JPH05506561A - HIV―1 MN gp120のヒトモノクローナル抗体 - Google Patents

HIV―1 MN gp120のヒトモノクローナル抗体

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JPH05506561A JP90510360A JP51036090A JPH05506561A JP H05506561 A JPH05506561 A JP H05506561A JP 90510360 A JP90510360 A JP 90510360A JP 51036090 A JP51036090 A JP 51036090A JP H05506561 A JPH05506561 A JP H05506561A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 HIV−I MN gp120のヒトモノクローナル抗体発明の背景 本出願は、1989年6月5日出願のU、S、S、 N、第361,541号の 継続出願の、スコツト(Scott)ら、1989年11月3日出願のU、SS 、 N、第431,281号の継続出願である。
本発明は、ヒト免疫不全ウィルス(HI V)に特異的な抗体に関する。
HIVは後天性免疫不全症候群(AIDS)の原因となる要素であると提唱され ている(ボボビック(Popovic)ら、1984.5cience 224 :497)。別々のHIV株はウィルスゲノムにコードされている蛋白質のアミ ノ酸配列、特に外部エンベロープ糖蛋白質gp120のアミノ酸配列が異なる( スターシッチ(Starcich)、1986.Ce1l 45:637;バー ン(Hahn) ら、1986,5cience 232:1548)。gp1 2oはウィルスCD4の細胞リセブター蛋白質に結合する。エンベロープ蛋白質 を発現する細胞は培養液中でCD4を保有する細胞と融合する(リブソン(Li pson)ら、1986.Nature 323ニア25; ソドロスキー(S odroski)ら、1986. Nature 322:470)ことにより 、多核性融合細胞を形成する。天然のgp120および組換え体gp120のい ずれもがHIVを中和することのできる抗体を細胞培養液中で誘発する(マツュ ーズ(Ma t h ews) ら、1986.Proc、Nat 1.Aca 、Sci。
83 : 9709 、ラスキー(L a s k e y)ら、1986.  5cience233 : 209 、およびピュート= −(Pu t n  e y)ら、1986,5cience 234:1392)。これらの抗体は 通常gp120が由来したウィルス変異株のみを中和する。
100以上のHIV変異株が同定された;それらのうちにはRFCポポビック( Popovic)ら、上記) 、WM J−1(バーン(Hahn)ら、上記) 、LAV (ウエインーポプリン(Wa 1n−Hobson) ら、1985 .Ce11 40:9)、ARV−2(サンチェーペスカドール(Sanche z−Pescador)ら、1985,5cience 227:484)、お よびIII−B(ラトナー(Ratner) ら、1985.Nature 3 13:277)が含まれる。HIV−I I 1.変異株を中和するモノクロー ナル抗体の多くは、主要中和ドメイン(PND)と呼ばれる、IIl、のgp1 20分子の特定領域に結合するが、そのドメインはgp120の高頻度可変領域 の24のアミノ酸にマツプされる(マツシタ(Matsusita)ら、198 8.J、Virol、62:2107;およびスキナー(Skinner)ら、 1988.AIDS Re5earch and Human Retrovi ruses 4:187)。
上記ラトナー(Ratner)らのgp120の慣用的な番号によれば、HIV のgp120の高頻度可変領域はgp120分子の303番目から338番目の 36のアミノ酸である。完全長のgp120のうち、gp120ポリペプチド配 列は一つのHIV変異株の次の世代において約20%から約25%変化するが、 主要中和配列内のアミノ酸配列は約40%から約50%変化する。この高頻度可 変領域は保存されている複数のシスティン残基の前後にあり、該残基はジスルフ ィド結合を形成し、極めて保存されている配列Gly−Pro−Glyをその中 心に含むループ領域を規定する。合成ループ領域のペプチドは8アミノ酸または それ以上の長さであり、該ペプチドのアミノ酸配列が由来する単離体またはその 変異株からのウィルスのみを中和する抗体の生産を誘発することが分かった。
HIV−1蛋白質にたいして反応するヒトモノクローナル抗体はハイブリドーマ 形成またはEBvトランスフォーメーションにより生産される(バナボアー(B anapour) ら、1987.J、Immunol、139:4027;ス ガノ (S u g a n o) ら、1988.Biochem、and  Btophys、Res、Comm、155 :1105 ;モロウ(Mo r  r ow)ら、1988、J、rmmunol、140:941;ゴーニー( Gorny)ら、1989、Proc、NaL Aca、Sci、86:162 4;およびアマトリ(Amadori) ら、1989.AIDS Res、a nd Human Retroviruses 5ニア3)。
発明の概要 本発明は、HIVのMN変異株がHIV感染患者に最も多く、我々の推定によれ ばHIVに感染している人の約30%がMN変異株またはごく近縁の変異株、特 にMN変異株と当価の変異株に感染しているという、我々の発見に一部基づいて いる。
したがって、本発明はHIVのMNプロトタイプ、またはMNプロトタイプのウ ィルス変異株を中和できる抗体を特徴とする(ここで使用されているとおり、「 中和」は、細胞を含まないピリオン、または感染している細胞と感染していない 細胞の融合、またはその両方によりHIVが細胞に感染するのを阻害する、抗体 の能力を意味する)。MNプロトタイプウィルスは、主要中和ドメイン(即ち、 gp120エンベロープ蛋白質のループ領域)内の特定のアミノ酸配列に準する 配列により規定され、その配列はA1からA17のに−R−に−R−I−H−I −G−P−G−R−A−F−Y−T−T−にである。MNウィルス変異株はI− G−P−G−R配列、即ちA7からA11が完全に同一のアミノ酸配列であり、 そして上記MN配列の残りの12アミノ酸と少なくとも36%相同性を示す変異 株としてここに規定される。
好ましい態様において、その抗体は広範囲な中和能力を有する(ここで使用され ているとおり、「広範囲な中和」は、MNNプロトタイプおよび/またはMNウ ィルス変異株および他のHIV株による感染を阻害する、抗体の能力を意味する 。広範囲な中和活性を有する抗体は2つまたはそれ以上のHIV株を中和する能 力の証明に際して同定される)。ここで使用されているとおり、広範囲な中和抗 体は、表1a−dに見られるHIV単離体の少なくとも60%に存在する一次中 和ドメインの中央部のアミノ酸配列を有するHIV株を中和でき、より好ましく は、その配列はこれらHIV単離体の70%に存在する。本発明の広範囲な中和 抗体はHIVエンベロープ蛋白質の一次中和ドメイン内にアミノ酸配列G−P− G−A11−A12を含む少なくとも2株のHIVを中和できるが、但しA11 はRまたはRに類似のアミノ酸置換体であり、そしてA l 2はAまたは八に 類似のアミノ酸置換体である。ここで使用されている「類似の」アミノ酸置換体 は、親水性、疎水性、芳香性、またはアミノ酸の電荷の特徴か同じ置換体である 。
