DK162773B - Humane anti-rh(d) monoklonale antistoffer, antistofferne til anvendelse til passiv immunisering, anti-rh(d)-reagenser og farmaceutiske praeparater, der indeholder antistofferne, humane lymfocytafledte cellelinjer, der producerer antistofferne, samt fremgangsmaade til rh-typebestemmelse under anvendelse af antistofferne - Google Patents

Description

i

DK 162773 B

Den foreliggende opfindelse angår humane monoklonale antistoffer mod Rh(D)-antigenet på humane røde blodlegemer. Især angår opfindelsen sådanne antistoffer af IgG3-underklassen, hvilke antistoffer kan anvendes til detektion af ikke blot det normale Rh(D)-antigen på 5 enten D-positive eller "svage D-" eller Du-celler, men også betydningsfulde varianter af Rh(D)-antigenet.

Blandt antigenerne fra det såkaldte Rh-blodtypesystem er Rh(D)-antigenet ansvarligt for nogle af de mest alvorlige reaktioner efter transfusion til en patient med tilsvarende antistof. Eftersom et 10 Rh(D-)-individ med anti-Rh(D), som modtager Rh(D+)-blod, er tilbøjeligt til at være udsat for betydelig nedbrydning af røde blodlegemer på grund af Rh(D)-fænotype-irikompatibiliteten, klassificeres blod fra donorer og blodtransfusionsmodtagere rutinemæssigt som Rh(D+) eller Rh(D-) ved agglutinationstests med anti-Rh(D)-antistof. Røde blod-15 legemers Rh-fænotype defineres almindeligvis yderligere under henvisning til Fisher-Race-systernet, som er baseret på den antagelse, at nedarvningen af Rh-antigenerne bestemmes af tre par allele gener, C-c. D-d og E-e. der er på meget tæt forbundne loci. Ifølge denne teori kan en person arve et sæt af tre Rh-gener fra hver af sine 20 forældre: (i) £ eller c, (ii) D eller d, (iii) E eller e (der er indtil nu ikke identificeret noget d-antigen, men symbolet "d" anvendes til at indikere tilstedeværelsen af et gen, der er en allel til D-genet, og som ikke producerer D-antigen). Fx kan en Rh(D+)-person arve CDe fra den ene af forældrene og cde fra den anden. Hyppigheden 25 af de almindeligste Rh-genkombinationer, bestemt under henvisning til Fisher-Race-systemet for en engelsk befolkning, sammen med de "korte symboler", der anvendes, især i talesproget, er anført i tabel I nedenfor:

TABEL I

2

DK 162773 B

Hyppighed af almindelige Rh-gener for en engelsk befolkning

Kort symbol CDE-nomenklatur Hyppighed (Z) 5 ___ R1 CDe 40,8 r cde 38,9 R2 cI)E 14,1 R° cBe 2,6 10 Rlw CwDe 1,3

Il cdE 1,2 ri C£e 0,01

Rz CDE sj ældnere

ry CdE

15 RN fOD(e’) På trods af dets udbredelse med årene har Fisher-Race-systemet ikke været egnet til at forklare alle de reaktioner, der er blevet observeret med Rh-systemet (Mollison, P.L. (1983) Blood Transfusion In 20 Clinical Medicine, 7. udgave, Blackwell Scientific, Oxford). Verdens-sundhedsorganisationen (WHO) har ikke desto mindre anbefalet, at denne nomenklatur på grund af sin enkelhed og ensartethed bør anvendes universelt, og alle de nedenfor angivne Rh-genotyper er defineret på basis af det konventionelle Fisher-Race-system.

25 Foruden behovet for anti-Rh(D)-antistof til Rh-typebestemmelse af røde blodlegemer er et sådant antistof også meget påkrævet til passiv immunisering af Rh(D-)-mødre for at forhindre hæmolytisk sygdom hos nyfødte (erytroblastosis foetalis). Denne tilstand opstår hos nyfødte Rh(D+)-børn fra Rh(D-)-mødre, som tidligere er blevet sensitiviseret 30 over for Rh(D)-antigen som et resultat af, at IgG-anti-Rh(D)-antistoffer krydser placenta under graviditeten og forårsager nedbrydning af de føtale røde blodlegemer. Sensitivisering af Rh(D-)-moderen over for Rh(D)-antigen kan have fundet sted ved fødslen af et tidligere Rh(D+)-barn på grund af, at nogle føtale røde blodlegemer et kommet 35 ind i moderens kredsløb og er blevet genkendt af moderens • 3

DK 162773 B

immunsystem. For at nedsætte forekomsten af erytroblastosis foetalis er det rutinemæssig praksis i Storbritannien og mange andre lande at give Rh(D-)-mødre anti-Rh(D)-antistoffer umiddelbart efter fødslen af et Rh(D+)-barn, således at eventuelle Rh(D+) røde blodlegemer, som er 5 kommet ind i moderens kredsløb, hurtigt fjernes (Mollison, P.L.

(1983) loc. cit.; Laros Jr., R.K. (1986) "Erythroblastosis Fetalis” i "Blood Group Disorders In Pregnancy", kapitel 7, s. 103).

For tiden opnås anti-Rh(D)-antistof til anvendelse til både Rh-typebestemmelse af røde blodlegemer og passiv immunisering af Rh(D-)-10 mødre i stor udstrækning direkte fra kvindelige donorer, som er immuniseret under graviditeten, eller fra immuniserede frivillige forsøgspersoner af hankøn. Det vellykkede program med profylaktisk administration af human anti-Rh(D)-immunglobulin til Rh(D-)-kvinder efter fødslen har imidlertid medført et dramatisk fald i antallet af natur-15 ligt alloimmuniserede kvinder (Urbaniak, S.J., "EhD haemolytic disease of the newborn: the changing scene", Br. Med. J. (1985) 291.

