JPH05506843A - 抗―炭水化物抗体及び炭水化物抗原に作用する後天性免疫不全症候群（ａｉｄｓ）及びａｉｄｓ関連複合体（ａｒｃ）の薬剤及び治療法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 抗−炭水化物抗体及び炭水化物抗原に作用する後天性免疫不全症候群（Ａ　Ｉ　 Ｄ　Ｓ）及びＡＩＤＳ関連複合体（ＡＲＣ）の薬剤及び治療法産業上の利用分野 本発明は、後天性免疫不全症候群（Ａ　Ｉ　Ｄ　Ｓ）及びＡＩＤＳ関連複合体（ ＡＩＤＳ　ｒｅｌａｔｅｄ　ｃｏｍｐｌｅｘ）　（ＡＲＣ）の治療に関し、特に 、本発明は抗−炭水化物抗体ＬｅｓＡ□およびシアリル−Ｔｎに作用し並びに炭 水化物抗原Ｌｅ　。

Ａ　およびシアリル−Ｔｎに作用する薬剤及び治療法に関エ ウィルス感染に関連した宿主細胞における変化したグリコジル化が報告されてい る（レイ、イー、エックス、ら（Ｒａｙ、　Ｅ、Ｘ、、　ｅｔ、　ａｌ、）　（ １９７８）　、パイロロジー（ｎｍａｒａｓａｍｙ、　Ｒ，、ｅｔ、　ａｌ、　 ）　（１９８５）　、Ａｒｃｈ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ。

−貼凹凄戸工２３６　：　５９３　）　、腫瘍形成（ｏｎｃｏｇｅｎｅｓｉｓ　 ）のように、サイトメガロウィルスまたはＨＩＶにより誘導される異常なグルコ シル化は、もとの宿主細胞には存在しない新しい抗原の形成を引き起こす（アン トリユース、ピー、ダブリュー、ら（Ａｎｄｒｅｗｓ、　Ｐ、　Ｗ、　ｅｔ、　 ａｌ、）　（１９８９）　Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、　、１６９　：１３４７　 ；アダチ、エム。

ら（Ａｄａｃｈｉ、　Ｍ、、　ｅｔ、　ａｌ、　）　（１９８８）　Ｊ、　Ｅｘ ｐ、　Ｍｅｄ、。

１６７：３２３）。オリゴサツカライドエピトープ（ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒ ｉｄｅ　ｅｐｉｔｏｐｅ　）を定義するモノクローナル抗体を用い、ウィルス感 染後のＬｅ　およびＬｅｙ抗原の出現が検出された。

数種の研究により、インビトロ（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）におけるＨＩＶ感染の炭水 化物部分の関与が示された。従って、感染された細胞でのゴルジにおけるグルコ シル化の早期の段階での阻害は、産生されるウィルスの感染性を減少させ（グル ターズ、アール、ニー、ら（Ｇｒｕｔｅｒｓ、　Ｒ，Ａ、、　ｅｔ、　ａｌ、　 ）（１９８７）　Ｎａｔｕｒｅ　３３０　：　７４　；モンテフィオリ、ディー 、シー、ら（Ｍｏｎｔｅｆｉｏｒｉ、　Ｄ、Ｃ，、ｅｔ、　ａｌ、　）　（１９ ８８）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８５　：　９ ２４８）、レクチン類はおそらく感染された細胞のｇｐ１２０−グリカン類との 特異的な相互作用により融合細胞（ｓｙｎｃｙｔｉｕｍ　）形成を阻止し並びに 細胞フリーウィルスの感染性を中和する（リフソン、ジエイ、ら（Ｌｉｆｓｏｎ 、　Ｊ、、　ｅｔ、　ａｌ、（１９８６）　Ｊ−Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、　、１６４ 　：　２１０１）　、しかしながら、標的Ｔ−４細胞のＮ−グリコジル化の変動 は、ＨＩＶ感染に影響を与えるようには見えない（モンテフィオリ。

ディー、シー、ら（Ｍｏｎｔｅｆｉｏｒｉ、　Ｄ、Ｃ，、ｅｔ、ａｌ、　）　（ １９８８）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８５　 ：　９２４８）。

Ｇｐ　１２０は、数種の異なるグリカン構造を含み、炭水化物はｇｐ１２０の全 量の５０％を構成する（マチユーズ。

ティー、ジエイ、ら（Ｍａｔｔｈｅｖｓ、　Ｔ、Ｊ、、　ｅｔ、　ａｌ、　）　 （１９８７）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８４ 　：　５４２４）。

これまでは、Ｎ−結合グリカン類だけがｇｐ１２０上に見出された（コザルスキ ー、ケイ、ら（Ｋｏｚａｒｓｋｙ、　Ｋ、、　ｅｔ。

ａｔ、　）　（１９８９）　Ｊ、　Ａｃ、　Ｉｍｍ、　Ｄｅｆ、　５ｙｎｄｒ、 　２　：　１６３）。Ｔ４レセプターのためのｇｐ１２０上での結合部位は、分 子の非鎖状Ｃ−末端部分に局在しているらしい（ラスキー、エル、ニー、ら（Ｌ ａｓｋｙ、　Ｌ、Ａ、　ｅｔ、　ａｌ、　）（１９８７）　Ｃｅ　１１　５０　 ：　９７５）、グリカン（類）が直接的にウィルス結合に関与するかどうかは明 らかでない。従って、阻害性レクチン類は結合部位に隣接したグリカン類に結合 し、それにより抗体を中和するものとして見出されたＴ４−ｇｐ１２０結合を立 体的に阻害するのかもしれない（バラウイ、イーら（Ｂａｈｒａｏｕｉ、　Ｅ、 、　ｅｔ、　ａｌ、　）（１９８８）ＡＩＤＳ　２：１６５−１６９；　リンズ レ−、ピー、ニス、ら（Ｌｉｎｓｌｅｙ、　Ｐ、Ｓ、、　ｅｔ、　ａｌ、）　（ １９８８）　Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ。　６２：３６９５）。これまでは、レクチン研 究でｇｐ１２０上で同定されたグリカン類は、むしろ汎在し、それゆえレクチン に基づく処理の治療可能性は小さいように思われる。

本発明は、特にその病因がヒト免疫不全ウィルス（ＲＥＶ）（以前には、ヒトＴ 細胞リンフナトロビックウィルスＩ　Ｉ　Ｉ　（ＨＴＬＶ−Ｉ　Ｉ　Ｉ）　、ヒ トリンパ節症関連ウィルｘ　（ＬＡＶ）また１ｔＡｒＤｓ関連ウイ／１．、ス（ ＡＲＶ）などの種々の言葉で呼ばれた）と名付けられたリンパ栄養性レトロウィ ルスの新しい分類の感染に関与するものとして同定された、紛れもなく新しい疾 患として認識される後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）に関連するものである（ ガロ。

アール、シー、ら（Ｇａｌｌｏ、　Ｒ，Ｃ，、ｅｔ、　ａｌ、）　、（１９８６ ）Ｐｒｏｇ、　Ａｌｌｅｒｇｙ、３７　：　１　；モンターニエ、エル、（Ｍｏ ｎｔａｇｎｉｅｒ、　Ｌ、）　（１９８６）　Ａ旦肛鉦工３７　：　４６　）　 ｏ該疾病は、損傷された細胞介在免疫及び完全なリンパ球減少症に関連する疾患 、特に減少したヘルパーＴリンパ球（Ｔ４１またはＣＤ４）により特徴付けられ る。これは、ＨＩＶがＣＤ４リンパ球集団に好適に感染するという事実のためで ある。ＡＩＤＳは、現れた臨床的特徴とヘルパーＴリンパ球減少症の複合により 通常明らかにされるプレシンドローム（ｐｒｅｓｙｎｄｒｏｍ）により先導され る（フリードマンーキーン、ニー、イー、ら（Ｆｒｉｅｄｍａｎ−Ｋｉｅｎ、　 Ａ、Ｅ、、　ｅｔ、　ａｌ、、　）（１９８２）　Ａｎｎ、Ｉｎｔ、　Ｍｅｄ、 ９６　：　６９３　：ゴットリーブ、エム、ニス、ら（Ｇｏｔｔｌｉｅｂ、　Ｍ 、Ｓ、、　ｅｔ、ａｌ、）　（１９８１）　Ｎ、Ｅｎｇｌ、　Ｊ、　Ｍｅｄ、３ ０５　：１４２５　；マスール、エイチら（Ｍａｓｕｒ、　Ｈ，、、ｅｔ、　ａ ｌ、）　（１９８１）　Ｎ、　Ｅｎｇｌ、　Ｊ。

Ｍｅｄ、３０５　：１４３１）　。プレシンドロームは、ＡＩＤＳ関連複合体（ ＡＩＤＳ−ｒｅｌａｔｅｄ　Ｃｏｍｐｌｅｘ）（ＡＲＣ）と呼ばれる。ＨＩＶ感 染の診断は、通常ＨＩＶに対する関連抗体の検出に基づきなされる。正確な抗体 プロフィールは、疾患の段階により変化する（ガロ、アール、シー、ら（Ｇａ、 １１ｏ、　Ｒ，Ｃ，ｅｔ、　ａｌ、　）　（１９８６）　Ｐｒｏ、　Ａ１１ｅｒ ｙ、３７　：　１）　。ＨＩＶの病原性に対する理解の相当な進歩にも拘らず、 細胞表現形の機能的変化に関連する炭水化物の変化は十分に議論されてきたけれ ども（ハコモリ、　ニス、（Ｈａｋｏｍｏｒｉ、　Ｓ、）　（１９８１）　Ａｎ ｎｕ、　Ｒｅｖ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、　５０　：　７３３　）　、ＨＩ　Ｖに感染されたＴリンパ球 系の細胞の炭水化物抗原については何らの研究もなされていない。Ｌｅｙ抗原決 定基は、ＨＩＶに感染された後だけにヒトＴ細胞株の表面、並びに健康人の正常 なリンパ球ではな（ＡＩＤＳおよびＡＲＣの患者の末梢血のＴ　ＩＪンパ球に高 度に発現されるという証拠も集積されてきている（アダチ、エム、ら（Ａｄａｃ ｈｉ、　Ｍ、、　ｅｔ、　ａｌ−）　（１９８８）Ｊ、　Ｅｘｐｔ、　Ｍｅｄ、 　１６７　：　３２３）。

ＡＩＤＳおよびＡＲＣを特徴付けるための十分な進歩かなされたにも拘らず、Ａ ＩＤＳおよびＡＲＣを治療及び予防する方法は未だわずかに発展しただけであり 、この疾患およびそのプレシンドロームの治療及び予防のより良い方法の発展に 対する多大な必要性が存在する。

発明の要約 従って、本発明の１つの目的は、ウィルスまたは使用される標的細胞に結合する ことにより、インビトロでのＨＩ■感染を阻止するモノクローナル抗体を見出す ことである。

本発明のもう１つの目的は、ウィルス糖蛋白類およびウィルスに関連するグリコ スフィンゴリピド類として発現される炭水化物構造を定義するＨＩＶ感染をイン ビトロで阻害することが見出されたモノクローナル抗体を使用し、それにより免 疫治療および／またはワクチンの発展に有用であると期待される標的としてのウ ィルスカプセルのグリカン類（ｇｌｙｃａｎｓ）を同定することである。

これら及び他の目的は、後天性免疫不全症候群（Ａ　Ｉ　ＤＳ）及びＡＩＤＳ関 連複合体（ＡＲＣ）の進行を阻止しまたは遅延させるための薬剤を提供すること により達成され、それは： （Ａ）薬学的に効力のある量の、抗−Ｌｅｙ、抗−Ａｌ 及び抗−シアリル−Ｔｎからなる群から選ばれた一つ以上の抗体、及び （Ｂ）薬学的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤からなる。

本発明はまた・ （Ａ）薬学的に効力のある量の、抗−Ｌｅｙ、抗−八■ 及び抗−シアリル−Ｔｎからなる群から選ばれた一つ以上の抗体、及び （Ｂ）薬学的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤からなる薬剤をＡＩＤＳまた はＡＲＣを有する被験者（ｓｕｂｊｅｃｔ　）に投与することからなるＡＩＤＳ またはＡＲＣの進行を阻止しまたは遅延させるための方法を提供するものである 。

他の実施態様において、本発明は： （Ａ）免疫学的に効力のある量のＬｅｙ、Ａ　及びシア■ リルーＴｎからなる群から選ばれた一つ以上の抗原、及び（Ｂ）薬学的に許容さ れる担体、希釈剤又は賦形剤からなるＡＩＤＳおよびＡＲＣに対するワクチンを 提供するものである。

本発明はざらに： （Ａ）免疫学的に効力のある量のＬｅｙ、Ａ　及びシアエ リルーＴｎからなる群から選ばれた一つ以上の抗原、及び（Ｂ）薬学的に許容さ れる担体、希釈剤又は賦形剤からなる薬剤を被験者に投与することからなるＡＩ ＤＳおよびＡＲＣに対する免疫化を活発にする方法を提供するものである。

好ましい実施例において、抗−Ｌｅｙ、抗−八　及び抗ニ ーシアリルーＴｎ抗体は、ＡＣＴＴの寄託番号がＨＢＩＯ３１２であるハイブリ ドーマＢＭＩにより産生されるモノクローナル抗体ＢＭＩ、ＡＣＴＴの寄託番号 がＨＢ１０２２６であるハイブリドーマＡＨ２１により産生されるモノクローナ ル抗体ＡＨ２１、およびＡＣＴＴの寄託番号がＨＢ９６５４であるハイブリドー マＴＫＨ２（ＢＭ４）により産生されるモノクローナル抗体ＴＫＨ２である。

図面の簡単な説明 Ｆｉｇｌは、細胞のＨＩＶ感染に対する種々のモノクローナル抗体の阻害効果を 示す棒グラフである。縦軸は、任意の単位における抗原産生を示し、横軸は、非 処理ウィルスによるコントロール（÷ＡＢ）　、ウィルスのない場合のコントロ ール（÷ＨＩＶ）、または指定されたモノクローナル抗体を含有するハイブリド ーマ上清を示す。

Ｆｉｇ２Ａ〜２Ｄは、種々のモノクローナル抗体によるＨｌＶの阻害を示す棒グ ラフである。Ｆ　ｉ　ｇ２Ａ　：抗−ＡＩモノクローナル抗体（ＭＡｂ）　ＡＨ ２１；　Ｆ　ｉ　ｇ２　Ｂ　：抗−Ｌｅｙ　ＭＡｂ　ＢＭＩ；Ｆｉｇ２Ｃ：抗〜 シアリル−Ｔｎ　ＭＡｂ　ＴＫＨ２；Ｆｉｇ２Ｄ：抗−シアリル−Ｔｎ　ＭＡｂ 　Ｂ７２．３゜Ｆ　１ｇ２Ａ　〜２Ｄにおいて、縦軸は、ＨＩＶ抗原産生（コン トロールの％）を示し、横軸は、ウィルス接種源に関するモノクローナル抗体の 濃度（μｇ／ＴＣより５ｏ）を示す。

発明の詳細な説明 炭水化物構造は、しばしば標的細胞に対する病原体の初期付着に関係する。本発 明の発展において、抗炎水化物モノクローナル抗体のパネル（ｐａｎｅｌ　）が 、インビトロでＨＩＶ感染性を阻害する能力として、ウィルスまたは使用される 標的細胞に対する結合により試験した。３種の異なる炭水化物抗原、即ち、Ｌｅ ｙ、Ａ　及びシアリル−Ｔｎに工 対するモノクローナル抗体は、細胞ウィルスによる感染を阻止し、融合細胞形成 を阻害することができた。ウィルス感染性の阻害は、ウィルス株（ＨＴ　Ｌ　Ｖ １□１Ｂおよび患者から単離された５ＳＩ−００２）、ウィルス増殖に使用され る細胞株（Ｈ９及びＭＴ４）または感染標的として使用される細胞型（ＭＴ４、 ＰＭＣ及びＴ４リンパ球）とは無関係であった。阻害は、モノクローナル抗体が ウィルスとブレインキュベートされたときには観察されたが、細胞が感染前にそ のようにブレインキュベートされたときには観察されなかった。この様に、モノ クローナル抗体はウィルス糖蛋白として発現される炭水化物構造を定義すると信 じられ、ウィルスエンベロープのグリカン類は、免疫治療及び／またはワクチン の発展の標的として有用であると期待される。

従って、本発明は： （Ａ）薬学的に効力のある量の抗−Ｌｅ　、抗−Ａ１及び抗−シアリル−Ｔｎか らなる群から選ばれた一つ以上の抗体、及び （Ｂ）薬学的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤からなる後天性免疫不全症候 群（Ａ　Ｉ　Ｄ　Ｓ）及びＡＩＤｓＩＤ後合体（ＡＲＣ）の進行を阻害しまたは 遅延する薬剤を提供するものである。

同様に、本発明は： （Ａ）薬学的に効力のある量の抗−Ｌｅ　、抗−Ａ工及び抗−シアリル−Ｔｎか らなる群から選ばれた一つ以上の抗体、及び （Ｂ）薬学的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤からなる薬剤をＡＩＤＳまた はＡＲＣを有する被験者に投与することからなるＡＩＤＳおよびＡＲＣの進行を 阻害乃至遅延する方法を提供するものである。

抗−Ｌｅｙ抗体としては、以下の構造・［式中、Ｒはセラミドまたは担体分子を 示す。］を有する炭水化物抗原Ｌｅｙに特異的である限りいかなる抗体も使用で きる。

炭水化物抗原Ｌｅｙに特異的な好ましい抗体は、約５×１０　のＫＤに相当する Ｌｅｙに対する親和性を有する。

炭水化物抗原Ｌｅｙに特異的な特に好ましいモノクローナル抗体は、ＡＣＴＴの 寄託番号がＨＢ１０３１２であるハイブリドーマＢＭＩにより産生されるＢＭＩ であり、モノクローナル抗体ＢＭＩの同定的特徴を有する他のいかなるモノクロ ーナル抗体も好ましい。

モーツクローナル抗体ＢＭＩは、以下の同定的特徴を有し：（１）ＫＤが約１０ −８である； （２）アイソタイプがｉｇＭである；及び（３）あらゆる型のＬｅｙ抗原と反応 する担体鎖の長さまたは内部置換には関係しない。

さらに、モノクローナル抗体ＢＭＩは、ネズミのモノクローナル抗体である。

炭水化物抗原Ｌｅｙに対するポリクローナル抗体は、アベ、ケイ、ら（Ａｂｅ、 　Ｋ、、　ｅｔ　ａｌ）　（１９８３）　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、２５８　：１ １７９３に記載されている精製された抗原を用いる公知の方法により製造できる 。

Ｌｅｙに対するモノクローナル抗体は、当該技術分野で公知の方法、例えばアベ 、ケイ、ら（Ａｂｅ、　Ｋ、、　ｅｔ、　ａｌ、、）（１９８３）　Ｊ、Ｂｉｏ ｌ、Ｃｈｅｍ、２５３：１１７９により記載された方法により製造することがで きる。

モノクローナル抗体ＢＭＩは、免疫原（ｉｍｍｕｎｏｇｅｎ　）としてヒト胃癌 細胞株ＭＫＮ７４を用いる当該技術分野で公知の方法により製造することができ る。

［式中、Ｒはセラミドまたは担体分子を示す。コを有する炭水化物抗原Ａ１に特 異的である限りいかなる抗体も使用できる。

炭水化物抗原Ａ工に特異的な好ましい抗体は、さらに以下の同定的特徴を有する ： （１）ＫＤが約１０〜５×１０　に相当するＡ□に対する親和性を有する；及び （２）少なくともタイプ１鎖Ａに結合する。

炭水化物抗原ＡＩに特異的なそのような好ましいモノクローナル抗体の例は、Ａ ＣＴＴの寄託番号がＨＢ１０２２６であるハイブリドーマＡＨ２１により産生さ れるモノクローナル抗体ＡＨ２１、モノクローナル抗体ＡＨ１６（アベ、ケイ、 ら（Ａｂｅ、　Ｋ、、　ｅｔ、　ａｌ、）　（１９８４）　Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ 、１３２　：１９５１）およびこれらのモノクローナル抗体のいずれかの同定的 特徴を有する他のいかなるモノクローナル抗体も含むものである。モノクローナ ル抗体ＡＨ２１は、特に好ましい。

モノクローナル抗体ＡＨ２１は、以下の同定的特徴を有する： （１）ＫＤが約５Ｘ１０−７である； （２）アイソタイプがＩｇＭである；及び（３）タイプ１鎖Ａに特異的に結合す る。

さらに、モノクローナル抗体ＡＨ２１は、マウス（ｍｕｒｉｎｅ）のモノクロー ナル抗体である。

モノクローナル抗体ＡＨ１６は、以下の同定的特徴を有する： （１）ＫＤが約１０−８である； （２）アイソタイプがＩ　ｇ　Ｇ　ａである；及び（３）タイプ１鎖Ａを含むあ らゆるタイプのＡ抗原に結合し、担体炭水化物類または内部置換には関係しない 。

さらなるモノクローナル抗体ＡＨ１６の特徴は、アベ、ケイ、ら（Ａｂｅ、　Ｋ 、、　ｅｔ、　ａｌ、）　（１９８４）　Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ。

１３２・１９５１に記載されている。

炭水化物抗原Ａ工に対するポリクローナル抗体は、アベ、ケイ、ら（Ａｂｅ、　 Ｋ、、　ｅｔ、　ａｌ、）　（１９８３）　Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ。

１３２　：１９５１に記載された精製抗原を用いる公知の方法により製造できる 。

炭水化物抗原Ａ１に対するモノクローナル抗体は、当該技術分野における公知の 方法、例えばアベ、ケイ、ら（Ａｂｅ、　Ｋ、、　ｅｔ、　ａｌ、）　（１９８ ４）　Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、１３２　：１９５１に記載された方法により製造で きる。

モノクローナル抗体ＡＨ２１は、免疫原として精製されたタイプ１鎖Ａを用いる 当該技術分野における公知の方法により製造できる。

モノクローナル抗体ＡＨ１６は、免疫原としてヒト胃癌細胞株を用いる当該技術 分野における公知の方法により製造できる。

抗−シアリル−Ｔｎ抗体としては、以下の構造：ＮａｕＡｃα２−６ＧａｌＮ入 ｃａ１−０−５ａｒ／Ｔｈｒ［式中、Ｓｅｒはセリンを示し、Ｔｈｒはスレオニ ンを示す。］ を有するシアリル−Ｔｎ炭水化物抗原に特異的である限りいかなる抗体も使用で きる。

該抗原に対する好適な抗−シアリル−Ｔｎ抗体のアイソタイプおよび親和性は、 ある抗体から次の抗体にかけて広範に変わり、従って、シアリル−Ｔｎに対する 特異性は、これら抗体の重要な同定的特徴である。

好ましいモノクローナル抗体の例は、ＡＣＴＴの寄託番号がＨＢ９６５４である ハイブリドーマＴＫＨ２により産生されるＴＫＨ２、ＴＫＨＩ　（ケルゼン、テ ィー、ら（Ｋｊｅｌｄｓｅｎ、Ｔ、ｅｔ、ａｌ、）　（１９８８）　Ｃａｎｃｅ ｒＲｅｓ、４８　：　２２１４−２２２０）　、Ｂ７２．３　（コルシャー、デ ィーら（Ｃｏｌｃｈｅｒ、　Ｄ、　ｅｔ、ａｌ、）　（１９８１）　Ｐｒｏｃ、 　Ｎａ、ｔｌ、　Ａ、ｃａｄ。

