抗原はHE、A−A、B及びC遺伝子座によっ
てコードされ、他方クラス■抗原はHLA−DR,DP
及びDQC遺伝子座よシコードされる。
HLA抗原は高度に多型性(polymorphic
)である。すなわち、各遺伝子座に多数の対立遺伝子が
存在する。この高度な多型性のために、従来、ある個体
のr HLAタイプ」の決定には、抗体の大きなノぐネ
ルを用いてその個体の細胞を試験して各遺伝子座に2つ
の対立遺伝子のいずれが存在するかを同定する必要があ
った。そして、個体のHLAタイプは各遺伝子座に帰属
する対立遺伝子の全体である。
)である。すなわち、各遺伝子座に多数の対立遺伝子が
存在する。この高度な多型性のために、従来、ある個体
のr HLAタイプ」の決定には、抗体の大きなノぐネ
ルを用いてその個体の細胞を試験して各遺伝子座に2つ
の対立遺伝子のいずれが存在するかを同定する必要があ
った。そして、個体のHLAタイプは各遺伝子座に帰属
する対立遺伝子の全体である。
HLA抗原は個体間で移植される細胞又は組織の受容又
は拒絶に大きな役割を演することが知られWlley、
ニューヨーク、1982)。移植された細胞又は組織の
受容の可能性は、受容者と提供者が’HLA対立遺伝子
を共有する場合に増加する。異る組織の移植は異る厳格
さの一致を必要とする。
は拒絶に大きな役割を演することが知られWlley、
ニューヨーク、1982)。移植された細胞又は組織の
受容の可能性は、受容者と提供者が’HLA対立遺伝子
を共有する場合に増加する。異る組織の移植は異る厳格
さの一致を必要とする。
例えば、血小板の輸注に必要とされる厳格さは骨髄移植
の場合のそれよシも低い。
の場合のそれよシも低い。
HLA抗原はまた、罹疫性に役割を演することが知られ
ている。特定の対立遺伝子の存在が幾つかの疾患に対す
る素因をもたらす。例えば、B27対立遺伝子は強直背
椎炎と強い関連性を有するのでこの疾患の鑑別診断にお
いて有用である。
ている。特定の対立遺伝子の存在が幾つかの疾患に対す
る素因をもたらす。例えば、B27対立遺伝子は強直背
椎炎と強い関連性を有するのでこの疾患の鑑別診断にお
いて有用である。
HLA抗原の高度な多型性のため、それらはまた父系試
験のために特に有用である。
験のために特に有用である。
HLA多型性はすでに、経産婦からの血清を用いて、補
体依存細胞変性検定(complement −dep
andent cytotoxlclty assay
)によシ定義されている。これらの血清は多くの限界を
有する。
体依存細胞変性検定(complement −dep
andent cytotoxlclty assay
)によシ定義されている。これらの血清は多くの限界を
有する。
これらはしばしば弱く且つ複数特異的であシ、そしてま
れな多型性の幾つかに向けられる血清を見出すととは困
難である。従って、有用な1種類又は少数種類の血清を
見出すために多数の血清をスクリーニングすることが必
要である。さらに、入手できるのが比較的少容量である
ため、これらの血清を次々と新しい血清で置き換える必
要があシ、そしてこの新しい血清は先行する血清に対し
て標準化されそしてチェックされなければならない。
れな多型性の幾つかに向けられる血清を見出すととは困
難である。従って、有用な1種類又は少数種類の血清を
見出すために多数の血清をスクリーニングすることが必
要である。さらに、入手できるのが比較的少容量である
ため、これらの血清を次々と新しい血清で置き換える必
要があシ、そしてこの新しい血清は先行する血清に対し
て標準化されそしてチェックされなければならない。
アロ抗血清を製造する目的で志願者を故意に免疫感作す
ることが有用であることが証明されているが、しかしな
がら明らかな実際的及び倫理的限界が存在する。これら
の問題点の観点から、HLA多型性を認識する異種抗血
清を製造することが試みられている。しかしながら、こ
のような異種抗血清は種特異的決定基に対する抗体を支
配的に含有することが見出されている。従って、冬型性
決定基に対する抗体を検出するために広範な吸収が要求
されるC 5taines等、 Ti5sue Ant
lgens(1973) 3 : 1 ; Goodf
ellow$ 、前掲(1976)7:105)。冬型
性を認識する抗血清を生じさせることにおける幾つかの
成功が、精製された材料を用いて免疫感作し、且つ進化
の上で密接に関連する種を免疫感作するという組み合わ
せた方策によシ達成されている(Barn+5tabl
e等、 Ce1l (1979)14: 9:5and
erson等。
ることが有用であることが証明されているが、しかしな
がら明らかな実際的及び倫理的限界が存在する。これら
の問題点の観点から、HLA多型性を認識する異種抗血
清を製造することが試みられている。しかしながら、こ
のような異種抗血清は種特異的決定基に対する抗体を支
配的に含有することが見出されている。従って、冬型性
決定基に対する抗体を検出するために広範な吸収が要求
されるC 5taines等、 Ti5sue Ant
lgens(1973) 3 : 1 ; Goodf
ellow$ 、前掲(1976)7:105)。冬型
性を認識する抗血清を生じさせることにおける幾つかの
成功が、精製された材料を用いて免疫感作し、且つ進化
の上で密接に関連する種を免疫感作するという組み合わ
せた方策によシ達成されている(Barn+5tabl
e等、 Ce1l (1979)14: 9:5and
erson等。
Transplantation (1973) 16
: 304 〕oしかしながら、これらの抗血清の非
多型性活性を除去するために広範な吸収がなお必要とさ
れる。
: 304 〕oしかしながら、これらの抗血清の非
多型性活性を除去するために広範な吸収がなお必要とさ
れる。
Koh 1 e r及びMiligtetn 、 Na
ture (1975)256:495のハイブリドー
マ技法の出現によシ、強力で且つ特異的な抗−HLA試
薬を製造し、そしてこれによって上に検討した問題点を
解決することが比較的容易であると予想された。しかし
ながら、今まで製造されたモノクローナル抗−HLA抗
体のほとんどは半型性(monomorphlc )の
又は広く交差反応する決定基を認識しておシ、そしてこ
のために組織のタイプ分げにおける用途が限定されてい
た。事実、有意な数のHLAがアロ抗原過程に特有のエ
ピトープをコードしているか否か、及びそのような個別
のエピドーグ部位が存在するとしてこれらの工ぎトープ
に反応する適当なIr遺伝子しA’ −) IJ−を有
する実験動物が入手可能か否かは実質的に定かではなか
った。さらに、有用な特異性基を検出するモノクローナ
ル抗体が生じ得るか否かも不明である。
ture (1975)256:495のハイブリドー
マ技法の出現によシ、強力で且つ特異的な抗−HLA試
薬を製造し、そしてこれによって上に検討した問題点を
解決することが比較的容易であると予想された。しかし
ながら、今まで製造されたモノクローナル抗−HLA抗
体のほとんどは半型性(monomorphlc )の
又は広く交差反応する決定基を認識しておシ、そしてこ
のために組織のタイプ分げにおける用途が限定されてい
た。事実、有意な数のHLAがアロ抗原過程に特有のエ
ピトープをコードしているか否か、及びそのような個別
のエピドーグ部位が存在するとしてこれらの工ぎトープ
に反応する適当なIr遺伝子しA’ −) IJ−を有
する実験動物が入手可能か否かは実質的に定かではなか
った。さらに、有用な特異性基を検出するモノクローナ
ル抗体が生じ得るか否かも不明である。
Brodsky等、 Immunological R
eview(1979)47:4はその時代におけるこ
の分野の卓越した総説を提供している。Grumet等
。
eview(1979)47:4はその時代におけるこ
の分野の卓越した総説を提供している。Grumet等
。
HLA−B27を2つのサブグルー7’に分けるモノク
ローナル抗体を記載している。Mu 11 e r等。
ローナル抗体を記載している。Mu 11 e r等。
Human Immunology(1983) 6
: 189は、HLAアロ特異性A2及びA28 にょ
)共有される抗原決定基に対するIgMモノクローナル
抗体を記載している。Mu 11 @r等、 Huma
