JPH03502401A

JPH03502401A - ヒト抗Ｒｈ（Ｄ）モノクローナム抗体

Info

Publication number: JPH03502401A
Application number: JP63507469A
Authority: JP
Inventors: ド、バラ、ブラッドリー，ベンジャミン、アーサー; ドイル，アラン; カンペル，ベリンダ　メアリー
Original assignee: セントラル、ブラッド、ラボラトリーズ、オーソリティー
Priority date: 1987-09-18
Filing date: 1988-09-16
Publication date: 1991-06-06
Also published as: GB8722020D0; AU2383288A; DK69690D0; DK69690A; EP0378572A1; WO1989002443A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】ヒト抗Ｒｈ　（Ｄ）モノクローナル抗体本発明はヒト赤血球のＲｈ　（Ｄ）抗原に対するヒトモノクローナル抗体に関する。特に本発明は、正常Ｒｈ（Ｄ）抗原のみならずこの抗原の重要な変異体をも検出するために用いられるＩｇＧ１サブクラスのこのような抗体に関する。

いわゆるＲｈ血液型系の抗原の中では、Ｒｈ　（Ｄ）抗原が対応抗体保有患者への輸血後における最も重篤な反応の一部に関与している。Ｒｈ　（Ｄ＋）血液をうけた抗Ｒｈ　（Ｄ）保有Ｒｈ　（Ｄ−）個体はＲｈ　（Ｄ）表現型不適合のせいで実質的赤血球（ＲＢＣ）破壊をうけやすいことから、ドナー及び受血者の血液は抗Ｒｈ（Ｄ）抗体との凝集試験によりＲｈ　（Ｄ＋）又はＲｈ　（Ｄ−）としてルーチンに分類される。ＲＢＣのＲｈ表現型は普通更にフィッシャー・レース（Ｆｉｓｈｅｒ−Ｒａｃｅ）系に基づき定義されるが、これはＲｈ抗原の遺伝は非常に近接して結合した座で作用する３対の対立遺伝子Ｃ−ｃ　ｓ　Ｄ　−ｄ及びＥ−ｅで決定されるという仮定に基づいている。この理論によれば、ヒトは彼の両親の各々から３つのＲｈ遺伝子、即ち（１）Ｃ又はＣ，（２）Ｄ又はｄ、（３）Ｅ又はｅの一組を受は継ぐ（’ｄ抗原はまだ同定されていないが、但し記号“ｄｏはＤ抗原を産生じないＤ遺伝子と対立する遺伝子の存在を示すために用いられている）。例えば、Ｒｈ　（Ｄ＋）者は片親からＣＤｅ及び他方からｃｄｅを受は継いでいる。イギリス人をフィッシャー・レース系に関して調べた場合に最も共通するＲｈ遺伝子組合せの割合が、特に言語上用いられる“短記号“と共に下記第１表で示されている。

第１表イギリス人に関する共通Ｒｈ遺伝子の割合短記号　　　　　　　ＣＤＥ名　　　　　割合（％）ｒ　　　　　　　　　　ｃ　ｄ　ｅ　　　　　　　　８ｇ、９Ｒ２ｃ　Ｄ　Ｅ　　　　　　　　１４．ＩＲＯｃ　Ｄ　ｅ　　　　　　　　２．６Ｒ１ｖ　　　　　　　　Ｃ”Ｄｅ　　　　　　　ｌＪｒ’　　　　　　　　　ｃｄＥ　　　　　　　　１．２ｒ″　　　　　　　　Ｃｄ　ｅ　　　　　　　　Ｏ，０１何年にもわたる拡大調査にもかかわらず、フィッシャー・レース系はＲｈ系で観察されたすべての反応を説明する上で十分ではなかった〔モリソン、　Ｐ、　　Ｌ、　。

１９８３年、臨床医学における輸血、第７版、ブラックウェル・サイエンティフィック、オックスフォード（Ｍｏ１１１ｓｏｎ、Ｐ、Ｌ、、（１９１１８）　Ｂｌｏｏｄ　Ｔｒａｎｓｆｕｓｌｏｎ　ＩｎＣ１１ｎｉｃａｌ　Ｍｅｄｉｃｌｎｅ、７ｔｈ　ｅｄｎ、、ＢＩａｃｋｗｅｌｌ　５ｃｌｅｎｔｌｆｉｅ。

０ｘ４ｏｒｄ）　）。それにもかかわらず、世界保健機構では単純性及び画一性の理由からこの命名法が世界的に採用されるべきであると推奨してきたため、以下で示されるすべてのＲｈ遺伝子型は慣用的フィッシャー・レース系に基づき定義される。

ＲＢＣのＲｈ型判定に関する抗Ｒｈ　（Ｄ）抗体の必要性に加えて、このような抗体は新生児溶血症（ＨＤＮ）を防止するためＲｈ　（Ｄ−）母親の受動免疫にとっても非常に必要とされる。この症状は、妊娠中胎盤を通過して胎児ＲＢＣ破壊を引き起こすＩｇＧ抗Ｒｈ　ＣＤ）抗体に起因してＲｈ　（Ｄ）抗原に既に感作されたＲｈ　（Ｄ−）母親の新生Ｒｈ　（Ｄ＋）児で生じる。Ｒｈ　（Ｄ）抗原によるＲｈ　（Ｄ−）母親の感作は、母親の循環に入って母親の免疫系により認識されるある胎児ＲＢＣのせいで第−Ｒｈ　（Ｄ＋）子の誕生時に生じたのであろう。ＨＤＮの発生率を低下させるため、母親の循環に入ったいかなるＲｈ　ＣＤ＋）ＲＢＣも速やかに除去されるようＲｈ（Ｄ＋）児の誕生直後Ｒｈ　（Ｄ −）母親に抗Ｒｈ　（Ｄ）抗体を投与することがイギリス及び他の多数の国におけるルーチン的実務である〔モリソン、Ｐ、Ｌ、。