Ｓｃｉ、ＵＳＡ、７８：３１９９　３２０３）、およびこれらモノクローナル抗 体の同定的特徴を有する他のすべてのモノクローナル抗体を含む。モノクローナ ル抗４ＴＫＨ２は、特に好ましい。

炭水化物抗原シアリル−Ｔｎに特異的に結合する他に、モノクローナル抗体ＴＫ ＨＩ、ＴＫＨ２およびＢ７２．３のさらなる同定的特徴は、各々ＩｇＭ、ＩｇＧ １および■ｇＧ工であるそれらのアイソタイプである。

さらに、モノクローナル抗体ＴＫＨ２は、マウスのモノクローナル抗体である。

モノクローナル抗体ＴＫＨＩおよびＢ７２．３の追加の特徴は、ケルゼン、ティ ー、ら（Ｋｊｅｌｄｓｅｎ、　Ｔ、　ｅｔ、　ａｌ、）（１９８８）　Ｃａｎｃ ｅｒ　Ｒｅｓ、　４８　：　２２１４−２２２０およびコルシャー、ディーら（ Ｃｏｌｃｈｅｒ、　Ｄ、　ｅｔ、ａｌ、）　（１９８１）　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ 、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　、７８　：　３１９９−３２０３に各々記載され ている。

炭水化物抗原シアリル−Ｔｎに対するポリクローナル抗体は、公知の方法、ケル ゼン、ティー、ら（Ｋｊｅｌｄｓｅｎ、　Ｔ。

ｅｔ、　ａｌ、）　（１９８８）　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、４８　：　２２１４ により製造できる。

炭水化物抗原シアリル−Ｔｎに対するモノクローナル抗体は、当該技術分野にお ける公知の方法、例えばケルゼン。

ティー、ら（Ｋｊｅｌｄｓｅｎ、　Ｔ、　ｅｔ、　ａｔ、）　（１９８８）　Ｃ ａｎｃｅ記載の方法により製造できる。

シアリル−Ｔｎに対するモノクローナル抗体はまた、ともに係属している（　ｃ ｏ−ｐｅｎｄｉｎｇ）出願Ｕ、Ｓ、　５ｅｒｉａｌ　Ｎｏ、　３１７．４９２に 記載された新規な方法に従い製造することもでき、その完全な開示は、参考のた め以下に挿入される。

シアリル−Ｔｎ抗原に対する抗体を得るために使用される免疫原は、多くのムチ ンタイプの糖蛋白類のコア構造であるシアリル−Ｔｎ抗原である。以下に使用さ れるムチンタイプの糖蛋白は、セリンまたはスレオニン残基で高度に〇−結合で グリコジル化された高分子量の蛋白（Ｍｒ＞１０６）を意味する。ムチンタイプ の糖蛋白類は、さらにＳ−Ｓ依存結合によりさらに重合された、上皮性分泌の主 要成分である。また、ムチンタイプの糖蛋白類のコア構造は、以下に使用される ようにムチンタイプの糖蛋白の蛋白質部分に直接的に結合される周辺置換（ｐｅ ｒｉｐｈｅｒａｌ　５ｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）のない基本的な炭水化物構造を 意味する。本発明では、ムチンタイプの糖蛋白のすべてのシアリル−Ｔｎコア構 造は、糖蛋白が高分子量を有しく相対的分子量〉１０６ドルトン）且つムチンと 同程度、即ち、全量の５０％以上がグリコジル化されている限り、免疫原として 使用することができる。シアリル−Ｔｎ抗原を含む動物ムチン類も、免疫原とし て使用することができる。

シアリル−Ｔｎ抗原免疫原は、シアリル−Ｔｎ抗原コア構造を露出させるために ムチンタイプの糖蛋白を酵素的または化学的修飾するか、或いはその表面にシア リル−Ｔｎコア構造を有するムチン類を単離することにより製造することができ る。これらのムチン類は、いくつかの動物種に存在する。

種々のムチンタイプ糖蛋白のシアリル−Ｔｎコア構造を露出させるために使用さ れる酵素的修飾のタイプの例は、・インフルエンザウィルスのシアリダーゼによ る末端に存在するα２→３シアリル残基の除去またはクロストリジウム・バーフ リンジエンス（Ｃｒｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓｅ）のシアリ ダーゼによるすべてのシアル酸残基の全体の除去を含む。酵素的修飾はまた、β −ガラクトシダーゼ（好ましくは力ｏニア・ランパス（Ｃｈａｒｏｎｉａ　ｌａ ｍｐａｓ）由来）、α−フコシダーゼ、及びＮ−アセチルへキソサミニダーゼの 処理も含む。ムチンの糖蛋白の酵素的加水分解は、ヒロハシら（Ｈｉｒｏｈａｓ ｈｉ　ｅｔ　ａｌ、　）により記載されている（　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａ ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　（１９８５）　８２　：　７０３９−７０４３） 。

ムチンタイプの糖蛋白のシアリル−Ｔｎコア構造を露出させるために使用される 化学反応の例は、過ヨウ素酸塩による酸化と、それに続く水素化ホウ素ナトリウ ムによる還元と弱酸処理を含む。その手順は、スミス分解と呼ばれる（Ｓｐｒｉ ｏ、　Ｇ、、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、（１９７２）　２８　：　３ −４３）。この化学処理は、シアル酸を除く炭水化物残基の非還元末端を除去し 、シアル酸は上記のようにシアリダーゼ処理により除去される。

免疫原として使用できる動物から単離されるムチン類の例は、炭水化物路の９０ ％がシアリル−Ｔｎ抗原からなる羊の下顎部のムチン（ｏｖｉｎｅ　ｓｕｂｍａ ｘｉｌｌａｒｙ　ｍｕｃｉｎ）　（ＯＳＭ）および炭水化物路の５０％がシアリ ル−Ｔｎ抗原がらなり、炭水化物路の２０％がＴ抗原からなり、残りは未同定の 残基であるウシの下顎部のムチン（ＢＳＭ）　を含む。

シアリル−Ｔｎ抗原免疫原は、通常の方法に従い単離及び精製される。

例えば、シアリル−Ｔｎコア構造を得るために酵素的または化学的に修飾された ムチンタイプの糖蛋白は、セファロース４Ｂまたはセファクリル２００８を通す ゲル濾過により単離できる。

単離された糖蛋白は、次いでシアリル−Ｔｎコア構造を露出させるために上述の 方法により酵素的または化学的に修飾され、シアリル−Ｔｎコア構造は、以下の ような免疫原として使用するために精製される。

修飾されたムチンは、セファロース４Ｂまたはセファクリル２００Ｓを通すゲル 濾過により分離できる。合成分子フィルターカラム上での高圧クロマトグラフィ ー（高速液体クロマトグラフィー；ファルマシア）も、酵素的または化学的に修 飾されたムチン類を分離するのに有用である。

しかしながら、モノクローナル抗体を製造するための免疫原としては、修飾され たムチンは必ずしも精製される必要はない。少量の未修飾ムチンの存在は、本発 明による免疫原として使用するのに有害ではないであろう。さらに、もし適当な ルーチン的注意が払われているならば、修飾は通常定量的である。

動物種由来のすでにシアリル−Ｔｎコア構造の形態である糖蛋白を含むムチン類 は、通常の方法により得られる。

例えば、上記のようにセファロース４Ｂ、セファクリル２００ＳまたはＦＰＬＣ を通すゲル濾過による。

この様な動物由来のムチン類は、さらに上述のような通常のゲル濾過またはＦＰ ＬＣなどの同様な方法により免疫原として使用するために精製する。しかしなが ら、免疫原の精製は、モノクローナル抗体を製造して使用するために必須ではな い。

ヒト赤血球グリコフォリンは、マルシエシ、ブイ、ティ＋、（Ｍａｒｃｈｅｓｉ 、　Ｖ、Ｔ、　）及び７　ン）’　Ｕ　ユース、　イー、　ｙ’１２４７−１２ ４８）により最初に記載された方法によりヒト赤血球膜から得ることができる。

糖蛋白が、シアリル−Ｔｎコア構造を有するか否かは、ピーナツレクチンカラム を用いたアフィニティークロマトグラフィー（カーター、ダブリュー、ジー、（ Ｃａｒｔｅｒ、　Ｗ。

によるか又は抗−Ｔｎ抗体を用いた糖蛋白類のイムノブロッティング（ケムバイ オムド、エドモンストン、アルベルタ、カナダ（ＣｈｅｍＢｉｏｍｅｄ、　Ｅｄ ｍｏｎｓｔｏｎ、　Ａｌｂｅｒｔａ、　Ｃａｎａｄａ）から入手できる）により 決定される。

シアリル−Ｔｎ抗原の分布は、むしろ限られている。しかしながら、本発明で有 用なシアリル−Ｔｎ抗原の１つの源は、ウロコ状の肺カルチノーマ細胞株ＱＧ５ ６およびＬＵ−６５の培養上清である（ヒロハシ　ニス、ら（Ｈｉｒｏｈａｓｈ ｉ　Ｓ、　ｅｔ、　ａｌ、）　（１９８５）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａ ｄ、　Ｓｃｉ。

虱、ｌ又ニア０３９−７０４３） 第２の源はまた、羊の下顎ムチンであり、それは、高密度のシアリル−Ｔｎを含 有する。

培養上清から本発明の免疫原として有用な形態でシアリル−Ｔｎ抗原を得るため に、上述の種々の細胞株が、公知の方法により培養される。該培養上清は、シア リル−Ｔｎ抗原を得るために以下のように処理される。

懸濁状態で培養された細胞からの消費された（ｓｐｅｎｔ　）培養培地は、初期 容量の１１５０になるまで容量を減少させるため凍結乾燥する。濃縮された消費 培地は、次いで０゜０１％ナトリウムアジドを含有するリン酸緩衝生理食塩水に 対し４℃で大規模に透析される。透析された物質は、セファロース４Ｂ上に載せ られ、ゲル濾過される。排出容量（ｖｏｉｄ　ｖｏｌｕｍｅ　）はプールされ、 さらに濃縮され、セファクリル２００Ｓ上で再度クロマトグラフにかけられる。

排出容量中の糖蛋白フラクションは、免疫原として使用される。シアリル結合は 不安定なので、すべての手順は、制限された時間内に低温（４℃）で完了されな ければならない。

上述のように調製した免疫原は、下記のように免疫化のために処理される。

シアリル−Ｔｎ抗原（例えば４．０ｍｇ）を蒸留水（例えば４ｍ１）中に溶解し 、適切な量の酸処理済みのサルモネラ・ミネソタ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｍ１ ｎｎｅｓｏｔａ）　（例えば１６ｍｇ）と共に完全に混合して凍結乾燥する。乾 燥した混合物を適切容量（例えば４．０ｍ１）の適当な担体（例えば１４０ｍＭ のＮａＣ１を含有する２０ｍＭのリン酸緩衝液、ｐＨ７，０）に懸濁し、約１０ ０μｇのムチン（ｍｕｃｉｎ）及び４００μｇのバクテリアのアリコツト（ａｌ ｉｑｕｏｔｓ）を静脈内に注射する。

免疫化はバクテリアへの吸着の代わりに完全フロインドアジュバント（ｃｏｍｐ ｌｅｔｅ　Ｆｒｅｕｎｄ’　ｓ　ａｄｊｕｖａｎｔ）を用いても実施することが でき、ムチンとサルモネラ・ミネソタの量の比率は変化させることができる。最 も良好な結果は、サルモネラ・ミネソタを上述のように酢酸と共に処理した時に 観察された（ヤング、ダブリュー、ダブリュー、ら（１９７９）ジャーナル　オ ヴ　エクスペリメンタル　メデイシン（Ｙｏｕｎｇ、　Ｌ　Ｗ、　ｅｔ、　ａｌ 、、　（１９７９）　Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、）１５０　：１００８〜１０１ ９）。