n Immunology(1983)7:229は、
HE、A−B13分子のプライベート−アロ抗原決定基
に対して特異的なモノクローナル抗体を記載している。
: 189は、HLAアロ特異性A2及びA28 にょ
)共有される抗原決定基に対するIgMモノクローナル
抗体を記載している。Mu 11 @r等、 Huma
n Immunology(1983)7:229は、
HE、A−B13分子のプライベート−アロ抗原決定基
に対して特異的なモノクローナル抗体を記載している。
Antonelli等、 Hurnan Immuno
logy (1984) 11 : 11は、ヒトーア
ロ抗1HLA−B8を認識するモノクローナル抗体P8
.1を記載している。そこに記載される抗体P8.1
、B5.1 、B5.3及びB5.4はThe N1n
th International Hlstoeom
patl −bility Workshop and
Conferenee 、ミュンヘン、西独、198
4年5月6〜11日において使用され、そして” Hl
stocompatlbillty T@sting1
984 ’ 、 Albert 、 Bauer及びM
ayr 編。
logy (1984) 11 : 11は、ヒトーア
ロ抗1HLA−B8を認識するモノクローナル抗体P8
.1を記載している。そこに記載される抗体P8.1
、B5.1 、B5.3及びB5.4はThe N1n
th International Hlstoeom
patl −bility Workshop and
Conferenee 、ミュンヘン、西独、198
4年5月6〜11日において使用され、そして” Hl
stocompatlbillty T@sting1
984 ’ 、 Albert 、 Bauer及びM
ayr 編。
Springer −Verlag 、 ベルリン、
1984年に公表された。さらにEPO0068790
。
1984年に公表された。さらにEPO0068790
。
0073953.0103368及び0131878゜
並びにPOT/US81101684を参照のこと。
並びにPOT/US81101684を参照のこと。
ヒ) IJンパ系細胞の組織適合性タイプ分けを可能に
する方法及び組成物が提供される。種々のHLAアロ抗
原に対して特異的なモノクローナル抗体を分泌するバイ
ブリドセルラインが製造される。
する方法及び組成物が提供される。種々のHLAアロ抗
原に対して特異的なモノクローナル抗体を分泌するバイ
ブリドセルラインが製造される。
これらのモノクローナル抗体のノfネルが診断及び治療
に使用される。バイブリドセルラインが種々のHLAア
ロ特異性の抗体をコードするDNA源として機能するこ
とができ、このDNAを組換DNA(rDNA)技法を
用いて操作して他の細胞性宿主が特定の抗体を生産する
ことができるようにすることができる。
以下余白〔具体的な記載〕 この発明に従えば、ヒトの細胞、特にリンパ系細胞の組
織適合性のタイプ分けを可能にする新規なセルライン及
び組成物が提供される。このセルラインはネズミの染色
体を有し、この染色体においてはジャームラインDNA
がHLA抗A抗原上ビ発明のセルラインによって生産さ
れるこれらのモノクローナル抗体のパネルは診断及び治
療の両者のための種々の方法において使用することがで
きる0 この発明のモノクローナル抗体は、ヒ)HLAアロ抗原
に対して特異的な抗体の発現のための核酸の能力を不滅
化することによって製造される。
に使用される。バイブリドセルラインが種々のHLAア
ロ特異性の抗体をコードするDNA源として機能するこ
とができ、このDNAを組換DNA(rDNA)技法を
用いて操作して他の細胞性宿主が特定の抗体を生産する
ことができるようにすることができる。
以下余白〔具体的な記載〕 この発明に従えば、ヒトの細胞、特にリンパ系細胞の組
織適合性のタイプ分けを可能にする新規なセルライン及
び組成物が提供される。このセルラインはネズミの染色
体を有し、この染色体においてはジャームラインDNA
がHLA抗A抗原上ビ発明のセルラインによって生産さ
れるこれらのモノクローナル抗体のパネルは診断及び治
療の両者のための種々の方法において使用することがで
きる0 この発明のモノクローナル抗体は、ヒ)HLAアロ抗原
に対して特異的な抗体の発現のための核酸の能力を不滅
化することによって製造される。
不滅化は抗体をコードするDNAを培養において増殖す
ることができる宿主に導入することにより、又は抗体を
生産することができる細胞の形質転換によシ達成するこ
とができる。不滅化されたセルラインは、発癌によシ、
トランスフェクションによシ、又は変異等によシ形質転
換された哺乳類動物セルラインであることができる。こ
のような細胞系には骨髄腫系、リン、pg系等、すなわ
ち抗体のインビトロ(組織培養による)発現及び分泌を
支持することができるセルラインが含まれる。抗体は、
リンパ球の形質転換によシ、特に牌細胞のウィルスによ
る形質転換によシ、又はリンパ球と新生物細胞、例えば
骨髄腫細胞との融合によるバイブリドセルラインの形成
によシ、生産される哺乳類の天然免疫グロブリンである
ことができる。
ることができる宿主に導入することにより、又は抗体を
生産することができる細胞の形質転換によシ達成するこ
とができる。不滅化されたセルラインは、発癌によシ、
トランスフェクションによシ、又は変異等によシ形質転
換された哺乳類動物セルラインであることができる。こ
のような細胞系には骨髄腫系、リン、pg系等、すなわ
ち抗体のインビトロ(組織培養による)発現及び分泌を
支持することができるセルラインが含まれる。抗体は、
リンパ球の形質転換によシ、特に牌細胞のウィルスによ
る形質転換によシ、又はリンパ球と新生物細胞、例えば
骨髄腫細胞との融合によるバイブリドセルラインの形成
によシ、生産される哺乳類の天然免疫グロブリンである
ことができる。
これとは異り、抗体は、組換DNA技法によシ生産され
る免疫グロブリンであってもよく、この場合例えばHL
A−特異的モノクローナル抗体のヘビー鎖及びライト鎖
をコードするゲノムDNA又はcDNAがこれらの鎖の
発現のための発現ベクターに挿入される。形質転換又は
融合は常法に従って行うことができ、融合法は多数の米
国特許、例えばA4..172,124.A4,350
,683#黒4.363,799 、A4,381,2
92.及び4.423,147に記載されている。さら
にKennettプレナムプレス、1980年を参照の
こと。形質転換法は例えば米国特許44,464,46
5に記載されている。バイブリドセルラインはクローン
化し、そして種々のHLAアロ抗原の各々に対して特異
的な抗体を検出するための常法に従ってスクリーニング
することができる。通常、各ハイブリドーマセルライン
は限界稀釈法による少なくとも3サイクルのクローニン
グによシ樹立される。目的とする抗体を生産する細胞は
常用の検定(例えば細胞変性検定)によシまず同定され
、そして次に拡張され、そして多数の供血者(250名
以上)を用いて特異性及び感受性についてスクリーニン
グされる。適切なハイプリドーマセルラインが培養にお
いて拡張され、そして腹水を調製するために適尚な宿主
の腹腔に注射される。
る免疫グロブリンであってもよく、この場合例えばHL
A−特異的モノクローナル抗体のヘビー鎖及びライト鎖
をコードするゲノムDNA又はcDNAがこれらの鎖の
発現のための発現ベクターに挿入される。形質転換又は
融合は常法に従って行うことができ、融合法は多数の米
国特許、例えばA4..172,124.A4,350
,683#黒4.363,799 、A4,381,2
92.及び4.423,147に記載されている。さら
にKennettプレナムプレス、1980年を参照の
こと。形質転換法は例えば米国特許44,464,46
5に記載されている。バイブリドセルラインはクローン
化し、そして種々のHLAアロ抗原の各々に対して特異
的な抗体を検出するための常法に従ってスクリーニング
することができる。通常、各ハイブリドーマセルライン
は限界稀釈法による少なくとも3サイクルのクローニン
グによシ樹立される。目的とする抗体を生産する細胞は
常用の検定(例えば細胞変性検定)によシまず同定され
、そして次に拡張され、そして多数の供血者(250名