１９８３年、前掲；レーロス・ジュニア、　Ｒ，Ｋ。

（Ｌａｒｏｓ　Ｊｒ、、Ｒ，に、）、　　１９８６年、′妊娠中の血液型疾患１中における“胎児赤芽球症°、第第７章箱第１０３〕。

現在、ＲＢＣのＲｈ型判定及びＲｈ　（Ｄ−）母親の受動免疫の双方における使用のための抗Ｒｈ　（Ｄ）抗体は、妊娠中に免疫された女性ドナーから又は免疫された男性ボランティアから直接主に得ている。しかしながら、Ｒｈ　（Ｄ−）女性へのヒト抗Ｒｈ　（Ｄ）免疫グロブリンの産後予防投与プログラムの成功で、自然アロ免疫女性の数に関し著しい減少を招いた〔アーバニアック、Ｓ。

Ｊ８．　“新生児のＲｈＤ溶血症：変化する状況”、プリテラシュ・メディシナル・ジャーナル、１９８５年。

第２９１巻、第４−６頁（Ｕｒｂａｎｌａｋ　、Ｓ、Ｊ、。

ＲｈＤ　ｈａｅｍｏｌｙｔｌｃ　ｄｉｓｅａｓｅ　ｏｒ　ｔｈｅ　ｎｅｗｂｏｒｎ：ｔｈｅｃｈａｎｇｉｎｇ　５ｃｅｎｅ’　、Ｂｒ１ｔ１ｓｈ　Ｍｅｄｌｃｌｎａｌ　Ｊｏｕｒｎａｌ（１９８５）２９１．４−８））。更に、Ｒｈ　（Ｄ十）ＲＢＣによる個体の意図的な免疫には、いかなるＲＢＣ輸血をうけた場合にも共通するリスク、例えば肝炎ウィルス及びＨＩＶの移入のリスクを伴う。したがって、診断及び治療双方の目的のためヒトモノクローナル抗Ｒｈ　（Ｄ）抗体を得ることに多大な関心が集まっているのである。

上記のようにルーチンの血液試験において、血液型は抗Ｒｈ　（Ｄ）の凝集試験で示されるようにＲＢＣ上のＲｈ　（Ｄ）抗原の見掛上の存在又は非存在に基づきＲｈ（Ｄ＋）及びＲｈ　（Ｄ−）に分けられる。しかしながら、見掛上Ｒｈ　（Ｄ−）血液を有するヒトの少数は、このようなルーチン試験において抗Ｒｈ　（Ｄ）により直接凝集されないが、Ｄ型判定試験が選択された抗Ｒｈ　（Ｄ）試薬を用いて間接的抗グロブリン試験で実施された場合には反応するＲＢＣを有している。こうして同定された細胞はＤ　と表示される。Ｄ　表現型の割合は全体で約０．２％、コーカサス人中０．６％及び全Ｒｈ　（Ｄ−）妊娠女性巾約１．５％である。少なくとも３つの異なるメカニズム、即ち（１）完全Ｒｈ　ＣＤ）抗原の一部の遺伝的欠如、（２））ランス位置におけるＣによるＤの抑制に関する遺伝子相互作用及び（３）弱抗原を産生ずるＤ遺伝子が、Ｄ　表現型の発現に関与しているのであろう。

１９５０年代初期、Ｒｈ　（Ｄ＋）血液の輸血後又はＲｈ　（Ｄ＋）児を出産した妊娠の後、Ｄｕ表現型の個体における抗Ｒｈ　（Ｄ）の存在に関する報告が最初にみられた。血液がＲｈ　（Ｄ＋）に分類された一部の個体においてＲｈ　ＣＤ）抗原の一部がＲＢＣから欠落していることが、その検切らかになった。輸血又は妊娠により完全Ｒｈ　（Ｄ）抗原を有するＲｈ　（Ｄ＋）ＲＢＣと接触された場合、不完全Ｒｈ　（Ｄ）抗原をＲＢＣ上に有するヒトは彼等が欠如するＲｈ　（Ｄ）抗原部分に対するアロ抗りを産生ずることができる。このような個体の血液は、ＲＢＣがルーチン抗Ｒｈ　（Ｄ）試薬と直接反応する場合にはＤ変異体と呼ばれ又は細胞が間接的抗グロブリン技術でのみ反応する場合にはＤｕ変異体と呼ばれる。

Ｒｈ　（Ｄ＋）ＲＢＣを有する患者でアロ抗Ｒｈ　ＣＤ）が産生されるという観察から、用語“Ｄモザイク°の共通の用法としてその完全天然型のＲｈ　ＣＤ）抗原を表すようになった。ルーチン抗Ｒｈ　（Ｄ）試薬では、Ｄモザイクの一部を欠＜ＲＢＣをすべてのＤ成分を有するＲＢＣから通常区別しえない。

Ｄ変異体表現型はチベット（Ｔｌｐｐｅｔｔ）及びサンガー（Ｓａｎｇｅｒ）　（ボックス・サンプ（Ｖｏｘ、Ｓａｎｇ）、　　１９６２年。

第７巻、第９−１３頁）により類別された。この系はＤ−及びＤｕ変異体個体からのＲＢＣ及び血清の相互作用に基づいている。６つのカテゴリー（下記第■表参照）に大別され、小分類がカテゴリー■、■及びＶで既に認められている。カテゴリー！及び■は、それらが現在単一のサブグループとして通常考えられるほど多数の類似性を有することが判明した。

第■表抗Ｒｈ　ＣＤ）のＤ−又はＤｕ陽性血液に関するチベット及びサンガーカテゴリーカテゴリー　　　　種　起　源　　　　通常のノ１プロタイプＩ　　　　　白人　　　　　　　　　　　　　　ＤＣｅ■ Ｈａ　　　　　黒人ｍｂ　　　　　通常黒人　　　　　　　　　　　Ｄｃｅｍｃ　　　　　白人 ■ａ　　　　　大部分黒人、一部白人ＩＶｂ　　　　　白人　　　　　　　　　　　　　　ＤｃｅＶａ　　　　　黒人及び白人ｖｂ　　　　　白人　　　　　　　　　　　　　　ＤｕＣｅＶｃ　　　　　黒人及び白人 ■　　　　　はぼすべて白人　　　　　　　　ＤｕＣｅ一方、さほど用いられないが、ウイーナ−（Ｗｉｅｎｅｒ）による分類ではローマ数字の代わりに文字ＡＳＢ、Ｃ，Ｄを用いている。２つの系間に直接の相互関係はないが、ＤＢ及びＤｖＩは互換性があると通常考えられる。

