JP2583302B2 - ヒト抗Ｒｈ（Ｄ）モノクローナル抗体 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はヒト赤血球のRh（Ｄ）抗原に対するヒトモノ
クローナル抗体に関する。特に本発明は、Ｄ−陽性、
“弱D"又はD^u細胞のいずれかにおける正常Rh（Ｄ）抗原
のみならずRh（Ｄ）抗原の重要な変異体をも検出するた
めに用いられるIgG3サブクラスのこのような抗体に関す
る。

いわゆるRh血液型系の抗原の中では、Rh（Ｄ）抗原が
対応抗体保有患者への輸血後における最も重篤な反応の
一部に関与している。Rh（Ｄ＋）血液をうけた抗Rh
（Ｄ）保有Rh（Ｄ−）個体はRh（Ｄ）表現型不適合のせ
いで実質的赤血球（RBC）破壊をうけやすいことから、
ドナー及び受血者の血液は抗Rh（Ｄ）抗体との凝集試験
によりRh（Ｄ＋）又はRh（Ｄ−）としてルーチンに分類
される。RBCのRh表現型は普通更にフィッシャー・レー
ス（Fisher−Race）系に基づき定義されるが、これはRh
抗原の遺伝は非常に近接して結合した座で作用する３対
の対立遺伝子Ｃ−ｃ、Ｄ−ｄ及びＥ−ｅで決定されると
いう仮定に基づいている。この理論によれば、ヒトは彼
の両親の各々から３つのRh遺伝子、即ち（１）Ｃ又は
ｃ、（２）Ｄ又はｄ、（３）Ｅ又はｅの一組を受け継ぐ
（ｄ抗原はまだ同定されていないが、但し記号“d"はＤ
抗原を産生しないＤ遺伝子と対立する遺伝子の存在を示
すために用いられている）。例えば、Rh（Ｄ＋）者は片
親からCDe及び他方からcdeを受け継いでいる。イギリス
人をフィッシャー・レース系に関して調べた場合に最も
共通するRh遺伝子組合せの割合が、特に言語上用いられ
る“短記号”と共に下記第Ｉ表で示されている。

何年にもわたる拡大調査にもかかわらず、フィッシャ
ー・レース系はRh系で観察されたすべての反応を説明す
る上で十分ではなかった〔モリソン,P.L.,1983年，臨床
医学における輸血，第７版，ブラックウェル・サイエン
ティフィック，オックスフォード（Mollison,P.L.,（19
83）Blood Transfusion In Clinical Medicine,7th ed
n.,Blackwell Scientific,Oxford）〕。それにもかかわ
らず、世界保健機構では単純性及び画一性の理由からこ
の命名法が世界的に採用されるべきであると推奨してき
たため、以下で示されるすべてのRh遺伝子型は慣用的フ
ィッシャー・レース系に基づき定義される。

RBCのRh型判定に関する抗Rh（Ｄ）抗体の必要性に加
えて、このような抗体は新生児溶血症（HDN）を防止す
るためRh（Ｄ−）母親の受動免疫にとっても非常に必要
とされる。この症状は、妊娠中胎盤を通過して胎児RBC
破壊を引き起こすIgG抗Rh（Ｄ）抗体に起因してRh
（Ｄ）抗原に既に感作されたRh（Ｄ−）母親の新生Rh
（Ｄ＋）児で生じる。Rh（Ｄ）抗原によるRh（Ｄ−）母
親の感作は、母親の循環に入って母親の免疫系により認
識されるある胎児RBCのせいで第一Rh（Ｄ＋）子の誕生
時に生じたのであろう。HDNの発生率を低下させるた
め、母親の循環に入ったいかなるRh（Ｄ＋）RBCも速や
かに除去されるようRh（Ｄ＋）児の誕生直後Rh（Ｄ−）
母親に抗Rh（Ｄ）抗体を投与することがイギリス及び他
の多数の国におけるルーチン的実務である〔モリソン,
P.L.,1983年，前掲；レーロス・ジュニア,R.K.（Laros
Jr.,R.K.）,1986年，“妊娠中の血液型疾患”中におけ
る“胎児赤芽球症",第７章，第103頁〕。