好ましい態様によれば、本発明により、広範囲に中和されるHIV単離体のPN Dアミノ酸配列配列Nのコンセンサス配列のG−P−G−R−Aと100%相同 であり、配列I−G−P−G−R−Aまたは配列G−P−G−R−A−Fと10 0%相同であることが好ましい。本発明により広範囲に中和される2株の内の一 つがHIVのI I 1.プロトタイプであることが好ましい。
他方、本発明による広範囲な中和抗体により認識されるPNDエピトープはHI Vエンベロープ蛋白質の一次中和ドメイン内にアミノ酸配列I−A’−A’−G −P−G−Rを含む隣接しないエピトープであるが、但し各々A6またはA7は 別個にどのアミノ酸でもよい(ここで使用されている「隣接しないエピトープ」 は、G−P−Gのすぐアミノ側の2つのアミノ酸の位置の一方または両方が抗体 の結合を解離させないどのようなアミノ酸置換体も含む。)。本発明の広範囲に 中和する抗体はエピトープI−A’−A’−G−P−G−R−A、またはI−A ’−I−G−P−G−R,またはI−A’−I−G−P−G−R−Aが好ましい 。これらのエピトープは表1のHIV単離体の69%、68%、および78%に それぞれ存在する。
上述のエピトープに隣接した複数のアミノ酸も中和抗体の結合活性に影響する。
HIVループ領域の配列の相対頻度を表2に示す。
好ましい態様において、本発明により中和されるMNウィルス変異株は式(1% 式% A” A” A16 A17のgp120ループ領域に準じた配列を有し、但し A1A6またはA12 A17は別個に、どのアミノ酸でもよく、最も好ましく は本発明のMNウィルス変異株が式(1)のgp120ループ領域に準じた配列 を有し、但し A”=に、 T、 A、 R,V、P、S、 マタハI。
A2=R,T、I、 M、またはK。
A”=に、 R,T、 N、またはA。
A’=R,S、 G、またはH1 A5=I、 M、 またはLl A’=H,P、S、 Y、 K、 N、またはRlA”=A、P、 T、S、ま たはK。
A13=F、 V、I、 W、またはり。
A14=Y、 H,V、 マタl;!F。
A15=T、 Y、またはA。
A”=T、 A、G、 またはR1およびA17=に、 G、E、S、 Q、  R,T、またはAである。
他の好ましい態様において、本発明により中和されるHIV株は式(2):A% 式% A” A” A17のgp120ループ領域に準じた配列を有し、但しA1−A 6およびA12−A17は別個に、どのアミノ酸でもよい。
本発明により中和され、そして上記の式(2)に準じた配列を有するHIV株は 、 A7が1であり、A12がAであり、A13がどのアミノ酸でもよく、そしてA 1からA6までとA 14からA”までを別個に欠失しているアミノ酸配列I− G−P−G−R−A−A13; A”がFであり、A7またはA14が別個にどのアミノ酸でもよく、そしてA1 からA6までとA”からA”までを別個に欠失しているアミノ酸配列A7−G− P−G−R−A−F−A”。
A5が1であり、A6またはA7が別個にどのアミノ酸でもよく、そしてA1か らA4までとA”からA17までを別個に欠失しているアミノ酸配列I −A’ −A’−G−P−G−R−A;または A5またはA7が別個に1であり、そして八〇がどのアミノ酸でもよい、アミノ 酸配列I−A’−1−G−P−G−R−Aの準じた配列である。
本発明の抗体はモノクローナルまたはポリクローナルでありヒトの抗体が好まし い。抗体はヒト以外の種由来の可変領域とヒト由来の定常領域を含むキメラ抗体 でもよく、抗体はキャリアーと共に配合してもよい。
抗体がモノクローナルであるならば、 (a)gp120のPND領域のMNプロトタイプウィルス配列または上記MN 変異株のアミノ酸配列の一つのどちらかを有するペプチドまたはポリペプチドを 用いて咽乳動物を免疫し、また作製された抗体か広範囲に中和するものであれば 免疫源をG−P−G−R−A−FまたはI−G−P−G−R−Aのどちら力)を 含むプロトタイプ配列または上記の他のコンセンサスエピトープ配列にし、(b )免疫化された哺乳動物の牌臓細胞と永久増殖性のセルラインを融合することに より個別のクローンを作製し、そして(C)モノクロ−チル抗体を産生ずるクロ ーンを選別する。選別段階1!ELISAによるのが好ましい。選別段階はMN プロトタイプまたはMNN変異株ウィルススまたは頻繁に生じるエピトープ配列 、例えば上記のよう1こ規定されたG−P−G−R−A−FまたはI−G−P− G−R−Aを含む広範囲のHIV株による感染を中和する、抗体の能力も含む。
抗体がポリクローナルであるならば、gp120のPND領域のMNプロトタイ プウィルス配列または上記MN変異株のアミノ酸配列の一つのどちら力1を含む ペプチド、または上記のモノクローナルにおいて規定された、PND内(二通常 生じるHIV配列(即ち、G−P−G−R−A−Fを含む配列)と反応する抗体 の存在を調べるために、ヒト抗血清により作製される。そして血しよう変換採血 法により、これらのペプチドと反応する、高力価の抗体を有するヒト力)ら血し ようを除去する。この抗血清のIgG画分はポリクロ−カル抗体源として使用さ れる。ポリクローナル抗体は慣用的な方法、例えばプロティンAアフイニテイ力 ラムによりさらに精製される。
他の側面において、本発明は上述の広範囲な中和抗体の同定法を特徴とし、(a )HIVエンベロープ蛋白質の一次中和ドメイン内に、A11はRまたはRに類 似のアミノ酸置換体であり、A12はAまたはAに類似の置換体であるアミノ酸 配列(1)G−P−G−A11−A”、または旧vエンベロープ蛋白質の一次中 和ドメイン内に、A6またはA7が別個にどのアミノ酸でもよいアミノ酸配列( 2)I−A’−A’−G−P−G−Rを含むペプチドまたは蛋白質に結合する能 力、または (b)HIvの中和における生物学的活性のいずれかまたは両方に関して抗体を 試験することを含む。
好ましくは、ひとつまたはそれ以上の以下のア・ンセイにおいて抗体を試験する ことを含む (a)HIVエンベロープ蛋白質の一次中和ドメイン内のアミノ酸配列(1)G −P−G−A11−A12、但しA11はRまたはRに類似のアミノ酸置換体で あり、A12はAまたはAに類似のアミノ酸置換体である、またはHIVエンベ ロープ蛋白質の一次中和ドメイン内のアミノ酸配列(2)I−A’−A’−G− P−G−R,但し各々A6またはA7は別個にどのアミノ酸でもよい、を含むペ プチドまたは蛋白質への抗体の結合を試験することによるELISAアッセイ; (b)上記アミノ酸配列(1)または(2)を含む二次ペプチドまたは蛋白質に よる競合の為に、抗体がペプチドまたは蛋白質に結合できなくなることを試験す ることによる競合EL I SAアッセイ;(c)抗体をHIV感染細胞に加え たとき、少なくとも80%、好ましくは90%融合細胞の形成を阻害することに よる融合阻害アッセイ、但しHIVは、A11はRまたはRに類似のアミノ酸置 換体であり、A12はAまたはAに類似のアミノ酸置換体である、HIVエンベ ロープ蛋白質の一次中和ドメイン内のアミノ酸配列(1)G−P−G−A11− A12、または各々A6またはA7は別個にどのアミノ酸でもよい、HTVエン ベロープ蛋白質の一次中和ドメイン内のアミノ酸配列(2)I−A’−A7−G −P−G−Rを含む。