4-6). Tilsigtet immunisering af individer med Rh(D+) røde blodlegemer medfører også de risici, som er almindelige ved alle transfusioner med røde blodlegemer, fx risiko for overførsel af 20 hepatitis-virus og HIV. Der er derfor en stor interesse for at opnå humane monoklonale anti-Rh(D)-antistoffer til både diagnostiske og terapeutiske formål.

Ved rutinemæssig blodtestning opdeles blodtyper som nævnt ovenfor i Rh(D+) og Rh(D-) på basis af den tilsyneladende tilstedeværelse eller 25 det tilsyneladende fravær af Rh(D)-antigen på de røde blodlegemer, hvilket indikeres ved agglutinationstests med anti-Rh(D). Imidlertid har et lille antal personer med tilsyneladende Rh(D-)-blod røde blodlegemer, der ikke agglutineres direkte af anti-Rh(D) under sådan rutinemæssig testning, men som reagerer, når D-typebestemmelsen udfø-30 res under anvendelse af udvalgte anti-Rh(D)-reagenser ved den indirekte antiglobulintest. Således identificerede celler betegnes Du.

Hyppigheden af Du-fænotypen er totalt ca. 0,2%, 0,6% blandt den europide race og ca. 1,5% blandt alle gravide Rh(D-)-kvinder. Mindst tre forskellige mekanismer kan være ansvarlige for ekspressionen af 35 Du-fænotypen: (1) nedarvet fravær af en del af det komplette Rh(D)- 4

DK 162773 B

antigen, (2) gen-interaktion med undertrykkelse af D med C i trans-stillingen, og (3) et D-gen, der producerer et svagt antigen.

I de tidlige 1950'ere kom der for første gang rapporter om tilstedeværelsen af anti-Rh(D) i individer med Du-fænotypen efter blodtrans-5 fusion med Rh(D+)-blod eller graviditet, der førte til fødsel af et Rh(D+)-barn. Det blev senere klart, at i nogle individer, hvis blod klassificeres som Rh(D+)> mangler dele af Rh(D)-antigenet i de røde blodlegemer. Når personer ved transfusion eller graviditet udsættes for Eh(D+) røde blodlegemer, som bærer det komplette Rh(D)-antigen, 10 er disse personer, som bærer et ukomplet Rh(D)-antigen på deres røde blodlegemer, i stand til at producere alloanti-D mod den Rh(D)-anti-gendfel, som de mangler. Blodet fra sådanne individer kaldes D-vari-ant, når de røde blodlegemer reagerer direkte med rutinemæssige anti-Rh(D)-reagenser, eller Du-variant, når cellerne kun reagerer ved den 15 indirekte antiglobulinteknik.

Den iagttagelse, at allo-anti-Rh(D) kan produceres i patienter, som har Rh(D+) røde blodlegemer, har ført til almindelig brug af udtrykket "D-mosaik" for at beskrive Rh(D)-antigenet i dets komplette native form. Rutinemæssige anti-Rh(D)-reagenser kan generelt ikke 20 skelne de røde blodlegemer, som mangler en del af D-mosaikken, fra de røde blodlegemer, som har alle D-komponenterne. D-variant-fænotypeme er kategoriseret af Tippett og Sanger (Vox. Sang. (1962) 2, 9-13).

Dette system er baseret på interaktion mellem røde blodlegemer og serum fra individer med D- og Du-variant. De syv kategorier (se tabel 25 II nedenfor) åbner mulighed for udvidelser; der er allerede anerkendt underinddelinger i kategorierne III, IV og V. Kategorierne I og II har vist sig at have så mange lighedspunkter, at de nu generelt anses for at være en enkelt undergruppe.

TABEL II

5

DK 162773 B

Tippett og Sanger-kategorier for D- eller Du-positivt blod med anti-Rh(D) 5 Kategori Racemæssig oprindelse Sædvanlig haplotype I Hvid DCe

II

Illa Sort 10 Hib Sædvanligvis sortDce IIIc Hvid IVa Flest sort, nogle hvid IVb Hvid Dce

Va Sort og hvid 15 Vb Hvid DuCe

Vc Sort og hvid VI Næsten alle hvidDuCe VII Hvid DCe 20 En alternativ, men mindre anvendt, klassificering af Wiener anvender bogstaverne Δ, B, C og D i stedet for romertal. Selv om der ikke er nogen direkte sammenhæng mellem de to systemer, menes det ofte, at DB og kan anvendes i flæng.

Selv om hyppigheden af D og Du-variant individer i den humane be-25 folkning er relativt lav, er det samlede antal individer med disse blodtyper, som potentielt har en vis risiko for effektiv anti-Rh(D)-dannelse som resultat af eksposition ved blodtransfusion eller graviditet for ikke-variant Rh(D+)-celler, langt fra ubetydeligt. Foruden Rh(D-)-kvinder, som foder Rh(D+)- eller Du-børn, kan Du-variant kvin-30 der, som føder et Rh(D+)-barn, også have gavn af anti-Rh(D)-behandling efter fødslen for at nedsætte risikoen f®r erytroblastosis foe-talis (White, C.A. et al. (1983) Am. J. Obstet. Gynecol. 145, 1069-1073). Antiserum, som kan skelne mellem D og Du-variant røde blodlegemer, er ikke almindeligt tilgængelige. Derfor anses tilvejebrin-35 gelse af monoklonale anti-Rh(D)-antistoffer med bindingsspecificite- 6

DK 162773 B

ter over for D og Du-variant røde blodlegemer for at være nyttig, idet dette muliggør lettere identificering og kategorisering af individer, som har sådanne celler (især D eller Du-variant gravide kvinder, som er egnede kandidater til profylaktisk anti-Rh(D)-behand-5 ling), og dette giver yderligere strukturel information om Rh(D)-antigenkomplekset.