以上)を用いて特異性及び感受性についてスクリーニン
グされる。適切なハイプリドーマセルラインが培養にお
いて拡張され、そして腹水を調製するために適尚な宿主
の腹腔に注射される。
1又は複数のHLA多型性決定基に対して特異的な抗体
を手にすることにより、競争検定においてその部位に対
して特異的であることが知られている目的モノクローナ
ル抗体との競争によシ候補ハイブリドーマからの上清を
スクリーニングすることができる。従って、特定の多型
性に対して特異的な抗体の入手可能性に基いて、種々の
入手源からバイブリドセルラインを容易に製造すること
ができる。別の方法として、目的の多型性に対して特異
的な抗体を生産するバイブリドセルラインが一人手可能
であれば、これらのバイブリドセルラインを他の新生物
性B細胞と融合せしめることができ、との場合このよう
な他のB細胞はモノクローナル抗体をコードするゲノム
DNAの受容体として機能する。害菌動物、特にネズミ
の新生物B細胞が好ましいが、他の哺乳類動物種、例え
ばウサギ、ウシ、ヒツジ、ウマ、ブタ、鳥類等も使用す
ることができ、これらの動物及び鳥類は融合のためのリ
ンパ球、特に牌細胞を提供することができ、そして種々
のヒ)HLA多型性を抗原性として認識するであろう。
を手にすることにより、競争検定においてその部位に対
して特異的であることが知られている目的モノクローナ
ル抗体との競争によシ候補ハイブリドーマからの上清を
スクリーニングすることができる。従って、特定の多型
性に対して特異的な抗体の入手可能性に基いて、種々の
入手源からバイブリドセルラインを容易に製造すること
ができる。別の方法として、目的の多型性に対して特異
的な抗体を生産するバイブリドセルラインが一人手可能
であれば、これらのバイブリドセルラインを他の新生物
性B細胞と融合せしめることができ、との場合このよう
な他のB細胞はモノクローナル抗体をコードするゲノム
DNAの受容体として機能する。害菌動物、特にネズミ
の新生物B細胞が好ましいが、他の哺乳類動物種、例え
ばウサギ、ウシ、ヒツジ、ウマ、ブタ、鳥類等も使用す
ることができ、これらの動物及び鳥類は融合のためのリ
ンパ球、特に牌細胞を提供することができ、そして種々
のヒ)HLA多型性を抗原性として認識するであろう。
モノクローナル抗体(MAbs)は任意のクラス又はサ
ブクラス、例えばIgM 、 IgD 。
ブクラス、例えばIgM 、 IgD 。
IgG1 、1gG2 、 IgG3もしくはI gG
4、又はIgE。
4、又はIgE。
あるいはその宿主同等物であることができる。
HLAOタイプ分けのために選択されるモノクローナル
抗体は、それらがいかにして使用されるかに依存して多
数の注目の性質を有するととが−できる。この注目の性
質には、106以上、通常108、好ましくは10
M の親和性定数(Ka)が含まれる。モノクローナ
ル抗体は広範囲の稀釈(5倍以上、好ましくは10倍以
上)にわたって同一の特異性を有すべきであシ、そして
この範囲内での濃度の関数として交差反応性を示すべき
ではない。
抗体は、それらがいかにして使用されるかに依存して多
数の注目の性質を有するととが−できる。この注目の性
質には、106以上、通常108、好ましくは10
M の親和性定数(Ka)が含まれる。モノクローナ
ル抗体は広範囲の稀釈(5倍以上、好ましくは10倍以
上)にわたって同一の特異性を有すべきであシ、そして
この範囲内での濃度の関数として交差反応性を示すべき
ではない。
しかしながら、これらは、この範囲外での濃度において
異る有用な特異性を有することができる。
異る有用な特異性を有することができる。
幾つかの目的のためには補体固定の性質が興味深く、補
体介在細胞溶解に基礎を置く検定での使用のために特に
そうである。モノクローナル抗体は長期間の貯蔵に対し
て安定であるべきである。
体介在細胞溶解に基礎を置く検定での使用のために特に
そうである。モノクローナル抗体は長期間の貯蔵に対し
て安定であるべきである。
この発明のために、種々のMAbs(モノクローナル抗
体)の特異性の程度を次のように表現する。
体)の特異性の程度を次のように表現する。
”プライベート111つのアロ抗原上の1つのユニーク
決定基への結合を意味し;”オリゴタイf″は2〜5の
異るアロ抗原上に存在する1つの決定基に結合すること
を意味し、“スーパータイプ”は5よシ多くの異るアロ
抗原に結合することを意味し:そして“クレームワーク
”は特定の種の実質上すべてのアロ抗原上に存在する1
つの決定基に結合することを意味する。HLAのタイプ
分けを行う目的(例えば移植、父系試験等)に依存して
、モノクローナル抗体の異るパネルを使用することがで
きる。
決定基への結合を意味し;”オリゴタイf″は2〜5の
異るアロ抗原上に存在する1つの決定基に結合すること
を意味し、“スーパータイプ”は5よシ多くの異るアロ
抗原に結合することを意味し:そして“クレームワーク
”は特定の種の実質上すべてのアロ抗原上に存在する1
つの決定基に結合することを意味する。HLAのタイプ
分けを行う目的(例えば移植、父系試験等)に依存して
、モノクローナル抗体の異るパネルを使用することがで
きる。
同じ遺伝子座の複数の対立遺伝子産物と反応するオリゴ
タイプ又はスーパータイプモノクローナル抗体が特に興
味深い。2〜4種類のこれらの抗体のパネルがこの遺伝
子座を完全に定義することができる。この厳格性の低い
定義が、血小板輸注のごとき幾つかの移植状況において
提供者と受容者を適合させるために十分である。
タイプ又はスーパータイプモノクローナル抗体が特に興
味深い。2〜4種類のこれらの抗体のパネルがこの遺伝
子座を完全に定義することができる。この厳格性の低い
定義が、血小板輸注のごとき幾つかの移植状況において
提供者と受容者を適合させるために十分である。
次の結合特異性を有するモノクローナル抗体を生産する
ハイブリドーマセルラインが興味深い。
ハイブリドーマセルラインが興味深い。
プライベー)−AI、2,3,24:Bw6t8゜13
.44;DRI、3,4,5,7.WS2゜w53;D
Qwl、w3.及びw3.1;オリゴタイプ−(A2.
W69)、(A2,28)p(A23,24.25(3
2))、(A25,32)。
.44;DRI、3,4,5,7.WS2゜w53;D
Qwl、w3.及びw3.1;オリゴタイプ−(A2.
W69)、(A2,28)p(A23,24.25(3
2))、(A25,32)。
(B14,18,39,59)、(B17,27)。
(DRI、2.7)、(DR5,8)、(DR4,5゜
13)、(DR3,5,6,7)、(DQWl、DQブ
ランク)、及び(DQW2.W3.ブランク);スーパ
ータイプ−(AI、11,23,24,25゜26.3
6,68.2)、(A2,3,28,29,30゜31
.33,68.69)、(B7,27,42,54゜5
5.56,57,58,63(14,46))、及び(
B8,18,39,41,45,61)。
13)、(DR3,5,6,7)、(DQWl、DQブ
ランク)、及び(DQW2.W3.ブランク);スーパ
ータイプ−(AI、11,23,24,25゜26.3
6,68.2)、(A2,3,28,29,30゜31
.33,68.69)、(B7,27,42,54゜5
5.56,57,58,63(14,46))、及び(
B8,18,39,41,45,61)。
カッコ内は、他の特異性が見出される濃度とは異る濃度
における結合を示す。“ブランク“はDQwl、2及び
3とは異ることが知られている帰属されていない特異性
を示す。これらのモノクローナル抗体はそれ自体として
、又は他の研究者、例えばB 27 、 Ellis等
、 Human Immunology(1982)5
:49.によシ報告されている抗体と組合わせて使用す
ることができる。
における結合を示す。“ブランク“はDQwl、2及び
3とは異ることが知られている帰属されていない特異性
を示す。これらのモノクローナル抗体はそれ自体として
、又は他の研究者、例えばB 27 、 Ellis等
、 Human Immunology(1982)5
:49.によシ報告されている抗体と組合わせて使用す
ることができる。
個々のモノクローナル抗体について、入手可能であるこ
とが今まで報告されていない特異性は次の通シである。
とが今まで報告されていない特異性は次の通シである。
