JPS6225994A - Ｈｌａタイプ分け用モノクロ−ナル抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔発明の分野〕 ヒトの主要組織適合遺伝子複合体（ＭＭＣ）はヒト白血
球抗原（ＨＬＡ）と称され、そして第６染色体の短腕上
に連鎖する遺伝子座によシコードされている。クラスＩ
−ＨＬＡ抗原はＨＥ、Ａ−Ａ、Ｂ及びＣ遺伝子座によっ
てコードされ、他方クラス■抗原はＨＬＡ−ＤＲ，ＤＰ
及びＤＱＣ遺伝子座よシコードされる。

ＨＬＡ抗原は高度に多型性（ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ　
）である。すなわち、各遺伝子座に多数の対立遺伝子が
存在する。この高度な多型性のために、従来、ある個体
のｒ　ＨＬＡタイプ」の決定には、抗体の大きなノぐネ
ルを用いてその個体の細胞を試験して各遺伝子座に２つ
の対立遺伝子のいずれが存在するかを同定する必要があ
った。そして、個体のＨＬＡタイプは各遺伝子座に帰属
する対立遺伝子の全体である。

ＨＬＡ抗原は個体間で移植される細胞又は組織の受容又
は拒絶に大きな役割を演することが知られＷｌｌｅｙ、
ニューヨーク、１９８２）。移植された細胞又は組織の
受容の可能性は、受容者と提供者が’ＨＬＡ対立遺伝子
を共有する場合に増加する。異る組織の移植は異る厳格
さの一致を必要とする。

例えば、血小板の輸注に必要とされる厳格さは骨髄移植
の場合のそれよシも低い。

ＨＬＡ抗原はまた、罹疫性に役割を演することが知られ
ている。特定の対立遺伝子の存在が幾つかの疾患に対す
る素因をもたらす。例えば、Ｂ２７対立遺伝子は強直背
椎炎と強い関連性を有するのでこの疾患の鑑別診断にお
いて有用である。

ＨＬＡ抗原の高度な多型性のため、それらはまた父系試
験のために特に有用である。

ＨＬＡ多型性はすでに、経産婦からの血清を用いて、補
体依存細胞変性検定（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ　−ｄｅｐ
ａｎｄｅｎｔ　ｃｙｔｏｔｏｘｌｃｌｔｙ　ａｓｓａｙ
）によシ定義されている。これらの血清は多くの限界を
有する。

これらはしばしば弱く且つ複数特異的であシ、そしてま
れな多型性の幾つかに向けられる血清を見出すととは困
難である。従って、有用な１種類又は少数種類の血清を
見出すために多数の血清をスクリーニングすることが必
要である。さらに、入手できるのが比較的少容量である
ため、これらの血清を次々と新しい血清で置き換える必
要があシ、そしてこの新しい血清は先行する血清に対し
て標準化されそしてチェックされなければならない。

アロ抗血清を製造する目的で志願者を故意に免疫感作す
ることが有用であることが証明されているが、しかしな
がら明らかな実際的及び倫理的限界が存在する。これら
の問題点の観点から、ＨＬＡ多型性を認識する異種抗血
清を製造することが試みられている。しかしながら、こ
のような異種抗血清は種特異的決定基に対する抗体を支
配的に含有することが見出されている。従って、冬型性
決定基に対する抗体を検出するために広範な吸収が要求
されるＣ　５ｔａｉｎｅｓ等、　Ｔｉ５ｓｕｅ　Ａｎｔ
ｌｇｅｎｓ（１９７３）　３　：　１　；　Ｇｏｏｄｆ
ｅｌｌｏｗ＄　、前掲（１９７６）７：１０５）。冬型
性を認識する抗血清を生じさせることにおける幾つかの
成功が、精製された材料を用いて免疫感作し、且つ進化
の上で密接に関連する種を免疫感作するという組み合わ
せた方策によシ達成されている（Ｂａｒｎ＋５ｔａｂｌ
ｅ等、　Ｃｅ１ｌ　（１９７９）１４：　９：５ａｎｄ
ｅｒｓｏｎ等。

Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ　（１９７３）　１６
　：　３０４　〕ｏしかしながら、これらの抗血清の非
多型性活性を除去するために広範な吸収がなお必要とさ
れる。

Ｋｏｈ　１　ｅ　ｒ及びＭｉｌｉｇｔｅｔｎ　、　Ｎａ
ｔｕｒｅ　（１９７５）２５６：４９５のハイブリドー
マ技法の出現によシ、強力で且つ特異的な抗−ＨＬＡ試
薬を製造し、そしてこれによって上に検討した問題点を
解決することが比較的容易であると予想された。しかし
ながら、今まで製造されたモノクローナル抗−ＨＬＡ抗
体のほとんどは半型性（ｍｏｎｏｍｏｒｐｈｌｃ　）の
又は広く交差反応する決定基を認識しておシ、そしてこ
のために組織のタイプ分げにおける用途が限定されてい
た。事実、有意な数のＨＬＡがアロ抗原過程に特有のエ
ピトープをコードしているか否か、及びそのような個別
のエピドーグ部位が存在するとしてこれらの工ぎトープ
に反応する適当なＩｒ遺伝子しＡ’　−）　ＩＪ−を有
する実験動物が入手可能か否かは実質的に定かではなか
った。さらに、有用な特異性基を検出するモノクローナ
ル抗体が生じ得るか否かも不明である。

〔従来技術〕

Ｂｒｏｄｓｋｙ等、　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｒ
ｅｖｉｅｗ（１９７９）４７：４はその時代におけるこ
の分野の卓越した総説を提供している。Ｇｒｕｍｅｔ等
。