人口中におけるＤ及びＤｕ変異体個体の割合は比較的低いけれども、輸血又は妊娠による非変異体Ｒｈ　（Ｄ＋）細胞との接触のせいで現実的な抗Ｒｈ　（Ｄ）形成のリスクを潜在的に有するこれら血液型の個体の総数は決して微々たるものではない。更にＲｈ　（Ｄ＋）又はＤ　児を生んだＲｈ　（Ｄ−）女性に加えて、Ｒｈ　（Ｄ＋）児を生んだＤ　変異体女性もＨＤＮのリスクを低下させるため産後抗Ｒｈ　ＣＤ）治療から利益を得るであろう〔ホワイ）、　ｃ、　Ａ、　　ら、１９８３年、アメリカン・ジャーナル・オブ・オブステトリカル・キネコロジー６第１４５巻。

ｊ＠１０６９−１０７３頁（Ｗｈｉｔｅ、Ｃ，Ａ、ｅｔ　ａｌ、（１９ｇ８）Ａｍｅｒｌｃａｎ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｒ　０ｂｓｔｅｔｒｌｃａｌ　Ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｙ、１４５゜１０８９−１０７８））　、　Ｄ及（ＦＤ　ＵＳＩＸ体ＲＢ　Ｃヲ区別Ｌ　ウ；Ｅｒ抗血清は広く入手しえない。したがって、Ｄ及びＤ　変異体ＲＢＣに関しである範囲の結合特異性を有する抗Ｒｈ（Ｄ）モノクローナル抗体の供給は、このような細胞を有する個体（特に予防的抗Ｒｈ　（Ｄ）治療の適切な候補者であるＤ又はＤｕ変異体妊娠女性）の更に容品な確認及び類別化を可能にし並びにＲｈ　（Ｄ）抗原複合体に関する構造情報を更に得る上で有用とみられる。

ヒトモノクローナル抗Ｒｈ　（Ｄ）抗体産生は既に：（ａ）　抗Ｒｈ　（Ｄ）陽性ドナーの８９２８球に由来するエプスタイン・バール（Ｅｐｓｔｅｌｎ　Ｂａｒｒ）ウィルス形質転換Ｂリンパ球細胞系（以下、ＥＢＶ形質転換ＬＣＬと称される）を直接クローニングする【英国特許出願第２１２７４３４号明細書；クロフォードら、１９８３年、ランセット第１巻、第３８６−３８８頁（Ｃｒａｖｆｏｒｄ　ｅｔａＪ、（１９８３）　Ｌａｎｃｅｔ、１，３８８−３８８）　　；及びペアーら。

１９８６年、イムノロジー・レターズ、第１３巻。

第１３７−１４１頁（Ｐａｌｒｅ　ｅｔ　ａｌ、（１９ｇＢ）　ＪｓｓｕｏｏｌｏｇＦＬｅｔｔｅｒｓ、１１１，１８７−１４１）参照〕　；（ｂ）抗Ｒｈ　ＣＤ）産生ＥＢＶ形質転換ＬＣＬをマウス、マウス−ヒト又はヒトミエローマ細胞系と融合させて形成されるハイブリドーマ細胞系をクローニングする〔同時係属英国特許出願第８７０９７４８号明細書−トンプソン（Ｔｈｏｓｐｓｏｎ）ら、１９８６年、イムノロジー、第５８巻、第１５７−１６０頁；及び欧州特許出願第１６２９１８号明細書参照〕　；又は（Ｃ）ヒトＬＣＬと免疫Ｂ細胞との励合〔ローウニ（Ｌｏｖｅ）ら、１９８６年、ボックス・サング、第５１巻。

第２１２−２１６頁〕　；により達成された。

しかしながら抗Ｒｈ　（Ｄ）陽性ドナーからのＥＢＶ形質転換ＬＣＬをクローニングすることにより、我々は以前に開示されたいずれの抗Ｒｈ　（Ｄ）モノクローナル抗体試薬の場合でも示されていない特に有用な結合特異性スペクトルを有するＩｇＧクラスのモノクローナル抗Ｒｈ　（Ｄ）抗体を得ることができた。

本発明によれば、我々は下記の本質的特徴：（ａ）Ｒｈ血液型系のＣ，ｃＳＥ又はｅ抗原ではなくＲｈ　（Ｄ）抗原に対して活性を示す；（ｂ）ＩｇＧ１タンパク質である；（ｃ）にＬ鎖を有する：（ｄ）アロタイプＧ１ｍ　（１，２，１７）に属する；Ｖ　　　　丁ａｒ　　　　　ＶＩ　　　　　　　Ｂ（ｅ）　Ｄ　　ｓ　Ｄ、　Ｄ　　及びＤ　変異抗原に対して活性を示す；及び（ｆ）ＩＡＧ試験において非パパイン処理り■細胞と実質上非反応性である；を有するヒトモノクローナル抗体及びその抗原結合性断片を提供する。

しかも本発明のモノクローナル抗体は、ＩＡＧ試験でＤ　及びパパイン処理ＤＩｖＲＢＣに対して活性を示しかつｉＮ抗原に対して不活性であることが示された。

慣用的凝集試験でＤ陽性又はＤ　として分類されるが但し抗りを産生しうる個体の中では、高率でＤＶｌ又はＤＢ変異抗原を有することが確立されていた〔モリラン。

Ｐ、、Ｌ、、１９８３年、　“臨床医学における輸血“、第８章、第３３９頁〕。本発明の抗体は重要なことにこのような個体をＲｈ　（Ｄ＋）として分類しうるばかりか、いくつかの他の重要なり変異抗原とも結合しうる。このようなモノクローナル抗体はＲＢＣをＤ陽性、Ｄｕ又はＤ陰性として分類するためのルーチン抗り試薬として使用可能であり、更にＤＩｖ型の個体を確認する上での用途も有している。