すなわち、AI、24.(Al、11゜23.24,2
5,26,36,68.2)、(A2,3゜28.29
,30,31,33,68,69):(DR5゜8)、
(DR4,5,13)、(DR3,5,6,7)。
5,26,36,68.2)、(A2,3゜28.29
,30,31,33,68,69):(DR5゜8)、
(DR4,5,13)、(DR3,5,6,7)。
(DQwl、DQブランク)、及び(DQW2.W3゜
DQブランク)である。
DQブランク)である。
組換DNA技法に従えば、この発明のモノクローナル抗
体のヘビー鎖及びライト鎖をコードする遺伝子から転写
されたm RN Aを、この発明のクローンではないB
a1b/cリンパ球からのcDNAを用いる分別cDN
Aハイブリダイゼーションによシ単離′することができ
る。すなわち、目的の免佼グロブリン鎖をコードするm
RNAを含むハイブリダイズしないm RN Aが濃縮
されるであろう。この方法を反復することによシ目的と
するm RNAのレベルを一層高めることができる。こ
の削減されたmRNA組成物を逆転写して目的とする配
列について濃縮されたcDNA混合物を得ることができ
る。RNAをアルカリ又は適描なRNaseによシ加水
分解し、そしてDNAの単離をDNAポリメラーゼ■及
びランダムプライマー、例えばランダムに断片化された
ウシ胸腺DNAを用いて2本鎖にする。次に、得られた
2本鎖DNAを、適当なベクター、例えばウィルスベク
ター、例えばラムダベクター、λdv及びシャロン、例
えばプラスミドベクター、例えばpBR322及びpA
CYC184等への挿入によってクローン化することが
できる。ライト鎖及びヘビー鎖の不変領域の既知配列を
プローブとして用いて、目的とするヘビー鎖及びライト
鎖をコードするcDNAを有するクローンを同定するこ
とができる。適切な操作によシ遺伝子をプラスミドから
切シ出し、開始コドンから上流の不要なりNAを除去す
るために操作し、そして遺伝子の発現のだめの宿主の形
質転換のための適切なベクターに導入することができる
。便利には、鎖を適切に加工してヘビー鎖及びライト鎖
を連結して完全な免疫グロブリンを形成し、そしてさら
にリーダー配列を有しないその免疫グロブリンを分泌す
ることができる哺乳類動物細胞を用いることができる。
体のヘビー鎖及びライト鎖をコードする遺伝子から転写
されたm RN Aを、この発明のクローンではないB
a1b/cリンパ球からのcDNAを用いる分別cDN
Aハイブリダイゼーションによシ単離′することができ
る。すなわち、目的の免佼グロブリン鎖をコードするm
RNAを含むハイブリダイズしないm RN Aが濃縮
されるであろう。この方法を反復することによシ目的と
するm RNAのレベルを一層高めることができる。こ
の削減されたmRNA組成物を逆転写して目的とする配
列について濃縮されたcDNA混合物を得ることができ
る。RNAをアルカリ又は適描なRNaseによシ加水
分解し、そしてDNAの単離をDNAポリメラーゼ■及
びランダムプライマー、例えばランダムに断片化された
ウシ胸腺DNAを用いて2本鎖にする。次に、得られた
2本鎖DNAを、適当なベクター、例えばウィルスベク
ター、例えばラムダベクター、λdv及びシャロン、例
えばプラスミドベクター、例えばpBR322及びpA
CYC184等への挿入によってクローン化することが
できる。ライト鎖及びヘビー鎖の不変領域の既知配列を
プローブとして用いて、目的とするヘビー鎖及びライト
鎖をコードするcDNAを有するクローンを同定するこ
とができる。適切な操作によシ遺伝子をプラスミドから
切シ出し、開始コドンから上流の不要なりNAを除去す
るために操作し、そして遺伝子の発現のだめの宿主の形
質転換のための適切なベクターに導入することができる
。便利には、鎖を適切に加工してヘビー鎖及びライト鎖
を連結して完全な免疫グロブリンを形成し、そしてさら
にリーダー配列を有しないその免疫グロブリンを分泌す
ることができる哺乳類動物細胞を用いることができる。
他方、鎖を製造するために単細胞微生物を使用すること
ができ、この場合にはさらに操作を行って膜組込み配列
を含む分泌リーダー及びプロセシングシグナルをコード
するDNA配列を除去し、他方ヘビー鎖をコードする配
列の5′末端に開始コドンを設ける必要がある。こうし
て、ネズミ細胞以外の細胞内で、免疫グロブリンを調製
し、そして加工して集成し、そしてグリコジル化するこ
とができる。
ができ、この場合にはさらに操作を行って膜組込み配列
を含む分泌リーダー及びプロセシングシグナルをコード
するDNA配列を除去し、他方ヘビー鎖をコードする配
列の5′末端に開始コドンを設ける必要がある。こうし
て、ネズミ細胞以外の細胞内で、免疫グロブリンを調製
し、そして加工して集成し、そしてグリコジル化するこ
とができる。
所望によシ、各鎖を少なくとも可変領域を残して切除し
、次にとの領域を操作して注目のI(LA多型性決定基
に対して特異的なりセッターを備えるようにすることが
できる。
、次にとの領域を操作して注目のI(LA多型性決定基
に対して特異的なりセッターを備えるようにすることが
できる。
この発明のモノクローナル抗体は、インビトロ及びイン
ビデの両者において広範囲な用途を有する。インビトロ
において、これらの抗体のパネルは組織適合性タイプ分
けのために特に有用である。
ビデの両者において広範囲な用途を有する。インビトロ
において、これらの抗体のパネルは組織適合性タイプ分
けのために特に有用である。
例えば、米国特許!4,471,056を参照のこと。
これらの目的のため、これらの抗体はラベルされた形又
はラベルされない形で用いることができる。
はラベルされない形で用いることができる。
ラベルされない場合、これらは凝集試験又は補体依存性
細胞変性検定において、あるいはその中でモノクローナ
ル抗体が作られた特定の宿主程の免疫グロブリンに対し
て特異的な他のラベル化抗体と組合わせて、あるいは非
ラベル化抗体を用いる他のイムノアッセイにおいて使用
することができる。ラベルされる場合、放射性核種、螢
光物質、酵素、酵素基質、酵素コーファクター、酵素阻
害剤等を含む種々のラベルを使用することができる。
細胞変性検定において、あるいはその中でモノクローナ
ル抗体が作られた特定の宿主程の免疫グロブリンに対し
て特異的な他のラベル化抗体と組合わせて、あるいは非
ラベル化抗体を用いる他のイムノアッセイにおいて使用
することができる。ラベルされる場合、放射性核種、螢
光物質、酵素、酵素基質、酵素コーファクター、酵素阻
害剤等を含む種々のラベルを使用することができる。
種々の免疫検定法が当業界において知られておシ、そし
て次の米国特許、すなわちA3,817,837゜If
&3,850,752.43,901,654 、A3
.935,074.43,984,533.43,99
6,345゜A4,034,074 、及びA4,09
8,876に例示されている。但し、これらの特許のみ
に示されているのではない。抗体は種々の装置、例えば
流動微小螢光測定器中で使用することができ、この場合
螢光物質と結合した抗体を使用することができ、細胞を
それらの組織適合タイプについて計数し又は分類するこ
とができる。興味ある螢光物質にはフルオロレッセイン
、テキサスレッド、ローダミン、ウンベリフェロン(u
mbllliferone )、フィコビリプロティン
(phycobiliprotein ) 、メンシル
等が含まれる。
て次の米国特許、すなわちA3,817,837゜If
&3,850,752.43,901,654 、A3
.935,074.43,984,533.43,99
6,345゜A4,034,074 、及びA4,09
8,876に例示されている。但し、これらの特許のみ
に示されているのではない。抗体は種々の装置、例えば
流動微小螢光測定器中で使用することができ、この場合
螢光物質と結合した抗体を使用することができ、細胞を
それらの組織適合タイプについて計数し又は分類するこ
とができる。興味ある螢光物質にはフルオロレッセイン
、テキサスレッド、ローダミン、ウンベリフェロン(u
mbllliferone )、フィコビリプロティン
(phycobiliprotein ) 、メンシル
等が含まれる。
別の方法として、他の検定法、例えば酵素免疫検定法を