Fremstilling af humant monoklonalt anti-Rh(D)-antistof er tidligere blevet opnået ved: (a) direkte kloning af Epstein Barr-virustransformerede B-lymfocyt-10 cellelinjer (i det følgende betegnet EBV-transformerede LCL) afledt fra B-lymfocytter fra anti-Rh(D)-positive donorer (se GB-A 2127434;

Crawford et al. (1983) Lancet 1, 386-388 og Paire et al. (1986)

Immunol. Lett. 13, 137-141), (b) kloning af hybridomcellelinjer, der er dannet ved fusion af anti-15 Rh(D)-producerende, EBV-transformerede LCL med muse-, muse-humane eller humane myelomcellelinjer (se verserende GB-patentansøgning nr. 8709748, Thompson et al. (1986) Immunol. 58, 157-160 og EP-A-0162918), eller (c) fusion af en human LCL med immune B-celler (Lowe et al. (1986) 20 Vox. Sang. 51, 212-216).

Ved kloning af EBV-trans formerede LCL fra anti-Eh(D) -positive donorer har det imidlertid været muligt at opnå monoklonale anti-Rh(D)-antistoffer af IgG-klassen, hvilke antistoffer har et særligt nyttigt bindingsspecificitetsspektrum, der ikke er påvist for noget 25 tidligere beskrevet monoklonalt anti-Rh(D)-antistofreagens.

Den foreliggende opfindelse angår således humane monoklonale antistoffer med følgende væsentlige karakteristika: (a) de udviser aktivitet mod Rh(D)-antigen, men ikke C, c, E eller e antigener fra Rh-blodtypesysternet; 30 (b) de er IgG3-proteiner; 7

DK 162773 B

(c) de har kappa-lette kæder; (d) de har allotypen G3m(21); (e) de udviser aktivitet mod Du-celler ved en indirekte antiglobu-lintest; 5 (f) de udviser aktivitet mod D^, og D^-·*- variant-antigener; og (g) de er inaktive mod eller D® variant-antigener, og antigenbindende fragmenter deraf.

Foretrukne monoklonale antistoffer ifølge opfindelsen er monoklonale antistoffer fra cellelinjen ECACC 87091606, der er deponeret den 16.

10 september 1987 hos European Collection of Animal Cell Cultures,

Porton Down, Storbritannien.

Desuden har monoklonale antistoffer ifølge opfindelsen vist sig at udvise aktivitet mod R^-antigenet.

Monoklonale antistoffer ifølge opfindelsen kan anvendes som 15 rutinemæssige anti-D-reagenser til klassificering af røde blodlegemer som D-positive, Du eller D-negative. Til dette formål kan et monok-lonalt antistof ifølge opfindelsen enten anvendes alene eller i kombination med ét eller flere yderligere anti-Rh(D)-antistoffer, fortrinsvis monoklonale antistoffer, der har én eller flere yder-20 ligere bindingsspecificiteter. Et aspekt af opfindelsen angår således et anti-Rh(D)-reagens, der indeholder et monoklonalt antistof som angivet ovenfor kombineret med ét eller flere yderligere anti-Rh(D)-. antistoffer med én eller flere yderligere bindingsspecificiteter. Fx kan et monoklonalt antistof ifølge den foreliggende opfindelse så-25 ledes med fordel blandes med et yderligere monoklonalt antistof, som kan binde D^-varianten, til dannelse af et anti-Rh(D)-reagens, der har bredere specificitet, og som kan klassificere D^*-variant røde blodlegemer som D-positive. I et sådant anti-Rh(D)-reagens kan et IgG3-antistof ifølge den foreliggende opfindelse fx kombineres med 8

DK 162773 B

et monoklonalt IgGl-antistof af den type, der er beskrevet i verserende dansk patentansøgning nr. 696/90, og som har følgende bindingskarakteristika: (a) det udviser aktivitet mod Rh(D)-antigen, men ikke C, c, E eller 5 e antigener af Rh-blodtypesystemet; (b) det udviser aktivitet mod D^, D^-*, og variantantigener; og (c) det er i alt væsentligt ikke-reaktivt med ikke-papainbehandlede D^-celler i en IAG-test.

10 Blandt sådanne antistoffer er et særligt foretrukket antistof til anvendelse i kombination med et monoklonalt anti-Rh(D)-antistof ifølge den foreliggende opfindelse det monoklonale antistof fra cellelinjen med betegnelsen B7, der den 16. september 1987 er deponeret hos European Collection of Animal Cell Cultures, Porton Down, 15 Storbritannien, med deponeringsnummeret ECÅCC 87091603.