好ましくはＲｈ型判定で使用の場合、本発明の抗Ｒｈ（Ｄ）モノクローナル抗体は、抗ＤＩＶ活性を含めた１以上の付加的結合特異性を有する更に１種以上の抗ＲｈＣＤ）モノクローナル抗体、例えば英国特許出願第８７２２０１８号の優先権を主張する本出願と同日付の我々の同時係属国際特許出願におけるＩｇＧ１抗Ｒｈ　（Ｄ）モノクローナル抗体又は英国特許出願第８７２２０１９号の優先権を主張する本出願と同日付の我々の同時係属国際特許出願におけるＩｇＧ３抗Ｒｈ　ＣＤ）モノクローナル抗体と混合されるが、上記出願の内容は参考のため本明細書に組込まれる。このため例えば本発明の抗Ｒｈ（Ｄ）モノクローナル抗体、特に以下で８７と称される細胞系のモノクローナル抗体は、下記結合特徴＝（ａ）Ｒｈ血液型系のＣ％ｃ、Ｅ又はｅ抗原ではなくＲｈ　ＣＤ）抗原に対して活性を示す；（ｂ）間接的抗グロブリン試験でＤｕ細胞に対して活性を示す：ＶＶ（ｃ）Ｄ、Ｄ　　及びｐＴＪｌＦ変異抗原に対して活性を示す；及び（ｄ）ＤＶＩ及びＤＢ変異抗原に対して不活性である：を有するＩｇＧ１又はＩ　ｇＧ３抗Ｒｈ　ＣＤ）モノクローナル抗体、例えば寄託されたＥＢＶ形質形質転換９疎３０９１６０５及びＥＣＡＣＣ　　８６０９１６０６のモノ合される。

本発明のモノクローナル抗体は、抗Ｄ　活性の弱い又はない、即ち慣用的凝集試験でＤ　細胞をＤ陰性細胞から信頼性をもって区別しうるにはこのような細胞に対して不十分な活性であるＩｇＭ抗Ｒｈ　（Ｄ）を更に含有した抗Ｒｈ　ＣＤ）型判定試薬における使用にとっても特に価値がある。このような組合せ抗Ｒｈ　ＣＤ）試薬は下記抗体成分を含有している：（ａ）以下で定義されるＩｇＭモノクローナル抗体、好ましくは特に欧州特許出願公開第２５１４４０号明細書の主題をなす寄託されたハイブリドーマ細胞系ＭＡＤ−２（ＥＣＡＣＣ８６０４１８０３号）及びＦＯＭ−１（ＥＣＡＣＣ８７０２１３０１号）のモノクローナルＩｇＭから選択されるＩｇＭモノモノーナル抗Ｒｈ（Ｄ）；（ｂ）本発明の抗体、特に以下でＢ７と称される細胞系のモノクローナル抗体；及び（ｃ）混合試薬が同一の試験でＤｕ、ＤＩｖｌＤｖ及びＤｖＩ細胞と反応するように間接的抗グロブリン試験でＤｕ赤血球との活性を個別的に示す更に１種以上のＩｇＧモノモノーナル抗Ｒｈ　（Ｄ）抗体。

Ｒｈ型判定が上記（ｃ）で定義される結合能力を有したこのような試薬で行われる場合、Ｄ陽性細胞は最初にＩｇＭ抗Ｒｈ　（Ｄ）で直接凝集される。次いで残りの非凝集細胞（見掛上り陰性）は抗グロブリン試験用の慣用的クームス（Ｃｏｏ■ｂ’ｓ）試薬の添加により真のＤ陰性及びＤｕ細胞に分けられるが、その場合１ｇＧ抗体に結合するＤｕ細胞は凝集されるため区別される。

本発明のモノクローナル抗Ｒｈ　ＣＤ）抗体は、モノクローナル抗体の産主に関して公知の常法により、特に必要な抗体に関する上記特徴を有した抗Ｒｈ　（Ｄ）免疫グロブリンの分泌に基づき選択されるＥＢＶ形質転換ヒトＢリンパ球の培養により得ることができる。こうして得られた培養上澄は、本発明の特徴を有している。

我々は上記のようなＩｇＧ１抗Ｒｈ　（Ｄ）モノクローナル抗体を産生ずるクローニングされたＥＢＶ形質転換リンす球細胞系３つについて今や詳細に研究した。これらは以下でＢ７、Ｂ８及びＢ９と称される。これらすべてのクローニングされた細胞系は、単独の抗Ｒｈ　（Ｄ）ドナーの末梢８９２８球から出発し、下記ステップを実施することにより得られた：（１）末梢８９２８球をＥＢＶで感染させ；（２）１０％（Ｖ／Ｖ）フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）で補充されたＲＰＭ１１６４０培地中でＥＢＶ形質転換細胞を培養し；（３）３〜４週間隔で４回ＤｖＩＲＢ　Ｃとロゼツト化させることにより抗ＤＶＩ産生細胞を豊富化させ；及び（４）所望のＤ変異体特異性のある抗Ｒｈ　ＣＤ）を産生ずる細胞をクローニングする。

１０％（Ｖ／Ｖ）無マイコプラズマ牛脂児血清、０６２■／ｍｌアルギニン及びマイコプラズマ増殖を予防する抗生物質で補充されたＲＰＭＩ　１６４０培地を用いた連続培養において、上記の具体的細胞系は高度に安定であって、濃縮必要性のないＲｈ型判定での使用に適した培養上澄を生じることが判明した。実際には、これらの培養上澄は使用上希釈してもよい。

上記第■表は、上記具体的クローンの連続培養からの未処理上澄に関する間接的抗グロブリン（ＩＡＧ）試験（低イオン強度塩水中３％ＲＢＣ）の結果について示している。凝集の程度は、常法に従いスケール０〜６に等級分けされた。