現在、RBCのRh型判定及びRh（Ｄ−）母親の受動免疫
の双方における使用のための抗Rh（Ｄ）抗体は、妊娠中
に免疫された女性ドナーから又は免疫された男性ボラン
ティアから直接主に得ている。しかしながら、Rh（Ｄ
−）女性へのヒト抗Rh（Ｄ）免疫グロブリンの産後予防
投与プログラムの成功で、自然アロ免疫女性の数に関し
著しい減少を招いた〔アーバニアック,S.J.,“新生児の
RhD溶血症：変化する状況",ブリテッシュ・メディシナ
ル・ジャーナル,1985年，第291巻，第４−６頁（Urbani
ak,S.J., “RhD haemolytic disease of the newborn:the changi
ng scene",British Medicinal Journal（1985）291,4−
６）〕。更に、Rh（Ｄ＋）RBCによる個体の意図的な免
疫には、いかなるRBC輸血をうけた場合にも共通するリ
スク、例えば肝炎ウイルス及びHIVの移入のリスクを伴
う。したがって、診断及び治療双方の目的のためヒトモ
ノクローナル抗体Rh（Ｄ）抗体を得ることに多大な関心
が集まっているのである。

上記のようにルーチンの血液試験において、血液型は
抗Rh（Ｄ）の凝集試験で示されるようにRBC上のRh
（Ｄ）抗原の見掛上の存在又は非存在に基づきRh（Ｄ
＋）及びRh（Ｄ−）に分けられる。しかしながら、見掛
上Rh（Ｄ−）血液を有するヒトの少数は、このようなル
ーチン試験において抗Rh（Ｄ）により直接凝集されない
が、Ｄ型判定試験が選択された抗Rh（Ｄ）試薬を用いて
間接的抗グロブリン試験で実施された場合には反応する
RBCを有している。こうして同定された細胞はD^uと表示
される。D^u表現型の割合は全体で約0.2％、コーカサス
人中0.6％及び全Rh（Ｄ−）妊娠女性中約1.5％である。
少なくとも３つの異なるメカニズム、即ち（１）完全Rh
（Ｄ）抗原の一部の遺伝的欠如、（２）トランス位置に
おけるＣによるＤの抑制に関する遺伝子相互作用及び
（３）弱抗原を産生するＤ遺伝子が、D^u表現型の発現に
関与しているのであろう。

1950年代初期、Rh（Ｄ＋）血液の輸血後又はRh（Ｄ
＋）児を出産した妊娠の後、D^u表現型の個体における抗
Rh（Ｄ）の存在に関する報告が最初にみられた。血液が
Rh（Ｄ＋）に分類された一部の個体においてRh（Ｄ）抗
原の一部がRBCから欠落していることが、その後明らか
になった。輸血又は妊娠により完全Rh（Ｄ）抗原を有す
るRh（Ｄ＋）RBCと接触された場合、不完全Rh（Ｄ）抗
原をRBC上に有するヒトは彼等が欠如するRh（Ｄ）抗原
部分に対するアロ抗Ｄを産生することができる。このよ
うな個体の血液は、RBCがルーチン抗Rh（Ｄ）試薬と直
接反応する場合にはＤ変異体と呼ばれ又は細胞が間接的
抗グロブリン技術でのみ反応する場合にはD^u変異体と呼
ばれる。

Rh（Ｄ＋）RBCを有する患者でアロ抗Rh（Ｄ）が産生
されるという観察から、用語“Ｄモザイク”の共通の用
法としてその完全天然型のRh（Ｄ）抗原を表すようにな
った。ルーチン抗Rh（Ｄ）試薬では、Ｄモザイクの一部
を欠くRBCをすべてのＤ成分を有するRBCから通常区別し
えない。Ｄ変異体表現型はチペット（Tippett）及びサ
ンガー（Sanger）〔ボックス・サング（Vox.Sang）,196
2年，第７巻，第９−13頁〕により類別された。この系
はＤ−及びD^u変異体個体からのRBC及び血清の相互作用
に基づいている。７つのカテゴリー（下記第II表参照）
に大別され、小分類がカテゴリーIII、IV及びＶで既に
認められている。カテゴリーＩ及びIIは、それらが現在
単一のサブグループとして通常考えられるほど多数の類
似性を有することが判明した。

一方、さほど用いられないが、ウィーナー（Wiener）
による分類ではローマ数字の代わりに文字Ａ、Ｂ、Ｃ、
Ｄを用いている。２つの系間に直接の相互作用はない
が、D^B及びD^VIは互換性があると通常考えられる。