用いることができ、この場合、この発明の抗体が酵素と
結合され、あるいはこの発明の抗体の種と異る種からの
抗−Igが酵素と結合されそして本発明の抗体と組合わ
せて使用される。抗−Igの代シに、免疫複合体に対し
て特異的なりセッター、例えばS、アウレウス(S 、
aureus )のプロティンAを用いることができる
。すなわち、ヒト血液サンプル又はその両分もしくは溶
解物がこの発明の抗体と混合され、この場合この発明の
抗体が注目のHLAアロ抗原を有する細胞に結合する。
用いることができ、この場合、この発明の抗体が酵素と
結合され、あるいはこの発明の抗体の種と異る種からの
抗−Igが酵素と結合されそして本発明の抗体と組合わ
せて使用される。抗−Igの代シに、免疫複合体に対し
て特異的なりセッター、例えばS、アウレウス(S 、
aureus )のプロティンAを用いることができる
。すなわち、ヒト血液サンプル又はその両分もしくは溶
解物がこの発明の抗体と混合され、この場合この発明の
抗体が注目のHLAアロ抗原を有する細胞に結合する。
次に、細胞を上清から分離し、そして酵素ラベル、例工
ばホースラディッシュノぐ−オキシダーゼ(HRP)、
グルコースオキシダーゼ(Go)、グルコース−6−ホ
スフェートデヒドロゲナーゼ(G−6−PDH)等と結
合された抗−Igと共にインキユベートされる。未結合
のラベル化抗−Igを洗浄除去した後、次に適切な基質
を添加し、そして細胞に特異的に結合した抗体/酵素結
合体の存在を決定する。他の常用技法を用いるとともで
きる。
ばホースラディッシュノぐ−オキシダーゼ(HRP)、
グルコースオキシダーゼ(Go)、グルコース−6−ホ
スフェートデヒドロゲナーゼ(G−6−PDH)等と結
合された抗−Igと共にインキユベートされる。未結合
のラベル化抗−Igを洗浄除去した後、次に適切な基質
を添加し、そして細胞に特異的に結合した抗体/酵素結
合体の存在を決定する。他の常用技法を用いるとともで
きる。
HLAOタイプ分けのために特に興味ある検定法は、M
icro−EIAと称することができる。ミクロトレー
のウェルをペプチド、例えばポリーL−リジンによシ次
のようにしてコートする。やや上昇した温度(30℃〜
50℃)にて約0.1〜2時間、ペプチドの溶液中でイ
ンキュベートし、溶液をデカントし、そしてウェルを洗
浄する。ヒト白血球をウェルに導入し、トレイを遠心し
、そして希薄な緩衝化蛋白質溶液、例えば1%BSA又
は1.25チ粉末ミルク液を添加し、そしてトレイを例
えは4℃の冷室に0.25〜48時間貯蔵する。次に、
グレートを十分に洗浄する。
icro−EIAと称することができる。ミクロトレー
のウェルをペプチド、例えばポリーL−リジンによシ次
のようにしてコートする。やや上昇した温度(30℃〜
50℃)にて約0.1〜2時間、ペプチドの溶液中でイ
ンキュベートし、溶液をデカントし、そしてウェルを洗
浄する。ヒト白血球をウェルに導入し、トレイを遠心し
、そして希薄な緩衝化蛋白質溶液、例えば1%BSA又
は1.25チ粉末ミルク液を添加し、そしてトレイを例
えは4℃の冷室に0.25〜48時間貯蔵する。次に、
グレートを十分に洗浄する。
間接法と称する態様においては、抗原に対するモノクロ
ーナル抗体を添加し、混合物をインキュベートし、次に
十分に洗浄して非特異的に結合した抗体を除去する。酵
素ラベルに結合された、モノクローナル抗体に対する抗
体(抗−IgX、ここでXは一般にM又はGである)、
特にF(ab’ )2、を添加し、次に周囲温度にてイ
ンキュベートする。
ーナル抗体を添加し、混合物をインキュベートし、次に
十分に洗浄して非特異的に結合した抗体を除去する。酵
素ラベルに結合された、モノクローナル抗体に対する抗
体(抗−IgX、ここでXは一般にM又はGである)、
特にF(ab’ )2、を添加し、次に周囲温度にてイ
ンキュベートする。
通常、0.2〜2時間のインキュベーションで十分であ
る。他の方法として、モノクローナル抗体及び抗−Ig
Xの両者を混合し、そして−緒に添加することができる
。直接検定法のためには、モノクローナル抗体を酵素ラ
ベルに結合せしめ、抗−IgXは添加しない。ラベルさ
れた抗体を、ブロッキング剤を含む適切に緩衝化された
媒体、例えばPBS中14BsA中適当な濃度において
用いる。
る。他の方法として、モノクローナル抗体及び抗−Ig
Xの両者を混合し、そして−緒に添加することができる
。直接検定法のためには、モノクローナル抗体を酵素ラ
ベルに結合せしめ、抗−IgXは添加しない。ラベルさ
れた抗体を、ブロッキング剤を含む適切に緩衝化された
媒体、例えばPBS中14BsA中適当な濃度において
用いる。
抗体は、組織適合性のタイプ分けの目的に依存シテパネ
ルにグループ分けすることができる。血小板の適合性に
関する場合、A及びB遺伝子座の対立遺伝子のすべてを
カバーするスーパータイプ及びオリゴタイプ抗体のノ9
ネルで十分である。従って、抗体P5,4及びPI3.
1並びにBW4をカバーする抗体(MAbP85.1)
及びBw6をカバーする抗体(MAbP38.1及びP
77.1)を使用することができる。
ルにグループ分けすることができる。血小板の適合性に
関する場合、A及びB遺伝子座の対立遺伝子のすべてを
カバーするスーパータイプ及びオリゴタイプ抗体のノ9
ネルで十分である。従って、抗体P5,4及びPI3.
1並びにBW4をカバーする抗体(MAbP85.1)
及びBw6をカバーする抗体(MAbP38.1及びP
77.1)を使用することができる。
父系試験においては、HLA −A及び−B対立遺伝子
をカバニする25〜30のモノクローナル抗体のパネル
によシ、90%以上の信頼度をもって父系を排除するこ
とが可能になる〔例えば、Family Law Qu
arterly 、 10 :(3)、 1976 :
197を参照のこと〕。移植のためには、クラス1(H
LA−A、B)及びクラス[(HLA−DR。
をカバニする25〜30のモノクローナル抗体のパネル
によシ、90%以上の信頼度をもって父系を排除するこ
とが可能になる〔例えば、Family Law Qu
arterly 、 10 :(3)、 1976 :
197を参照のこと〕。移植のためには、クラス1(H
LA−A、B)及びクラス[(HLA−DR。
DQ)の両者についてタイプ分げするために抗血清を使
用することができよう。ある種の疾患、例えばHLA−
関連疾患、例えば若年性糖尿病の罹患マーカーのために
は、HLA−DR及びDQに対する抗体の例えば4種類
という小パネルで十分であろう。従って、抗体パネルの
サイズは特定の用途のために仕立てることができる。
用することができよう。ある種の疾患、例えばHLA−
関連疾患、例えば若年性糖尿病の罹患マーカーのために
は、HLA−DR及びDQに対する抗体の例えば4種類
という小パネルで十分であろう。従って、抗体パネルの
サイズは特定の用途のために仕立てることができる。
組織適合性タイプ分けのために、この発明の抗体を含む
キットを使用することができる。この発明のモノクロー
ナル抗体は、それ自体として又は他の抗体との組合わせ
において、一般に凍結乾燥組成分として提供され得る。
キットを使用することができる。この発明のモノクロー
ナル抗体は、それ自体として又は他の抗体との組合わせ
において、一般に凍結乾燥組成分として提供され得る。
ラベルに結合され得るか又は結合されない抗体と共に、
緩衝剤、例えば’Tr1g、 +77酸、炭酸又は硼酸
緩衝剤、殺生物剤、不活性蛋白質、例えばウシ血清アル
ブミンを含めることができる。一般にこれらの材料は、
活性抗存在する。しばしば、活性成分を稀釈するために
不活性増量剤又は賦形剤が存在することが望ましく、こ
の場合賦形剤は全組成物の約1〜99重量%で存在する
ことができる。この発明の抗体に結合する第2抗体が使
用される場合、この抗体はラベルに連結されそしてこの
発明の抗体と同様にして製剤化されるであろう。
緩衝剤、例えば’Tr1g、 +77酸、炭酸又は硼酸
緩衝剤、殺生物剤、不活性蛋白質、例えばウシ血清アル
ブミンを含めることができる。一般にこれらの材料は、
活性抗存在する。しばしば、活性成分を稀釈するために
不活性増量剤又は賦形剤が存在することが望ましく、こ
の場合賦形剤は全組成物の約1〜99重量%で存在する
ことができる。この発明の抗体に結合する第2抗体が使