第Ｈａ表８７　　　　８８　　　　　Ｂ９培養上澄　　低イオン強度塩水中３％ＲＢＣに対する上澄のＩＡＧ反応性（等級二〇〜６）ＲＢＣ表現型ｒ’　ｒ　　　　　　　　０　　　　　０　　　　　０ｒｒ　　　　　　　　　Ｏ００第ｍｂ表はモノクローナル抗体Ｂ７に関するデータについて更に示している：ＩＡＧ力価　ｖｓ　　ＲＩ　Ｒ１−２５８ＩＡＧ力価　ｖｓＲＢｒ　　　　　＝１２８微量滴定　　ｖｓ　　ＲＩＲ２＝　ｌＸｌ０６抗Ｒｈ　（Ｄ）　　　　　　　　　　−３，３１Ｕ／ｍ１１　ｇＧ　　　　　　　　　　　　　　＝　０．８μｇ／ｍｌ試験された本発明のモノクローナル抗体は表現型ＲｒＧ−１ｈｒ　　−１ＲＩＲ２及びＲ２Ｒ２のＲＢＣと反応するが、但しｒ’　Ｇｒ、ｒ”％ｒＧＳｒ　−ｓｒ。

ｈｒＢ−１「　　ｒ及びＲｈ３３＋とは陰性であることが更に判明した。

本発明の更にもう１つの面によれば、我々は本発明のモノクローナル抗Ｒｈ　（Ｄ）免疫グロブリンの水性溶液が用いられるＲＢＣのＲｈ型判定法を提供する。

七ツクローナル免疫グロブリンは、直接又はより一般的には希釈後用いられる培養上澄中に含有されることが好ましい。

前記のように、本発明のＩｇＧ１抗体を異なる特異性の抗Ｒｈ　（Ｄ）モノクローナル抗体の１種以上、例えば更に抗ＤＩｖ活性を有するＩｇＧ抗体と混合することが望ましい。適切な希釈剤としては、有利には牛血清アルブミン及びツイーン（Ｔｖｅｅｎ）　８０又はメチルセルロースのような界面活性剤又は懸濁化剤を含有した生理塩水又はすン酸緩衝液がある。

本発明のモノクローナル抗体は、ＨＤＮの産後防止用の予防試薬の供給という用途も有している。このため本発明のもう１つの面によれば、我々はＲｈ　（Ｄ＋）児の誕生後Ｒｈ　（Ｄ−）　、Ｄ又はＤｕ変異体母親の受動免疫用に下記のようなモノクローナルＩｇＧ１抗体を提供する。通常この目的のためには、本発明のモノクローナル抗体は、異なる特徴を有する更に１種以上の抗Ｒｈ　（Ｄ）モノクローナル抗体、例えば１ｇＧ３サブクラスの及び／又はＤｒＶ細胞に対して活性を示しうる１種以上の杭用に適した本発明の抗体無菌溶液は、いずれかの生理学上許容される水性媒体、例えば等張リン酸緩衝液又は血清で処方される。一方、このような抗体は使用前に再調整される凍結乾燥処方剤として供給してもよい。

上記のＥＢＶ形質形質転換９疎８ス、ボートン舎ダウンのヨーロピアン・コレクシ１ン・オブーアニマル拳セル・カルチャーズに受理ＮＩＥＣＡＣＣ　　８６０９１６０３号として１９８７年９月１６日付で寄託された。

この寄託細胞系の産生及びその連続培養上澄の同定特徴に関する詳細は、下記非制限例の例１で示されている。

例１用いられたドナーは、最初１９６６年に輸血で免疫され、以後６回追加免疫され、彼の血清抗Ｄレベルが３　１　８　Ｉ　Ｕ／ｍｌになった１９８５年に“バフィーコート。

分画（白血球）を贈与する１３日前最後に追加免疫された男性であった。

（ｂ）細胞系の確立選択されたドナーの末梢血単核細胞をリンホプレブ（Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ）　にニガード社（Ｎｙｅｇａａｒｄ　ａｎｄ　Ｃｏ．））で分離し、ＥＢＶ　（濾過された無マイコプラズマＢ９５−８細胞系からの培養上澄１ｍｌ／１０７細胞）の存在下３７℃で１時間インキエベートし、リン酸緩衝液（Ｐ　Ｂ　Ｓ）で洗浄した。一部をプロメライン処理０ＲＩＲ２（ＣＤｅ／ｃＤＥ）ＲＢＣでロゼツト化することにより表面抗Ｒｈ　（Ｄ）陽性リンパ球に関して豊富化し、しかる後１％（Ｖ／Ｖ）フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）で補充されたリンパ芽球細胞培地〔１０％（Ｖ／Ｖ）無マイコプラズマ牛脂児血清（Ｆｅ２）　、０．２■／　ｍｌアルギニン、１００■υ／ｍｌペニシリン（グラクツ（Ｇｌａｘｏ）　）、５０μｇ　／　ｍｌストレプトマイシン（グラクツ）、２５１０７ｍ１ポリミキシン（グラクツ）、２５μｇ／ｍｌカナマイシン（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）　）　、２　０μＩ／ｍｌフンギシン（スクイブ（Ｓｑｕｉｂｂ））　、２　５　ｕ　ｇ　／ｍｌ硫酸ゲンタマイシン（シグマ（Ｓｉｇｍａ＞　）及び２０μｇ／ｍｌトロビシン〔アツブジ日ン（υｐＪｏｈｎ））を含有したＲＰＭ１１６４０培地〕を用い２ｍｌウェル中１．０ＸＩＯ６細胞／ｍｌで培養した。

次いで、すべての培養物を５％Ｃ０２、９５％湿空気中３７℃でインキユベートした。培地変更を３〜４日毎に行い、３週間の培養後細胞を５０ｍ１フラスコに移した。

細胞系を３〜４週間隔でＲ　１■ｒ細胞で４回ロゼツト化することにより豊富化させた。

（ｃ）クローニング細胞をマウス腹膜マクロファージの供給細胞層上平底９６ウエルプレート中１及び５細胞／ウエルで限定希釈下培養した〔ドイルら，１９８５年，ヒニーマン・イムノロジー、第１３巻，第１９９−２０９頁（Ｄｏｙｌｅ　ｅｔ　ａｌ。