人口中におけるＤ及びD^u変異体個体の割合は比較的低
いけれども、輸血又は妊娠による非変異体Rh（Ｄ＋）細
胞との接触のせいで現実的な抗Rh（Ｄ）形成のリスクを
潜在的に有するこれら血液型の個体の総数は決して微々
たるものではない。更にRh（Ｄ＋）又はD^u児を生んだRh
（Ｄ−）女性に加えて、Rh（Ｄ＋）児を生んだD^u変異体
女性もHDNのリスクを低下させるため産後抗Rh（Ｄ）治
療から利益を得るであろう〔ホワイト,C.A.ら,1983年，
アメリカン・ジャーナル・オブ・オブステトリカル・ギ
ネコロジー，第145巻，第1069−1073頁（White,C.A.et
al.（1983） American Journal of Obstetrical Gyneco
logy,145,1069−1073）〕。Ｄ及びD^u変異体RBCを区別し
うる抗血清は広く入手しえない。したがって、Ｄ及びD^u
変異体RBCに関してある範囲の結合特異性を有する抗Rh
（Ｄ）モノクローナル抗体の供給は、このような細胞を
有する個体（特に予防的抗Rh（Ｄ）治療の適切な候補者
であるＤ又はD^u変異体妊娠女性）の更に容易な確認及び
類別化を可能にし並びにRh（Ｄ）抗原複合体に関する構
造情報を更に得る上で有用とみられる。

ヒトモノクローナル抗Rh（Ｄ）抗体産生は既に： （ａ）抗Rh（Ｄ）陽性ドナーのＢリンパ球に由来するエ
プスタイン・バール（Epstein Barr）ウイルス形質転換
Ｂリンパ球細胞系（以下、EBV形質転換LCLと称される）
を直接クローニングする〔英国特許出願第2127434号明
細書；クロフォードら,1983年，ランセット，第１巻，
第386−388頁（Crawford et al.（1983）Lancet,1,386
−388）；及びペアーら， 1986年，イムノロジー・レターズ，第13巻， 第137−141頁（Paire et al.（1986）Immunology Lette
rs,13,137−141）参照〕； （ｂ）抗Rh（Ｄ）産生EBV形質転換LCLをマウス、マウス
−ヒト又はヒトミエローマ細胞系と融合させて形成され
るハイブリドーマ細胞系をクローニングする〔同時係属
英国特許出願第8709748号明細書；トンプソン（Thompso
n）ら,1986年，イムノロジー，第58巻，第157−160頁；
及び欧州特許出願第162918号明細書参照〕；又は （ｃ）ヒトLCLと免疫Ｂ細胞との融合〔ローウェ（Low
e）ら,1986年，ボックス・サング，第51巻，第212−216
頁〕； により達成された。

しかしながら抗Rh（Ｄ）陽性ドナーからのEBV形質転
換LCLをクローニングすることにより、我々は以前に開
示されたいずれの抗Rh（Ｄ）モノクローナル抗体試薬の
場合でも示されていない特に有用な結合特異性スペクト
ルを有するIgGクラスのモノクローナル抗Rh（Ｄ）抗体
を得ることができた。

本発明によれば、我々は下記の本質的特徴： （ａ）Rh血液型系のＣ、ｃ、Ｅ又はｅ抗原ではなくRh
（Ｄ）抗原に対して活性を示す； （ｂ）IgG3タンパク質である； （ｃ）κＬ鎖を有する； （ｄ）アロタイプG3m（21）に属する； （ｅ）間接的抗グロブリン試験でD^u細胞に対して活性を
示す； （ｆ）D^IV、D^V及びD^VII変異抗原に対して活性を示す；
及び （ｇ）D^VI又はD^B変異抗原に対して不活性である； を有するヒトモノクローナル抗体及びその抗原結合性断
片を提供する。

しかも本発明のモノクローナル抗体は 抗原に対して活性を示すことがわかった。

このようなモノクローナル抗体は、RBCをＤ陽性、D^u
又はＤ陰性に分類しうるルーチン抗Ｄ試薬として使用可
能である。この目的のため、本発明のモノクローナル抗
体は単独で、又は更に１種以上の抗Rh（Ｄ）抗体、好ま
しくは１以上の付加的結合特異性を有するモノクローナ
ル抗体と共に、のいずれでも用いることができる。この
ため例えば本発明のモノクローナル抗体は、D^VI変異RBC
をＤ陽性として分類しうる更に広い特異性のある抗Rh
（Ｄ）試薬を得るためD^VI変異体と結合しうる更にもう
１種のモノクローナル抗体と混合されることが有利であ
ろう。このような抗Rh（Ｄ）試薬において、本発明のIg
G1抗体は、例えば本出願と同日付の我々の同時係属国際
特許出願（公開第WO89/2443号明細書）中で開示された
タイプの下記結合特徴を有するIgG1モノクローナル抗体
と混合される： （ａ）Rh血液型系のＣ、ｃ、Ｅ又はｅ抗原ではなくRh
（Ｄ）抗原に対して活性を示す； （ｂ）D^V、D^VII、D^VI及びD^B変異抗原に対して活性を示
す；及び （ｃ）IAG試験において非パパイン処理D_IV細胞と実質上
非反応性である。