ＨＬＡ−Ｂ２７を２つのサブグルー７’に分けるモノク
ローナル抗体を記載している。Ｍｕ　１１　ｅ　ｒ等。

Ｈｕｍａｎ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９８３）　６　
：　１８９は、ＨＬＡアロ特異性Ａ２及びＡ２８　にょ
）共有される抗原決定基に対するＩｇＭモノクローナル
抗体を記載している。Ｍｕ　１１　＠ｒ等、　Ｈｕｍａ
ｎ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９８３）７：２２９は、
ＨＥ、Ａ−Ｂ１３分子のプライベート−アロ抗原決定基
に対して特異的なモノクローナル抗体を記載している。

Ａｎｔｏｎｅｌｌｉ等、　Ｈｕｒｎａｎ　Ｉｍｍｕｎｏ
ｌｏｇｙ　（１９８４）　１１　：　１１は、ヒトーア
ロ抗１ＨＬＡ−Ｂ８を認識するモノクローナル抗体Ｐ８
．１を記載している。そこに記載される抗体Ｐ８．１　
、Ｂ５．１　、Ｂ５．３及びＢ５．４はＴｈｅ　Ｎ１ｎ
ｔｈ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｈｌｓｔｏｅｏｍ
ｐａｔｌ　−ｂｉｌｉｔｙ　Ｗｏｒｋｓｈｏｐ　ａｎｄ
　Ｃｏｎｆｅｒｅｎｅｅ　、ミュンヘン、西独、１９８
４年５月６〜１１日において使用され、そして”　Ｈｌ
ｓｔｏｃｏｍｐａｔｌｂｉｌｌｔｙ　Ｔ＠ｓｔｉｎｇ１
９８４　’　、　Ａｌｂｅｒｔ　、　Ｂａｕｅｒ及びＭ
ａｙｒ　編。

Ｓｐｒｉｎｇｅｒ　−Ｖｅｒｌａｇ　、　　ベルリン、
１９８４年に公表された。さらにＥＰＯ００６８７９０
。

００７３９５３．０１０３３６８及び０１３１８７８゜
並びにＰＯＴ／ＵＳ８１１０１６８４を参照のこと。

〔発明の概要〕

ヒ）　ＩＪンパ系細胞の組織適合性タイプ分けを可能に
する方法及び組成物が提供される。種々のＨＬＡアロ抗
原に対して特異的なモノクローナル抗体を分泌するバイ
ブリドセルラインが製造される。

これらのモノクローナル抗体のノｆネルが診断及び治療
に使用される。バイブリドセルラインが種々のＨＬＡア
ロ特異性の抗体をコードするＤＮＡ源として機能するこ
とができ、このＤＮＡを組換ＤＮＡ（ｒＤＮＡ）技法を
用いて操作して他の細胞性宿主が特定の抗体を生産する
ことができるようにすることができる。　　　　　　　
　　　　以下余白〔具体的な記載〕 この発明に従えば、ヒトの細胞、特にリンパ系細胞の組
織適合性のタイプ分けを可能にする新規なセルライン及
び組成物が提供される。このセルラインはネズミの染色
体を有し、この染色体においてはジャームラインＤＮＡ
がＨＬＡ抗Ａ抗原上ビ発明のセルラインによって生産さ
れるこれらのモノクローナル抗体のパネルは診断及び治
療の両者のための種々の方法において使用することがで
きる０ この発明のモノクローナル抗体は、ヒ）ＨＬＡアロ抗原
に対して特異的な抗体の発現のための核酸の能力を不滅
化することによって製造される。

不滅化は抗体をコードするＤＮＡを培養において増殖す
ることができる宿主に導入することにより、又は抗体を
生産することができる細胞の形質転換によシ達成するこ
とができる。不滅化されたセルラインは、発癌によシ、
トランスフェクションによシ、又は変異等によシ形質転
換された哺乳類動物セルラインであることができる。こ
のような細胞系には骨髄腫系、リン、ｐｇ系等、すなわ
ち抗体のインビトロ（組織培養による）発現及び分泌を
支持することができるセルラインが含まれる。抗体は、
リンパ球の形質転換によシ、特に牌細胞のウィルスによ
る形質転換によシ、又はリンパ球と新生物細胞、例えば
骨髄腫細胞との融合によるバイブリドセルラインの形成
によシ、生産される哺乳類の天然免疫グロブリンである
ことができる。

これとは異り、抗体は、組換ＤＮＡ技法によシ生産され
る免疫グロブリンであってもよく、この場合例えばＨＬ
Ａ−特異的モノクローナル抗体のヘビー鎖及びライト鎖
をコードするゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡがこれらの鎖の
発現のための発現ベクターに挿入される。形質転換又は
融合は常法に従って行うことができ、融合法は多数の米
国特許、例えばＡ４．．１７２，１２４．Ａ４，３５０
，６８３＃黒４．３６３，７９９　、Ａ４，３８１，２
９２．及び４．４２３，１４７に記載されている。さら
にＫｅｎｎｅｔｔプレナムプレス、１９８０年を参照の
こと。形質転換法は例えば米国特許４４，４６４，４６
５に記載されている。バイブリドセルラインはクローン
化し、そして種々のＨＬＡアロ抗原の各々に対して特異
的な抗体を検出するための常法に従ってスクリーニング
することができる。通常、各ハイブリドーマセルライン
は限界稀釈法による少なくとも３サイクルのクローニン
グによシ樹立される。目的とする抗体を生産する細胞は
常用の検定（例えば細胞変性検定）によシまず同定され
、そして次に拡張され、そして多数の供血者（２５０名
以上）を用いて特異性及び感受性についてスクリーニン
グされる。適切なハイプリドーマセルラインが培養にお
いて拡張され、そして腹水を調製するために適尚な宿主
の腹腔に注射される。