免疫化に使用される宿主はいかなる系統のマウスでもラットでも良く、スプレノ サイト（ｓｐｌｅｎｏｃｙｔｅｓ）がハイブリドーマの調製に適していれば、す なわちＨＡＴ−感受性ミエローマ細胞株との細胞融合に対して感受性があり安定 したハイブリドーマを確立することができれば、いかなる型の動物でも良い。

免疫化のスケジュールはムチン免疫化に対する宿主動物の感受性に依存するが、 上述のプロトコールはマウスに適している。他の条件も適用することができる。

好適な免疫化のスケジュールは熟練した当業者によって決定することができる。

例えば、Ｂａ１ｂ／ｃマウスに適した免疫化のスケジュールは、５週間に亘り週 に１度尾静脈を通して免疫原製剤を静脈注射し、１か月体止期間の後免疫原製剤 で抗原追加（ｂｏｏｓｔ）を行う。

宿主に投与される免疫原製剤の量は、ムチンの分子量、炭化水素エピトープ（ｃ ａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ　ｅｐｉｔｏｐｅ）の露出、並びにムチン型糖蛋白に関 連したエピトープの新規性及び密度に依存する。マウスに注射した糖蛋白の範囲 は３〜５μｇで、１００μＩの生理食塩水に懸濁した３０〜５０μｇのサルモネ ラ・ミネソタ上にコートされたものであり、体重の範囲が１００〜１５０ｇであ る個々のマウスの静脈内に注射した。

完全フロインドアジュバントを使用した場合、約２０μｇの糖蛋白を含む５００ μｌの生理食塩水は５００μｌの完全フロインドアジュバントと乳化し、約２０ ０μｌを種々の部位から皮下注射した（各部位につき約５０μｍ）。

サルモネラ・ミネソタにコートするか、又は完全フロインドアジュバントと混合 した抗原の同じ量を、ラット、ハムスター、又はモルモットのような他の宿主に 使用し、ウサギのような他の宿主にはその何倍もの量を使用した。動物の体重に 比例して抗原の量を増加させる必要は必ずしもない。

免疫化は、全体の血清中に充分な抗体が検出されるまで繰り返した。宿主の肺臓 細胞を除去し、十分に確立された技術によりスプレノサイトをＨＡＴ−感受性ミ エローマ細胞と融合した（ケーラー、ジー、及びミルシュタイン、シー、　、（ １９７５）ネイチャー（Ｋ６ｈｌｅｒ、　Ｇ、　ａｎｄ　Ｍｉｌｓｔｅｉｎ、　 Ｃ，、（１９７５）　Ｎａｔｕｒｅ　）　２５６　：　４９５〜４９７及びヤン グ、ダブリュー、　ダブり二一、ら、上述（Ｙｏｕｎｇ、　Ｗ、　Ｗ。

ｅｔ、　ａｌ、、　５ｕｐｒａ）　）。

ＨＡＴ−感受性ミエローマ細胞は例えばＮ５−１．５Ｐ−１又は５Ｐ−２で良い が、いかなる型のＨＡＴ−感受性ミエローマ細胞を使用しても良い。時折、宿主 血清中に抗体が全く検出されなくても、宿主スプレンサイト（ｓｐｌｅｎｃｙｔ ｅｓ）とミエローマ細胞とを融合させてハイブリドーマを確立することができる 。よって、細胞融合前の抗体検出は必須でない。融合は通常、ヤング、ダブリュ ー、　ダブリュー、ら（上述）　（Ｙｏｕｎｇ、　Ｗ、　Ｌ　ｅｔ、　ａｌ、　 ５ｕｐｒａ）が詳述したように、ポリエチレングリコール中にて実施される。

本発明で使用するより好ましいミエローマ細胞株は５Ｐ−２である。

融合された細胞は、ミニクローンが形成されるまで９６−ウェルを有するプレー ト中で培養する。残存し増殖し得る多くの融合細胞を得るためには、最後の免疫 追加（ｂｏｏｓｔｅｒ）注射後４８〜７２時間のスプレノサイトを使用すること 及び増殖性が良いミエローマ細胞と融合することが重要である。インキュベータ ー中の湿度及びＣＯ２濃度は、融合細胞の培養初期段階において注意深く調節さ れなければならない。

本発明の方法によれば、融合細胞を増殖させるためには、フィーダー細胞（Ｆｅ ｅｄｅｒ　ｃｅｌｌｓ）は必ずしも必要ではない。

当業者にとっては、適切な培養条件は難なく決定することができる。

適切な培養期間後、免疫化に使用したシアリル−Ｔｎ抗原と反応する抗体を分泌 するハイブリドーマを、限界希釈により、すなわち各新培養中に細胞が１個も検 出されなくなるまで希釈した後ウェル中にブレーティングすることにより、サブ クローン化及びクローン化した。

一般に、各ウェルを糖蛋白のＰＢＳ溶液と共にインキュベートすることにより、 すなわち５〜１０μｇ１５０μｍ／ウェルを添加して一夜インキユベートするこ とにより、９６−ウェルを有するプレート中の各ウェルは、免疫原として使用し たシアリル−Ｔｎの核構造を含むムチン糖蛋白でコートされる。糖蛋白溶液を除 去して洗浄後、さらにウシ血清アルブミン（１０μｇ１５０μＩ／ウェル）と共 にインキュベートして、スクリーン抗体（ｓｃｒｅｅｎ　ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ）に使用する前にプレートをブロックした。該方法は、ヒロハシら（上述）　（ Ｈｉｒｏｈａｓｈｉ　ｅｔ　ａｌ、（ｓｕｐｒａ））により開示されている。

特定の抗原と反応する抗体を分泌するノーイブリドーマは、以下の方法に従って スクリーンされる。抗原でコートされたウェルに結合１−た抗体は、ヤング、ダ ブリュー、　ダブリュー、ら（上述）　（Ｙｏｕｎｇ、　Ｗ、　Ｗ、　ｅｔ　ａ ｌｌ、　５ｕｐｒａ）が最初に開示した方法に従い、通常二次抗体（ｓｅｃｏｎ ｄａｒｙ　ａｎｔｉｂｏｄｙ）（抗−マウスＩｇＭ及びＩｇＧヤギ又はウサギ抗 体）で検出され、引き続き　■で標識されたプロティンＡで検出される。該方法 は利用可能なエライザ分析（ＥＬＩＳＡ　ａｓｓａｙＳ）よりもさらに感度が高 いが、エライザを使用するこも可能である。エライザ類（ＥＬＩＳＡ’　ｓ）は 、自動化された解読機（ａｕｔｏｍａｔｅｄ　ｒｅａｄｅｒｓ）及び市販品とし て入手可能なエライザキットがあるため、使用にはより便利である。

このように単離されたハイブリドーマから分泌されるシアリル−Ｔｎ抗原に対す るモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ細胞の大きな回分培養を増殖させて上 清から抗体を精製するか、又はマウスに該ハイブリドーマ系を注射して腹水の生 成を刺激することにより、大量に生産することができる。両方法は当業者にとっ て周知の方法である。

本発明によるモノクローナル抗体の大量生産方法は、ヤ本発明の方法に従って単 離されたハイブリドーマは大きな懸濁回分培養中にて増殖できるが、増殖できる ように細胞を高密度で詰め込んでファイバーグラス容器（ｆｉｂｅｒｇｌａｓｓ 　ｃｏｎｔａｉｎｅｒ）中で培養すると、抗体が培地中に拡散されるので、さら に便利である。

モノクローナル抗体は公知の方法に従って、例えば、プロティンＡを使用したア フィニティー分離（ａｆｆｉｎｉｔｙ　ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ）或いはアルキル 化された逆相シリカゲル上での高圧液体クロマトグラフィー又は合成ポリスチレ ンゲル濾過カラムを用いることにより精製される。

上述した薬剤の適切な用量は、投与様式に従い、熟練した当業者により難なく決 定することができる。

より明確には、ＡＩＤＳ患者の初期の段階においてさらなるＡＩＤＳ感染力を押 さえるための抗体の適切な静脈投与用量は、ＴＫＨ２抗体がイン・ビトロにおい て２μｇ／ｍｌの濃度でＨＩＶ感染を阻止することができるため、慣用的な種々 の実験により決定されるべきである。ＴＫＨ２は、体重が６０ｋｇで約７．８１ の血液を有する男性に投与する場合、ＨＩＶ感染を阻止するには１５．６ｍｇで 十分であると信じられている。イン・ビボにおいてＨＩＶ感染を阻止するには、 人体抗体（ｈｕｍａｎｉｚｅｄ　ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）を用いるのが非常に好 ましい。

上述した薬剤の適切な投与方法も、当業者によって決定されるものである。抗体 は静脈内に注射できるが、他の投与形式も同様に可能である。

薬学的に許容される適切な担体、希釈剤及び賦形剤は、当業者によって難なく決 定される。例えば、抗体は生理的緩衝溶液中に溶解させて投与する。しかし、特 に好ましい担体は見出されていない。

本発明は、以下のものからなるＡＩＤＳ及びＡＲＣに対するワクチンをも提供す るものである：（Ａ）免疫学的に効力のある量のＬｅｙ、Ａ　及びシアリル−Ｔ ｎからなる群から選ばれた一つ以上の抗原、及び（Ｂ）薬学的に許容される担体 、希釈剤又は賦形剤。

同様に、本発明は、被験者に以下のものからなる薬剤を投与することからなるＡ ＩＤＳ及びＡＲＣに対して活動的に免疫化する方法をも提供するものである：（ Ａ）免疫学的に効力のある量のＬｅｙ、Ａ　及びシアエ リルーＴｎからなる群から選ばれた一つ以上の抗原、及び（Ｂ）薬学的に許容さ れる担体、希釈剤又は賦形剤。

前記で定義した構造を有するＬｅｙ抗原は、公知の方法に従って合成して調製で き（ヒンズゴール、オー、ら、（１９８２）カーボハイドレート　リサーチ（Ｈ ｉｎｄｓｇａｕｌ。

０、　ｅｔ、　ａｌ、、　（１９８２）　Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ　Ｒｅｓ、 ）１０９　：　１０２〜１４２及びスポール、ニー、ら、（１９８５）カナディ アン　ジャーナル　オヴ　ケミストリー（Ｓｐｏｈｒ、　Ｕ、　ｅｔ、　ａｌ、 。

（１９８５）　Ｃａｎａｄｉａｎ　Ｊ、　Ｃｈｅｍ、）６３　：　２６４４〜２ ６５２）、また、アベ、ケー、ら、（１９８３）ジャーナル　オヴバイオロジカ ル　ケミストリー（Ａｂｅ、　Ｋ、　ｅｔ、　ａｌ、、（１９８３）Ｊ、　Ｂｉ ｏｌ、　Ｃｈｅｍ、）　２５８　：　１１７９３に記載されているような公知の 方法に従って天然物（ｎａｔｕｒａｌｌｙ　ｏｃｃｕｒｉｎｇ　５ｏｕｒｃｅｓ ）から単離することもできる。

上述した構造を有するＡ１抗原も、公知の方法に従って合成して調製でき（Ａ鎖 の１型の合成に関しては、ルミニー、アール、ニー、ケミカル　ソサイエティー 　レヴユーズ（１９７８）第７巻（Ｌｅｍｉｅｕｘ、　Ｒ，Ｕ、　Ｃｈｅｍｉｃ ａｌ　ＳｏｃｉｅｔｙＲｅｖｉｅｗｓ　（１９７８）　Ｖｏｌ、　７）　４２３ 〜４５２　；　Ｉ　ＵＰＡＣフロンティアーズ　オヴ　ケミストリー（ＩＵＰＡ ＣＦｒｏｎｔｉｅｒｓｏｆ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）　１９８２　ケー、ジェー、 　レイドラ−１第３〜２４版、（Ｋ、　Ｊ、　Ｌａ１ｄｌｅｒ、　ｅｄ、　３− ２４）を参照）、また、アベ、ケー、ら、（Ａｂｅ、　Ｋ、　ｅｔ、　ａｌ、、 ）１１９８０　ジャーナル　オヴ　イムノロジー〇、　Ｉｍｍｕｎｏ！、）　１ ３２．　１９５１に記載されているような公知の方法に従って天然物から単離す ることができる。