(d)上記の(1)または(2)に規定されたアミノ酸配列を有するペプチドと 抗体をインキュベートすることにより、抗体が融合細胞の形成を阻害できなくな ることを試験し、そして抗体をHIV感染細胞に加えることによる競合融合阻害 アッセイ; (e)抗体をHIVとインキュベートし、そしてHIVに感染しゃすい細胞に加 えたとき、抗体がHIVの感染を中和することによるHIV感染中和アッセイ; および (f)抗体をHIVとインキュベートし、そしてHIVに感染しゃすい細胞に加 えたとき、抗体がHIVの力価を低下させることによるHIV感染性低下アッセ イである。
本発明は、 (a)MNプロトタイプウィルスまたはそのMN変異株ウィルス、但しHIVエ ンベロープ蛋白質の一次中和ドメイン内のアミノ酸配列が、−次中和ドメインの AX ARTの位置のアミノ酸残基に−R−に−R−I−H−I−G−P−G− R−A−F−Y−T−T−Kに準じた配列、およびA 7− A 11の位置の I −G−P−G−R残基と完全に相同な配列であり、MNプロトタイプに準じ た配列の残りの残基が少なくとも36%相同であることからなる、MN変異株に 準じた、対応するアミノ酸配列を含み、そして (b))(IVエンベロープ蛋白質の一次中和ドメイン内にアミノ酸配列G−P (、−AI L A 12を含む少なくとも2つのHIV株、但しA”はRまた はRに類似のアミノ酸置換体であり、A12はAまたはAに類似のアミノ酸置換 体である、または (C)HIVエンベロープ蛋白質の一次中和ドメイン内にアミノ酸配列I−A’ −A’−G−P−G−Rを含む少なくとも2つのHIV株、但し各々A6または A7は別個にどのアミノ酸でもよい を中和できる抗体を患者に投与することを含む、患者へのHIV感染の治療法ま たは予防法も特徴とする。
抗体はモノクローナルまたはポリクローナルであることが好ましい。
他の側面において、本発明は、真核生物細胞への感染に際して、二次HIV株の 一次中和ドメインを含む一次株のHIVエンベロープ蛋白質を発現できる組換え 体ワクシニアウィルスを特徴とする。ウィルスはエンベロープ蛋白質をコードす るDNAを含み、DNAは二次HIV株の一次中和ドメインを含む一次株のHI Vエンベロープ蛋白質をコードするDNA配列を含み、エンベロープ蛋白質をコ ードするDNAはワクシニアウィルスプロモーターの転写制御下にある。
HIVエンベロープ蛋白質をコードする、組換え体ウィルスのDNAは組換え体 ベクター由来であることが好ましい。ベクターはエンベロープ蛋白質をコードす るDNA配列を含み、そしてDNAは二次HIV株の一次中和ドメインを含む一 次株のHIVエンベロープ蛋白質をコードするDNA配列を含み、そしてDNA はワタシニアウイルスゲノム内にエンベロープ蛋白質をコードするDNAを挿入 できる。
HIVエンベロープ蛋白質をコードするDNAは雑種配列、即ち一次中和ドメイ ンをコードする配列と残りの配列か別のHIV株由来である。即ち、例えば、そ れか由来するウィルスまたはベクターは、所望の株からの一次中和ドメインをコ ードする領域か、ウィルスまたはベクターの他の部分を変化させることなしに、 エンベロープをコートする領域の残りを含んで挿入され得ることにより、カセッ トとして機能できる。コートされたエンベロープ蛋白質は、その雑種か自然によ るにもかかわらず、−次中和ドメインをコードする配列が由来した株のHIV中 和に関して、免疫的な特徴を呈する。換言すれば、例えば−次中和ドメインがM NまたはMN変異株であれば、コードされるエンベロープ蛋白質はMN変異株に 特異的な抗体により特異的に中和され;また、例えば−次中和ドメインがgp1 20のチップ、即ちG−P−G−R−A−Fの右側由来であるならば、コードさ れたエンベロープ蛋白質はMN株またはMN変異株の両方およびG−P−G−R −A−F配列を含む他のHIV株を中和できる広範囲な中和抗体により中和され る。したがって、雑種エンベロープをコードするウィルスは、真核生物細胞の表 面に雑種エンベロープ蛋白質を発現させる能力を該真核生物細胞に付与できる感 染性の因子として使用できる。雑種エンベロープをコードするベクターを使用す ることにより、どのようなHIV株をも中和でき、一つの株、例えばRF、WM J−1,LAV、またはARV−2より多くの株を中和するのに有効な抗体を同 定する能力に関して抗体をスクリーニングできる。
他の側面において、本発明は、ヒト免疫不全ウイルスタイブエのMN変異株を特 異的に中和し、そして広範囲なHIV株、例えば上記の配列を含む株を中和でき るヒトモノクローナル抗体、およびHIVに感染した患者に対してウィルスを中 和できる量の抗体を投与するための治療法を特徴とする。
より好ましい態様によれば、抗体はHIVに感染した患者由来の固定化B細胞に より生産され、該B細胞はエプスタインパールウィルスを用いた感染により固定 化される。他の好ましい態様によれば、該ヒトモノクローナル抗体を薬学的に受 容可能なキャリアー物質と化合した組成物を投与することにより患者を治療する 。
該組成物は、T(rVエンベロープ蛋白質の一次中和ドメイン内のアミノ酸配列 (1)G−P−G−A”−A12、但しA11はRまたはRに類似のアミノ酸置 換体であり、A12はAまたはAに類似のアミノ酸置換体である、またはHIV エンベロープ蛋白質の一次中和ドメイン内のアミノ酸配列(2)I−A’−A7 −G−P−G−R,但し各々A6またはA7は別個にどのアミノ酸でもよい、を 含む少なくとも2つのHIV株を中和できる抗体を含む。
本発明は、通常生じるエピトープ、例えば上記のようなG−P−G−R−A−F またはI−G−P−G−R−Aを含むHIV株を中和できる、広範囲に中和する 抗体でもあるH I VM、を中和できるヒトモノクローナル抗体を得る方法も 特徴とし、その方法は抗HIVモノクロ−士ル抗体を付与する段階、およびHI  VM。
のgp120エンベロープ蛋白質の断片に結合する能力のあるモノクローナル抗 体を最初に試験することを含み、但し該断片は一次中和ドメインからなり、結合 は抗体がHIVMNを中和する能力を示す。