（１９８５）　Ｈｕｍａｎ　１１１ｕｎ０１０ｇｙ．１３．１９９−２０９）　）　＠培養物に１週間１回基質添加したところ、３〜４週間後抗りに陽性のクローニング細胞が生じた。

（ｄ）培養上澄中における抗り活性及びＩｇＧの定量上澄中における抗り活性は、オートアナライザーでイギリスナシロナルスタンダードに対して定量された。

ＩｇＧの定量的評価は、ＥＬＩＳＡＣウェイクフィールドら．クリ二カ・キミ力・アクタ、１９８２年。

第１２３巻，第３０３−３１０頁（ｗａｋｅｒｌｅｌｄ　ｅｔ　ａｌ．。

Ｃ１１ｎｉｃａ　Ｃｈｌｓｌｃａ　Ａｃｔａ（１９８２）　１２３．３０３−３１０）の方法の修正〕により各上澄毎に少なくとも８回の測定で行われた。

コーティング抗体〔アフィニティー精製ヤギ抗ヒトＩｇＧ（シグマ）〕をｐＨ９．６の０．０５Ｍ炭酸緩衝液中１／２００で用いた。上澄及びスタンダード〔精製ヒトＩｇＧ（シグマ）〕をＲＰＭＩ　１６４０＋ｌＯ％ＦＣＳで希釈した。ペルオキシダーゼ複合化ヤギ抗ヒトＩｇＧ（シグマ）をＰＢＳ＋０．０５％ツイーン２０で１１５００希釈したが、基質はＴＭＢ　（３．３”、　！。

５′−テトラメチルベンジジン）であった。

（ｅ）免疫グロブリンクラス及びサブクラス決定イムノドツトアッセイ〔マクドウガル（ＭｃＤｏｕｇａｌ）ら。

１９８３年，第６３巻，第２８１−２９０頁〕がニトロセルロースに吸着されたモノクローナル抗Ｒｈ　（Ｄ）抗体と抗１ｇＧ，抗１ｇＭ，抗に及び抗λ抗血清〔セロチック（Ｓｅｒｏｔｅｃ）　）との反応を調べるため用いられ、陽性反応はペルオキシダーゼ複合北枕ヒツジＩｇＧ（セロチック）しかる後４−クロロ− １−ナフトールでの発色により検出した。ＩｇＧサブクラスは、モノクローナル抗サブクラス抗体〔ユニパス（Ｕｎｌｐａｔｈ）　）による抗Ｒｈ（Ｄ）被覆ＲＢＣの凝集から評価された。

アイコブ（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ）上澄（無血清）を１５％ポリアクリルアミドゲル上還元条件下で電気泳動に付した〔レムリ、ネーチャー、１９７０年、第２２７巻、第６８０・６８５頁化ａｅｗｓｌｉ、Ｎａｔｕｒｅ　（１９７０）　２２７．８８０−８８５）　）　ｏ次いで、分離されたタンパク質を電気泳動でニトロセルロース膜に移し〔プラネット、アンルズ・オブ・バイオケミストリー、１９８１年、第１１２巻、第１９５−２０３頁（Ｂｒｕｎｅｔｔｅ、Ａｎｎａｌｓ　ｏｒ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　（１９８１）１１２．１９５−２０３））　、これを抗ＩｇＧ抗血清（セロチック）でプローブ処理し、上記のように検出した。

（ｇ）プロティンＡ＠着上澄２ｍｌ容量をプロティンＡセファロースＣＩ　−４Ｂ（シグマ）の２５＋ｓｍ（１ｍｌ）カラムに２回通し、抗Ｒｈ　（Ｄ）の吸着を滴定で評価した。

細胞系Ｂ７、Ｂ８及びＢ９のＩｇＧ１抗Ｒｈ　（Ｄ）はすべてプロティンＡで吸着されることが判明した。

（ｈ）Ｇｍアロタイプ判定ＲＢＣをモノクローナル抗Ｒｈ　（Ｄ）抗体でコーティングし、凝集をＧｍアロタイプ判定試薬〔バーミンガム（Ｂｌｒｍｉｎｇｈａｓ）又はアムステルダム（＾ａ＋５ｔｅｒｄａｓ）　）で評価した。

（２）血清学Ｂ７、Ｂ７及びＢ９の連続培養による培養上澄は、低イオン強度塩水中ウサギ抗ヒトＩｇＧ及び３％ＲＩ　Ｒ１、ｒ″ｒ、ｒ’　ｒ又はｒｒ細胞を用いてＩＡＧ試験により測定された（第■ａ及びｍｂ表参照）。同一の上澄は同一の条件下でＤ変異体赤血球のパネルに対しても試験された（上記第■表参照）。凝集の程度は常法に従いスケール０〜５又は０〜６に等級分けされた。

第■表ＩＡＧによるモノクローナル抗Ｒｈ　（Ｄ）抗体と“部分的”Ｄ陽性赤血球との反応培養上澄Ｂ７　　　　８８　　　　　Ｂ９ＤＩＶ　＜非パパイン処理）− 下記第７表に記載された細胞系Ｂ７、Ｂ７及びＢ９の組織型及び核型分析の結果は、細胞系が上記セクシ目ン（１）（ａ）で記載されたドナーＢのＢリンパ球に由来することを確認させた。

第７表細胞系　　　　　　　Ｂ７　　　　　Ｂ７　　　　　Ｂ９性別　　　　　　　　　　　　　　男性組織型ＨＬＡ　　二　Ａ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１．３Ｂ　　　　　　　　　　　　８．！１５ＤＲ１，３核型性染色体　　　　　　　　　　　　ｘｙ倍数性　　　　　　　　はとんどの細胞が二倍体一般に、本発明の抗Ｒｈ　（Ｄ）モノクローナル抗体（例えばＢ７）と更にＩｇＧ抗Ｒｈ　（Ｄ）モノクローナル抗体、例えば英国特許出願第８７２２０１８号の優先権を主張した本出願と同日付の我々の同時係属国際特許出願第　　　　　　　号の細胞系Ｂｌｌとの混合剤を用いることが上記目的にとって好ましい。