１又は複数のＨＬＡ多型性決定基に対して特異的な抗体
を手にすることにより、競争検定においてその部位に対
して特異的であることが知られている目的モノクローナ
ル抗体との競争によシ候補ハイブリドーマからの上清を
スクリーニングすることができる。従って、特定の多型
性に対して特異的な抗体の入手可能性に基いて、種々の
入手源からバイブリドセルラインを容易に製造すること
ができる。別の方法として、目的の多型性に対して特異
的な抗体を生産するバイブリドセルラインが一人手可能
であれば、これらのバイブリドセルラインを他の新生物
性Ｂ細胞と融合せしめることができ、との場合このよう
な他のＢ細胞はモノクローナル抗体をコードするゲノム
ＤＮＡの受容体として機能する。害菌動物、特にネズミ
の新生物Ｂ細胞が好ましいが、他の哺乳類動物種、例え
ばウサギ、ウシ、ヒツジ、ウマ、ブタ、鳥類等も使用す
ることができ、これらの動物及び鳥類は融合のためのリ
ンパ球、特に牌細胞を提供することができ、そして種々
のヒ）ＨＬＡ多型性を抗原性として認識するであろう。

モノクローナル抗体（ＭＡｂｓ）は任意のクラス又はサ
ブクラス、例えばＩｇＭ　、　ＩｇＤ　。

ＩｇＧ１　、１ｇＧ２　、　ＩｇＧ３もしくはＩ　ｇＧ
４、又はＩｇＥ。

あるいはその宿主同等物であることができる。

ＨＬＡＯタイプ分けのために選択されるモノクローナル
抗体は、それらがいかにして使用されるかに依存して多
数の注目の性質を有するととが−できる。この注目の性
質には、１０６以上、通常１０８、好ましくは１０　　
Ｍ　　の親和性定数（Ｋａ）が含まれる。モノクローナ
ル抗体は広範囲の稀釈（５倍以上、好ましくは１０倍以
上）にわたって同一の特異性を有すべきであシ、そして
この範囲内での濃度の関数として交差反応性を示すべき
ではない。

しかしながら、これらは、この範囲外での濃度において
異る有用な特異性を有することができる。

幾つかの目的のためには補体固定の性質が興味深く、補
体介在細胞溶解に基礎を置く検定での使用のために特に
そうである。モノクローナル抗体は長期間の貯蔵に対し
て安定であるべきである。

この発明のために、種々のＭＡｂｓ（モノクローナル抗
体）の特異性の程度を次のように表現する。

”プライベート１１１つのアロ抗原上の１つのユニーク
決定基への結合を意味し；”オリゴタイｆ″は２〜５の
異るアロ抗原上に存在する１つの決定基に結合すること
を意味し、“スーパータイプ”は５よシ多くの異るアロ
抗原に結合することを意味し：そして“クレームワーク
”は特定の種の実質上すべてのアロ抗原上に存在する１
つの決定基に結合することを意味する。ＨＬＡのタイプ
分けを行う目的（例えば移植、父系試験等）に依存して
、モノクローナル抗体の異るパネルを使用することがで
きる。

同じ遺伝子座の複数の対立遺伝子産物と反応するオリゴ
タイプ又はスーパータイプモノクローナル抗体が特に興
味深い。２〜４種類のこれらの抗体のパネルがこの遺伝
子座を完全に定義することができる。この厳格性の低い
定義が、血小板輸注のごとき幾つかの移植状況において
提供者と受容者を適合させるために十分である。

次の結合特異性を有するモノクローナル抗体を生産する
ハイブリドーマセルラインが興味深い。

プライベー）−ＡＩ、２，３，２４：Ｂｗ６ｔ８゜１３
．４４；ＤＲＩ、３，４，５，７．ＷＳ２゜ｗ５３；Ｄ
Ｑｗｌ、ｗ３．及びｗ３．１；オリゴタイプ−（Ａ２．
Ｗ６９）、（Ａ２，２８）ｐ（Ａ２３，２４．２５（３
２））、（Ａ２５，３２）。

（Ｂ１４，１８，３９，５９）、（Ｂ１７，２７）。

（ＤＲＩ、２．７）、（ＤＲ５，８）、（ＤＲ４，５゜
１３）、（ＤＲ３，５，６，７）、（ＤＱＷｌ、ＤＱブ
ランク）、及び（ＤＱＷ２．Ｗ３．ブランク）；スーパ
ータイプ−（ＡＩ、１１，２３，２４，２５゜２６．３
６，６８．２）、（Ａ２，３，２８，２９，３０゜３１
．３３，６８．６９）、（Ｂ７，２７，４２，５４゜５
５．５６，５７，５８，６３（１４，４６））、及び（
Ｂ８，１８，３９，４１，４５，６１）。

カッコ内は、他の特異性が見出される濃度とは異る濃度
における結合を示す。“ブランク“はＤＱｗｌ、２及び
３とは異ることが知られている帰属されていない特異性
を示す。これらのモノクローナル抗体はそれ自体として
、又は他の研究者、例えばＢ　２７　、　Ｅｌｌｉｓ等
、　Ｈｕｍａｎ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９８２）５
：４９．によシ報告されている抗体と組合わせて使用す
ることができる。