好ましい態様によれば、抗体は、HIVエンベロープ蛋白質の一次中和ドメイン 内のアミノ酸配列(1)G−P−G−A11−A”、但しA11はRまたはRに 類似のアミノ酸置換体であり、A12はAまたはAに類似のアミノ酸置換体であ る、またはHIVエンベロープ蛋白質の一次中和ドメイン内のアミノ酸配列(2 )I−A6−A’−G−P−G−R,但し各々A6またはA7は別個にどのアミ ノ酸でもよい、からなる少なくとも2株のHTVを中和できる。MN変異株への 結合能力を試験するために使用される断片は、上記のような通常生じるPNDエ ピトープ配列のうちの一つからなる断片であるか、またはすべての断片、または アミノ酸配列I−G−P−G−R,I−G−P−G−R−A、G−P−G−R− A−FS I−A’−A’−G−P−G−R−A、I−A’−I−G−P−G− R,I−A’−I−G−P−G−R−A、またはに−R−に−R−I−H−1− G−P−G−R−A−F−Y−T−T−に、但しこれらの配列はMNgp120 蛋白質の一次中和ドメインに含まれる、に類似の原型MNgp120PND領域 に類似の断片である。該方法は最初の試験段階の前または後に、例えば融合の形 成の阻害を確認することにより、モノクローナル抗体がHIV。Nを中和する能 力を試験する二番目の試験段階をさらに含み、そして最初および二番目の試験段 階の前または後に、該抗体が広範囲なHIV株を中和する能力を試験する三番目 の段階をさらに含む。該断片はgp120のPND由来のペプチドであり、より 好ましくは閉環したループペプチドであることが好ましい。
該方法は最初および二番目の試験段階の前または後に、抗体がHI V、、以外 の少なくとも一つのHIV株を中和する能力を試験する三番目の段階をさらに含 むことが好ましいが、但し上記株はHIVエンベロープ蛋白質の一次中和ドメイ ン内のアミノ酸配列(1)G−P−G−A11−A”、但しA11はRまたはR に類似のアミノ酸置換体であり、A12はAまたはAに類似のアミノ酸置換体で ある、またはHrVエンベロープ蛋白質の一次中和ドメイン内のアミノ酸配列( 2)I−A’−A7−G−P−G−R,但し各々A6またはA7は別個にどのア ミノ酸でもよい、を含む。
より好ましくは、該配列がR−1−H−r−G−P−G−R−A−Fを含み、M Nプロトタイプ配列に準じた配列の残りの配列の相同性が36%未満であるが、 但しプロトタイプに準じた配列はに−R−に−R−I−H−I−G−P−G−R −A−F−Y−T−T−Kを含む。
本発明の抗体を使用することにより、HIVに感染しているかまたは感染してい る疑いのある患者におけるHIV感染を予防できる。感染性因子に暴露まはた擬 似暴露した直後に、患者にヒト抗体を投与すれば、ウィルスによる感染の定着を 阻害する。例えば患者が偶然HrVで汚染された血液、血液製剤、または体の分 泌物に接触する。抗体は、妊娠の前または妊娠中に抗体を投与することにより、 および/または出産時およびその後子供に投与することにより、血清に陽性の妊 婦からのHIVの子供への移入も阻害する。該抗体は受け身の免疫治療にも使用 され、例えば依然としてHrV陰性のハイリスクグループの人々に一定の間隔で 抗体調製物を用いて治療することにより、慢性HIV感染の定着を阻害できる本 発明の抗体は、感染した人々にMN変異株が広く分配されるために、生物学的な 試料内のHIVの検出、血液供給物のスクリーニング、およびもしかすると高い パーセンテージのHIV感染患者の治療に有用である。
本発明の広範囲に中和する抗体は、IvfNまたはMN変異株の両方および通常 のエピトープ配列を含むHIV株をrAMaするため特に上記の応用に有用であ る。
本発明の他の特徴および利点は、以下のその好ましい態様の記述および請求項に より明らかにされる。
好ましい態様の詳細な説明 図面の簡単な説明する。
図1は、ヒトモノクローナル抗体(HMab)と2株のHIV−1との反応性を 示す、ウェスタンプロット分析である。
図2は、4つのHMabと別のHIV株のgp120との反応性を示すドツトプ ロットである。
図3は、図2の2つの抗体、X24−3bおよびN7O−23゜aと9株のHI V−1のCon−A固定化gp120とのELISA反応性を示すグラフである 。
図4は、N7O−23,a、N7O−15,e、N7CL−19,b HMab と9株のHIV−1のCon−A固定化gp120とのELISA反応性を示す グラフである。
図5は、X24−3bおよびN7O−23,a HMabと8株のHIV−1と の反応性を示す、ウェスタンプロット分析である。
我々は以下に本発明の抗体の製造法および使用法を記述する。
免長原Ω製造汰 本発明の抗体を生成するために使用される免疫源は合成ペプチド、蛋白質断片、 MNプロトタイプまたはMN変異株のgp160ポリペプチドであり得、または 大多数のHIV株に共通のMNプロトタイプ配列に準じた配列を含む。免疫する ペプチド、ポリペプチド、または蛋白質は少なくとも8、より好ましくは少なく とも17の長さのアミノ酸がよく、上記の同定されたgp120内のMNプロト タイプ中和ドメインに準じた配列と100%相同な5以上のアミノ酸配列を含む かまたは中心の5つのアミノ酸が100%相同でその周りのアミノ酸が少なくと も36%相同なアミノ酸配列がより好ましい。本発明の広範囲に中和する抗体を 生成するために使用される免疫源は中心の6つのアミノ酸がG−P−G−R−A −Fまたはr−G−P−G−R−Aであるアミノ酸でもよい。
免疫するペプチド、ポリペプチド、または蛋白質は直鎖状で、別法としてPND 配列の末端のシスティン残基間でジスルフィド結合を形成することにより閉環ル ープ内に形成される、−次中和ドメイン部分を含む。免疫するペプチドがひとつ より多くのPNDを含むのならば、各々はジスルフィド結合により別々にループ を形成する。
HIV−MNウィルスプロトタイプまたはMNウィルス変異株のgp160−次 中和ドメインのアミノ酸配列を完全に含むか、または配列G−P−G−R−A− Fまたはr−G−P−G−R−Aを含む合成ペプチドは、自動ペプチド合成機を 使用して自動化されたペプチド合成により合成された。さらに、完全なエンベロ ープポリペプチドはバキュロウィルスの発現系を使用して昆虫細胞において生産 され、そして1987年8月31日出願のルッシエ(Rusche)ら、U。
S、S、 N、091. 481 (本願発明と同じ承継人であり、その記載は 引用により本明細書の一部をなす)に記述されているとおりに精製された。FB Iと示された(ピュートニ−(PI、I t n e y) ら、1986,5 cience 234:1392)、−次中和ドメインのアミノ酸配列を含む1 80アミノ酸の蛋白質断片は、U、S、S、N、107,703 (1987年 10月9日出願、本願発明と同じ承継人であり、その記載は引用により本明細書 の一部をなす)に記述されているとおりに、完全長の且ユヱ遺伝子をPvuII およびBglllで切断することにより生成された約540bpのDNA断片か ら発現された。免疫源として使用された合成ペプチドまたは蛋白質断片は、以下 のとおり、サクシニルマレイミドメチルシクロヘキサニルカルボキシレート(S MCC)を化合因子として使用して、免疫原性キャリアー、例えばキーホールリ ンベットへマドシアニン(KLH)またはオバルミンと化合してもよい(ヨシタ ケ(Yoshitake)ら、1982.J、Biochem、、92:141 3−1424)。