用される場合、この抗体はラベルに連結されそしてこの
発明の抗体と同様にして製剤化されるであろう。
この発明の抗体は他の方法、例えばアフィニティーク四
マドグラフィー、種々のHLA多型性抗原のN製、ある
抗原を含有する細胞の他の抗原を含有する細胞からの分
離(この分離は細胞変性東件等を用いることができる)
において使用される。
マドグラフィー、種々のHLA多型性抗原のN製、ある
抗原を含有する細胞の他の抗原を含有する細胞からの分
離(この分離は細胞変性東件等を用いることができる)
において使用される。
従って、この発明の抗体はインビトロ及びインビデの両
者において広範囲の用途を有する。
者において広範囲の用途を有する。
次に、例によシこの発明をさらに具体的に説明する。但
し、これによシこの発明の範囲を限定するものではない
。
し、これによシこの発明の範囲を限定するものではない
。
実験
Ba1b/e 、C57B1/6 又はそのF、子孫
の系統のマウスを、ヒト−リンポプラストイド細胞上に
存在するか又は免疫沈澱によシ濃縮された画分中に存在
するHLA抗原あるいはこれらの細胞から得られたHL
A抗原によシ免疫感作する。
の系統のマウスを、ヒト−リンポプラストイド細胞上に
存在するか又は免疫沈澱によシ濃縮された画分中に存在
するHLA抗原あるいはこれらの細胞から得られたHL
A抗原によシ免疫感作する。
アジュバントを伴うか又は伴わない皮下又は腹腔内注射
によシマウスを免役感作する。マウスに1〜5回の注射
を行い、そして最後の注射の後3日目に肺臓を摘出する
。
によシマウスを免役感作する。マウスに1〜5回の注射
を行い、そして最後の注射の後3日目に肺臓を摘出する
。
免疫感作されたマウスからの牌FiABリン/臂球を、
40 % (、w/v )のポリエチレングリコール(
コダ、りMW1450)及び記載されている標準的方法
(Kohler及びMilstein 、前掲)を用い
てN5I−1又はS P O/ 2骨髄腫細胞と融合せ
しめる。融合の後、細胞混合物をHAT培地(20チの
ウシ血清、lXl0 Mヒポキサンチン、4X10−
7Mアミノグチリン及び1.6X10−5Mチミジンを
補充したRPMI −1640培地)に懸濁してバイブ
リド細胞の増殖について選択し、そして1〜3X106
糺胞/dの濃度で96ウエルミクロカルチユアートレイ
に分配する。
40 % (、w/v )のポリエチレングリコール(
コダ、りMW1450)及び記載されている標準的方法
(Kohler及びMilstein 、前掲)を用い
てN5I−1又はS P O/ 2骨髄腫細胞と融合せ
しめる。融合の後、細胞混合物をHAT培地(20チの
ウシ血清、lXl0 Mヒポキサンチン、4X10−
7Mアミノグチリン及び1.6X10−5Mチミジンを
補充したRPMI −1640培地)に懸濁してバイブ
リド細胞の増殖について選択し、そして1〜3X106
糺胞/dの濃度で96ウエルミクロカルチユアートレイ
に分配する。
適切な抗体を生産する細胞を、ヒト白血球の補体介在細
胞溶融を測定する検定法[:NAIAD1980)]に
よシ、又はヒト白血球への結合を測定するエンザイムー
リンクドミクロイムノアッセイ(下記参照のこと)によ
り同定する。各ハイプリドーマセルラインは、フィーダ
ー細胞として同種胸腺細胞を用いる限界稀釈法による3
サイクロのクローニングによシ樹立される。
胞溶融を測定する検定法[:NAIAD1980)]に
よシ、又はヒト白血球への結合を測定するエンザイムー
リンクドミクロイムノアッセイ(下記参照のこと)によ
り同定する。各ハイプリドーマセルラインは、フィーダ
ー細胞として同種胸腺細胞を用いる限界稀釈法による3
サイクロのクローニングによシ樹立される。
モノクローナル抗体蛋白質は、S、アウレウスのプロテ
ィンAセファロース(ファルマシア)上でのアフィニテ
ィークロマトグラフィー、硫酸アンモニウム沈澱、又は
イオン交換クロマトグラフィーを用いて、常用手段によ
シ腹水から単離される。
ィンAセファロース(ファルマシア)上でのアフィニテ
ィークロマトグラフィー、硫酸アンモニウム沈澱、又は
イオン交換クロマトグラフィーを用いて、常用手段によ
シ腹水から単離される。
腹水は、プリスタンの腹腔内注射によシ1〜4週間前に
準備した同種又はF1マウスの腹腔内でハイツリドーマ
細胞を増殖せしめることによシ得られる。モノクローナ
ル抗体のアイソタイプはELISAによシ決定する。
準備した同種又はF1マウスの腹腔内でハイツリドーマ
細胞を増殖せしめることによシ得られる。モノクローナ
ル抗体のアイソタイプはELISAによシ決定する。
細胞ノfネル
モノクローナル抗体の特異性は、150の個体からの1
972球の79ネル、及び160個のBリン/4’ブラ
ストイド細胞系のパネルの構成員に対する反応性を検定
することによシ決定する。1972球は末梢血から、F
icoll−Hypaque上での密度匂配遠心、プラ
スチック上への付着、及びナイロンクールの通過によシ
得られ、そしてBリンパ球は付着細胞をナイロンウール
から溶出することによシ得られる( Danilove
g等、 8th Inter −national H
lstocompatlbility Worksho
pNswsletter (1978)6:3:lo
Bリンポプラストイド細胞系は、エプスタイン−パール
ウィルスによシ形質転換された末梢Bリンノ臂球から得
られた。さらに、各抗体を250〜1000人の無作為
的に選択された提供者のパネルに対する特異性及び感受
性について検定した。
972球の79ネル、及び160個のBリン/4’ブラ
ストイド細胞系のパネルの構成員に対する反応性を検定
することによシ決定する。1972球は末梢血から、F
icoll−Hypaque上での密度匂配遠心、プラ
スチック上への付着、及びナイロンクールの通過によシ
得られ、そしてBリンパ球は付着細胞をナイロンウール
から溶出することによシ得られる( Danilove
g等、 8th Inter −national H
lstocompatlbility Worksho
pNswsletter (1978)6:3:lo
Bリンポプラストイド細胞系は、エプスタイン−パール
ウィルスによシ形質転換された末梢Bリンノ臂球から得
られた。さらに、各抗体を250〜1000人の無作為
的に選択された提供者のパネルに対する特異性及び感受
性について検定した。
この検定法は、HLA抗原に対する抗体を分泌するハイ
プリドーマを同定するための間接法において使用される
。この検定法はまた、ヒト細胞のHLAタイプを決定す
るために既知モノクローナル抗体を用いる直接法又は間
接法においても使用される。
プリドーマを同定するための間接法において使用される
。この検定法はまた、ヒト細胞のHLAタイプを決定す
るために既知モノクローナル抗体を用いる直接法又は間
接法においても使用される。
リン酸緩衝化塩溶液(PBS)中ポリーL−リジンの1
μi/ml溶液5μtを各ウェルに添加することによシ
テラサキ・ミクロトレイを調製する。別の方法として、
ヒト白血球に対する抗体(1μI/dの溶液5μt)を
各ウェルに加え、そしてプレートを40℃建て18〜2
4時間インキュベートすることもできる。
μi/ml溶液5μtを各ウェルに添加することによシ
テラサキ・ミクロトレイを調製する。別の方法として、
ヒト白血球に対する抗体(1μI/dの溶液5μt)を
各ウェルに加え、そしてプレートを40℃建て18〜2
4時間インキュベートすることもできる。
プレートを37℃にで1時間インキュベートし、そして
浸漬及びデカンHCよj5PBSで洗浄する。
浸漬及びデカンHCよj5PBSで洗浄する。
ヒト白血球、血清を含まないRPMI −1640培地
−洛夛1〜5 X 10’細胞の懸濁液lμtを各ウェ
ルに分配する。プレートを9+1にて3分間遠心する。
−洛夛1〜5 X 10’細胞の懸濁液lμtを各ウェ
ルに分配する。プレートを9+1にて3分間遠心する。
0.2チのアジドを含むPBS中1%のウシ血清アルブ
ミン(BSA)の溶液をプレートに加え、これを4℃に
て1〜48時間、又は周囲温度にて15分間貯蔵する。
ミン(BSA)の溶液をプレートに加え、これを4℃に
て1〜48時間、又は周囲温度にて15分間貯蔵する。
抗体を添加する前にプレートをPBS及びPBS中1.