このような抗体の中では、本発明の抗Rh（Ｄ）モノク
ローナル抗体と共に使用する上で、イギリス，ポートン
・ダウン（Porton Down）のヨーロピアン・コレクショ
ン・オブ・アニマル・セル・カルチャーズ（European C
ollection of Animal Cell Cultures）に受理No.ECACC
87091603号として1987年９月16日付で寄託されたB7と称
されるモノクローナル抗体が特に好ましい。

本発明のモノクローナル抗体がD^VI変異体に対して反
応性の抗Rh（Ｄ）、例えば適切なポリクローナル抗Rh
（Ｄ）血清と共にRh型判定に用いられる場合において、
後者に関する凝集試験で陽性結果を示すが但し本発明の
モノクローナル抗体に関して陰性結果を示す血液サンプ
ルは主に又は完全にD_VIカテゴリーに属すると予測する
ことができる（これは新規モノクローナル抗体が不活性
な事実上唯一のＤ変異抗原であるためである）。慣用的
凝集試験でRh（Ｄ＋）又はD^uとして分類されるが但し抗
Ｄを産生しうる個体の中では、高率でD_VI変異抗原を有
することが確立されていた〔モリソン,P.L.,1983年，
“臨床医学における輸血",第８章，第339頁〕。そのた
め本発明のモノクローナル抗体の一使用例は、人口中に
おけるD_VI型個体の発生率を研究することである。

本発明のモノクローナル抗体は、抗D^u活性のない又は
非常に弱い、即ち慣用的凝集試験でD^u細胞をＤ陰性細胞
から信頼性をもって区別しうるにはこのような細胞に対
して不十分な活性である抗Rh（Ｄ）の特異性を補うため
抗Rh（Ｄ）型判定試薬における使用にとっても特に価値
がある。実際に、米国規制市販抗Rh（Ｄ）型判定試薬に
関する食品医薬品局（FDA）の規制下では、このような
試薬はD^uRBCを真のＤ陰性RBCから区別しうることが要求
されている。本発明の組合せ抗Rh（Ｄ）試薬の中では、
本発明のIgG抗Rh（Ｄ）が非常に弱いD^u活性のIgM抗Rh
（Ｄ）、例えば特に欧州特許出願公開第251440号明細書
の主題をなす寄託されたハイブリドーマ細胞系MAD−２
（ECACC86041803号）及びFOM−１（ECACC87021301号）
のモノクローナルIgMから選択されるIgMモノクローナル
抗Rh（Ｄ）と共に用いられた上記条件を満足するこのよ
うな試薬が特に好ましい。このような試薬は間接的抗グ
ロブリン試薬でD^u赤血球との活性を個別的に示す更に少
なくとも１種のIgGモノクローナル抗Rh（Ｄ）抗体で更
に補充されることが有利であり、その結果混合試薬は同
一の試験でD^u、D^IV、D^V及びD^VI細胞と反応するようにな
る。Rh型判定がこのような試薬で行われる場合、Ｄ陽性
細胞は最初にIgM抗Rh（Ｄ）で直接凝集される。次いで
残りの非凝集細胞（見掛上Ｄ陰性）は間接的抗グロブリ
ン試験用の慣用的クームス（Coomb's）試薬の添加によ
り真のＤ陰性及びD^u細胞に分けられるが、その場合IgG
抗体に結合するD^u細胞は凝集されるため区別される。

本発明のモノクローナル抗Rh（Ｄ）抗体は、モノクロ
ーナル抗体の産生に関して公知の常法により、特に、必
要な抗体に関する上記特徴を有した抗Rh（Ｄ）免疫グロ
ブリンの分泌に基づき選択されるEBV形質転換ヒトＢリ
ンパ球の培養により得ることができる。こうして得られ
た培養上澄は、本発明の特徴を有している。

我々は上記のようなIgG3抗Rh（Ｄ）モノクローナル抗
体を産生するクローニングされたEBV形質転換LCL5つに
ついて今や詳細に研究した。これらは以下でA4、A5、A
6、A7及びA8と称される。これらすべてのクローニング
された細胞系は、選択された抗Rh（Ｄ）ドナーの末梢Ｂ
リンパ球から出発し、所望の特異性をもつモノクローナ
ル抗体を産生するEBV形質転換LCLを確立しかつクローニ
ングするため英国特許出願第2145113号明細書で記載さ
れた操作又は実質上同様の操作を用いることにより得た
（例１参照）。10％（v/v）無マイコプラズマ牛胎児血
清、0.2mg/mlアルギニン及びマイコプラズマ増殖を予防
する抗生物質で補充されたRPMI1640培地を用いた連続培
養において、それらは高度に安定であって、R₁R₁（CDe/
CDe）RBCに対する低イオン強度塩水中での間接的抗グロ
ブリン（IAG）アッセイにより測定した場合に2000〜160
00の範囲内の抗Rh（Ｄ）力価を有する培養上澄を生じる
ことが見出された。このような培養上澄は濃縮必要性の
ないRh型判定での使用に適しているが、実際には使用上
希釈してもよい。