マニニアル使用法最終混合剤は１：１：１のＢｌｌ：Ｂ７：希釈剤である。

希釈剤　３０％牛血清アルブミン１００ｍ１ＫＨ２ＰＯ４２，４２ｇＮａ　　　ＨＰＯ拳　２Ｈ２０２，７７ｇＮａＣ１４，５０ｇツイーン２００．２ｍ１Ｎ　ａ　Ｎ　３　１　、００　ｇ全量　蒸留水で１．０ｆｔ　：　ｐＨ６，８この混合剤は、Ｄ及びＤｕ型判定用のすべてのマニュアル試験、例えば微量滴定、マイクロプレート、ＮＡＧで用いることができる。

１：１：２のＢｌｌ：Ｂ７：希釈剤の混合剤も使用可能である。

マシン用混合剤この混合剤は例えばテクニコン・オートグルーバー１６　Ｃ（Ｔｅｃｈｎｉｃｏｎ　ａｕｔｏｇｒｏｕｐｅｒ　１６Ｃ）で使用することができる。

前混合試薬Ｂｌｌ：Ｂ７　１：ＩＤ表現型判定（Ｄ陽性ＶＳＤ陰性）の場合溶液は１：１０００混合剤：希釈剤であり、Ｄｕ決定法（ＤｕｖＳＤ陰性）の場合溶液は１：５混合剤：希釈剤である。

希釈剤　１３．５％メチルセルロース含有１．３％生理塩水中２％牛血清アルブミン補正書の翻訳文提出書（特許法第１８４条の８）平成　２　年　３　月　１７日特許庁長官　吉　１）文　毅　殿１、　国際出願の表示ＰＣＴ／ＧＢ　　８８１００７５７２、発明の名称ヒト抗Ｒｈ　（Ｄ）モノクローナル抗体３、特許出願人名　称　　　セントラル、ブラッド、ラボラトリーズ、オーソリティー４、代理人（郵便番号１０の５、　補正書の提出年月日１９８９年　１２月　１１日６、　添付書類の目録（１）　　補正書の翻訳文　　　　　　　　　　　　　　　　　　１　通１、明細書第６頁第１４行に「６つのカテゴリー」とあるを「７つのカテゴリー」に補正する。

２、同第７頁第■表中ｒＶＩＪの行の下に「■　　　　　白人　　　　　　　　　　　ＤＣｅ　　　Ｊを挿入する。

３、　第１０頁第３行及び１６１１頁１１１６行にｒＤ”Ｊとあるを「Ｄ町に補正する。

４、第１０頁下から第２行〜第１１頁第８行に「本発明の抗Ｒｈ　（Ｄ）・・・・・・混合されるが、」とあるを「本発明の抗Ｒｈ　（Ｄ）モノクローナル抗体は、更に１種以上の抗Ｒｈ　（Ｄ）抗体、好ましくは抗ＤＩｖ活性を含めた１以上の付加的結合特異性を有するモノクローナル抗体、例えば本出願と同日付の我々の同時係属国際特許出願（公開節ＷＯ３９／２４４２号明細書）におけるＩｇＧ１抗Ｒｈ　（Ｄ）モノクローナル抗体又は本出願と同日付の我々の同時係属国際特許出願（公開節ＷＯ３９／２６００号明細書）におけるＩ　ｇＧ３抗Ｒｈ　（Ｄ）モノクローナル抗体と混合されるが、」に補正する。

５、第２１頁第５行に「０〜５又は０〜６」とあるを「０〜６」に補正する。

６、第１０頁第３表中「ＤＴａｒ」トアルヲ「ＤＶＩＪに補正する。

７、第２２頁下から第６〜５行に「同時係属・・・・・・細胞系Ｂ１１」とあるを「同時係属国際特許出願磁ＰＣＴ／ＧＢ８８／７５５（公開節ＷＯ３９／２４４２号明細書）におけるＢ１１」に補正する。

請求の範囲１、　下記の本質的特徴：（ａ）Ｒｈ血液型系のＣ，ｃ、Ｅ又はＣ抗原ではなくＲｈ　ＣＤ）抗原に対して活性を示す；（ｂ）ＩｇＧ１タンパク質である；（ｃ）にＬ鎖を有する；（ｄ）アロタイプＧ１ｍ　（１，２，１７）に属する；（ｅ）Ｄｖ、Ｄ’、ＤｖＩ及びＤＢ変異抗原に対して活性を示す；及び（ｅ）間接的抗グロブリン試験で非パパイン処理ＤＩＶ細胞と実質上非反応性である；を有するヒトモノクローナル抗体及びその抗原結合性断片。

２、　細胞系ＥＣＡＣＣ８６０９１６０３により産生される、請求項１に記載のモノクローナル抗体。

３、　請求項１又は２に記載されたモノクローナル抗体が１以上の付加的結合特異性を冑する更に１種以上の抗Ｒｈ　（Ｄ）抗体と混合された抗Ｒｈ　（Ｄ）試薬。

４、　間接的抗グロブリン試験でＤｕ赤血球及び非パパイン処理赤血球上のＤＩＶ変異体に対する活性を示しうるモノクローナル抗体が存在する、請求項３に記載の抗Ｒｈ　ＣＤ）試薬。

５、　抗体成分が：（ａ）請求項１に記載されたモノクローナル抗体；及び（ｂ）抗Ｄ　活性のない又は非常に弱いＩｇＭ抗Ｒｈ（Ｄ）；を含む、請求項３に記載の抗Ｒｈ　（Ｄ）試薬。

６、　抗体成分が間接的抗グロブリン試験でＤＬ＋赤血球に対する活性を別個に示す更に１種以上のＩｇＧモノモノーナル抗Ｒｈ　（Ｄ）抗体を更に含み、その結果試薬ｕ　　　ＩＶ　　　Ｖが同一の試験でＤ　　、Ｄ　　、Ｄ　　及びＤｖＩ赤血球と反応する、請求項５に記載の抗Ｒｈ　（Ｄ）試薬。