個々のモノクローナル抗体について、入手可能であるこ
とが今まで報告されていない特異性は次の通シである。

すなわち、ＡＩ、２４．（Ａｌ、１１゜２３．２４，２
５，２６，３６，６８．２）、（Ａ２，３゜２８．２９
，３０，３１，３３，６８，６９）：（ＤＲ５゜８）、
（ＤＲ４，５，１３）、（ＤＲ３，５，６，７）。

（ＤＱｗｌ、ＤＱブランク）、及び（ＤＱＷ２．Ｗ３゜
ＤＱブランク）である。

組換ＤＮＡ技法に従えば、この発明のモノクローナル抗
体のヘビー鎖及びライト鎖をコードする遺伝子から転写
されたｍ　ＲＮ　Ａを、この発明のクローンではないＢ
ａ１ｂ／ｃリンパ球からのｃＤＮＡを用いる分別ｃＤＮ
Ａハイブリダイゼーションによシ単離′することができ
る。すなわち、目的の免佼グロブリン鎖をコードするｍ
ＲＮＡを含むハイブリダイズしないｍ　ＲＮ　Ａが濃縮
されるであろう。この方法を反復することによシ目的と
するｍ　ＲＮＡのレベルを一層高めることができる。こ
の削減されたｍＲＮＡ組成物を逆転写して目的とする配
列について濃縮されたｃＤＮＡ混合物を得ることができ
る。ＲＮＡをアルカリ又は適描なＲＮａｓｅによシ加水
分解し、そしてＤＮＡの単離をＤＮＡポリメラーゼ■及
びランダムプライマー、例えばランダムに断片化された
ウシ胸腺ＤＮＡを用いて２本鎖にする。次に、得られた
２本鎖ＤＮＡを、適当なベクター、例えばウィルスベク
ター、例えばラムダベクター、λｄｖ及びシャロン、例
えばプラスミドベクター、例えばｐＢＲ３２２及びｐＡ
ＣＹＣ１８４等への挿入によってクローン化することが
できる。ライト鎖及びヘビー鎖の不変領域の既知配列を
プローブとして用いて、目的とするヘビー鎖及びライト
鎖をコードするｃＤＮＡを有するクローンを同定するこ
とができる。適切な操作によシ遺伝子をプラスミドから
切シ出し、開始コドンから上流の不要なりＮＡを除去す
るために操作し、そして遺伝子の発現のだめの宿主の形
質転換のための適切なベクターに導入することができる
。便利には、鎖を適切に加工してヘビー鎖及びライト鎖
を連結して完全な免疫グロブリンを形成し、そしてさら
にリーダー配列を有しないその免疫グロブリンを分泌す
ることができる哺乳類動物細胞を用いることができる。

他方、鎖を製造するために単細胞微生物を使用すること
ができ、この場合にはさらに操作を行って膜組込み配列
を含む分泌リーダー及びプロセシングシグナルをコード
するＤＮＡ配列を除去し、他方ヘビー鎖をコードする配
列の５′末端に開始コドンを設ける必要がある。こうし
て、ネズミ細胞以外の細胞内で、免疫グロブリンを調製
し、そして加工して集成し、そしてグリコジル化するこ
とができる。

所望によシ、各鎖を少なくとも可変領域を残して切除し
、次にとの領域を操作して注目のＩ（ＬＡ多型性決定基
に対して特異的なりセッターを備えるようにすることが
できる。

この発明のモノクローナル抗体は、インビトロ及びイン
ビデの両者において広範囲な用途を有する。インビトロ
において、これらの抗体のパネルは組織適合性タイプ分
けのために特に有用である。

例えば、米国特許！４，４７１，０５６を参照のこと。

これらの目的のため、これらの抗体はラベルされた形又
はラベルされない形で用いることができる。

ラベルされない場合、これらは凝集試験又は補体依存性
細胞変性検定において、あるいはその中でモノクローナ
ル抗体が作られた特定の宿主程の免疫グロブリンに対し
て特異的な他のラベル化抗体と組合わせて、あるいは非
ラベル化抗体を用いる他のイムノアッセイにおいて使用
することができる。ラベルされる場合、放射性核種、螢
光物質、酵素、酵素基質、酵素コーファクター、酵素阻
害剤等を含む種々のラベルを使用することができる。

種々の免疫検定法が当業界において知られておシ、そし
て次の米国特許、すなわちＡ３，８１７，８３７゜Ｉｆ
＆３，８５０，７５２．４３，９０１，６５４　、Ａ３
．９３５，０７４．４３，９８４，５３３．４３，９９
６，３４５゜Ａ４，０３４，０７４　、及びＡ４，０９
８，８７６に例示されている。但し、これらの特許のみ
に示されているのではない。抗体は種々の装置、例えば
流動微小螢光測定器中で使用することができ、この場合
螢光物質と結合した抗体を使用することができ、細胞を
それらの組織適合タイプについて計数し又は分類するこ
とができる。興味ある螢光物質にはフルオロレッセイン
、テキサスレッド、ローダミン、ウンベリフェロン（ｕ
ｍｂｌｌｌｉｆｅｒｏｎｅ　）、フィコビリプロティン
（ｐｈｙｃｏｂｉｌｉｐｒｏｔｅｉｎ　）　、メンシル
等が含まれる。

別の方法として、他の検定法、例えば酵素免疫検定法を
用いることができ、この場合、この発明の抗体が酵素と
結合され、あるいはこの発明の抗体の種と異る種からの
抗−Ｉｇが酵素と結合されそして本発明の抗体と組合わ
せて使用される。抗−Ｉｇの代シに、免疫複合体に対し
て特異的なりセッター、例えばＳ、アウレウス（Ｓ　、
ａｕｒｅｕｓ　）のプロティンＡを用いることができる
。すなわち、ヒト血液サンプル又はその両分もしくは溶
解物がこの発明の抗体と混合され、この場合この発明の
抗体が注目のＨＬＡアロ抗原を有する細胞に結合する。