25%粉末ミルクで洗浄する。
25%粉末ミルクで洗浄する。
間接検定法においては、モノクローナル抗体をウェル当
I)1μを加える。室温にて1時装置いた後、プレート
を5回洗浄し、そしてホースラディツシュパーオキシダ
ーゼ(I(RP)に連結された抗−免疫グロブリンのF
(ab’)2断片をウェル邑シ5μを加える。別の方法
として、モノクローナル抗体及び抗−免疫グロブリンの
両者を混合し、そして−緒に加える。次に、プレートを
室温にて30〜60分間インキュベートする。直接検定
法においては、HRPがモノクローナル抗体に連結され
、従って第2段階が不要である。HRPに連結された抗
体をアジドを含まないPBS中0−1%BSAの溶液中
に稀釈する。
I)1μを加える。室温にて1時装置いた後、プレート
を5回洗浄し、そしてホースラディツシュパーオキシダ
ーゼ(I(RP)に連結された抗−免疫グロブリンのF
(ab’)2断片をウェル邑シ5μを加える。別の方法
として、モノクローナル抗体及び抗−免疫グロブリンの
両者を混合し、そして−緒に加える。次に、プレートを
室温にて30〜60分間インキュベートする。直接検定
法においては、HRPがモノクローナル抗体に連結され
、従って第2段階が不要である。HRPに連結された抗
体をアジドを含まないPBS中0−1%BSAの溶液中
に稀釈する。
抗体に上る処理の後、トレイを5回洗浄する。
ウェル中のHRP−抗体複合体の存在を、0,1Mクエ
ン酸ナトリウム10.2Mリン酸ナトリウム中基質であ
る過酸化水素及び色原体である0PD(オルガノン・ダ
イアグノスチクス、西オランジ、NJ)又はABTS(
ペーリンガーマンハイム拳バイオケミカルス、インディ
アナポリス、IN)の溶液の添加によシ可視化する。室
温にて30〜60分間インキュベートした仮の色の変化
がこれらのウェル中での白血球へのモノクローナル抗体
の結合を示す。
ン酸ナトリウム10.2Mリン酸ナトリウム中基質であ
る過酸化水素及び色原体である0PD(オルガノン・ダ
イアグノスチクス、西オランジ、NJ)又はABTS(
ペーリンガーマンハイム拳バイオケミカルス、インディ
アナポリス、IN)の溶液の添加によシ可視化する。室
温にて30〜60分間インキュベートした仮の色の変化
がこれらのウェル中での白血球へのモノクローナル抗体
の結合を示す。
一ナル抗体の特異性の分析
リンホブラストイド細胞の膜蛋白質をラクトパーオキシ
ダーゼを用いて Iによ)ラベルする( Vitet
ta等、 J、Exp、Med、 (1971) 13
4:242〕。細胞を、0.5チのノニデットP−40
を含有する緩衝液中で破砕し、そして対照抗体及び固相
イムノソルベントの添加の前後に遠心にょシ澄明にする
。モノクローナル抗体を細胞溶解物のアリコートに加え
、そして抗体及びラベルされた抗原の複合体をS、アウ
レウスのプロティンA又は固相に連結されたマウス免疫
グロブリンに対するラビット抗体を用いて沈澱せしめる
。十分に洗浄した後、ポリアクリルアミドゲル中Lae
mmli法電気泳動に必要とされるのと同じか又は0’
Farrell の非平衡2次元ダル電気泳動法のため
に特定されているのと同じサンプル電気泳動緩衝液の添
加により、ラベルされた抗原を放出する。
ダーゼを用いて Iによ)ラベルする( Vitet
ta等、 J、Exp、Med、 (1971) 13
4:242〕。細胞を、0.5チのノニデットP−40
を含有する緩衝液中で破砕し、そして対照抗体及び固相
イムノソルベントの添加の前後に遠心にょシ澄明にする
。モノクローナル抗体を細胞溶解物のアリコートに加え
、そして抗体及びラベルされた抗原の複合体をS、アウ
レウスのプロティンA又は固相に連結されたマウス免疫
グロブリンに対するラビット抗体を用いて沈澱せしめる
。十分に洗浄した後、ポリアクリルアミドゲル中Lae
mmli法電気泳動に必要とされるのと同じか又は0’
Farrell の非平衡2次元ダル電気泳動法のため
に特定されているのと同じサンプル電気泳動緩衝液の添
加により、ラベルされた抗原を放出する。
各方法に要求されるようにして電気泳動を行う。
乾燥したグル中のラベルされた蛋白質をラジオオートグ
ラフィーによシ同定する。
ラフィーによシ同定する。
腹水から単離されたモノクローナル抗体をGoding
の方法〔Godfng 、 J −1mrnunol
。
の方法〔Godfng 、 J −1mrnunol
。
従ってFITCに結合せしめた。分析されるべき細胞を
飽和量のFITC−結合抗体と混合し、そして4℃にで
30分間インキュベートした。処理された細胞を洗浄し
、そして結合した抗体の量を、対数増幅器を有するFA
C8V(ペクトンーデッケンソン)上で、試験抗体及び
対照抗体と共にインキエペートされた細胞の螢光強度(
平均モダル)比較することによシ評価した。
飽和量のFITC−結合抗体と混合し、そして4℃にで
30分間インキュベートした。処理された細胞を洗浄し
、そして結合した抗体の量を、対数増幅器を有するFA
C8V(ペクトンーデッケンソン)上で、試験抗体及び
対照抗体と共にインキエペートされた細胞の螢光強度(
平均モダル)比較することによシ評価した。
融合体の合計数の内の少数が、1又は限定された数のク
ラスI又はクラス■対立遺伝子産物上に存在するHLA
エピドーグに対して特異的なネズミモノクローナル抗体
をもたらした。HLAアロ決定基に対して特異的な抗体
を生産するクローンのリストを第1表(クラス■)及び
第2表(クラス■)に示す。
以下余白特開口HG2−25994 (10
)ζ 直 「 田工田罵工悶二悶エエエ冒 エ エ 1■ T又は8972球のHLAタイプを決定するためにこれ
らの抗体のいくつをパネルに組合わせることができるか
を示す例を次の第3表、第4表及び第5表に示す。
あ−ト余白HLA特異性のタイプ分
けに使用される方法HLA抗原の発現についてヒト−リ
ンパ球をタイプ分けするために使用される3種類の一般
的方法が存在する。第1の、そして現在最も使用されて
いる方法は補体依存細胞溶解である。第2はエンザイム
ーリンクドイムノアッセイ(ELISA)によシリンパ
球への抗体の結合を測定する検定法である。
ラスI又はクラス■対立遺伝子産物上に存在するHLA
エピドーグに対して特異的なネズミモノクローナル抗体
をもたらした。HLAアロ決定基に対して特異的な抗体
を生産するクローンのリストを第1表(クラス■)及び
第2表(クラス■)に示す。
以下余白特開口HG2−25994 (10
)ζ 直 「 田工田罵工悶二悶エエエ冒 エ エ 1■ T又は8972球のHLAタイプを決定するためにこれ
らの抗体のいくつをパネルに組合わせることができるか
を示す例を次の第3表、第4表及び第5表に示す。
あ−ト余白HLA特異性のタイプ分
けに使用される方法HLA抗原の発現についてヒト−リ
ンパ球をタイプ分けするために使用される3種類の一般
的方法が存在する。第1の、そして現在最も使用されて
いる方法は補体依存細胞溶解である。第2はエンザイム
ーリンクドイムノアッセイ(ELISA)によシリンパ
球への抗体の結合を測定する検定法である。
第1の方法の要素を標準ホーマツ) ELISA検定法
と組合わせてHLAOタイプ分けに適するミクロEL
I SA検定法が開発された。第3の方法はリンパ球へ
の抗体の結合を測定するために螢光化合物を使用する。
と組合わせてHLAOタイプ分けに適するミクロEL
I SA検定法が開発された。第3の方法はリンパ球へ
の抗体の結合を測定するために螢光化合物を使用する。
フルオレッセインインチオシアナート及び螢光活性化セ
ルソーターを用いて対象抗体の特異性が分析された。
ルソーターを用いて対象抗体の特異性が分析された。
第1表中のすべての抗体がこれら3種類の検定法のそれ
ぞれにおいて試験され、そして同じ反応を与えた。これ
らの抗体のパネルを用いるヒトTリンパ球のタイプ分け
の例を第3表に示す。第2表の抗体はまた、抗体4AA
7,143.1 、及び1421を除き2つの検定系に
おいて有効である。これら3種類の抗体は補体を固定せ
ず、従って検定法2及び3のためにのみ適箔である。幾
つかのモノクローナル抗体を使用してクラスIf HL
A抗原についてBリンパ球をタイプ分けした例を第4表
に示す。
ぞれにおいて試験され、そして同じ反応を与えた。これ
らの抗体のパネルを用いるヒトTリンパ球のタイプ分け
の例を第3表に示す。第2表の抗体はまた、抗体4AA
7,143.1 、及び1421を除き2つの検定系に
おいて有効である。これら3種類の抗体は補体を固定せ
ず、従って検定法2及び3のためにのみ適箔である。幾
つかのモノクローナル抗体を使用してクラスIf HL
A抗原についてBリンパ球をタイプ分けした例を第4表
に示す。
第3表及び第4表のパネルは、オーバラップするがしか
し別個の一連のHLA抗原を定義するために選択される
一連のI(LAモノクローナル抗体から成る。抗体のパ
ネルによる十結果及び−結果のマトリクスが試験された
個体におけるHLAタイプの側渦てを可能にする。
し別個の一連のHLA抗原を定義するために選択される
一連のI(LAモノクローナル抗体から成る。抗体のパ
ネルによる十結果及び−結果のマトリクスが試験された
個体におけるHLAタイプの側渦てを可能にする。
モノクローナル抗体のパネルは、従来から使用可能であ
った常用のアロ抗血清パネルに対して幾つかの利点を有
する。
った常用のアロ抗血清パネルに対して幾つかの利点を有
する。
(1) これらの抗体は無限供給において入手可能で
ある。従ってこれらの特異性が一旦決定されれば追加の
特徴付けを必要としない。これに対して、組織のタイプ
分けが最近経産婦又は多数回輸血された患者から得られ
た血清を用いて行われる。ある1人の提供者からは限ら
れた量のみのこれらの試薬が入手可能である。従って、
これらの抗血清を常に新しいものと取シ換えることが必
要であシ、後者を先行する抗血清に対して標準化しそし
てチェックしなけれはならない。
ある。従ってこれらの特異性が一旦決定されれば追加の
特徴付けを必要としない。これに対して、組織のタイプ
分けが最近経産婦又は多数回輸血された患者から得られ
た血清を用いて行われる。ある1人の提供者からは限ら
れた量のみのこれらの試薬が入手可能である。従って、
これらの抗血清を常に新しいものと取シ換えることが必
要であシ、後者を先行する抗血清に対して標準化しそし
てチェックしなけれはならない。
(2) このようにして得られる抗体の不均一性のた
め、交差反応性、及び特異性を異にする多数の抗体によ
る汚染が大問題である。モノクローナル抗体パネルの場
合、特異性の汚染を無視して個々のクローン化抗体を高
濃度で使用することができる。
め、交差反応性、及び特異性を異にする多数の抗体によ
る汚染が大問題である。モノクローナル抗体パネルの場
合、特異性の汚染を無視して個々のクローン化抗体を高
濃度で使用することができる。
(3)アロ抗血清は通常非常に低い力価を示すので、反
応混合物中で一層高い濃度を必要とする。
応混合物中で一層高い濃度を必要とする。
これは、細胞表面への蛋白質の非特異的結合に寄与する
ことができ、そして補体依存検定法において誤まった陰
性結果(fale negativ@) iもたらす。
ことができ、そして補体依存検定法において誤まった陰
性結果(fale negativ@) iもたらす。
さらに、細胞表面に蛋白質が非特異的に結合する可能性
があるため、これらの血清は結合検定法においてあまシ
有用でない。これに対して、モノクローナル抗体は数千
のタイターをもたらすように精製及び濃縮され得る。
があるため、これらの血清は結合検定法においてあまシ
有用でない。これに対して、モノクローナル抗体は数千
のタイターをもたらすように精製及び濃縮され得る。
(4) これらの抗体の精緻な特異性のため、種々の
検定ホーマットにおける広い用途を有する。モノクロー
ナル抗体パネルの使用によシ、従来の抗体パネルによっ
ては不可能であった種々の検定法を用いることが可能と
なる。これらの方法には自動化された螢光法、ELIS
Aを基礎にした方法、及びフローサイトメトリーが含ま
れるが、これらに限定されない。
検定ホーマットにおける広い用途を有する。モノクロー
ナル抗体パネルの使用によシ、従来の抗体パネルによっ
ては不可能であった種々の検定法を用いることが可能と
なる。これらの方法には自動化された螢光法、ELIS
Aを基礎にした方法、及びフローサイトメトリーが含ま
れるが、これらに限定されない。
以上、この発明を具体的に説明したが、これによってこ
の発明の範囲を限定するものではない。
の発明の範囲を限定するものではない。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1、5.4、16.1、17.1、114.1、142
.1、145.2、159.2、200.1、210.