簡単に言えば、50μlのジメチルホルムアミドに溶解した1mgのSMCCを 6mgのキャリアー(0,LM NaPO,、pH6,5に10−20mg/m 1の濃度で)に加え、室温において0.5時間インキュベートした。溶液をセフ ァデックスG−25カラムに通すことにより、過剰の未反応のSMCCを除去し 、そして2mgのペプチドを加えた(脱気した0、LM NaPO4,pH8, 1mM EDTAに10mg/mlの濃度で懸濁した)。溶液を窒素ガスと混合 し、そして4℃において一部インキユベートした。沈殿が溶解するまで試料を6 M尿素、O,LM NaPO,、pH7に対して透析し、そして6M尿素、O、 IM NaPO,で平衡化したバイオミルP−40カラムにより溶出した。溶出 した蛋白質を集め、そして蒸留水に対して透析した。
RP142.RP70.RP342.RPloo、RP102.RP108゜R P123cおよびRP174cと名付けられたこれら免疫源の多くは、表3に示 すとおりgp120のループ領域の中和ドメインに準じたアミノ酸配列をもつペ プチドRP70.RP123c、およびRP174cは該アミノ酸の末端近辺の 2つのシスティン残基間のジスルフィド結合の形成により、閉環ループになる。
そのような結合の形成法はザング(Z h a n g)ら(1988,Bio chemistry 27:3785−3794)により記述されている。
ペプチドは標準的な技術により、フロイント完全アジュバント内で乳化すること により免疫化のために製造された(CFA、Difco Labs、Grand  l5land、NY)。
ヒト塩 のMN 的モノクローナル の1″マウスの株(Ba Ib/c、C5 7BL/6.A、SW、BIO,BR,またはBIO,A、Jackson L abs、、Bar Harbor、ME)を上述のペプチドのうちのひとつによ り、マウスあたり10−50μgの濃度で、腹腔内で免疫した。該マウスに対し て、フロイント不完全アジュバントの乳化または可溶性の形のいずれかで、最初 の免疫から2〜4週間後に2〜3回、免疫源の追加免疫を行った。該マウスから 採血し、血清について免疫源と反応性のある抗体の存在をアッセイした。強い免 疫的応答を示すマウスは3−5日後に追加免疫され、これらのマウスの牌臓細胞 をコーラ−(Kohler)およびミルスタイン(Mi l5tein)、Na ture (1975)256:495の方法に基づいた標準的な方法により、 重鎮と軽鎖イムノグロブリン鎖を分泌できる、N5−1 (A、T、C,C,N o、TlB18) 、5P2−0 (A、T、C,C。
No、CRL8287.CRL8006) 、またはP3.X63.AC3,6 53ミエローマ細胞と融合させた(キア=−(Kea rney)ら、J、Im munot、、1979,123:1548)。
融合後6−21日目に現れたハイブリトーマの上清について、表3に示したひと つまたはそれ以上のペプチドと反応する抗体の生産を、以下に示すELISAス クリーニング分析によりスクリーニングした。
96ウエルのコスタ−(Costar)平底マイクロタイタープレートの各プレ ートに、ペプチドを含むPBS溶液の50At+アリコートを入れ、各ウェルの 最終濃度が0.1−10Mg/mlになるようにしてペプチドをコートした。ペ プチド溶液を吸引し、そしてPBS+0.5%BSAで置換した。インキュベー ト後、ウェルを吸引し、洗浄し、そしてハイブリドーマの上清を加えた。インキ ュベート後、ウェルを3回PBSで洗浄し、そして羊抗マウスイムノグロブリン をセイヨウワサビ(Horseradish)パーオキシダーゼ(HRP、zy med Laboratories、San Francisco、CA)と化 合した特定の希釈液50μlとインキュベートした。ウェルを再びPBSで3回 洗浄し、そして50μmの1mM ABTS (0,1Mクエン酸ナトリウム、 pH4,2に溶解し30%Hx O2を加えることにより1:1000に希釈し た、2.2 アジノービス(3−エチルベンズチアゾリン−6−スルフォン酸) )をHRPの基質として加えて、抗体の結合を検出した。そしてABTS試料の 0D410をグイナテック(Dynatech)分光光度計自動読み取り機(バ ージニア(Virginia))により測定した。
ELISA法により陽性と判定されたハイブリドーマについて、以下のようにし て融合形成の阻害をアッセイした。通常、興味あるHIV株のエンベロープ遺伝 子を発現する組換え体ワクシニアウィルス(例えば、v a c−e n CM N)を使用してCD4+ヒトT−リンパ腫ラインCEM (A、 T、 C,C ,寄託番号CCL119)細胞に感染させ、そしてハイブリドーマの上清を該細 胞に加えることにより、モノクロ−カル抗体によるHTvエンベロープを介した 細胞融合の妨害をスクリーニングした。
え ワクシニアウィルス HIVエンヘローフヲコード るベクターの ワクシニアウィルスプロモーターから完全長のHIVエンベロープ遺伝子を発現 できる組換え体ワクシニアウィルスの構築は欧州特許第0 243 029号に 記述されておりその内容は引用により本明細書の一部をなす。二次ワクシニアウ ィルスプロモーターから発現されるHIVenv遺伝子および大腸画工acZ遺 伝子、およびチミジンキナーゼ(T K)をコードする、ワクシニアウィルスの 周辺配列を含む組換え体ベクターpSC25を使用して組換え体ウィルスを製造 した。
本発明の目的のために、HIV−MN変異株に特異性を有するエンベロープ遺伝 子をコードするDNAを含む組換え体ベクターを構築することが必要であった。
このために、pSC25の一次中和ドメインの領域を含むHIV−IIl、eユ ヱ遺伝子から570bpのBglII断片(180アミノ酸をコードする)を除 去し、そしてHIV−MNenヱ遺伝子由来の、対応するBgllI断片でそれ を置換した。その結果得られたプラスミドpscR2502はエンベロープ蛋白 質をコードする雑種エンベロープ遺伝子を含み、該蛋白質はMNウィルスの一次 中和ドメインとHIV−I I 1.エンベロープの!1二遺伝子配列を有した 。
HIV−MNgp160の同じ領域を前述の180アミノ酸に置き換えて使用で きる。例えば、36アミノ酸の一次中和ドメインをコードするDNAを対応する I I 1.DNA配列に代えてエンベロープをコードするDNAに挿入でき、 またすべてのHIVenv遺伝子由来のPNDを他のすべての変異株のPNDで 置き換えられる。別法として、完全なHIV−MNenv遺伝子を含む組換え体 を使用できる。多目的な、HIVエンベロープを発現する株は、抗体が広範囲な 中和活性を有するかどうかを決定するのに有用である。
組換え体ベクターpSCR25o2で、完全なTK遺伝子を含むワクシニアウィ ルスを予め感染させたCV−1宿主細胞をトランスフェクションした。HIVエ ンベロープ遺伝子はベクター上のTK配列とウィルスゲノム内のTK配列との間 の相同組換えによりウィルスDNAに挿入された。HIVエンベロープ遺伝子を 含む組換え体はTK−細胞に感染させ、そしてブロモデオキシウリジン(BUd R)およびX−galを含む培地にプレートすることにより選択された。BUd RはTKゝ細胞に有毒であるために、TK−組換え体の選択に使用され、X−g alは青いプラークの生産をもたらす上l仝Z遺伝子産物により分解される色原 体であり、±acZ遺伝子が発現されることにより、HIV−eユヱ遺伝子も含 む組換え体ウィルスか同定される。