連続培養における上記具体的クローンの抗体産生特徴
は、下記第IIIa及びIIIb表で要約されている。これらす
べてのクローンは、少なくとも８ケ月間にわたる連続培
養で安定な力価を維持しうることが示された。IAG試験
における凝集の程度は、常法に従いスケール０〜６に等
級分けされた。

試験された本発明のモノクローナル抗体は表現型R₂rG
−、hr^s−、R₁R_z及びR₂R_zのRBCと反応するが、但しｒ″
Gr、r^m、r^G、ｒ′^sｒ、hr^B−、ｒ′^wｒ及びRh33＋とは
陰性であることが更に判明した。

本発明の更にもう１つの面によれば、我々は本発明の
モノクローナル抗Rh（Ｄ）免疫グロブリンの水性溶液が
用いられるRBCのRh型判定法を提供する。モノクローナ
ル免疫グロブリンは、直接又はより一般的には希釈後用
いられる培養上澄中に含有されることが好ましい。前記
のように、本発明のIgG3抗体を異なる特異性の抗Rh
（Ｄ）モノクローナル抗体の１種以上、例えば更に抗D
_VI活性を有するIgG抗体と混合することが望ましい。適
切な希釈剤としては、有利には牛血清アルブミン及びツ
ィーン（Tween）80又はメチルセルロースのような界面
活性剤又は懸濁化剤を含有した生理塩水又はリン酸緩衝
液がある。

本発明のIgG3抗Rh（Ｄ）抗体は単球及びマクロファー
ジによるRh（Ｄ＋）RBC結合及び食作用の優れた促進剤
であって、このためHDN予防用の有効な予防抗Ｄ治療剤
を提供するという観点からも大きな関心がある。実際
に、細胞系A4及びA5の培養上澄はインビトロアッセイに
おいて慣用的ポリクローナル抗Rh（Ｄ）血清よりもU937
単球による感作RBCのロゼット化及び食作用を更に高度
に誘導することが判明した。しかも同様の培養上澄は、
γ−インターフェロン刺激単球由来培養マクロファージ
に対する感作RBCの結合を媒介する上で慣用的ポリクロ
ーナル抗Rh（Ｄ）血清に匹敵する（例１のセクション
（３）及び（４）参照）。

このため本発明のもう１つの面によれば、我々はRh
（Ｄ）抗原に対する母親の感作を防止するためRh（Ｄ
＋）児の誕生後Rh（Ｄ−）、Ｄ又はD^u変異体母親の受動
免疫用に本発明のモノクローナルIgG3抗体を提供する。
ヒト注射用のかかる抗体の無菌溶液は、いずれかの生理
学上許容される水性媒体、例えば等張リン酸緩衝液又は
血清で処方される。一方、抗体は使用前に再調整される
凍結乾燥処方剤として供給してもよい。HDNの予防用と
して高度に有効な予防製剤を提供するため、本発明のモ
ノクローナル抗Rh（Ｄ）は更に１種以上の抗Rh（Ｄ）抗
体と共に用いられる。ルーチン使用のためには、抗D^VI
抗体が含有されていることが望ましい。本発明の抗体
は、その内容が参考のため本明細書に組込まれる英国特
許出願第8722018号の優先権を主張した本出願と同日付
の我々の同時係属国際特許出願（公開第WO89/2442号明
細書）におけるIgG1抗Rh（Ｄ）モノクローナル抗体を補
助する予防製剤としての用途も有する。

上記のクローニングされたEBV形質転換リンパ球細胞
系A7は、イギリス，ポートン・ダウンのヨーロピアン・
コレクション・オブ・アニマル・セル・カルチャーズに
受理No.ECACC 87091606号として1987年９月16日付で寄
託された。

この寄託細胞系の産生及びその連続培養上澄の同定特
徴に関する詳細は、下記非制限例の例１で示されてい
る。

例１ （１）抗Rh（Ｄ）産生EBV形質転換LCLの確立及びクロー
ニング （ａ）Ｂリンパ球源 ドナーA:彼女の最初でかつ唯一の妊娠（正常Rh（Ｄ
＋）児を生んだ）中に免疫され、分娩４年後にパック詰
めRh（Ｄ＋）（R₂ｒ）RBC0.5mlで追加免疫され及び追加
免疫の８日後に彼女の血清抗Ｄレベルが60IU/mlになっ
たとき得られた末梢血液サンプルで追加免疫された女
性。