次に、細胞を上清から分離し、そして酵素ラベル、例工
ばホースラディッシュノぐ−オキシダーゼ（ＨＲＰ）、
グルコースオキシダーゼ（Ｇｏ）、グルコース−６−ホ
スフェートデヒドロゲナーゼ（Ｇ−６−ＰＤＨ）等と結
合された抗−Ｉｇと共にインキユベートされる。未結合
のラベル化抗−Ｉｇを洗浄除去した後、次に適切な基質
を添加し、そして細胞に特異的に結合した抗体／酵素結
合体の存在を決定する。他の常用技法を用いるとともで
きる。

ＨＬＡＯタイプ分けのために特に興味ある検定法は、Ｍ
ｉｃｒｏ−ＥＩＡと称することができる。ミクロトレー
のウェルをペプチド、例えばポリーＬ−リジンによシ次
のようにしてコートする。やや上昇した温度（３０℃〜
５０℃）にて約０．１〜２時間、ペプチドの溶液中でイ
ンキュベートし、溶液をデカントし、そしてウェルを洗
浄する。ヒト白血球をウェルに導入し、トレイを遠心し
、そして希薄な緩衝化蛋白質溶液、例えば１％ＢＳＡ又
は１．２５チ粉末ミルク液を添加し、そしてトレイを例
えは４℃の冷室に０．２５〜４８時間貯蔵する。次に、
グレートを十分に洗浄する。

間接法と称する態様においては、抗原に対するモノクロ
ーナル抗体を添加し、混合物をインキュベートし、次に
十分に洗浄して非特異的に結合した抗体を除去する。酵
素ラベルに結合された、モノクローナル抗体に対する抗
体（抗−ＩｇＸ、ここでＸは一般にＭ又はＧである）、
特にＦ（ａｂ’　）２、を添加し、次に周囲温度にてイ
ンキュベートする。

通常、０．２〜２時間のインキュベーションで十分であ
る。他の方法として、モノクローナル抗体及び抗−Ｉｇ
Ｘの両者を混合し、そして−緒に添加することができる
。直接検定法のためには、モノクローナル抗体を酵素ラ
ベルに結合せしめ、抗−ＩｇＸは添加しない。ラベルさ
れた抗体を、ブロッキング剤を含む適切に緩衝化された
媒体、例えばＰＢＳ中１４ＢｓＡ中適当な濃度において
用いる。

抗体は、組織適合性のタイプ分けの目的に依存シテパネ
ルにグループ分けすることができる。血小板の適合性に
関する場合、Ａ及びＢ遺伝子座の対立遺伝子のすべてを
カバーするスーパータイプ及びオリゴタイプ抗体のノ９
ネルで十分である。従って、抗体Ｐ５，４及びＰＩ３．
１並びにＢＷ４をカバーする抗体（ＭＡｂＰ８５．１）
及びＢｗ６をカバーする抗体（ＭＡｂＰ３８．１及びＰ
７７．１）を使用することができる。

父系試験においては、ＨＬＡ　−Ａ及び−Ｂ対立遺伝子
をカバニする２５〜３０のモノクローナル抗体のパネル
によシ、９０％以上の信頼度をもって父系を排除するこ
とが可能になる〔例えば、Ｆａｍｉｌｙ　Ｌａｗ　Ｑｕ
ａｒｔｅｒｌｙ　、　１０　：（３）、　１９７６　：
１９７を参照のこと〕。移植のためには、クラス１（Ｈ
ＬＡ−Ａ、Ｂ）及びクラス［（ＨＬＡ−ＤＲ。

ＤＱ）の両者についてタイプ分げするために抗血清を使
用することができよう。ある種の疾患、例えばＨＬＡ−
関連疾患、例えば若年性糖尿病の罹患マーカーのために
は、ＨＬＡ−ＤＲ及びＤＱに対する抗体の例えば４種類
という小パネルで十分であろう。従って、抗体パネルの
サイズは特定の用途のために仕立てることができる。

組織適合性タイプ分けのために、この発明の抗体を含む
キットを使用することができる。この発明のモノクロー
ナル抗体は、それ自体として又は他の抗体との組合わせ
において、一般に凍結乾燥組成分として提供され得る。

ラベルに結合され得るか又は結合されない抗体と共に、
緩衝剤、例えば’Ｔｒ１ｇ、　＋７７酸、炭酸又は硼酸
緩衝剤、殺生物剤、不活性蛋白質、例えばウシ血清アル
ブミンを含めることができる。一般にこれらの材料は、
活性抗存在する。しばしば、活性成分を稀釈するために
不活性増量剤又は賦形剤が存在することが望ましく、こ
の場合賦形剤は全組成物の約１〜９９重量％で存在する
ことができる。この発明の抗体に結合する第２抗体が使
用される場合、この抗体はラベルに連結されそしてこの
発明の抗体と同様にして製剤化されるであろう。

この発明の抗体は他の方法、例えばアフィニティーク四
マドグラフィー、種々のＨＬＡ多型性抗原のＮ製、ある
抗原を含有する細胞の他の抗原を含有する細胞からの分
離（この分離は細胞変性東件等を用いることができる）
において使用される。