且旦ヱ遺伝子を発現する組換え体ウィルスを使用してCD4+細胞に感染させた 。これら細胞の表面上に存在するHIVエンベロープ蛋白質はCD4の細胞表面 リセブターに結合することにより細胞融合し、そして融合細胞と呼ばれる巨大多 核細胞を形成する。
融合細胞の形成は連続に希釈したハイブリドーマ上清または精製されたモノクロ ーナル抗体の存在下または非存在下においてアッセイされた。形成された融合細 胞の数は24時間後の感染において定量された。陽性のハイブリドーマ上清、即 ち中和活性を有する上清は少なくとも90%融合の形成を阻害するものとして規 定された。
ペプチド結合(ELISAアッセイ)および中和活性(融合の形成の阻害)の両 方に関して陽性と判定されたハイブリドーマを限定希釈法によりサブクローン化 した。ハイブリドーマ細胞および免疫化していない同系マウスの照射した牌臓細 胞(立方あたりの最終濃度はそれぞれ5細胞、および2.5X10’細胞)を混 合し、そして混合された懸濁液200μmをマイクロタイターウェルにプレート することにより、ウェルあたり1ハイブリドーマ細胞になるようにした。7−1 4日後に現れたサブクローンを再び上述のEL I SA法によりアッセイした 。
個々の陽性サブクローンをもう一部サブクローンした。
ハイブリドーマを分泌する多くの陽性モノクローナル抗体が得られた。抗体のア イソタイプは、5つの主要マウスイムノグロブリンアイソタイプ(IgM、Ig G1.IgG2A、IgG2Bおよび1gG3)それぞれに対応する羊抗マウス HRP調製物を使用してEL T SA法により決定された。
モノクローナル几 の声6および I 精製された抗体は、ELI SAおよび融合阻害により再度陽性と判定されたハ イブリドーマをブリステンープライムド(pristane−primed)同 系マウスの腹腔内に注射することにより調製した。発達した腹水を注射後2から 3週間後に回収し、そしてモノクローナル抗体を以下のように抗体のアイソタイ プに依存した方法により精製した。溶出後、すべてのIgG抗体をPBSに対し て透析した。
IgM抗体は対応するハイブリドーマ細胞を注射したマウスの腹水を50%NH 2S○4で沈殿させることにより精製し、そして沈殿物を4xPBSに対して透 析した。そして透析した抗体を4xPBSにより平衡化したウルトロゲル(Ul  t roge I)A−6カラム(バイオテクニクス(Biotechnic s)社、Vi l Ieneuve−La−Garenne、 フランス)に通 した。抗体を含む画分をELISAにより同定した。
I gG1抗体を含む腹水をO,IM Tris−HCI、3M NaCl、p H8,9により4倍に希釈し、そして同じTris−NaC1緩衝液により平衡 化したプロティンAアフィニティ力ラムを通して単離した。抗体は0.IM ク エン酸ナトリウム、pH6,0により溶出した。
IgG2抗体を含む複水をPBSにより2倍に希釈し、そしてPBSにより平衡 化したプロティンAアフィニティカラムに結合させた。そして0.15MNac l、O,1M酢酸、pH3,0を用いてカラムから溶出した。溶出後、1MNa 2HCOsにより抗体をすぐに中和した。
I gG3抗体を含む腹水をO,LM Tris−HCI、3M NaCl、p H8,9により4倍に希釈し、プロティンAアフィニティカラムを通し、そして 0.15M NaC1,O,1M酢酸を用いてプロティンAカラムか、ら溶出し た別法として、すべてのIgGサブクラスを以下の方法により精製できる。腹水 を0.LM Tris−HCI、3M NaC1,pH8,9により2倍に希釈 し、プロティンAセファロースアフィニティ力ラムを通し、そして0.15MN aC1,O,1M酢酸を用いて溶出した。
精製襄れム仄体二投盈 モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体について、結合特異性およびHI Vで誘導された融合細胞の妨害における能力およびHIV感染能力に関する特徴 を明らかにした。抗体の潜在的な治癒値は最初に生化学的(即ち結合)アッセイ および生物学的(即ちウィルスの中和)アッセイの組み合わせにより決定し、そ の結果から抗体調製物の能力および特異性が示される。
持金里位Ωヱエ旦乞グ 本発明の抗体の結合部位は標準のELISAアッセイ(上述)、競合ELISA アッセイ、および上述のペプチドを使用した競合融合阻害アッセイにより決定さ れた。3つのグループのペプチド、即ち:(1)さまざまなHIV変異株のPN D配列の24マーまたは25マーのシリーズ(表5)。
(2)MNの置換体のシリーズであるが、MN PNDチップ配列(C)−に− R−I−H−I−G−P−G−R−A−F−Y−T−T−(C)に対応する12 マーのシリーズで、各々はアミノ酸の一つをアラニン残基で置換され、最初がア ルギニン(R)で始まり、チロシン(Y)で終わる(表6)。(自然に生じるア ラニンはグリシノにより置換された。)MN配列内に含まれるエピトープの抗体 の認識は、アラニンで置換されたペプチドに対して抗体が結合できなくなること により明らかにされ、アラニンの置換により結合関係が壊された;そして(3) PNDループのチップにおいて頻繁に生じる配列に対応したペプチドのシリーズ (表7)を使用した。
競合ELISAアッセイは標準のELISAアッセイに以下の修飾をして実施さ れた。抗体をプレートにぬる前に、抗体調製物を10μMから0.0045μM の濃度の上記グループの試験ペプチドと共にインキュベートした。試験ペプチド が抗体への結合に関して固定化免疫源と競合するならば、抗体がプレートにほと んど結合しないかまたは全ぐ結合しないことがEL I SAにより明らかにさ れる。
の力 と 性の 定 本発明の抗体の力価または相対中和活性は、三種の生物学的測定法で決定した。
第一に、組換えワクチニアウイルスンンンチウムアッセイは、巨大細胞形成を9 0%抑制する抗体のエンドポイントの濃度を測定する。サンプルを含む抗体を連 続希釈し、各希釈物を融合抑制活性の試験に用いる。サンプルの力価は、シンシ チウムの形成が少なくとも90%抑制される濃度として表される。
さらに、上記の標準的シンシチウム抑制アッセイを次のように改変した、競合ジ ンシチウム抑制アッセイを行った。gp160を発現するCD4″″細胞のカル チャーに抗体を添加する前に、抗体を被検ペプチドと100−0.1μg/ml の濃度範囲で混合した。もし被検ペプチドか中和抗体との結合に関して細胞の表 面のgl)160エピトープと競合すれば、シンジチアが形成されるであろう。
逆に、被検ペプチドが中和抗体との結合に関して細胞表面のエピトープと競合し なければ、シンジチアの形成は抑制されるであろう。このアッセイは、実際にウ ィルスの単離物を用いることなしに、生物学的活性を阻止するウィルスポリペプ チド配列の検索を可能にする。