（ｂ）細胞系の確立 ドナーＡの末梢血単核細胞をリンホプレプ （Lymphoprep）〔ニエガード社（Nyegaard and Co.）〕
で分離し、EBV（濾過された無マイコプラズマB95−８細
胞系からの培養上澄1ml/10⁷細胞）の存在下37℃で１時
間インキュベートし、リン酸緩衝液（PBS）で洗浄し
た。一部を、１％（v/v）フィトヘマグルチニン（PHA）
又は0.5μg/mlシクロスポリンＡ（CsA）のいずれかで補
充されたリンパ芽球細胞培地〔10％（v/v）無マイコプ
ラズマ牛胎児血清（FCS）、0.2mg/mlアルギニン、100IU
/mlペニシリン（グラクソ（Glaxo））、50μg/mlストレ
プトマイシン（グラクソ）、25IU/mlポリミキシン（グ
ラクソ）、25μg/mlカナマイシン（ギブコ（Gibc
o））、 20μl/mlフンギゾン（スクイブ（Squibb））、 25μg/ml硫酸ゲンタマイシン（シグマ（Sigma））及び2
0μg/mlトロビシン（アップジョン（UpJohn））を含有
したRPMI1640培地〕を用いマウス腹膜マクロファージ供
給細胞層上で2mlウェル中0.5×10⁶細胞/mlで培養した。

次いで、すべての培養物を５％CO₂、95％湿空気中37
℃でインキュベートした。培地変更を３〜４日毎に行
い、３週間の培養後細胞を50mlフラスコに移した。すべ
ての細胞系を３〜４週間隔でロゼット化することにより
豊富化させた。

（ｃ）クローニング 細胞をマウス腹膜マクロファージの供給細胞層上平底
96ウェルプレート中５及び10細胞／ウェルで限定希釈下
培養した〔ドイルら,1985年，ヒューマン・イムノロジ
ー，第13巻，第199−209頁（Doyle et al.（1985）Huma
n Immunology,13,199−209）〕。培養物に１週間１回基
質添加したところ、３〜４週間後抗Ｄに陽性のクローニ
ング細胞が生じた。

（ｄ）クローンの誘導 クローンA4を生じるドナーＡポリクローナル細胞系を
PHAで開始し、続いてクローニング前に13回ロゼット化
することにより抗Rh（Ｄ）陽性細胞について豊富化させ
た。

IgG3サブクラスの抗Rh（Ｄ）抗体を産生する更に４つ
のクローン（A5、A6、A7及びA8と称される）は、クロー
ンA4のＢリンパ球から誘導された。

クローンA5、A6及びA7は優先権出願（英国特許出願公
開第8722019号）で各々B4、B5及びB6と誤記された。上
記選択細胞系の組織型及び核型分析の結果は、下記第IV
表で示されている。

（ｅ）培養上澄中における抗Rh（Ｄ）活性及びIgGの定
量 上澄中における抗Rh（Ｄ）活性は、オートアナライザ
ーでイギリスナショナルスタンダードに対して定量され
た。少なくとも２回の測定平均が計算された。IgGの定
量的評価は、ELISA〔ウェイクフィールドら，クリニカ
・キミカ・アクタ,1982年，第123巻，第303−310頁（Wa
kefield et al.,Clinica Chimica Acta（1982）123,303
−310）の方法の修正〕により各上澄毎に少なくとも８
回の測定で行われた。コーティング抗体〔アフィニティ
ー精製ヤギ抗ヒトIgG（シグマ）〕をpH9.6の0.05M炭酸
緩衝液中1/200で用いた。上澄及びスタンダード〔精製
ヒトIgG（シグマ）〕をRPMI1640＋10％FCSで希釈した。
ペルオキシダーゼ複合化ヤギ抗ヒトIgG（シグマ）をPBS
＋0.05％ツィーン20で1/500希釈したが、基質はTMB（3,
3′,5,5′−テトラメチルベンジジン）であった。

異なる実験条件下で確立されたすべての細胞系が安定
な抗体産生を示したのではなかった。しかしながら、そ
の後でクローニングされたすべての細胞系は６月間以上
にわたり高力価（微量滴定で1/33,000以上）の抗Rh
（Ｄ）を維持した。これら細胞系からのすべてのクロー
ンは抗Rh（Ｄ）に関して陽性であり、連続培養期間中そ
れらの力価を維持した（例えば、A4の場合２年間以
上）。倍加時間は３〜７日であった。細胞は抗体産生の
低下なしに懸濁培養物中でよく増殖した。