従って、この発明の抗体はインビトロ及びインビデの両
者において広範囲の用途を有する。

次に、例によシこの発明をさらに具体的に説明する。但
し、これによシこの発明の範囲を限定するものではない
。

実験 Ｂａ１ｂ／ｅ　、Ｃ５７Ｂ１／６　　又はそのＦ、子孫
の系統のマウスを、ヒト−リンポプラストイド細胞上に
存在するか又は免疫沈澱によシ濃縮された画分中に存在
するＨＬＡ抗原あるいはこれらの細胞から得られたＨＬ
Ａ抗原によシ免疫感作する。

アジュバントを伴うか又は伴わない皮下又は腹腔内注射
によシマウスを免役感作する。マウスに１〜５回の注射
を行い、そして最後の注射の後３日目に肺臓を摘出する
。

免疫感作されたマウスからの牌ＦｉＡＢリン／臂球を、
４０　％　（、ｗ／ｖ　）のポリエチレングリコール（
コダ、りＭＷ１４５０）及び記載されている標準的方法
（Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ　、前掲）を用い
てＮ５Ｉ−１又はＳ　Ｐ　Ｏ／　２骨髄腫細胞と融合せ
しめる。融合の後、細胞混合物をＨＡＴ培地（２０チの
ウシ血清、ｌＸｌ０　　Ｍヒポキサンチン、４Ｘ１０−
７Ｍアミノグチリン及び１．６Ｘ１０−５Ｍチミジンを
補充したＲＰＭＩ　−１６４０培地）に懸濁してバイブ
リド細胞の増殖について選択し、そして１〜３Ｘ１０６
糺胞／ｄの濃度で９６ウエルミクロカルチユアートレイ
に分配する。

適切な抗体を生産する細胞を、ヒト白血球の補体介在細
胞溶融を測定する検定法［：ＮＡＩＡＤ１９８０）］に
よシ、又はヒト白血球への結合を測定するエンザイムー
リンクドミクロイムノアッセイ（下記参照のこと）によ
り同定する。各ハイプリドーマセルラインは、フィーダ
ー細胞として同種胸腺細胞を用いる限界稀釈法による３
サイクロのクローニングによシ樹立される。

モノクローナル抗体蛋白質は、Ｓ、アウレウスのプロテ
ィンＡセファロース（ファルマシア）上でのアフィニテ
ィークロマトグラフィー、硫酸アンモニウム沈澱、又は
イオン交換クロマトグラフィーを用いて、常用手段によ
シ腹水から単離される。

腹水は、プリスタンの腹腔内注射によシ１〜４週間前に
準備した同種又はＦ１マウスの腹腔内でハイツリドーマ
細胞を増殖せしめることによシ得られる。モノクローナ
ル抗体のアイソタイプはＥＬＩＳＡによシ決定する。

細胞ノｆネル モノクローナル抗体の特異性は、１５０の個体からの１
９７２球の７９ネル、及び１６０個のＢリン／４’ブラ
ストイド細胞系のパネルの構成員に対する反応性を検定
することによシ決定する。１９７２球は末梢血から、Ｆ
ｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ上での密度匂配遠心、プラ
スチック上への付着、及びナイロンクールの通過によシ
得られ、そしてＢリンパ球は付着細胞をナイロンウール
から溶出することによシ得られる（　Ｄａｎｉｌｏｖｅ
ｇ等、　８ｔｈ　Ｉｎｔｅｒ　−ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｈ
ｌｓｔｏｃｏｍｐａｔｌｂｉｌｉｔｙ　Ｗｏｒｋｓｈｏ
ｐＮｓｗｓｌｅｔｔｅｒ　（１９７８）６：３：ｌｏ　
Ｂリンポプラストイド細胞系は、エプスタイン−パール
ウィルスによシ形質転換された末梢Ｂリンノ臂球から得
られた。さらに、各抗体を２５０〜１０００人の無作為
的に選択された提供者のパネルに対する特異性及び感受
性について検定した。

この検定法は、ＨＬＡ抗原に対する抗体を分泌するハイ
プリドーマを同定するための間接法において使用される
。この検定法はまた、ヒト細胞のＨＬＡタイプを決定す
るために既知モノクローナル抗体を用いる直接法又は間
接法においても使用される。

リン酸緩衝化塩溶液（ＰＢＳ）中ポリーＬ−リジンの１
μｉ／ｍｌ溶液５μｔを各ウェルに添加することによシ
テラサキ・ミクロトレイを調製する。別の方法として、
ヒト白血球に対する抗体（１μＩ／ｄの溶液５μｔ）を
各ウェルに加え、そしてプレートを４０℃建て１８〜２
４時間インキュベートすることもできる。

プレートを３７℃にで１時間インキュベートし、そして
浸漬及びデカンＨＣよｊ５ＰＢＳで洗浄する。

ヒト白血球、血清を含まないＲＰＭＩ　−１６４０培地
−洛夛１〜５　Ｘ　１０’細胞の懸濁液ｌμｔを各ウェ
ルに分配する。プレートを９＋１にて３分間遠心する。

０．２チのアジドを含むＰＢＳ中１％のウシ血清アルブ
ミン（ＢＳＡ）の溶液をプレートに加え、これを４℃に
て１〜４８時間、又は周囲温度にて１５分間貯蔵する。

抗体を添加する前にプレートをＰＢＳ及びＰＢＳ中１．
２５％粉末ミルクで洗浄する。

間接検定法においては、モノクローナル抗体をウェル当
Ｉ）１μを加える。室温にて１時装置いた後、プレート
を５回洗浄し、そしてホースラディツシュパーオキシダ
ーゼ（Ｉ（ＲＰ）に連結された抗−免疫グロブリンのＦ
（ａｂ’）２断片をウェル邑シ５μを加える。別の方法
として、モノクローナル抗体及び抗−免疫グロブリンの
両者を混合し、そして−緒に加える。次に、プレートを
室温にて３０〜６０分間インキュベートする。直接検定
法においては、ＨＲＰがモノクローナル抗体に連結され
、従って第２段階が不要である。ＨＲＰに連結された抗
体をアジドを含まないＰＢＳ中０−１％ＢＳＡの溶液中
に稀釈する。