上述した構造を有するシアリル−Ｔｎ抗原は、ケルゼン、ティー、ら、（１９８ ８）キャンサー　リサーチ（Ｋｊｅｌｄｓｅｎ、　Ｔ、　ｅｔ、　ａｌ、、（１ ９８８）　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、）　４８　：　２２１４に記載されているよ うな公知の方法に従って天然物から単離することができ、また、シアリル−Ｔｎ 抗原からなる精製免疫原を調製する上記方法に従って調製することもできる。

上述したワクチンの免疫学的に効力のある用量並びに薬学的に許容される担体、 希釈剤及び賦形剤は、熟練した当業者によって難なく決定される。例えば、ワク チンとじてのシアリル−Ｔｎ抗原の免疫学的作用用量は、各注射につき約５５μ ｇとされている。しかし、担体の分子が重要である。シアリル−Ｔｎ抗原でコー トされたＢＣＧは、ＡＩＤＳ感染力を阻止するには有用な手段であるとされてい る。

−例として、５００μｇのＢＣＧに５０μｇのシアリル−Ｔｎ抗原をコートした ものが皮肉注射又は皮下注射に供される。

上述したワクチンの適切な投与方法もまた、熟練した当業者により難なく決定さ れるものである。

実施例 以下に、実施例に限定されること無く本発明を記載する。

特に記載しない限り、パーセント、割合、部等は、すべ抗−炭水化物（ａｎｔｉ −ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ　）モノクローナル抗体試験した抗体、それらの特 異性、アイソタイプ及び産生のための参考文献を、以下の第１表に一覧する。第 １表に示した２０種の異なるモノクローナル抗体は、炭水化物構造成いはＮ−結 合及び〇−結合又は排他的に〇−結合した糖蛋白鎖の表面（ｐｅｒｉｐｈｅｒｙ 　）に見られるグリコスフィンゴリピド、及びまたグリコスフィンゴリピド類を 定義する（クララセン。エッチ及びニス、ハコモリ（Ｃ１ａｕｓｅｎ、　Ｈ，。

ａｎｄ　Ｓ、　ＥｆａｋｏｍｏｒｉＸ１９８９）Ｖｏｘ　Ｓａｎｇ、　５６：１ 参照）。

すべての細胞は、１０％牛脂児血清（Ｆｅ２）　、２ｍＭグルタミン及び１ｍＭ ピルビン酸含有ＲＰＭ１１６４０中で成育し、０．０２％Ｎ　ａ　Ｎ　ａの存在 下で４℃で保存した。

この試験は３段階で行われた。

最初に、一覧したモノクローナル抗体全てを、約１０−５０μｇ免疫グロブリン （Ｉｇ）／ｒｎｌ含有培養ハイブリドーマ上清として、ＨＩＶ−阻害試験に供し た。

第２段階として、ＨＩＶ感染のいくらかの低減を示すモノクローナル抗体（ＴＫ Ｈ２、ＢＭＩ、ＡＨ２１、ＡＨＩ６、ＮＫＨｌ、ＨＨ６、ＳＨ２、ＣＡ３Ｆ４） を、保存剤が除去されるようＰＢＳに対してハイブリドーマ上清の十分な透析を 行った後に、ハイブリドーマ上清として再試験に供した（実施例１；Ｆｉｇ、１ ）。

最後に、モノクローナル抗体ＴＫＨ２、Ｂ７２．３、ＢＭｌ及びＡＨ２１を培養 上清から精製の後に使用した（実施例２；Ｆｉｇｓ２Ａから２Ｄ）。Ｔ　Ｋ　Ｈ ２（Ｉ　ｇ　Ｇ　１　）及びＢ７２．３　（ＩｇＧ１）をプロティンＡ−セファ ロースカラムクロマトグラフィーによって、ＡＨ２１及びＢＭｌはイオン−交換 クロマトグラフィーによって、製造会社（ファルマコア、ウプサラ、スエーダン （Ｐｈａｒｍａｃｏａ、　Ｕｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄａｎ）　）によって記載され た方法に従って精製した。

菅　ｕ′Ｉ　Ｑ 細胞 ＨＩＶ感染実験において、Ｔ４−リンパ球細胞株Ｈ９（ポボヴイック、エム、ら （Ｐｏｐｏｖｉｃ、　Ｍ、、ｅｔ　ａｌ、）（１９８４）サイｘ　＞　ス（Ｓｃ ｉｅｎｃｅ）　２２４：４９７　）　、ＣＥ　Ｍ　（フォレイ、ジー。

イー、ら（Ｆｏｌｅｙ、　Ｇ、Ｅ、、　ｅｔ　ａｌ、）（１９６５）キャンサー （Ｃａｎｃｅｒ）１８：５２２）及びＭＴ４（ハラダ、ニス、ら（Ｈａｒａｄａ 、　５．、ｅｔａｌ）（１９８５）サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）　２２９：５ ６３　）を、５％Ｃ○２下、１０％ＦＣ３（ＣＥＭ細胞については５％）、１０ ０１Ｕ／ｍｌペニシリン、２０μｇ／ｍｌゲンタミシン（ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎ ）及び１００ＩＵ／ｍ！ストレプトマイシン含有ＲＰＭ１１６４０　（成育培地 ）を使用して、３７℃で培養した。細胞を２−１９Ｘ１０５細胞／ｍｌの濃度で 維持し１、−週間に二度培地を交換した。末梢血単核細胞（ＰＭ　Ｃ）を、フィ コール−ハイバック比重差遠心（ボユム。

エイ、（Ｂｏｙｕｍ、Ａ、、）　（１９６８）　５ｃａｎｄ、Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、 Ｌａｂ、Ｉｎｖｅｓｔ、　２１：５ｕｐｐ１．９７　）によって健康な供給者か ら得、Ｔ４−リンパ球をパンニング（ｐａｎｎｉｎｇ　）　（ウィソッキー、エ ル。

ジエイ、ら（Ｗｙｓｏｃｋｉ、　Ｌ、　Ｊ、、ｅｔ　ａｌ）　（１９７８）　Ｐ ｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ７５：２８４４　）によって選択した。供給者の ＰＭＣとＴ４−リンパ球を、２０ＩＵ／ｍｌのインターロイキン−２を加えた成 育培地中で上記のように培養した。

参考のＨＩＶ−１株ＨＴＬＶ１□ＩＢに慢性的に感染しているＨ９細胞の上清（ ボボヴイック、エム、ら（Ｐｏｐｏｖｉｃ。

Ｍ、　、　ｅｔ　ａｌ、　）　（１９８４）サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）　２ ２４：４９７　）を、滅菌濾過し、部分標本化後使用するまで一８０℃で保存し た。

ＨＩＶ−１株５Ｓｒ−００２を以前記載したようにＨＩｖ−感染患者（ＣＤＣＩ 　Ｄから単離した（ナラ、ビー。

細胞中を通し、上述の様に保存した。使用前にウィルス調製物のＴ　ＣＩ　Ｄ　 ｓｏをＭＴ４細胞及びＰＭＣについて測定した。

毒性 モノクローナル抗体調製物の毒性を、２４ウエルの細胞培養プレートで、０．５ Ｘ１０６個のＭＴ４細胞を２０から０μｇ／ｍｌの精製された抗体を含有する成 育培地中インキュベートすることによって試験し、上清を培養４日後に適当な濃 度の抗体を含有する新鮮な培地に交換した。トリバンブルー圧排法を用いて０， ４及び７日目に生細胞数を得た。

ＥＬ　Ｉ　ＳＡ 細胞フリーの培養上清を、以前記載された２種の抗体のサンドイッチＥＬＴＳＡ （ニールセン、シー、エム、ら（Ｎ１ｅｌｓｅｎ、　Ｃ，Ｍ、、　ｅｔ　ａｌ） 　（１９８７）ランセット（Ｌａｎｃｅｔ）　８５３２５６６）を使用してＨＩ Ｖ抗原について調べた。それぞれのプレートは種々希釈されたスタンダードのＨ ＩＶ抗原調製物を含み、吸光度（ｏｐｔｉｃａ２　ｄｅｎｓｉｔｉｅｓ　）　（ ４９０ｎｍ）を標準調製物との比較によって表わした（任意の単位）。すべての インビトロの感染実験では、処理されていないＨＴＬｖエエよりを用いたコント ロールを含有した。培養４８後上清を希釈して０Ｄ４９０がこのコントロールの 約２倍になるようにする。感染の阻害を試験した抗体すべてを、また、ＥＬＩＳ Ａ検出の干渉（１ｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）の試験に供したが、そのような干渉 は認められなかった。

細胞のペレットをトリトン−Ｘ−４００を含む燐酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）１ ００μ工中に懸濁させ、１０分間沸騰させてＤＮＡを放出させた。１０μｍを９ ０μｌの増幅混合物（２００ｐｍｏｌの各プライマー、２００μｍｏｌの各ｄＡ ＴＰ、　ｄＣＴＰ、　ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ、　５０ｍＭ　ＫＣＩ、　１０ｍＭ 　）リス（ｐＨ８−３）　、６　、　５　ｍＭ　Ｍ　ｇ　ＣＩ　２並びに０．０ ２％ゼラチン）と混合した。これら使用したプライマーは、５Ｋ２９／５Ｋ３０ 　（オウ、シー、−ワイ、、ら（Ｏｕ、　Ｃ，−Ｙ、。

た。この混合物を９４℃で５分間加熱し、２単位のＴａｑ−ポリメラーゼ（パー キン−エル？　−（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）　シータス（Ｃｅｔｕｓ）ノル ウオーク（Ｎｏｒｗａｌｋ）　Ｕ　Ｓ　Ａ）を加えた。

ＤＮＡサーマルサイクラ−（パーキン−エルマー　シータス）中で、４０回増幅 を行った。それぞれのサイクルを、９４℃、１分、６５℃、１分、７２℃、１分 で続けた。

１μｌの増幅生成物を６０μｍの０．６７Ｍ　ＮａＯＨ１０，６７Ｍ　ＮａＣ１ と混合し、５分間沸騰させ、氷上で冷却した。試料をバキュームマニホールド中 ゼータープローブメンプランに転写し、試料のウェルをそれぞれ５００μｍの０ ．４Ｍ　ＮａＯＨで洗浄した。メンプランを簡単に２×標準生理食塩水クエン酸 溶液（ＳＳＣ；ｌＸ５ＳＣ：０．１５Ｍ　ＮａＣ１，０，０１５Ｍ　クエン酸Ｎ ａｐＨ７，０）中でリンスし、空気中で乾燥後、８０℃で２時間熱した。メンプ ランをハイブリダイゼーション溶液（５０％脱イオン化されたホルムアミド、１ ％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）　、ＬＭ　ＮａＣ１，５０ｍｇ／ｍｌ　デ キストラン硫酸塩及び０．１ｍｇ／ｍｌ　切断されたサケ精子ＤＮＡ）中で４２ ℃、２時間プレハイブリダイズさせ、その後２Ｑｐｍｏｌの３２Ｐ−ラベルされ たプローブ（ＳＫ３１）を加え、ハイブリダイゼーションを４２℃で一晩行った 。メンプランを２ＸＳＳＣ，０，１％　ＳＤＳ中室中室上０分間洗浄した後、２ ＸＳＳＣ，０，１％　ＳＤＳ中６２℃で３０分間洗浄した。最後にメンプランを ０゜２ＸＳＳＣ，０，１％　ＳＤＳ中室中室上５分間、２回リンスし、−晩コダ ックＸＡＲフィルム（Ｋｏｄａｋ　ＸＡＲｆｉｌｍｓ　）に露出した。