1及び4AA7と称されるモノクローナル抗体の1つと
同一の抗体特異性を有するモノクローナル抗体。 2、異るアロ抗原を識別することができる少なくとも2
種類のモノクローナル抗体を含みそして特許請求の範囲
第1項に記載の少なくとも1種類のモノクローナル抗体
を有する組織適合性タイプ分け用パネル。 3、前記モノクローナル抗体がネズミ由来のものである
特許請求の範囲第2項に記載のパネル。 4、前記モノクローナル抗体がネズミ由来のものである
特許請求の範囲第1項に記載のモノクローナル抗体。 5、前記抗体がクラスIgM又はIgGである特許請求
の範囲第1項に記載のモノクローナル抗体。 6、検出可能なシグナルを提供することができるラベル
に結合した特許請求の範囲第1項に記載のモノクローナ
ル抗体。 7、前記ラベルが螢光物質又は酵素である特許請求の範
囲第6項に記載のモノクローナル抗体。 8、第1表又は第2表に記載のモノクローナル抗体から
成るモノクローナル抗体。 9、異なるアロ抗原を識別するモノクローナル抗体を含
みそして特許請求の範囲第8項に記載の少なくとも2種
類のモノクローナル抗体を有する組織適合性タイプ分け
パネル。 10、検出可能なシグナルを提供することができるラベ
ルに結合した特許請求の範囲第8項に記載のモノクロー
ナル抗体。 11、前記ラベルが螢光物質又は酵素である特許請求の
範囲第10項記載のモノクローナル抗体。 12、ヒト細胞を特許請求の範囲第8項又は第10項の
いずれかに記載のモノクローナル抗体と混合し、そして
複合体の形成を検出することを含んで成るHLAタイプ
分け方法。 13、(1)ヒト白血球懸濁液を結合を増強するために
コートされたウェルに導入し; (2)該細胞を収容したウェルを遠心し; (3)上清を除去しそして該細胞を収容したウェルを洗
浄し; (4)アロ抗原に特異的なモノクローナル抗体を少なく
とも1個のウェルに加え、この場合異るモノクローナル
抗体を異るウェルに入れ;そして、 (5)該ウェルを洗浄して非特異的に結合したモノクロ
ーナル抗体を除去し; そして、酵素と結合したモノクローナル抗体を用いるこ
とにより、又は前記複合体に結合する、酵素に結合した
リセプターを添加することにより、前記複合体の形成を
検出し、そして特異的に結合した酵素の存在を検出する
; 段階を含んで成る特許請求の範囲第12項に記載の方法
。 14、前記モノクローナル抗体が補体介在細胞溶解を許
容するサブクラスのものであり、そして複合体の形成を
補体介在溶解によって検出する特許請求の範囲第12項
に記載の方法。 15、検出可能なシグナルを提供するラベルに結合した
第1表又は第2表中の少なくとも1種のモノクローナル
抗体を含むか、又は検出可能なシグナルを提供するラベ
ルに結合した、前記モノクローナル抗体に対する抗体を
含む、特許請求の範囲第12項に記載の方法に使用する
ためのキット。 16、特許請求の範囲第1項に記載のモノクローナル抗
体組成物の少なくとも1つの鎖をコードする、インビト
ロ培養が可能な宿主中のネズミ遺伝子。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US74012485A | 1985-05-30 | 1985-05-30 | |
US740124 | 1985-05-30 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS6225994A true JPS6225994A (ja) | 1987-02-03 |
Family
ID=24975148
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP61123889A Pending JPS6225994A (ja) | 1985-05-30 | 1986-05-30 | Hlaタイプ分け用モノクロ−ナル抗体 |
Country Status (2)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP0204522A3 (ja) |
JP (1) | JPS6225994A (ja) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2012510618A (ja) * | 2008-12-01 | 2012-05-10 | ボード オブ トラスティーズ オブ ザ レランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティ | 補体固定抗体の検出のための方法および組成物 |
US11796547B2 (en) | 2013-03-14 | 2023-10-24 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Methods of detecting donor-specific antibodies and systems for practicing the same |
Families Citing this family (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1986007464A1 (en) * | 1985-06-14 | 1986-12-18 | Genetic Systems Corporation | Methods for identifying alleles associated with increased risk of diabetes |
US5369010A (en) * | 1985-08-16 | 1994-11-29 | Genetic Systems Corporation | Monoclonal antibody to polymorphic HLA determinant -B27 |
CA1340610C (en) * | 1985-08-16 | 1999-06-29 | Karen A. Nelson | Monoclonal antibody to polymorphic hla determinant-b27 |
FR2621128B1 (fr) * | 1987-09-30 | 1994-05-06 | Sanofi | Trousse et methode de dosage immunometrique applicables a des cellules entieres |
AU1368292A (en) * | 1991-03-11 | 1992-10-06 | Sheila Drover | Murine monoclonal antibodies recognizing polymorphic determinants of hla |
WO1996020215A2 (en) * | 1994-12-23 | 1996-07-04 | Laboratoires Om S.A. | Use of mhc-ii binding and/or mhc-ii mimicking molecules for the prevention and/or treatment of inflammatory diseases |
US10527613B2 (en) | 2015-11-10 | 2020-01-07 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Biomarker detection methods and systems and kits for practicing same |
Family Cites Families (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE3381518D1 (de) * | 1982-01-22 | 1990-06-07 | Cetus Corp | Verfahren zur charakterisierung von hla und die darin benutzten cdns-testmittel. |
US4471056A (en) * | 1982-04-02 | 1984-09-11 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Method for HLA-DR typing of total human lymphocyte sample |
US4517289A (en) * | 1982-08-18 | 1985-05-14 | Brigham And Women's Hospital | Monoclonal antibodies for human tissue cross-matching |
-
1986
- 1986-05-30 JP JP61123889A patent/JPS6225994A/ja active Pending
- 1986-05-30 EP EP86304118A patent/EP0204522A3/en not_active Withdrawn
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2012510618A (ja) * | 2008-12-01 | 2012-05-10 | ボード オブ トラスティーズ オブ ザ レランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティ | 補体固定抗体の検出のための方法および組成物 |
US11796547B2 (en) | 2013-03-14 | 2023-10-24 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Methods of detecting donor-specific antibodies and systems for practicing the same |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP0204522A3 (en) | 1987-09-16 |
EP0204522A2 (en) | 1986-12-10 |
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