抗体に上る処理の後、トレイを５回洗浄する。

ウェル中のＨＲＰ−抗体複合体の存在を、０，１Ｍクエ
ン酸ナトリウム１０．２Ｍリン酸ナトリウム中基質であ
る過酸化水素及び色原体である０ＰＤ（オルガノン・ダ
イアグノスチクス、西オランジ、ＮＪ）又はＡＢＴＳ（
ペーリンガーマンハイム拳バイオケミカルス、インディ
アナポリス、ＩＮ）の溶液の添加によシ可視化する。室
温にて３０〜６０分間インキュベートした仮の色の変化
がこれらのウェル中での白血球へのモノクローナル抗体
の結合を示す。

一ナル抗体の特異性の分析 リンホブラストイド細胞の膜蛋白質をラクトパーオキシ
ダーゼを用いて　　Ｉによ）ラベルする（　Ｖｉｔｅｔ
ｔａ等、　Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、　（１９７１）　１３
４：２４２〕。細胞を、０．５チのノニデットＰ−４０
を含有する緩衝液中で破砕し、そして対照抗体及び固相
イムノソルベントの添加の前後に遠心にょシ澄明にする
。モノクローナル抗体を細胞溶解物のアリコートに加え
、そして抗体及びラベルされた抗原の複合体をＳ、アウ
レウスのプロティンＡ又は固相に連結されたマウス免疫
グロブリンに対するラビット抗体を用いて沈澱せしめる
。十分に洗浄した後、ポリアクリルアミドゲル中Ｌａｅ
ｍｍｌｉ法電気泳動に必要とされるのと同じか又は０’
Ｆａｒｒｅｌｌ　の非平衡２次元ダル電気泳動法のため
に特定されているのと同じサンプル電気泳動緩衝液の添
加により、ラベルされた抗原を放出する。

各方法に要求されるようにして電気泳動を行う。

乾燥したグル中のラベルされた蛋白質をラジオオートグ
ラフィーによシ同定する。

腹水から単離されたモノクローナル抗体をＧｏｄｉｎｇ
の方法〔Ｇｏｄｆｎｇ　、　Ｊ　−１ｍｒｎｕｎｏｌ　
。

従ってＦＩＴＣに結合せしめた。分析されるべき細胞を
飽和量のＦＩＴＣ−結合抗体と混合し、そして４℃にで
３０分間インキュベートした。処理された細胞を洗浄し
、そして結合した抗体の量を、対数増幅器を有するＦＡ
Ｃ８Ｖ（ペクトンーデッケンソン）上で、試験抗体及び
対照抗体と共にインキエペートされた細胞の螢光強度（
平均モダル）比較することによシ評価した。

融合体の合計数の内の少数が、１又は限定された数のク
ラスＩ又はクラス■対立遺伝子産物上に存在するＨＬＡ
エピドーグに対して特異的なネズミモノクローナル抗体
をもたらした。ＨＬＡアロ決定基に対して特異的な抗体
を生産するクローンのリストを第１表（クラス■）及び
第２表（クラス■）に示す。　　　　　　　　　　　　
　　　　以下余白特開口ＨＧ２−２５９９４　　（１０
）ζ 直 「 田工田罵工悶二悶エエエ冒　エ　エ　　　　　１■ Ｔ又は８９７２球のＨＬＡタイプを決定するためにこれ
らの抗体のいくつをパネルに組合わせることができるか
を示す例を次の第３表、第４表及び第５表に示す。　　
　　　　　　　　　あ−ト余白ＨＬＡ特異性のタイプ分
けに使用される方法ＨＬＡ抗原の発現についてヒト−リ
ンパ球をタイプ分けするために使用される３種類の一般
的方法が存在する。第１の、そして現在最も使用されて
いる方法は補体依存細胞溶解である。第２はエンザイム
ーリンクドイムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）によシリンパ
球への抗体の結合を測定する検定法である。

第１の方法の要素を標準ホーマツ）　ＥＬＩＳＡ検定法
と組合わせてＨＬＡＯタイプ分けに適するミクロＥＬ　
Ｉ　ＳＡ検定法が開発された。第３の方法はリンパ球へ
の抗体の結合を測定するために螢光化合物を使用する。

フルオレッセインインチオシアナート及び螢光活性化セ
ルソーターを用いて対象抗体の特異性が分析された。

第１表中のすべての抗体がこれら３種類の検定法のそれ
ぞれにおいて試験され、そして同じ反応を与えた。これ
らの抗体のパネルを用いるヒトＴリンパ球のタイプ分け
の例を第３表に示す。第２表の抗体はまた、抗体４ＡＡ
７，１４３．１　、及び１４２１を除き２つの検定系に
おいて有効である。これら３種類の抗体は補体を固定せ
ず、従って検定法２及び３のためにのみ適箔である。幾
つかのモノクローナル抗体を使用してクラスＩｆ　ＨＬ
Ａ抗原についてＢリンパ球をタイプ分けした例を第４表
に示す。

第３表及び第４表のパネルは、オーバラップするがしか
し別個の一連のＨＬＡ抗原を定義するために選択される
一連のＩ（ＬＡモノクローナル抗体から成る。抗体のパ
ネルによる十結果及び−結果のマトリクスが試験された
個体におけるＨＬＡタイプの側渦てを可能にする。