間接的な免疫蛍光分析 モノクローナル抗体の細胞への結合を間接的な免疫蛍光顕微鏡検査法（イナヌエ 、イー、アール、ら（Ｉｎａｎｕｅ　Ｅ、　Ｒ，。

ｅｔ　ａｌ、）　（１９８６）　Ｉｎ：Ｄ９Ｍ、　Ｗｅｉｒ　（ｅｄ）、Ｉｍｍ ｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙｌ、　２３：１）　によって決定した。簡潔に述べる と、５０μｍの懸濁緩衝液（１％ＢＳＡ、２％ヒト血清及び０．１％アジドを含 むＰＢＳ）に再懸濁させた１０６個の細胞を、５０μｍのハイブリドーマ上清と 共に４５分間４℃でインキュベートした。細胞をその後１ｍｌの冷やしたＰＢＳ 中で１回洗浄し、懸濁緩衝液中１：３０に希釈したＦ　Ｉ　ＴＣ−結合ウサギ抗 −マウス免疫グロブリン（ダコパツツ（Ｄａｋｏｐａｔｔｓ）　、コペンハーゲ ン）と、別に３０分間４℃でインキュベートした。インキュベーション後、細胞 を一度洗浄し、１２μｍの封入バッファー（３０％グリセロール、０．１％アジ ド及び１％パラホルムアルデヒド含有ＰＢＳ）中に再懸濁させ、顕微鏡のスライ ドに移した。少な（とも１００個の細胞をカウントし、蛍光細胞のパーセンテー ジを計算した。ＣＤ４（バイブリド−７ラボラトリー（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ、　 Ｌａｂｏｒａ、ｔｏｒｙ）の０ＫＴ４、ステートセーラムインスティチュート（ Ｓｔａｔｅ　Ｓｅｒｕｍ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ）　、コペンハーゲン及びダコパ ッツのＭＴ　３１０、コペンハーゲン）に対するモノクローナル抗体、及びｇｐ １２０　（デュポン（ＤｕＰｏｎｔ）　）に対するモノクローナル抗体を、コン トロールとして使用した。

８種の異なるオリゴサツカライドに対するモノクローナル抗体（ＮＫＨＩ、ＨＨ ６、ＴＫＨ２、ＳＨ２、ＢＭＩ、ＡＨ２１、ＡＨ１６及びＣＡ、　３　Ｆ　４　 ）を含有する８種のハイブリドーマ上清を、ＰＢＳの対して十分透析し、滅菌濾 過（０，２２μｍ）した。

ウィルス阻害活性 １０のＴＣｒＤ　ＨＴＬＶエエよりを０．５ｍｌのハイブリドーマ上清と混合し 、１時間３７℃でインキュベートした。ＭＴ４細胞（Ｉ　Ｘ　１０６）をこの混 合物中に懸濁させ、３７℃で２時間インキュベートした。細胞を十分に洗浄後、 細胞を１０％ｖ　／　ｖの対応するハイブリドーマ上清を含有する成育培地（４ ｍｌ）中に再懸濁させ、２つの同一物（ｄｕｐｌｉｃａｔｅｓ）　（１、５ｍ　 ｌ　）を２４ウエルの細胞培養プレートに移した。その細胞を３７℃、５％ＣＯ ２下で７日間培養し、細胞フリー上清（７５０μｌ）を、２．４及び７日後にハ イブリドーマ上清を含まない新鮮な培地と交換した。上清上に排出されるＨＩＶ 抗原を上述したようなＥＬ　Ｉ　ＳＡによって測定した。透析したハイブリドー マ上清（２００μｍ）を接種の前に１０　ＴＣＩＤ５ｏ　ＨＴＬＶエエ■Ｂ又は ５ＳＩ−００２と共にブレインキュベートし、上述のように培養した。

ＭＣまたは選択されたＴ４−リンパ球の接種に使用し７た。

３７℃で２時間インキュベート後、細胞を洗浄し、５ｍｌの成育培地中に再懸濁 した。１　ｍ　ｌの細胞懸濁液を４つの同一物としたもの（ｑｕａｄｒａｐｌｉ ｃａｔｅｓ）を２４ウエルの細胞培養プレートに移した。上清（５００μｌ）を 培養４及び７日後新鮮な成育培地と交換した。

結果をＦｉｇ、ｌに示した。

Ｆｉｇ−１では、縦軸に抗体産生を任意単位で示し、横軸は処理していないウィ ルスとのコントロール（÷ＡＢ）、ウィルスのないコントロール（十ＨＩ　Ｖ） または設計されたモノクローナル抗体を含有するハイブリドーマ上清を示す。

第１表に一覧したモノクローナル抗体のうち以下のモノクローナル抗体は、培養 上清中のＨＩＶ抗原濃度をバックグラウンドのレベルまで減少させた：ＴＫＨ２ 、ＢＭＩ、ＡＨ２１及び（ＡＨ２１に類似しているが、広い特異性を有する）Ａ Ｈ１６゜これら培養由来の細胞を、培養４日後、ＨＩＶ−ＤＮＡについてポリメ ラーゼ連鎖反応法によって分析した。ＨｒＶ抗原陰性上清（ＴＫＨ２、ＢＭＩ、 ＡＨ２１、ＡＨ１６及び感染していないコントロール）の培養物は、すべてＨＩ Ｖ−ＤＮＡについて陰性であり、抗原陽性上清の培養物は、ＨＩＶ−ＤＮＡにつ いても陽性であった。

実施例　２ 異なる標的細胞中での感染の阻害 異なる細胞系のＨｒＶ感染におけるモノクローナル抗体の阻害効果を比較するた めに、ＭＴ４細胞株の細胞、ＰＨＡで刺激されたＰＭＣ及び正常供給者由来の選 択されたＴ４−細胞を、モノクローナル抗体ＡＨ２１、ＴＫＨ２、Ｂ７２．３及 びＢＭＩとブレインキュベートしたＨＴＬＶエエ１Ｂの感染の標的細胞として使 用した。

１５０　ＴＣＩＤ　ＨＴＬＶ工Ｉよりを、６μｇのアフイニティー精製モノクロ ーナル抗体を含有する総量３００μｍのＲＰＭ１１’６４０中で、３７℃、１時 間インキュベートシた。２０μｍ　（＝ＭＴ４細胞における１０　ＴＣＩＤ　） を２×１０６個のＭＴ４細胞に添加するか又は１００μｒ（＝正常リンパ芽球（ Ｉｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｓ）の１０　７ＣＩＤ　）を４×１０６個の３−日ＰＨ Ａで刺激された供給者リンパ芽球又はパンされた（ｐａｎｎｅｄ）　Ｔ　４リン パ球に加え、３７℃で２時間インキュベートした。洗浄後、細胞を１μｇ／ｍｌ の抗体を含有する５ｍｌの成育培地に再懸濁させ、リンパ芽球についてはまた２ ０ＩＥ／ｍｌのインターロイキン−２も含有する５　ｍ、　１の成育培地に再懸 濁させ、４×１ｍｌを２４−ウェル細胞培養プレートに入れた。５００μｍの上 清を培養４及び７日後に新鮮な成育培地と交換した。上溝は上述したようなＥＬ 　ｒ　ＳＡで使用するまで一２０℃で保存した。

阻害濃度の決定 ２０　ＴＣＩＤ　ＨＴＬＶＩ■■Ｂを種々＜７）１１度１：ｌ’）７７イニティ ー精製モノクローナル抗体を含有する総量６０μｍのＲＰＭ１１６４０中で、３ ７℃、１時間インキュベートした。３０μｌ　（＝１０　７ＣＩ　Ｄ５ｏ）を５ ００μｌのＲＰＭＩ中の１×１０６個のＭＴ４細胞に添加し、３７℃、２時間イ ンキュベートした。十分に洗浄した後、細胞をＨＩＶブレインキュベーションに 使用した抗体濃度の１／１０を含む５ｍｌの成育培地中に再懸濁させ、４　Ｘ　 １　ｍ　ｌの細胞懸濁液を２４−ウェル細胞培養プレートに入れた。５００μｌ の上清を培養４及び７日後にトリパンブルー（Ｔｒｙｐａｎ　ｂｌｕｅ　）を使 用して新鮮な成育培地と交換した。上溝は上述したようなＥＬ　Ｉ　ＳＡで使用 するまで一２０’Ｃで保存した。

結果をＦｉｇ２Ａから２Ｄを示す。

Ｆｉｇ２Ａから２Ｄ中、縦軸はＨＩＶ抗原産生量（コントロールに対する％）を 示し、横軸はウィルス接種に関連するモノクローナル抗体濃度（μ／■ＣＩＤ５ ｏ）を示す。

Ｆ　ｉ　ｇ２Ａから２Ｄによって、ハイブリドーマ培養上清の精製した抗体、Ａ Ｈ２１、ＢＭＩ、ＴＫＨ２及びコントロールとしての（ＴＫＨ２と同一の特異性 を有する）８７２．３が、濃度依存的に感染を阻害をしたことが判る。阻害抗体 濃度を、モノクローナル抗体　（ＭＡｂ）タイター（ｔｉｔｅｒｓ）を中和する ために記載されているように（キンネイ　トーマス、イー６、ら（Ｋｉｎｎｅｙ 　Ｔｈｏｍａｓ、　Ｅ、、　ｅｔ、　ａｌ。

）　（１９８８）−ｒ−イズ（ＡＩＤＳ）　２：２５　）　、培養４日後（７） ＨＩＶ抗原発現を８０％減少させる抗体濃度として定義し、感染の量に関連して 示した。この阻害濃度は、８７２．３：０゜１８μｇ／ＴＣＩＤ５ｏ、ＡＨ２１ ：　０．３２μｇ／ＴＣＩＤ　５ｏ−Ｂ　Ｍ　１　’　１−１６μｇ／ＴＣｒ　 Ｄ５ｏＳＴＫＨ２：　１゜６μｇ／ＴＣＩＤ５ｏと書き入れた。

ウィルス調製物をＭＴ４細胞上への接種前に、ＭＡｂとブレインキュベートした 時、モノクローナル抗体は、ＨＩＶ−１関連株ＨＴＬＶエエより及びアイソレー ト５ＳＩ−００２の感染を阻害した。細胞をＭＡｂとブレインキュベートした後 処理していないウィルスを接種した場合、ＨＩｖ感染における減少は、観察され なかった。

細胞免疫蛍光 細胞免疫蛍光アッセイを、上述のように行った。

第２表に選択されたモノクローナル抗体での染色結果を示す。ＡＨ２１及びＡＨ １６は細胞を標識しなかった。ＴＫＨ２は、少量の細胞を弱く標識したが、一方 Ｂ７２．３は細胞を染色しなかった。モノクローナル抗体ＢＭＩは感染していな いＣＥＭ、Ｈ９細胞及び感染したＨ９細胞を標識した。ＢＭＩは非感染及び感染 したＭＴ４細胞を染色せず、パンニングによって正常供給者から精製した少数パ ーセントのＴ４リンパ球のみ陽性であった。

宿主細胞の糖脂質は、ピリオンの中に組み込まれる場合があり　（クランク。エ ッチ、−ディー、ら（Ｋｌｅｎｋ、　Ｈ，−Ｄ、。

ｅｔ　ａｌ、）　（１９７０）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ 、　ＵＳＡ　６６：５７　）、その結果それは宿主細胞に類似したグルコシル化 パターン（ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ　ｐａｔｔｅｒｎ　）を示す。ウィルス 蛋白のグリコジル化も、また宿主細胞遺伝子がコードするグリコジルトランスフ ェラーゼによって行われると信じられている。