Hvis monoklonale antistoffer ifølge den foreliggende opfindelse anvendes til Eh-typebestemmelse parallelt med et anti-Rh(D), som er reaktivt mod D^--varianter, fx et passende polyklonalt anti-Rh(D)-serum, kan de blodprøver, som giver et positivt resultat i en agglu-20 tinationstest med sidsnævnte, men negative resultater med et monoklonalt antistof ifølge opfindelsen, forventes hovedsageligt eller fuldstændigt at være af -kategorien (eftersom dette praktisk talt er det eneste D-variant-antigen, mod hvilket de hidtil ukendte monoklonale antistoffer er inaktive). Det er blevet fastslået, at der blandt 25 individer, der klassificeres som Kh(D+) eller Du ved en konventionel agglutinationstest, men som er i stand til at producere afiti-D, er en høj procentdel, der har D^ - variant - antigenet (Mollison, P.L. (1983) i "Blood Transfusion In Clinical Medicine", kapitel 8, s. 339). Én anvendelse af de monoklonale antistoffer ifølge opfindelsen er netop 30 til undersøgelse af forekomsten af individer af D^-typen i en befolkning .

9

DK 162773 B

Et monoklonalt antistof ifølge den foreliggende opfindelse kan også have særlig værdi til anvendelse i et anti-Rh(D)- typebestemmelses -reagens til supplering af specificiteten af et anti-Rh(D) med ingen eller kun svag anti-Du-aktivitet, dvs. utilstrækkelig aktivitet mod 5 Du-celler til at være i stand til på pålidelig måde at skelne sådanne celler fra D-negative celler i en konventionel agglutinationstest.

Under FDA-bestemmelserne i USA, der regulerer kommercielle anti-Rh(D)-typebestemmelsesreagenser, er det obligatorisk, at et sådant reagens skal være i stand til at skelne Du røde blodlegemer fra vir-10 kelig D-negative røde blodlegemer. Særligt foretrukne blandt kombina-tions-anti-Rh(D)-reagenser ifølge den foreliggende opfindelse er sådanne reagenser, der opfylder ovennævnte betingelse, og i hvilke et IgG anti-Rh(D) ifølge opfindelsen anvendes sammen med et IgM anti-Rh(D) med ingen eller kun svag Du-aktivitet, fx et IgM monoklonalt 15 anti-Rh(D) valgt blandt de monoklonale IgM'er fra de deponerede hy-bridomcellelinjer MAD-2 (ECACC 86041803) og FOM-1 (ECACC 87021301), som bl.a. er beskrevet i EP 0251440. Et sådant reagens kompletteres med fordel med i det mindste ét yderligere IgG monoklonalt anti-Rh(D)-antistof, som individuelt udviser aktivitet med røde Du-blod-20 legemer ved den indirekte antiglobulintest, således at det blandede reagens reagerer i den samme test med Du-, D^-, D^- og D^-celler.

Når der udføres Rh-typebestemmelse med et sådant reagens, vil D-positive celler først blive agglutineret direkte af IgM anti-Rh(D).

De resterende ikke-agglutinerede celler (tilsyneladende D-negative) 25 kan derefter opdeles yderligere i virkelig D-negative celler og Du-celler ved tilsætning af konventionelt Coombs reagens med henblik på en indirekte antiglobulintest, hvorefter Du-celler, som binder IgG-antistof, vil blive agglutineret og dermed skelnet.

Et interessant reagens ifølge opfindelsen er et sådant, hvor anti-30 stofkomponenten yderligere omfatter et monoklonalt IgG anti-Rh(D), der kan udvise aktivitet mod D^-celler i en indirekte antiglobulintest.

De monoklonale anti-Rh(D)-antistoffer ifølge opfindelsen kan fremstilles ved konventionelle fremgangsmåder, som er kendte til frem-35 stilling af monoklonale antistoffer, og især ved dyrkning af EBV-transformerede humane B-lymfodytter, som er udvalgt på basis af ud- 10

DK 162773 B

skillelse af anti-Rh(D)-immunglobulin, som har de ovenfor anførte karakteristika for de nødvendige antistoffer.

Der er nu i detaljer blevet undersøgt 5 klonede EBV-transformerede LCL, som producerer IgG3 monoklonale anti-Rh(D)-antistoffer som de-5 fineret ovenfor; disse betegnes i det følgende A4, A5, A6, A7 og A8.

Alle disse klonede cellelinjer blev opnået ved at gå ud fra perifere B-lymfocytter fra en udvalgt anti-Rh(D)-donor og anvende den i GB-A 2145113 beskrevne fremgangsmåde eller en i det væsentlige tilsvarende fremgangsmåde til etablering og kloning af EBV-transformerede LCL, 10 som producerer et monoklonalt antistof med den ønskede specificitet (se eksempel 1). I kontinuerlig kultur tinder anvendelse af RPMI-1640-medium tilsat 10% (vol/vol) mycoplasmafrit føtalt kalveserum, 0,2 mg/ml arginin og antibiotika for at forhindre mycoplasmavækst har de vist sig at være særdeles stabile og give en kultursupematant med en 15 anti-Rh(D)-titer, bestemt ved et indirekte antiglobulin- (IAG)-assay i saltvand med lav ionstyrke mod R^Rj^ (CDe/CDe) røde blodlegemer, i området 2000-16000. En sådan kultursupematant er egnet til anvendelse ved Rh-typebestemmelse uden behov for koncentration og kan endog fortyndes til anvendelse.

20 De ovenfor nævnte specifikke kloners karakteristika med hensyn til antistofproduktion i kontinuerlig kultur er opsummeret i tabel Illa og Hib nedenfor. Alle disse kloner har vist sig at bevare en stabil titer i løbet af mindst 8 måneders kontinuerlig kultur. Agglutinati-onsgraden ved IAG-tests blev gradueret på konventionel måde på en 25 skala fra 0 til 6.