モノクローナル抗体のパネルは、従来から使用可能であ
った常用のアロ抗血清パネルに対して幾つかの利点を有
する。

（１）　　これらの抗体は無限供給において入手可能で
ある。従ってこれらの特異性が一旦決定されれば追加の
特徴付けを必要としない。これに対して、組織のタイプ
分けが最近経産婦又は多数回輸血された患者から得られ
た血清を用いて行われる。ある１人の提供者からは限ら
れた量のみのこれらの試薬が入手可能である。従って、
これらの抗血清を常に新しいものと取シ換えることが必
要であシ、後者を先行する抗血清に対して標準化しそし
てチェックしなけれはならない。

（２）　　このようにして得られる抗体の不均一性のた
め、交差反応性、及び特異性を異にする多数の抗体によ
る汚染が大問題である。モノクローナル抗体パネルの場
合、特異性の汚染を無視して個々のクローン化抗体を高
濃度で使用することができる。

（３）アロ抗血清は通常非常に低い力価を示すので、反
応混合物中で一層高い濃度を必要とする。

これは、細胞表面への蛋白質の非特異的結合に寄与する
ことができ、そして補体依存検定法において誤まった陰
性結果（ｆａｌｅ　ｎｅｇａｔｉｖ＠）　ｉもたらす。

さらに、細胞表面に蛋白質が非特異的に結合する可能性
があるため、これらの血清は結合検定法においてあまシ
有用でない。これに対して、モノクローナル抗体は数千
のタイターをもたらすように精製及び濃縮され得る。

（４）　　これらの抗体の精緻な特異性のため、種々の
検定ホーマットにおける広い用途を有する。モノクロー
ナル抗体パネルの使用によシ、従来の抗体パネルによっ
ては不可能であった種々の検定法を用いることが可能と
なる。これらの方法には自動化された螢光法、ＥＬＩＳ
Ａを基礎にした方法、及びフローサイトメトリーが含ま
れるが、これらに限定されない。

以上、この発明を具体的に説明したが、これによってこ
の発明の範囲を限定するものではない。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、５．４、１６．１、１７．１、１１４．１、１４２
   ．１、１４５．２、１５９．２、２００．１、２１０．
   １及び４ＡＡ７と称されるモノクローナル抗体の１つと
   同一の抗体特異性を有するモノクローナル抗体。 ２、異るアロ抗原を識別することができる少なくとも２
   種類のモノクローナル抗体を含みそして特許請求の範囲
   第１項に記載の少なくとも１種類のモノクローナル抗体
   を有する組織適合性タイプ分け用パネル。 ３、前記モノクローナル抗体がネズミ由来のものである
   特許請求の範囲第２項に記載のパネル。 ４、前記モノクローナル抗体がネズミ由来のものである
   特許請求の範囲第１項に記載のモノクローナル抗体。 ５、前記抗体がクラスＩｇＭ又はＩｇＧである特許請求
   の範囲第１項に記載のモノクローナル抗体。 ６、検出可能なシグナルを提供することができるラベル
   に結合した特許請求の範囲第１項に記載のモノクローナ
   ル抗体。 ７、前記ラベルが螢光物質又は酵素である特許請求の範
   囲第６項に記載のモノクローナル抗体。 ８、第１表又は第２表に記載のモノクローナル抗体から
   成るモノクローナル抗体。 ９、異なるアロ抗原を識別するモノクローナル抗体を含
   みそして特許請求の範囲第８項に記載の少なくとも２種
   類のモノクローナル抗体を有する組織適合性タイプ分け
   パネル。 １０、検出可能なシグナルを提供することができるラベ
   ルに結合した特許請求の範囲第８項に記載のモノクロー
   ナル抗体。 １１、前記ラベルが螢光物質又は酵素である特許請求の
   範囲第１０項記載のモノクローナル抗体。 １２、ヒト細胞を特許請求の範囲第８項又は第１０項の
   いずれかに記載のモノクローナル抗体と混合し、そして
   複合体の形成を検出することを含んで成るＨＬＡタイプ
   分け方法。 １３、（１）ヒト白血球懸濁液を結合を増強するために
   コートされたウェルに導入し； （２）該細胞を収容したウェルを遠心し； （３）上清を除去しそして該細胞を収容したウェルを洗
   浄し； （４）アロ抗原に特異的なモノクローナル抗体を少なく
   とも１個のウェルに加え、この場合異るモノクローナル
   抗体を異るウェルに入れ；そして、 （５）該ウェルを洗浄して非特異的に結合したモノクロ
   ーナル抗体を除去し； そして、酵素と結合したモノクローナル抗体を用いるこ
   とにより、又は前記複合体に結合する、酵素に結合した
   リセプターを添加することにより、前記複合体の形成を
   検出し、そして特異的に結合した酵素の存在を検出する
   ； 段階を含んで成る特許請求の範囲第１２項に記載の方法
   。 １４、前記モノクローナル抗体が補体介在細胞溶解を許
   容するサブクラスのものであり、そして複合体の形成を
   補体介在溶解によって検出する特許請求の範囲第１２項
   に記載の方法。 １５、検出可能なシグナルを提供するラベルに結合した
   第１表又は第２表中の少なくとも１種のモノクローナル
   抗体を含むか、又は検出可能なシグナルを提供するラベ
   ルに結合した、前記モノクローナル抗体に対する抗体を
   含む、特許請求の範囲第１２項に記載の方法に使用する
   ためのキット。 １６、特許請求の範囲第１項に記載のモノクローナル抗
   体組成物の少なくとも１つの鎖をコードする、インビト
   ロ培養が可能な宿主中のネズミ遺伝子。