それゆえ、宿主細胞とその中に増殖されたウィルス蛋白質が類似のグルコシル化 パターンを示すことが一般に期待されている。しかしながら、糖蛋白質の最後の グリカン（ｇｌｙｃａｎｅ　）構造は、コア蛋白の一次構造と同じ様に、エキソ グリコシダーゼおよびグリコジルトランスフェラーゼ活性の結果であり、ウィル スの糖蛋白の場合においては、新規なグリコジル化パターンの結果を示す。また 、ウィルス感染は、宿主細胞中での異常なグリコジルトランスフェラーゼ遺伝子 の発現を誘導することができた。この結果は、感染の阻害と標的又はウィルス源 として使用した細胞の免疫蛍光染色とが関連がなかったことを示す。ＭＡｂのウ ィルス阻害は、このようにウィルス増殖に使用される細胞のタイプとは独立して いた。

成育培地（２５μｌ）中ＨＴＬＶ□１１Ｂが感染したＨ９細胞の２倍希釈物（１ ０５−１０２細胞）を、透析したハイブリドーマ上清（２５μｍ）と９６−ウェ ルマイクロタイタープレート中で混合し、１時間インキュベートした。

その後、成育培地（５０μｌ）中の２×１０５個のＣＥＭ細胞を加えた。２４時 間インキュベート後、培養物を顕微鏡検査によって融合細胞（５ｙｎｃｙｔｉａ ）を評価した。融合細胞活性（ｓｙｎｃｙｔｉａｌ　ａｃｔｉｖｉｔｙ）は、融 合細胞形成（巨細胞が核の５倍を越える）が、培養物中で検出される感染された Ｈ９細胞の最小数として定義される。

結果を第３表に示す。

第３表 感染されたＨ９細胞のブレインキュベーション後の炭水化物特異的モノクローナ ル抗体の融合細胞活性の減少。

融合細胞活性は、ＣＥＭ細胞との２４時間の共インキュベーション後融合細胞形 成が検出されるところでの、ＨＴＬＶエエＩＢ感染細胞の最小数として示した。

抗体　感染された細胞数 熱（コントロール）　３，１２５ Ｂ７２．３　１２，５００ ＢＭ１　１２，５００ ＡＨ２１６，２５０ ＴＫＨ２＞１００．０００　（融合細胞熱）この結果により、同定された炭水化 物抗原は、適当なモノクローナル抗体を使用して、消極的な（ｐａｓｓｉｖｅ） 免疫療法において標的として機能することが期待される。

また、同定された抗原は、活性のある免疫によって患者の免疫応答を刺激するの に使用される。

本研究において、マウスのモノクローナル抗体のパネルには、Ｎ−及び〇−結合 糖蛋白質のポリ−Ｎ−アセチルアセトサミン構造上で見つけられる末梢の炭水化 物構造（一般に２−５残基）及び〇−結合糖蛋白質のタイプに制限された構造が 定義されている（第１表）。モノクローナル抗体ＢＭＩは、Ｌｅｙに対応し、既 にＨＩＶ−感染リンパ球上に発現することが知られており（アダチ、エム１．ら （Ａｄａｃｈｉ、　Ｍ、、ｅｔ　ａｌ、）　（１９８８）　Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍ ｅｄ、　１６７：３２３　、ピンクスケニス、エッチ０．ら（Ｐｉｎｃｕｓ、　 Ｓ、Ｈ，、ｅｔ　ａｌ、）　（１９８９）Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１４２：３０ ７０　）　、感染及び非感染細胞間の融合細胞の形成及び細胞フリーウィルスの 感染を阻害した。この阻害は、モノクローナル抗体とウィルスとのプレインキュ ベージジンによってのみ観察されるが、接種前にモノクローナル抗体と細胞との ブレインキュベーションによっては観察されない。

血液グループＡタイプ１鎖抗原に特異性のある１種のモノクローナル抗体ＡＨ２ １（Ｉ　ｇＭ）　、タイプ１を含む全てのタイプのＡ抗原に結合する１種のモノ クローナル抗体ＡＨ１６（ＩｇＧ３）（アベ、ケー、、ら（Ａｂｅ、　Ｋ、、　 ｅｔ　ａｌ、）　（１９８４）　Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１３２：１９５１　） は、担体炭水化物又は内部構造に関係なく、阻害を示すが、タイプ１鎖以外のＡ 抗原タイプに関するＭＡｂは、阻害を示さなかった。ヒトリンパ球は、内因性の 血液グループＡ及びＢ抗原を産生じないことが知られているが、これら抗原は血 漿からグリコスフィンゴリピドの形態で得られるか（オリオール、アール１．ら （Ｏｒｉｏｌ、　Ｒ，、ｅｔ　ａｌ、）　（１９８０）　Ｈｕｍ、　Ｉｍｍｕｎ ｏｌ。

１：１９５　）　、又はＨＩＶ誘導されたネオグリコジル（ｎｅｏｇｌｙｃｏｓ ｙｌａｔｉｏｎ）化の結果として発現される。

シアリル−Ｔｎ抗原に関するモノクローナル抗体ＴＫＨ２及びＢ７２□　３が、 感染及び融合細胞形成を阻害するという発見により、〇−結合グリカンは、他の エンベロープされたウィルス中に見られるように、またＨＩＶエンベロープ上に 存在することが類推される（オロフソン、　ニス。

、ら（Ｏｌｏｆｓｓｏｎ、　Ｓｌ、ｅｔ　ａｌ、）　（１９８１）　Ａｒｃｈ、 　Ｖｉｒｏｌ、　７０＋３２１）。感染における減少がウィルスにさらす前に標 的細胞（ＭＴ４）をブレインキュベートすることによって全く観察されなかった ので、ＭＡｂｓの阻害効果は、標的細胞へというよりもむしろＨＩＶへの結合の 結果によると考えられる。しかしながら、ＴＫＨ２はまた標的細胞を標識したの で、この抗体がＴ４レセプターへの結合によるＨＩＶ感染を干渉する可能性は、 完全に除外することはできない。

一方、このことは類似の特異性を有するモノクローナル抗体８７２．３は、細胞 を染色しなかったが、感染性を阻害したことからありそうもない。

抗炭水化物モノクローナル抗体と相互作用するウィルスのエンベロープのグリコ コンジュゲート（ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅＳ）の分子の特性は、現在明ら かではなく、この相互作用は、ｇｐ１２０以外の他の構造に関係するであろう。

ＨＩＶを阻害した大部分のモノクローナル抗体は、感染した細胞を標識しなかっ た。これにより、それらのエピトープは、抗ｇｐ４１モノクローナル抗体を中和 するために推論されていたことと同様に、ｇｐ１２０のＣＤ４レセプターへの最 初の結合が起こるまで、隠れていることが判る（キンネイ　トーマス、イー１． ら（Ｋｉｎｎｅｙ　Ｔｈｏｍａｓ、　Ｅ、、　ｅｔ、　ａｌ、）（１９８８）エ イズ（ＡＩＤＳ）　２：２５　）。

ＨｒＶ−中和抗体はＨＩＶ感染患者中に観察され、ｇｐ１２０及びｇｐ４１由来 の選択された合成ペプチドを使用してインビトロで産生された（ウェーバ−ジエ イ、エヌ、ら＋Ｊｅｂｅｒ　Ｊ、Ｎ、、　ｅｔ　ａ、１．）　（１９８９）ラン セット（Ｌａｎｃｅｔ）　ｉ：１１９；チャン　ティー、シー、ら（Ｃｈａｎｈ 、　Ｔ、Ｃ０，ｅｔ　ａｌ、）（１９８６）　ＥＭＢＯＪ、　５：３０６５　； ラスキー　エル、ニーら（Ｌａｓｋｙ。

Ｌ、Ａ、ｅｔ　ａｌ、）　（１９８６）サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）　２３３ ：２０９　）。

これらは疾患の進行に対して保護しないようだが、タイプ特異的である。ｅｎｖ 遺伝子中変異を含むＨＩＶの“エスケープ（Ｅｓｃａｐｅ）”変異体は、インビ トロ中に起きていることが示されたが、それによりウィルスは以前抗体を中和し た効果を逃れることができる（ウニイス　アール、ニー（Ｗｅｉｓｓ　Ｒ，Ａ、 ）　（１９８ｇ）　Ｊ、　Ａｃｑ、　１ｍｍ、　Ｄｅｆ、　Ｓｙｎ、　１：５３ ６）。

ウマの感染性貧血ウィルスに対する抗血清の抗−ＨＩＶ反応性は、ＨＩＶエンベ ロープの炭水化物部分に対して記載されている（モンテラロ　アール、シー、ら （Ｍｏｎｔｅｌａｒ。

Ｒ，Ｃ，、ｅｔ　ａｌ、）　（１９８８）　Ｊ、　Ｇｅｎ、　Ｖｉｒｏｌ、６９ ：１７１１　）が、炭水化物特異的抗体によるＨＩＶ−中和は、より早く記載さ れていなかった。炭水化物エピトープは、ＨＩＶエンベロープのペプチド部分を コードするゲノム中変異によって容易に影響を受けると期待されることはない。

このように、この結果によって、ウィルスのグリカンは、抗ウイルス免疫療法及 び／又はワクチン発達のための標的とすることがヒツジの下顎のムチン（０３Ｍ ）をシアリル−Ｔｎ抗原源として使用した。０８Ｍにおいて約９０％の炭水化物 鎖がシアリル−Ｔｎ抗原からなっている。

０３Ｍは、公知の方法によってヒツジの下顎の腺から単離された（テッタマンチ 　ジー、及びピグマン　ダブリュ。

（Ｔｅｔｔａｍａｎｔｉ、　Ｇ、　ａｎｄ　Ｐｉｇｍａｎ、　Ｗ）　（１９６８ ）　Ａｒｃｈ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ。

簡潔には、下顎の腺の水性抽出物を酸性ｐＨで沈殿させる（例えば、３．　５） 。これをムチンクロットという。このムチンクロットを遠心して、水に溶解させ 、ｐＨを中性にした後、酢酸ナトリウム中分画したエタノール沈殿物を調製した 。

このように同定された０８Ｍは、免疫原組成物として使用された。

モノクローナル抗体の免疫化及び確立 上述のように同定された高分子量シアリル−Ｔｎ抗原を、４、Ｑｍｇ蛋白蛋白質 ／４水ｌ水合で蒸留水中に溶解させ、公知の方法で得られた酸処理したサルモネ ラ　ミネソタ（ｓａＬｍｏｎｅｌｌａ　ｍ１ｎｎｅｓｏｔａ）　１６　ｍ　ｇを 加えた。混合物を５７℃で一時間混合し続け、凍結乾燥した。その凍結乾燥した 試料を４．０ｍｌのＰＢＳに懸濁させ、その１００μｍのアリコツト（即ち、１ ００μｇの糖蛋白質及び４００μｇのバクテリア）を、５匹のＢａ１ｂ／ｃマウ スそれぞれに尾血管を通して静脈内に注射した。注射は５週間の間１週間に一度 行われ、１か月の中断の後２００μｍの抗原懸濁液（即ち、２００μｇの糖蛋白 と８００μｇのバクテリア）でマウスを促進（ｂｏｏｓｔ　）させる。促進注射 の３日後動物を殺し、膵臓の細胞を取り出し、肺細胞（ｓｐｌｅｎｏｃｙｔｅ） をマウスミエローマ５Ｐ−２細胞と公知の方法で融合させた（ヒＯハシ　ニス、 ら（Ｈｉｒｏｈａｓｈｉ　Ｓ、ｅｔ　ａｔ）　（１９８４）　Ｐｒ。

ｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　８２ニア０３９−７０４ ３及びフクシ　ワイ、ら（Ｆｕｋｕｓｈｉ　Ｙ、　ｅｔ　ａｌ、）　（１９８４ ）　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　、２５９・４６８１−４６８５）　。

選択された培地上で成育したハイブリドーマは、上述した０８Ｍ、脱シアリル化 した０８Ｍ、牛下顎ムチン（ＢＳＭ）（ＢＳＭ上約５Ｏ％の炭水化物鎖がシアリ ル−Ｔｎ抗原からなる）及びグリコフォリン　Ａへのモノクローナル抗体反応性 について公知の方法によってスクリーンする。