DK 162773 B

li TABEL IIla IAG-titer (3% røde blodlegemer i saltvand med lav ionstyrke) R^r-celler 64-256 5 RjRi-celler 2000-16000 R^r-celler 32-256

Mikrotiter med bromelain- behandlede R2R2-celler 8000-16000

Anti-Rh(D) (IU/ml) 2-12 10 IgG (pg/ml) 1,1-2,8 TABEL Illb

Kultur- A4 A5 A6 A7 A8 15 supernatant IAG-reaktivitet af supernatant med 3% røde blodlegemer i saltvand med lav ionstyrke (graduering 0 til 6) Røde blodlegemers fænotype 20 R-^R^ 6 6 6 6 5 R^r -6655 5 r£r 6 6 6 6 5

Det viste sig yderligere, at de monoklonale antistoffer ifølge 25 opfindelsen, der blev testet, reagerede med røde blodlegemer med fænotyperne R2rG-, hrs-, RjRz og R2RZ, men var negative med r"Gr, rm, rG, r'sr, hrB-, r,wr og Rh33+.

I overensstemmelse med et yderligere aspekt angår den foreliggende opfindelse således en fremgangsmåde til Rh-typebestemmelse af røde 30 blodlegemer, ved hvilken fremgangsmåde der anvendes en vandig opløsning af et monoklonalt anti-Rh(D)-immunglobulin ifølge den foreliggende opfindelse. Det monoklonale immunglobulin er fortrinsvis 12

DK 162773 B

indeholdt i en kultursupematant, som kan anvendes direkte eller mere sædvanligt efter fortynding. Som nævnt ovenfor kan det være ønskeligt at blande et IgG3-antistof ifølge den foreliggende opfindelse med ét eller flere yderligere monoklonale anti-Rh(D) 5 antistoffer med forskellig specificitet, fx et yderligere IgG- antistof med anti-D^*-aktivitet. Egnede fortyndingsmidler omfatter fysiologisk saltvand eller phosphatbufret saltvand, der fordelagtigt indeholder bovint serumalbumin og et overfladeaktivt middel eller suspenderingsmiddel såsom Tween 80 eller methylcellulose.

10 IgG3 anti-Rh(D)-antistoffer ifølge den foreliggende opfindelse er gode promotorer af binding og fagocytose af Eh(D+) røde blodlegemer af monocytter og makrofager og er derfor også af stor interesse med henblik på tilvejebringelse af effektiv profylaktisk anti-D-behand ling til forebyggelse af erytroblastosis foetalis. Kultursupematan-15 ter af cellelinjerne A4 og A5 har ved in vitro-assavs vist sig at inducere mere omfattende rosettering og fagocytose af sensitiverede røde blodlegemer af U937-monocytter end et konventionelt polyklonalt anti-Rh(D)-serum. De samme kultursupematanter kan desuden sammenlignes med et konventionelt polyklonalt anti-Rh(D)-servan med hensyn 20 til mediering af binding af sensitiverede røde blodlegemer til dyrkede makrofager afledt af interferon-y-stimulerede monocytter (se afsnit (iii) og (iv) i eksempel 1).

Et monoklonalt IgG3-antistof ifølge opfindelsen kan anvendes til passiv immunisering af en Rh(D-)- eller D- eller Du-variant-moder 25 efter fødslen af et Rh(D+)-barn for at forhindre sensivitisering af moderen over for Rh(D)-antigen. Et yderligere aspekt af opfindelsen angår derfor et monoklonalt antistof som her omhandlet til anvendelse til passiv immunisering med henblik på forebyggelse af hæmolytisk sygdom hos nyfødte. En steril opløsning af et sådant antistof til 30 injektion i mennesker kan formuleres i et hvilket som helst fysiologisk acceptabelt vandigt medium, fx isotonisk phosphatbufret saltvand eller serum. Alternativt kan antistoffet tilvejebringes i en frysetørret formulering, der er klar til rekonstitution før anvendelse.

For at tilvejebringe et høj effektivt profylaktisk præparat til 35 anvendelse til forebyggelse af erytroblastosis foetalis kan der anvendes et monoklonalt anti-Eh(D) ifølge den foreliggende opfindelse 13

DK 162773 B

sammen med ét eller flere yderligere anti-Rh(D)-antistoffer. Et yderligere aspekt af opfindelsen angår et farmaceutisk præparat til anvendelse til passiv immunisering med henblik på forebyggelse af hæmolytisk sygdom hos nyfødte, hvilket præparat omfatter et 5 monokfonalt antistof som tidligere beskrevet sammen med en fysiologisk acceptabel bærer eller et fysiologisk acceptabelt fortyndingsmiddel. Til rutinemæssig anvendelse er der fortrinsvis inkluderet et anti-D^·*·-antistof. Et antistof ifølge den foreliggende opfindelse kan også finde anvendelse i et profylaktisk præparat til 10 komplettering af et IgGl monoklonalt anti-Rh(D)-antistof som beskrevet i verserende dansk patentansøgning nr. 694/90, der kræver prioritet fra GB-A-8722018, og hvortil der henvises.

Et aspekt af opfindelsen angår en human lymfocytafledt cellelinje, der kan producere et monoklonalt antistof ifølge opfindelsen. Et 15 yderligere aspekt af den foreliggende opfindelse udgøres af et monoklonalt antistof af den her omhandlende art, der er indeholdt i en kul tur supernatant, der er opnået ved dyrkning af en cellelinje af den ovenfor omhandlende art.