（ｆ）免疫グロブリンクラス及びサブクラス決定 イムノドットアッセイ〔マクドゥガル（McDougal）
ら,1983年，第63巻，第281−290頁〕がニトロセルロー
スに吸着されたモノクローナル抗Rh（Ｄ）抗体と抗Ig
G、抗IgM、抗κ及び抗λ抗血清〔セロテック（Serote
c）〕との反応を調べるため用いられ、陽性反応はペル
オキシダーゼ複合化抗ヒツジIgG（セロテック）しかる
後４−クロロ−１−ナフトールでの発色により検出し
た。IgGサブクラスは、モノクローナル抗サブクラス抗
体〔ユニパス（Unipath）〕による抗Ｄ被覆RBCの凝集か
ら評価された。

（ｇ）SDS−PAGE及びウエスターンブロッティング アイコブ（Iscove's）上澄（無血清）を15％ポリアク
リルアミドゲル上還元条件下で電気泳動に付した〔レム
リ，ネーチャー,1970年，第227巻，第680−685頁（Laem
mli,Nature（1970）227,680−685）〕。次いで、分離さ
れたタンパク質を電気泳動でニトロセルロース膜に移し
〔ブラネット，アンルズ・オブ・バイオケミストリー,1
981年，第112巻，第195−203頁（Brunette,Annals of B
iochemistry（1981）112,195−203）〕、これを抗IgG抗
血清（セロテック）でプローブ処理し、上記のように検
出した。

細胞系A4、A5、A6及びA7のモノクローナル抗体はすべ
て分子量約61,000ドルトンのＨ鎖を有することが判明し
た。

（ｈ）プロテインＡ吸着 上澄2ml容量をプロテインＡセファロースC1−4B（シ
グマ）の25mm（1ml）カラムに２回通し、抗Ｄの吸着を
滴定で評価した。選択された細胞系の抗Rh（Ｄ）は、Ig
G3サブクラスの免疫グロブリンに関して予想されるよう
にプロテインＡで吸着されなかった。

（ｉ）Gmアロタイプ判定 RBCをモノクローナル抗Rh（Ｄ）抗体でコーティング
し、凝集をGmアロタイプ判定試薬〔バーミンガム（Birm
ingham）又はアムステルダム（Amsterdam）〕で評価し
た。

（２）血清学 選択された細胞系の連続培養による培養上澄は、低イ
オン強度塩水中ウサギ抗ヒトIgG及び３％R₁R₁、R₁ｒ、
▲R^u ₁▼ｒ又は▲R^u ₀▼ｒ細胞を用いてIAG試験により測
定された（第IIIa及びIIIb表参照）。同一の上澄は同一
の条件下でＤ変異体RBCのパネルに対しても試験された
（下記第Ｖ表参照）。凝集の程度は常法に従いスケール
０〜６に等級分けされた。

（３）U937単球ロゼット化及び食作用アッセイ パック詰めOR₁R₂RBC100μｌを37℃で60分間にわたり
抗Ｄ（既に１μg/mlに調整されている）500μｌで感作
し、洗浄し、RPMI中１×10⁸細胞/mlで再懸濁した。U937
細胞を対数増殖期に採取し、50U/mlでγ−インターフェ
ロン〔アマーシャム（Amersham）〕の存在下又は非存在
下のいずれかで２日間培養した。次いで45×10⁶の赤血
球を1.5×10⁶のU937細胞のペレットに加え、混合して3
0:1の比率にした。ロゼット化アッセイの場合、細胞を
室温で５分間インキュベートし、600rpmで３分間遠心
し、更に５〜20分間後血球計測器で試験した。食作用は
細胞を37℃で３時間インキュベートした直後に評価し
た。結果は１以上の付着又は貪食された赤血球に関する
単球の率として示された。

クローンA4及びA5の培養上澄並びに慣用的ポリクロー
ナル抗Rh（Ｄ）血清に関して得られた結果の比較は、第
１及び２図で示されている。クローンA8の培養上澄で感
作された赤血球は、（γ−インタ−フェロンの非存在下
で培養された場合）U937細胞の100％とロゼットを形成
した。

（４）マクロファージ結合アッセイ RBC（R₂ｒ）（１容量部）をモノクローナル抗Rh
（Ｄ）（未処理培養上澄２容量部）で感作し、単球由来
培養マクロファージと共にインキュベートした。マクロ
ファージをアッセイにおけるそれらの使用前48時間にわ
たり組換え免疫インターフェロン〔ジュネーブのバイオ
ゲン（Biogen）〕500U/mlで刺激した。マクロファージ
に対するRBCの結合は肉眼で評価され、マクロファージ
結合インデックス（＝100のマクロファージに付着した
又はそれで貪食された赤血球の数）として示された。