第二の生物学的測定は、HIV中和アッセイである。抗体の希釈物をHIVとイ ンキュベートし、HIVに感受性のCD4+細胞に添加する。ウィルス蛋白質の 製造を90%減少させる抗体希釈率がエンドポイント希釈率と定義される。この アッセイに関する概略はロベイ(Robey)ら、1986.Proc、Nat l、Acad、Sci、、83ニア032.およびロバートーグロフ(Robe rt−Guroff)、1985.Nature、316:72に記載されてい る。
第三の生物学的測定は、感染性減少アッセイ(Infectjvjty Red uction As5ay: IRA)であり、これは標準希釈の抗体の存在お よび不存在下の組織培養中で、感染性のウィルス量の差を測定する。抗体の力価 は、トータルウィルスタイターの減少の量により測定される。このアッセイにお いては、上記標準血清中和アッセイとは対照的に、細胞分裂およびウィルス複製 を促進するIRAアッセイ条件のため、10感染単位の100%阻止は高度に有 意である。
ネズミ モノクローナル几 の5足 拭体調製物を同定するためのステップは表8に示す。表8には上記アッセイも記 載されている。表3は免疫源として用いられた、またはスクリーニング試薬とし て用いられたペプチドの例を示す。以下の実施例は、ネズミおよびヒトHIV中 和抗体ならびに広範な中和を示す特異的抗体の同定を記載する。
P2H4の 1および合、性 マウスへのRP142ペプチドの免疫により、P2H4(またはF 4/P 7  E4)と命名されたハイブリトーマクローンが得られた。
抗−RP112 1gM抗体を生産するP7E4クローンをBa1b/cマウス の腹腔内投与により増殖させた。マウスから腹水を回収し、そして上記の様にし てゲル濾過クロマトグラフィーにより精製した。
この精製P7E4抗体を、ELISAによりMN (RP142.RP70.R P342)、IIIB (RP135)およびRF (RP339)変異体から のループ含有ペプチド配列との結合について試験した(表9)。P2H4は試験 した全部のペプチドと結合可能であった。
MN変異体のエンベロープを発現する組換えワクシニアウィルスに基づくシンシ チウム抑制アッセイにおいて、観察された中和活性はタイプに特異的であった( 表10)。CEM細胞は、IIIB、、RFまたはMN変異体のいずれかの主中 和ドメインを有するエンベロープを発現する組換えワクシニアウィルスで感染さ れた。モノクローナル抗体P7E4またはFEI15C5(RP135に結合し 、モしてHIVのIIIB変異体を中和するネズミIgG2a)は、培養の開始 時に添加した。各ウェルのシンシチウムの数は24時間後に測定した。結果は、 抗体の存在下に生じたシンシチウムの数/抗体の不在下に生じたシンシチウムの 数として表される。
モノクローナル の 1および A、 MN ロモノクローナル 以下の融合物(F31、F2O、F52、F1a)において、マウスへのRP7 0ペプチドの免疫により、MN特異的なF31/P2B10.、F50/P8D 10、F52/P7F12、F52/P8C9、F52/P7B9、F 52/ P5E9、F52/P6E9、F52/P8G1oおよびF52/P8F11と 命名されたハイブリドーマが得られた。
抗−RP70 IgG2a抗体を生産したクローンをヌードマウスへの腹腔内注 射で増殖させた。腹水を集め、上記のようにしてゲル濾過クロマトグラフィーで 抗体を精製した。
F31、F2OおよびF52融合物から単離したMN中和抗体に関して、結合特 異性をアッセイした。表11に示す結果は、これらMN抗体がMNループの左側 、即ちR−I−H−I−G配列に特異性を有したことを示す。
組換えワクシニアウィルスがNM変異体のエンベロープ(v a c−e n  vMN)を発現することに基づくシンシチウム抑制アッセイにおいては、全ての 抗体は0.5μg/mlまたはそれ以下の濃度でンンシチウムの形成を阻害でき た。
さらなる融合は、C57/BL6マウスをKLHにコンジュゲートさせた線状ペ プチドで免疫した後行った。F 54/P 5 F 4およびF56/P6G4 と命名したハイブリドーマクローンは、それぞれRP108−KLHおよびRP loo−KLHの免疫で得られた。さらに、F 60/P 5 C2と命名され たハイブリド−たクローンは、BALB/CマウスをRPloo−KL)(で免 疫して得られた。これらのクローンにより生産される抗体について、ELI S AによるMN特異性およびvac−envアッセイでのシンシチウム抑制につい て試験した。これら抗体の各々により認識されるPNDエピトープの地図を、前 記のようにして作製した。抗体F 54/P 5 F 4はH−1−G−P−G −R−A−F−Yを認識し、F56/P6G4はH−E−G−P−G−R−Aを 認識し;そり、てF60/P5C2はI−H−I−G−P−G−Rを認識する。
広堺虫租仄体 融合物F58、F59およびF64は、B L A B/Cマウスへ閉じたルー プの免疫源RP70を免疫して得られ、そしてF1aはC57B1/6マウスヘ RP102−KLHを免疫して得られた。F59/P7E3.F59/P5B3 .F64/P6G5 (64,10)およびF53/P7C4(53,4)、と 命名された抗体は、広域中和性の抗体の能力をもつことが判明した。これらの抗 体のうちの二つF 59/P 7 E 3およびF59/P5B3は、PNDル ープの先端の右側の配列に相当するアミノ酸配列を有するペプチドであるRP1 08に対する、顕著なELISAタイターを示した。F 59/P 7 E 3 およびF59/P5B3抗体への結合に関してRP70と競合する能力を持った アラニン−置換ペプチドは、G−P−G−R−A−F配列内にアラニン置換を有 しなかった。同様に、G−P−G−R−A−F配列を有したペプチドは、F59 /P7E3またはF59/P 5 B 3抗体への結合に関してRP70と競合 する能力を有したが、この配列(即ち、RP129およびRP175)を含まな いものは競合不可能であった。
これらの結果は、F 59/P 7 E 3およびF59/P5B3抗体が、G −P−G〜R−A−Fエピトープを認識することを示唆する。この配列を広範な HIV変異体中に存在する。F64抗体は不連続(non−cont iguo us)な、r−A’−A7−G−P−G−Rエピトープを認識し、そしてIII BおよびMN株を中和する。F53.4抗体はT−G−P−G−R−A−Fエピ トープを認識し、そしてMNおよびWMJ株を中和する。共通配列を認識する抗 −HIV抗体は、広域中和能力をもつ可能性がより大きい。本発明の抗体の中和 の範囲は、MN株および他のいくつかのHIV株を用いたシンシチウム抑制アッ セイによって試験することができる。
F59/P7E3およびF59/P5B3抗体は、前記の組換えワクシニアウイ ルスシンシチウム抑制アッセイにより広域中和能力について試験され、モしてI Il、、MNまたはWMJ2エンベロープを発現する組換えワクシニア〔6−’ H)6R−BI3を中和する能力を持つことが示された(表12)。さらに、こ れらのモノクローナル抗体はHIV感染性減少アッセイによって試験され、HI V変異体I I IB、MN、SF2、およびWMJ2のタイターを減少させた 。