A7 af de ovenfor nævnte klonede EBV-transformerede lymfocytcellelin-20 jer blev den 16. september 1987 deponeret hos European Collection of Animal Cell Cultures, Porton Down, Storbritannien, med deponeringsnummeret ECACC 87091606. Denne cellelinje udgør et særligt aspekt af opfindelsen.

Yderligere detaljer angående fremstillingen af denne deponerede cel-25 lelinje og identifikationskarakteristika for den kultursupernatant, der kan fås ved kontinuerlig kultur deraf, er angivet i eksempel 1 af følgende eksempler.

EKSEMPEL 1 14

DK 162773 B

(i) Etablering og kloning af anti-Rh(D')-producerende EBV-transformerede LCL

(a) Kilde til B-lymfocytter 5 Donor A: Kvinde, immuniseret under hendes første og eneste graviditet (som medførte fødsel af et normalt Rh(D+) -barn), boostet med 0,5 ml pakket Kh(D+) (R^r) røde blodlegemer 4 år efter fødslen, og en perifer blodprøve taget 8 dage efter boostning, da hendes anti-D-niveau i serum var 60 IU/ml.

10 (b) Etablering af cellelinjer

Mononukleære celler fra perifert blod fra donor A blev adskilt på Lymphoprep (Nyegaard & Co.)i inkuberet i nærværelse af EBV (1 ml kul-tursupernatant fra filtreret mycoplasmafri B95-8-cellelinje pr. 10^ celler) ved 37°C i 1 time og vasket i phosphatbufret saltvand (PBS).

15 Alikvoter blev udpladet med 0,5x10^ celler/ml i 2 ml-brønde under anvendelse af lymfoblastoid-cellekulturmedium (RPMI-1640-medium indeholdende 10% (vol/vol) mycoplasmafrit føtalt kalveserum (FCS), 0,2 mg/ml arginin, 100 IU/ml penicillin (Glaxo), 50 /tg/ml streptomycin (Glaxo), 25 IU/ml polymyxin (Glaxo), 25 /ig/ml kanamycin (Gibco), 20 20 /il/ml fungizone (Squibb), 25 /ig/ml gentamycinsulfat (Sigma) og 20 /ig/ml trobicin (Upjohn)), tilsat enten 1% (vol/vol) phytohæmaggluti-nin (PHA) eller 0,5 /ig/ml cyclosporin A (CsA) oven på et fødelag af muse-peritoneale makrofager.

Alle kulturerne blev derefter inkuberet ved 37°C i 5% CO2, 95% 25 befugtet luft. Mediumskift blev foretaget hver 3. til 4. dag, og efter 3 ugers dyrkning blev cellerne overført til 50 ml-kolber. Alle cellelinjerne blev beriget ved rosettering med 3-4 ugentlige intervaller.

15

DK 162773 B

(c) Kloning

Celler blev udpladet ved begrænsende fortynding med 5 og 10 celler pr. brønd i fladbundede 96-brønds plader oven på et fødelag af peri-toneale makrofager fra mus (Doyle et al. (1985) Human Immunology 13, 5 199-209). Kulturerne blev tilført næring én gang om ugen, og efter 3- 4 uger blev der opdyrket klonede celler, som var positive for anti-D.

(d) Afledning af kloner

Den polyklonale cellelinje fra donor A, der gav anledning til klonen A4, blev initieret med PHA og sekventielt beriget for anti-Rh(D)-10 positive celler ved rosettering 13 gange før kloning.

4 yderligere kloner, som producerede anti-Rh(D)-antistof af IgG3-underklassen, (betegnet A5, A6, A7 og A8) blev afledt af B-lymfocytter fra klonen A4.

Klonerne A5, A6 og A7 blev fej lagtigt betegnet henholdsvis B4, B5 og 15 B6 i prioritetsansøgningen (GB-A 8722019). Resultaterne af vævstype-og karyotype-analyse af ovenstående cellelinjer er angivet i tabel IV nedenfor.

DK 162773 B

16

TABEL IV

Cellelinj e A5 A6 A7 A8

Donor A

5 køn hunkøn Vævstype HLA: A 2,wl9 B 44,35 DR 3,5 10 Karvotvne kønskromosomer xx ploiditet nogle diploide celler, nogle tetra- ploide celler markører 12p+, 22p+ 15 _ (e) Kvantificering af anti-Rh(D)-aktivitet og IgG i kultursuperna-tanter

Anti-Rh(D)-aktivitet i supernatanteme blev kvantificeret i forhold til britiske nationalstandarder ved hjælp af en Auto Analyser. Mid-20 delværdien af mindst to bestemmelser blev beregnet. Den kvantitative IgG-bedømmelse blev udført ved ELISA (modifikation af metoden ifølge Wakefield et al. i Clin. Chim. Acta. (1982) 123. 303-310) med mindst 8 bestemmelser for hver supernatant. Overtrækningsantistof (affini-tetsoprenset gede-anti-human IgG (Sigma)) blev anvendt med 1/200 i 25 0,05 M carbonatbuffer, pH 9,6. Supernatanter og standard (oprenset human IgG (Sigma)) blev fortyndet i RPMI 1640 + 10% FCS. Peroxidase-konjugeret gede-anti-human IgG (Sigma) blev fortyndet 1/500 i PBS + 0,05% Tween 20, og substratet blev behandlet med TMB (3,3',5,5'-tetramethylbenzidin).

30 Ikke alle de cellelinjer, der var etableret under forskellige forsøgsbetingelser, udviste stabil antistofproduktion. Imidlertid havde alle de cellelinjer, som derefter blev klonet, bevaret høje titre (over 1/33.000 ved mikrotiter) af anti-Rh(D) i mere end 6 måneder.