ウシ下顎ムチン（ＢＳＭ）及びグリコフォリンＡはシグマケミカルカンパニー、 セントルイス、ミズーリ（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ、　 Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ、　Ｍｉｓｓｏｕｒｉ　）から購入した。

０８Ｍを、公知の方法によって、クロストリジウム　パーフリンジエンス（Ｃｌ ｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　Ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ　）タイプＸ（シグマ）由来のノ イロミノダーゼ（ｎｅｕｒｏｍｉｎｏｄａｓｅ　）０．１単位／ｍｌで処理する ことによって脱シアリル化した（マグナニ、ジエイ、エル、ら（Ｍａｇｎａｎｉ 、　Ｊ、　Ｌ、ｅｔ　ａｌ、）（１９８２）　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　 ２５７：１４３６５及びフクシら（Ｆｕｋｕｓｈｉｅｔ　ａｌ、）（１９８４） 　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　、２５９：１０５１１）。

０３Ｍとの陽性反応を示したモノクローナル抗体を分泌するものとして、約２２ 種のハイブリドーマが見つかった。

これらハイブリドーマをスケールアップして、モノクローナル抗体の反応性を０ ８Ｍ、脱シアリル化した０３Ｍ。

ＢＳＭ及びグリコフォリンＡを用いて再試験した。

０８Ｍと強い反応性を示すモノクローナル抗体、ＢＳＭと弱い反応性を示すモノ クローナル抗体及びグリコフォリンＡ又はシアリダーゼ−処理Ｏ３Ｍと反応を示 さないモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマが見つかった。

本発明は、種々の異なった態様を記載したが、本発明の更なる修飾が成されても 良いことが理解されなければならない。

任意単位 要　約　書 後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）及びＡＩＤＳ関連複合体（ＡＲＣ）の進行を 遅延又は阻害する薬剤であって、薬学的に効力のある量の抗−Ｌｅ　、抗−八〇 及び抗−シアリル−Ｔｎからなる群から選ばれた一つ以上の抗体、並びに薬学的 に許容される担体、希釈剤又は賦形剤からなる薬剤。ＡＩＤＳ及びＡＲＣを有す る被験者に、薬学的に効力のある量の抗−Ｌｅ　、抗−ＡＩ及び抗−シアリル− Ｔｎからなる群から選ばれた一つ以上の抗体、並びに薬学的に許容される担体、 希釈剤又は賦形剤からなる薬剤を投与することによりＡＥＤＳ及びＡＲＣの進行 を遅延又は阻害する方法。免疫学的に効力のある量のＬｅ　ＳＡ工及びシアリル −Ｔｎからなる群から選ばれた一つ以上の抗原、並びに薬学的に許容される担体 、希釈剤又は賦形剤からなるＡＩＤＳ及びＡＲＣに対するワクチン。被験者に免 疫学的に効力のある量のＬ　ｅ　％　Ａ　Ｉ及びシアリル−Ｔｎからなる群から 選ばれた一つ以上の抗原、並びに薬学的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤か らなる薬剤を投与することからなるＡＩＤＳ及びＡＲＣに対して活動的に免疫す る方法。

国際調査報告 −一一−ｍ−−ｍ、Ｐｅｒ／１ｌｓ９Ｌ１００３７３ャｌ＋団＋１ｌ−Ｐ１曜＋ １＾’−””−”””Ｉ）ｆ’Ｔ／１１（（Ｈ／Ａｎ’〕−７１１；

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）及びＡＩＤＳ関連複合体（ＡＲＣ）の進 行を遅延又は阻害する薬剤であって、以下のものからなる薬剤： （Ａ）薬学的に効力のある量の抗−Ｌｅｙ、抗−ＡＩ及び抗−シアリル−Ｔｎか らなる群から選ばれた一つ以上の抗体、及び （Ｂ）薬学的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤。 ２．一つ以上の抗体が抗−Ｌｅｙからなる請求項１に記載の薬剤。 ３．抗−ＬｅｙのＬｅｙに対する親和性がＫＤ約５×１０−７に相当する請求項 ２に記載の薬剤。 ４．抗−ＬｅｙがＡＴＣＣ寄託番号第ＨＢ１０３１２を有するハイブリドーマＢ Ｍ１により生産されたモノクローナル抗体ＢＭ１の同定的特徴を有する一つ以上 の抗体からなる請求項２に記載の薬剤。 ５．抗−ＬｅｙがＡＴＣＣ寄託番号第ＨＢ１０３１２を有するハイブリドーマＢ Ｍ１により生産されたモノクローナル抗体ＢＭ１からなる請求項４に記載の薬剤 。 ６．一つ以上の抗体が抗−ＡＩからなる請求項１に記載の薬剤。 ７．抗−ＡＩが以下の同定的特徴を有する請求項６に記載の薬剤： （１）ＡＩに対する親和性がＫＤ約１０−８〜５×１０−７に相当する；及び （２）少なくともタイプ１Ａ鎖に結合する。 ８．抗−ＡＩがＡＴＣＣ寄託番号第ＨＢ１０２２６を有するハイブリドーマＡＨ ２１により生産されたモノクローナル抗体ＡＨ２１の同定的特徴を有する一つ以 上のモノクローナル抗体からなる請求項７に記載の薬剤。 ９．抗−ＡＩがＡＴＣＣ寄託番号第ＨＢ１０２２６を有するハイブリドーマＡＨ ２１により生産されたＡＨ２１からなる請求項８に記載の薬剤。 １０．抗−ＡＩがモノクローナル抗体ＡＨ１６の同定的特徴を有する一つ以上の モノクローナル抗体からなる請求項７に記載の薬剤。 １１．抗−ＡＩがモノクローナル抗体ＡＨ１６からなる請求項１０に記載の薬剤 。 １２．一つ以上の抗体が抗−シアリル−Ｔｎからなる請求項１に記載の薬剤。 １３．抗−シアリル−ＴｎがＡＴＣＣ寄託番号第ＨＢ９６５４を有するハイブリ ドーマＴＫＨ２により生産されたモノクローナル抗体ＴＫＨ２の同定的特徴を有 する一つ以上のモノクローナル抗体からなる請求項１２に記載の薬剤。 １４．抗−シアリル−ＴｎがＡＴＣＣ寄託番号第ＨＢ９６５４を有するハイブリ ドーマＴＫＨ２により生産されたモノクローナル抗体ＴＫＨ２からなる請求項１ ３に記載の薬剤。 １５．抗−シアリル−Ｔｎがモノクローナル抗体ＴＫＨ１の同定的特徴を有する 一つ以上のモノクローナル抗体からなる請求項１２に記載の薬剤。 １６．抗−シアリル−Ｔｎがモノクローナル抗体ＴＫＨ１からなる請求項１５に 記載の薬剤。 １７．抗−シアリル−Ｔｎがモノクローナル抗体Ｂ７２．３の同定的特徴を有す る一つ以上のモノクローナル抗体からなる請求項１２に記載の薬剤。 １８．抗−シアリル−Ｔｎがモノクローナル抗体Ｂ７２．３からなる請求項１７ に記載の薬剤。 １９．ＡＩＤＳ及びＡＲＣを有する被験者に以下のものからなる薬剤を投与する ことによりＡＩＤＳ及びＡＲＣの進行を遅延又は阻害する方法： （Ａ）薬学的に効力のある量の抗−Ｌｅｙ、抗−ＡＩ及び抗−シアリル−Ｔｎか らなる群から選ばれた一つ以上の抗体、及び （Ｂ）薬学的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤。 ２０．一つ以上の抗体が抗−Ｌｅｙからなる請求項１９に記載の方法。 ２１．抗−ＬｅｙのＬｅｙに対する親和性がＫＤ約５×１０−７に相当する請求 項２０に記載の方法。 ２２．抗−ＬｅｙがＡＴＣＣ寄託番号第ＨＢ１０３１２を有するハイブリドーマ ＢＭ１により生産されたモノクローナル抗体の同定的特徴を有する一つ以上の抗 体からなる請求項２０に記載の方法。 ２３．抗−ＬｅｙがＡＴＣＣ寄託番号第ＨＢ１０３１２を有するハイブリドーマ ＢＭ１により生産されたモノクローナル抗体ＢＭ１からなる請求項２２に記載の 方法。 ２４．一つ以上の抗体が抗−ＡＩからなる請求項１８に記載の方法。 ２５．抗−ＡＩが以下の同定的特徴を有する請求項２４に記載の方法： （１）ＡＩに対する親和性がＫＤ約１０−８〜５×１０−７に相当する；及び （２）少なくともタイプ１鎖Ａに結合する。 ２６．抗−ＡＩがＡＴＣＣ寄託番号第ＨＢ１０２２６を有するハイブリドーマＡ Ｈ２１により生産されたモノクローナル抗体ＡＨ２１の同定的特徴を有する一つ 以上のモノクローナル抗体からなる請求項２４に記載の方法。 ２７．抗−ＡＩがＡＴＣＣ寄託番号第ＨＢ１０２２６を有するハイブリドーマＡ Ｈ２１により生産されたモノクローナル抗体ＡＨ２１からなる請求項２６に記載 の方法。 ２８．抗−ＡＩがモノクローナル抗体ＡＨ１６の同定的特徴を有する一つ以上の モノクローナル抗体からなる請求項２３に記載の方法。 ２９．抗−ＡＩがモノクローナル抗体ＡＨ１６からなる請求項２６に記載の方法 。 ３０．一つ以上の抗体が抗−シアリル−Ｔｎからなる請求項１９に記載の方法。 ３１．抗−シアリル−ＴｎがＡＴＣＣ寄託番号第ＨＢ９６５４を有するハイブリ ドーマＴＫＨ２により生産されたモノクローナル抗体ＴＫＨ２の同定的特徴を有 する一つ以上のモノクローナル抗体からなる請求項３０に記載の方法。 ３２．抗−シアリル−ＴｎがＡＴＣＣ寄託番号第ＨＢ９６５４を有するハイブリ ドーマＴＫＨ２により生産されたモノクローナル抗体ＴＫＨ２からなる請求項３ １に記載の方法。 ３３．抗−シアリル−Ｔｎがモノクローナル抗体ＴＫＨ１の同定的特徴を有する 一つ以上のモノクローナル抗体からなる請求項３０に記載の方法。 ３４．抗−シアリル−Ｔｎがモノクローナル抗体ＴＫＨ１からなる請求項３３に 記載の方法。 ３５．抗−シアリル−Ｔｎがモノクローナル抗体Ｂ７２．３の同定的特徴を有す る一つ以上のそノクローナル抗体からなる請求項３０に記載の方法。 ３６．抗−シアリル−Ｔｎがモノクローナル抗体Ｂ７２．３からなる請求項３５ に記載の方法。 ３７．以下のものからなるＡＩＤＳ及びＡＲＣに対するワクチン： （Ａ）免疫学的に効力のある量のＬｅｙ、ＡＩ及びシアリル−Ｔｎからなる群か ら選ばれた一つ以上の抗原、及び（Ｂ）薬学的に許容される担体、希釈剤又は賦 形剤。 ３８．一つ以上の抗原がＬｅｙからなる請求項３７に記載のワクチン。 ３９．一つ以上の抗原がＡＩからなる請求項３７に記載のワクチン。 ４０．一つ以上の抗原がシアリル−Ｔｎからなる請求項３７に記載のワクチン。 ４１．被験者に以下のものからなる薬剤を投与することからなるＡＩＤＳ及びＡ ＲＣに対して活動的に免疫する方法： （Ａ）免疫学的に効力のある量のＬｅｙ、ＡＩ及びシアリル−Ｔｎからなる群か ら選ばれた一つ以上の抗原、及び（Ｂ）薬学的に許容される担体、希釈剤又は賦 形剤。 ４２．一つ以上の抗原がＬｅｙからなる請求項４１に記載の方法。 ４３．一つ以上の抗原がＡＩからなる請求項４１に記載の方法。 ４４．一つ以上の抗原がシアリル−Ｔｎからなる請求項４１に記載の方法。