７、　成分（ａ）が細胞系ＥＣＡＣＣ８６０９１６０３により産生されるモノクローナル抗体である、請求項５又は６に記載の抗Ｒｈ　（Ｄ）試薬。

８、　成分（ｂ）が寄託されたハイブリドーマ細胞系ＭＡＤ−２（ＥＣＡＣＣ８６０４１８０３）及びＦＯＭ−１（ＥＣＡＣＣ８７０２１３０１）のモノクローナルＩｇＭから選択される、請求項５〜７のいずれか一項に記載の抗Ｒｈ　（Ｄ）試薬。

９、　請求項１に記載されたモノクローナル抗体を産生しうるヒトリンパ球由来細胞系。

１０、　　　ヨーロピアン拳コレクション・オブψアニマルψセル・カルチャーズに受理ｋＥｃＡｃｃ　　８６０９１６０３号として寄託された、請求項９に記載の細胞系。

１１、　　ｍ求項９又は１０に記載された細胞系の培養により得られた培養上澄。

１２、　　新生児の溶血症を防止するだめの受動免疫用である、請求項１又は２に記載のモノクローナル抗体。

１３、　　新生児の溶血症を防止する受動免疫用医薬組成物であって、生理学上許容される担体又は希釈剤と共に請求項１又は２に記載されたモノクローナル抗体を含むことを特徴とする医薬組成物。

１４、　抗体成分がＤＩｖ変異体と結合しうるモノクローナル抗体を更に含む、請求項１３に記載の医薬組成物。

１５、　　抗体成分が１ｇＧ３サブクラスの抗Ｒｈ　（Ｄ）抗体を１種以上含有する、請求項１３又は１４に記載の医薬組成物。

１６、　　請求項１又は２に記載されたモノクローナル抗体又は請求項３〜８のいずれか一項に記載された抗Ｒｈ　（Ｄ）試薬が用いられ、上記モノクローナル抗体又は上記試薬が水性溶液の形態であることを特徴とするＲｈ型判定方法。

国際調査報告ｍｌ崗１＋ａＭＩＡ＋＋ｓｌｌ＋ａ１１ｍｌｌｖ　ＰＣＴ／ＧＥ　８８１００７５７特壬子３−５０２４０１　（１０）

Claims

【特許請求の範囲】

１．下記の本質的特徴：（ａ）Ｒｈ血液型系のＣ、ｃ、Ｅ又はｅ抗原ではなくＲｈ（Ｄ）抗原に対して活性を示す；（ｂ）ＩｇＧｌタンパク質である；（ｃ）ｋＬ鎖を有する；（ｄ）アロタイプＧｌｍ（１，２，１７）に属する；（ｅ）ＤＶ、ＤＴａｒ、ＤＶＩ及びＤＢ変異抗原に対して活性を示す；及び（ｅ）間接的抗グロブリン試験で非パパイン処理ＤＩＶ細胞と実質上非反応性である；を有するヒトモノクローナル抗体及びその抗原結合性断片。
２．細胞系ＥＣＡＣＣ８６０９１６０３により産生される、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
３．請求項１又は２に記載されたモノクローナル抗体が１以上の付加的結合特異性を有する更に１種以上の抗Ｒｈ（Ｄ）抗体と混合された抗Ｒｈ（Ｄ）試薬。
４．間接的抗グロブリン試験でＤＵ赤血球及び非パパイン処理赤血球上のＤＩＶ変異体に対する活性を永しうるモノクローナル抗体が存在する、請求項３に記載の抗Ｒｈ（Ｄ）試薬。
５．抗体成分が：（ａ）請求項１に記載されたモノクローナル抗体；及び（ｂ）杭ＤＵ活性のない又は非常に弱いＩｇＭ抗Ｒｈ（Ｄ）；を含む、請求項３に記載の抗Ｒｈ（Ｄ）試薬。
６．抗体成分が間接的抗グロブリン試験でＤＵ赤血球に対する活性を別個に示す更に１種以上のＩｇＧモノクローナル抗Ｒｈ（Ｄ）抗体を更に含み、その結果試薬が同一の試験でＤＵ、ＤＩＶ、ＤＶ及びＤＶＩ赤血球と反応する、請求項５に記載の抗Ｒｈ（Ｄ）試薬。
７．成分（ａ）が細胞系ＥＣＡＣＣ８６０９１６０３により産生されるモノクローナル抗体である、請求項５又は６に記載の抗Ｒｈ（Ｄ）試薬。
８．成分（ｂ）が寄託されたハイブリドーマ細胞系ＭＡＤ−２（ＥＣＡＣＣ８６０４１８０３）及びＦＯＭ−１（ＥＣＡＣＣ８７０２１３０１）のモノクローナルＩｇＭから選択される、請求項５〜７のいずれか一項に記載の抗Ｒｈ（Ｄ）試薬。
９．請求項１に記載されたモノクローナル抗体を産生しうるヒトリンパ球由来細胞系。
１０．ヨーロピアン・コレクション・オブ・アニマル・セル・カルチャーズに受理ＮａＥＣＡＣＣ８６０９１６０３号として寄託された、請求項９に記載の細胞系。
１１．請求項９又は１０に記載された細胞系の培養により得られた培養上澄。
１２．新生児の溶血症を防止するための受動免疫用である、請求項１又は２に記載のモノクローナル抗体。
１３．新生児の溶血症を防止する受動免疫用医薬組成物であって、生理学上許容される担体又は希釈剤と共に請求項１又は２に記載されたモノクローナル抗体を含むことを特徴とする医薬組成物。
１４．抗体成分がＤＩＶ変異体と結合しうるモノクローナル抗体を更に含む、請求項１３に記載の医薬組成物。
１５．抗体成分がＩｇＧ３サブクラスの抗Ｒｈ（Ｄ）抗体を１種以上を含有する、請求項１３又は１４に記載の医薬組成物。
１６．請求項１又は２に記載されたモノクローナル抗体又は請求項３〜８のいずれか一項に記載された抗Ｒｈ（Ｄ）試薬が用いられ、上記モノクローナル抗体又は上記試薬が水性溶液の形態であることを特徴とするＲｈ型判定方法。