Alle kloner fra disse cellelinjer var positive for anti-Rh(D) og 17

DK 162773 B

bevarede deres titre under hele den kontinuerlige kultur (fx i tilfælde af A4 i over 2 år). Fordoblingstiden var 3-7 dage. Cellerne voksede godt i suspensionskultur uden tab af antistofproduktion.

(f) Bestemmelse af immunglobulinklasse og -underklasse 5 Et immunodot-assay (McDougal et al. (1983) 63, 281-290) blev anvendt til bestemmelse af reaktionen af de monoklonale anti-Rh(D)-antistoffer absorberet på nitrocellulose med anti-IgG-, anti-IgM-, anti-kappa- og anti-lambda-antiserum (Serotec); positive reaktioner blev detekteret med peroxidase-konjugeret anti-fåre-IgG (Serotec) efter-10 fulgt af farveudvikling med 4-chlor-l-naphthol. IgG-underklassen blev bedømt ved agglutination af anti-D-overtrukne røde blodlegemer med monoklonale anti-underklasse-antistoffer (Unipath).

(g) SDS-PAGE og Western Blotting

Iscoves supernatanter (serumfri) blev underkastet elektroforese under 15 reducerende betingelser på 15% polyacrylamidgeler (Laemmli, Nature (1970) 227. 680-685). De adskilte proteiner blev derefter elektroforetisk overført til nitrocellulosemembraner (Burnette, Annals Bio-chem. (1981) 112. 195-203), som blev probet med anti-IgG-antiserum (Serotec) og detekteret som ovenfor.

20 De monoklonale antistoffer fra cellelinjerne A4, A5, A6 og A7 viste sig alle at have en tung kæde med en molekylvægt på ca. 61.000 dalton.

(h) Protein A-absorption 2 ml volumina af supernatanter blev kørt to gange ned ad en 25 mm 25 (1 ml) søjle af Protein A Sepharose C1-4B (Sigma), og absorption af anti-Rh(D) blev bedømt ved titrering. Anti-Rh(D)'erne af de udvalgte cellelinjer blev ikke absorberet af Protein A som forventet for immunglobuliner af IgG3-underklassen.

18

DK 162773 B

(i) Gm-allotypebestemmelse røde blodlegemer blev overtrukket med de monoklonale anti-Rh(D) -antistoffer og agglutinationsbedømt under anvendelse af paneler af Gm-allotypebestemmelsesreagenser (Birmingham eller Amsterdam) .

5 (ii) Serologi

Kultursupernatanter fra kontinuerlige kulturer af de udvalgte celle-linjer blev testet ved IAG-testen under anvendelse af kanin-anti-human IgG og under anvendelse af 3% R^R^-, R^r-, R^r- eller Rjjr-celler i saltvand med lav ionstyrke (se tabel Illa og Hib). De samme 10 supematanter blev også testet mod et panel af D-variant røde blodlegemer under samme betingelser (se tabel V nedenfor). Agglutina-tionsgraden blev gradueret på konventionel måde på en skala fra 0 til 6.

TABEL V

15 Reaktion af monoklonale anti-Rh(D)-antistoffer

med "delvis" D-positive røde blodlegemer under anvendelse af IAG

Kultur- A4 A5 A6 A7 supernatant (graduering: 0 til 6) 20 _ DIV 5 5 6 6 D1 2 3 5 5 6 6

Dvn 5 5 6 6 DVI 0 0 0 0 25 DB 0 0 0 0 U937-monocvt-rosettering og fagocvtose-assav 2 100 μΐ pakkede OR3R2 røde blodlegemer blev sensitiveret med 500 μΐ 3 anti-Rh(D) (i forvejen indstillet til 1 /zg/ml) ved 37°C i 60 minut-30 ter, vasket og resuspenderet med 1 x 10^ celler/ml i RPMI. U937-celler blev taget i den logaritmiske vækstfase og dyrket i to dage 19

DK 162773 B

enten i nærværelse eller fravær af interferon-γ (Amersham) med 50 U/ml. 45 x 106 røde blodlegemer blev derefter tilsat en pellet af 1,5 x.10^ U937-celler og blandet, hvilket gav et forhold på 30:1. Til rosetteringsassayet blev cellerne inkuberet ved stuetemperatur i 5 5 minutter, centrifugeret ved 600 omdr./minut i 3 minutter og undersøgt i et hæmocytometer efter yderligere 5-20 minutter. Fagocytose blev bedømt umiddelbart efter inkubation af cellerne ved 37°C i 3 timer. Resultaterne blev udtrykt som procentdelen af monocytter med ét eller flere adhærerende eller fagocytoserede røde blodlegemer.

10 En sammenligning af de resultater, der blev opnået med kultursupernatanter af klonerne A4 og A5, og et konventionelt polyklonalt anti-Rh(D)-serum er vist i fig. 1 og 2. Røde blodlegemer sensitiveret med kultursupernatant fra klonen A8 dannede rosetter med 100% U937-celler (dyrket i fravær af interferon-y).

15 (iv) Makrofag-bindingsassav Røde blodlegemer (R£r) (1 volumen) blev sensitiveret med monoklonalt anti-Rh(D) (2 volumina ubehandlet kultursupernatant) og inkuberet med monocyt-afledte dyrkede makrofager. Makrofagerne blev stimuleret med 500 U/ml rekombinant immuninterferon (Biogen, Geneve) i 48 timer før 20 deres anvendelse i assayet. Røde blodlegemers binding til makrofager blev bedømt mikroskopisk og udttykt som makrofag-bindingsindekset (= antal røde blodlegemer, der fæstnedes til eller blev fagocyteret af 100 makrofager).