下記第VI表は、クローンA4及びA5の培養上澄に関して
得られた結果について示している。赤血球−マクロファ
ージ相互作用を起こしうるこれら上澄の能力は、陽性コ
ントロールとして機能するポリクローナル抗Rh（Ｄ）の
場合と類似していた。

（５）リンパ球ADCCアッセイ クローンA4、A5、A7及びA8の培養上澄をリンパ球抗体
性細胞毒性（ADCC）アッセイで試験した。等容量（50μ
ｌ）の標的細胞（クロム51標識R₁R₁RBC懸濁液）、エフ
ェクター細胞（Ｋリンパ球）及び抗Rh（Ｄ）培養上澄を
穏やかな遠心後マイクロプレート中37℃で一夜インキュ
ベートし、クロム51枚放出量を測定した〔アーバニアッ
ク,1979年，ブリティシュ・ジャーナル・オブ・ヘマト
ロジー，第42巻，第303−314頁（Urbaniak（1979）Brit
ish Journal of Haematology,42,303−314）〕・エフェ
クター：標的細胞の比率は15:1であった。

試験された培養上澄はいずれも有意のADCC活性を示さ
ないことが判明した（下記第VII表参照）。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｇ０１Ｎ 33/577 Ｂ 33/563 9162−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｃ 33/577 9281−4Ｂ 5/00 Ｂ (72)発明者 カンペル，ベリンダ メアリー イギリス国ブリストル、コングレスベリ ー、リントン、ロード、ウッドサイド （番地なし)

Claims (14)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】下記の本質的特徴： （ａ）Rh血液型系のＣ、ｃ、Ｅ又はｅ抗原ではなくRh
   （Ｄ）抗原に対して活性を示す； （ｂ）IgG3タンパク質である； （ｃ）κＬ鎖を有する； （ｄ）アロタイプG3m（21）に属する； （ｅ）間接的抗グロブリン試験でD^u細胞に対して活性を
   示す； （ｆ）D^IV、D^V及びD^VII変異抗原に対して活性を示す；
   及び （ｇ）D^VI又はD^B変異抗原に対して不活性である； を有するヒトモノクローナル抗体及びその抗原結合性断
   片。
2. 【請求項２】細胞系ECACC 87091606により産生される、
   請求項１に記載のモノクローナル抗体。
3. 【請求項３】請求項１又は２に記載されたモノクローナ
   ル抗体が１以上の付加的結合特異性を有する更に１種以
   上の抗Rh（Ｄ）抗体と混合された抗Rh（Ｄ）試薬。
4. 【請求項４】D^VI変異体と結合しうるモノクローナル抗
   体が存在する、請求項３に記載の抗Rh（Ｄ）試薬。
5. 【請求項５】抗体成分が： （ａ）請求項１に記載されたモノクローナル抗体； （ｂ）抗D^u活性のない又は非常に弱いIgM抗Rh（Ｄ）； を含む、請求項３に記載の抗Rh（Ｄ）試薬。
6. 【請求項６】抗体成分が間接的抗グロブリン試験でD^VI
   赤血球に対する活性を示しうるIgGモノクローナル抗Rh
   （Ｄ）を更に含む、請求項５に記載の抗Rh（Ｄ）試薬。
7. 【請求項７】成分（ｂ）が寄託されたハイブリドーマ細
   胞系MAD−２（ECACC 86041803）及びFOM−１（ECACC 87
   021301）のモノクローナルIgMから選択される、請求項
   ５又は６に記載の抗Rh（Ｄ）試薬。
8. 【請求項８】請求項１に記載されたモノクローナル抗体
   を産生しうるヒトリンパ球由来細胞系。
9. 【請求項９】ヨーロピアン・コレクション・オブ・アニ
   マル・セル・カルチャーズに受理No.ECACC 87091606号
   として寄託された、請求項８に記載の細胞系。
10. 【請求項１０】新生児の溶血症を防止するための受動免
    疫用である、請求項１又は２に記載のモノクローナル抗
    体。
11. 【請求項１１】請求項８又は９に記載された細胞系の培
    養により得られた培養上澄。
12. 【請求項１２】新生児の溶血症を防止する受動免疫用医
    薬組成物であって、 生理学上許容される担体又は希釈剤と共に請求項１又は
    ２に記載されたモノクローナル抗体を含むことを特徴と
    する医薬組成物。
13. 【請求項１３】抗体成分がD^VI変異体と結合しうるモノ
    クローナル抗体を更に含む、請求項12に記載の医薬組成
    物。
14. 【請求項１４】請求項１又は２に記載されたモノクロー
    ナル抗体又は請求項３〜７のいずれか一項に記載された
    抗Rh（Ｄ）試薬が用いられ、上記モノクローナル抗体又
    は上記試薬が水性溶液の形態であることを特徴とするRh
    型判定方法。