I tabel VI nedenfor er vist de resultater, der blev opnået med kul-25 tursupernatanter af klonerne A4 og A5. Disse supernatanters evne til at forårsage interaktion mellem røde blodlegemer og makrofag svarede til evnen hos det polyklonale anti-Rh(D), der tjente som positiv kontrol.

TABEL VI

20

DK 162773 B

Kilde til Kultur- Kultur- Polyklonalt anti-D supernatant supernatant anti-Rh(D)- 5 A4 A5 serum

Makrofag- bindingsindeks 480 472 416-500 anti-Rh(D) (IU/ml) 2 12 43 10 _ (v) Lvmfocvt-ADCC-assav

Kultursupernatanterne fra klonerne A4, A5, A7 og A8 blev testet i et lymfocytantistofdirigeret celletoksicitetsassay (ADCC-assay). Lige store volumina (50 /il) af målceller (chrom-51-mærket Rj_R^ suspension 15 af røde blodlegemer), effektorceller (K-lymfocytter) og anti-Rh(D)-kultursupernatant blev inkuberet natten over ved 37°C i mikroplader efter skånsom centrifugering, og chrom-51-afgivelsen blev målt (Urba-niak (1979) Br. J. Haematol. 42, 303-314). Forholdet mellem effektor-og målceller var 15:1.

20 Ingen af de testede kultursupematanter viste sig at udvise ADCC-aktivitet af betydning (se tabel VII nedenfor).

TABEL VII

21

DK 162773 B

Monoklonalt A4 A5 A7 A8 Anti-

Rh(D)- 5 antistof serum % specifik lyse

Effektor KF -2 1 0 * 95

Effektor BW 4 0 0 *92 10 Effektor TJ * * * 0 * * ikke bestemt

Claims (14)

22 DK 162773 B

1. Humant monoklonalt antistof, kendetegnet ved, at det har følgende essentielle karakteristika: 5 (a) det udviser aktivitet mod Rh(D)-antigen, men ikke C, c, E eller e antigener fra Rh-blodtypesystemet; (b) det er IgG3-proteiner; (c) det har kappa-lette kæder; (d) det har allotypen G3m(21); 10 (e) det udviser aktivitet mod Du-celler ved en indirekte antiglobu- lintest; (f) det udviser aktivitet mod D^, og variant-antigener; og (g) det er inaktivt mod eller variant-antigener, og antigeribindende fragmenter deraf.

2. Monoklonalt antistof ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det er produceret af cellelinjen ECACC 87091606.

3. Anti-Rh(D)-reagens, kendetegnet ved, at det indeholder et monoklonalt 20 antistof ifølge krav 1 eller 2 kombineret med ét eller flere yderligere anti-Rh(D)-antistoffer med én eller flere yderligere bindingsspecificiteter.

4. Anti-Rh(D)-reagens ifølge krav 3, kendetegnet ved, at et monoklonalt antistof, som kan binde 25 -varianten, er til stede. 23 DK 162773 B

5. Anti-Rh(D)-reagens ifølge krav 3, kendetegnet ved, at antistofkomponenten omfatter (a) et monoklonalt antistof ifølge krav 1 og (b) et IgM anti-Rh(D) med ingen eller kun svag anti-Du-aktivitet.

6. Anti-Rh(D)-reagens ifølge krav 5, kendetegnet ved, at antistofkomponenten yderligere omfatter et monoklonalt IgG anti-Rh(D), der kan udvise aktivitet mod D^-celler i en indirekte antiglobulintest.

7. Anti-Rh(D)-reagens ifølge krav 5 eller 6, 10 kendetegnet ved, at komponent (b) er valgt blandt de mono-klonale IgM'er fra de deponerede hybridomcellelinjer MAD-2 (ECACC 86041803) og F0M-1 (ECACC 87021301).

8. Human lymfocytafledt cellelinje, kendetegnet ved’, at den kan producere et monoklonalt 15 antistof ifølge krav 1.

9. Cellelinje ifølge krav 8, kendetegnet ved, at den er deponeret hos European Collection of Animal Cell Cultures med deponeringsnummeret ECACC 87091606.

10. Monoklonalt antistof ifølge krav 1 eller 2 til anvendelse til 20 passiv immunisering med henblik på forebyggelse af hæmolytisk sygdom hos nyfødte.

11. Monoklonalt antistof ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved, at det er indeholdt i en kul tursuper-natant, der er opnået ved dyrkning af en cellelinje ifølge krav 8 25 eller 9.

12. Farmaceutisk præparat til anvendelse til passiv immunisering med henblik på forebyggelse af hæmolytisk sygdom hos nyfødte, kendetegnet ved, at det omfatter et monoklonalt antistof 24 DK 162773 B ifølge krav 1 eller 2 sammen med en fysiologisk acceptabel bærer eller et fysiologisk acceptabelt fortyndingsmiddel.

13. Farmaceutisk præparat ifølge krav 12, kendetegnet ved, at antistofkomponenten desuden omfatter 5 et monoklonalt antistof, der kan binde -varianten.

14. Fremgangsmåde til Rh-typebestemmelse, kendetegnet ved, at der anvendes et monoklonalt antistof ifølge krav 1 eller 2 eller et anti-Rh(D)-reagens ifølge et hvilket som helst af kravene 3-7, idet det monoklona'le antistof eller reagen-10 set er i form af en vandig opløsning.