本発明の抗体が、MNプロトタイプ配列(もしくはMN変異体配列)をもつウィ ルスおよびG−P−G−R−A−Fを含有するHIV株を中和できることは、広 域中和活性の証明である。この結合および中和バタンをもつ他のモノクローナル 抗体は、F64.8、F64.9およびF64.10である。(表13(aおよ びb)はこれらのモノクローナル抗体を生産する細胞ラインの現在および過去の 名称の検索キーである) 本発明の抗体のもう一つの特異性は、エピトープI−G−P−G−R−Aに向け られている。これらの抗体はG−P−G−R−A−F−に向けられた抗体に比べ て若干大きい百分率のHIV単離物に結合して中和すると期待される(表2を参 照)。本発明者らは、抗体F53.4を単離同定し、この抗体は配列I −G− P−G−R−Aに結合する抗体に期待される結合および中和特性を示した(表1 2)。この抗体タイプの一つの特徴的性質は、R−G−P−G−R−A配列を含 むHIV−IIl、単離物を中和する能力を持たないことである。
したがって、本発明者らは二つの最も頻繁に生じるHIVの主中和ドメインのヘ キサマーエピトープ(試験した単離物中に64%の頻度で出現するI −G−P −G−R−A、および60%の頻度で出現するG−P−G−R−A−F)に対す る抗体を突き止めて同定した。これらの特性は、これらの抗体がHIV感染の予 防および/または治療のための医療用途に適することを意味する。
HIV、、を中和するヒトモノクローナル抗体を生産する細胞ラインN7O−1 9、b (ATCC寄託番号HB10290)は、ルイジアナ州立医科大学のジ 工−ムズ E ロビンソン博士から入手した。ロビンソン博士の方法は、HIV 感染に無症状であるがF(rV−1−陽性血清のヒト患者からリンパ球を単離し 、この細胞をエプスタインパールウィルス(EBV)で形質転換して不滅化し、 そしてgp120特異性に対する初期スクリーニングを含んだ。次に本発明者ら は、生じたリンパ芽球細胞ラインの抗−HIV、、抗体生産をスクリーニングし た。
ヒトリンパ のン HIV−1感染患者からの末梢血B細胞は、それらのEBV形質転換に対する感 受性が大きく変動することが知られている(ゴルニー(Gorny)ら、198 9、前記;ヤルコウン(Yarchoan)ら、J、Cl1n、Invest、 、1986,78:439−447)。一般に、免疫機能がひどく損なわれ、C D4細胞数が比較的少ない患者のB細胞は最も形質転換に抵抗性であるのに対し て、無症状でCD4細胞数が比較的高い患者のB細胞はより容易に形質転換され る傾向がある。しかしながら、外見上健康な無症状の患者の中でも形質転換率は 変動し、そのようなグループからのヒトモノクローナル抗体(HMab)の製造 の試みの全てが成功したわけではない。
本発明者らは、HIvMNからの主中和ドメインを含むgp120エンベロープ 蛋白質を用いたELI SAによりN7O−19,bの抗原特異性を決定し、そ してこの抗体のHIV中和活性をシンシチウム形成の抑制により調べた。N7O −19、bにより認識されるエピトープはN70ドナーに感染したウィルス株に より発現されると期待される。
HIV−MNのPDNを認識し、HTVのMN変異体を中和できる他のヒトモノ クローナル抗体は、)(IV−1−11性血清患者からの野外単離されたヒトB 細胞を形質転換し、そして抗体生産細胞をHIVエ gp160またはそのPN D含有断片との結合能またはHI V、、感染の中和能でスクリーニングして下 記のように見つけることか可能である。
二人の成人HIV−1陽性血清の男性患者からの末梢血単球(PBMC)のエプ スタインパールウィルス形質転換は、J、ロビンソン博士により次のようにして 行われた。PBMCをフィコール−ハイパツク(F i co I I−Hyp aque)グラジェント上で単離し、間接バンニング法(ウィソッキ(Wyso cki)ら、Proc、Nat 1.Acad、Sci、USA、1980.7 5:2844−2848)(この方法では0KT3モノクローナル抗体と反応す る細胞を、マウスTgGに対するF(ab)2抗体でコートしたベトリ皿に吸着 させる)でCD3陽性T細胞を減少させた。B細胞が富化された非−吸着細胞に 、B95−8株のEBV (ミラー(Mi I l e r)ら、Proc、N atl、Acad。
Set、USA、1973,70:190−194)を接種し、96ウエルの組 織培養プレートで照射請帯血リンパ球(HUCL)(ウェルあたり10’細胞) をフィーダー細胞として、ウェルあたり103ないし10’細胞でブレーティン グした。カルチャーを、5%ウシ胎児血清(F CS)および低蛋白質含有の血 清代替物であるNu t r i doma−Hu (ベーリンガーーマンハイ ム)を1%含有するRPMI1640中に維持した。
生産B ラインの ヒトモノクローナル抗体生産を困難にする要因は、何方もの小ウェルカルチャー の抗体生産をスクリーニングするための効率的で感度のよいイムノアッセイの入 手性である。血清学的テストのための大部分の市販ELI SAキットの基礎と なる慣用的ELI SAにおいては、精製されたウィルス抗原はEL ISAプ レートのウェルに受動的にコートされていた。このアッセイのための抗原の調製 は非常に大量のウィルスを生産し、これを精製し、不活性化することを必要とし た。
ウィルス精製の工程はgp120の顕著な損失を引き起こすおそれがある。した がって、このようなアッセイはgp120に対する抗体の検出および他のHIV 抗原に対する抗体の検出においては不十分である。このことが、且l(蛋白質ま たはgp41と反応するヒトモノクローナル抗体(バナポー(Banapour )ら、1987、前記;スガノ(S u g a n o)ら、1988.前記 ;モロ−(Morrow)ら、1988.前記:ゴーニーら、1988.前記、 アマトリ(、Amadori)ら、1989.前記)が優勢であることの理由の 一部であろう。慣用の抗体スクリーニングアッセイを用いて、一つのヒトモノク ローナル抗体を次のようにして単離した。
ロビンソン博士の最初の形質転換実験において、HIV−1g染提供者からのT 細胞−減少PBMCをEBVに暴露して、照射されたHUCLフィーダー細胞を 含む96ウエル培養プレートのウェルに103細胞づつブレーティングした。
カルチャーの約50%が4〜S週間後に形質転換された。次に培養液を用いてE LISAにより固定、不溶化HIV−感染H9細胞と反応するIgG抗体のスク リーニングを次のように行った。
HIV−1感染H9細胞を、コンカナバリン−A (Can−A)コートしたア ッセイウェルに不溶化し、次に1:1アセトン−メタノールで固定した。ウェル をRPMI−10%FC3で1時間ブロックした。96のウェルのカルチャーか らの液を、アッセイブレートのウェルに移した。1時間後、ウェルをリン酸緩衝 塩類液CPBS) に0.1%ト!J ト:/−X 100を加えた液(PBS −TX)で洗浄し、そしてヒトIgGに対するペルオキシダーゼ−結合抗体(P rot。
s Labs、サンフランシスコ、CA)と反応させた。100μmのテトラメ チルベンジジン(TMB)−H20□を基質として発色させた。反応をH,SO 4の添加により終了し、呈色をタイターチック・マルチスキャン・ELISA・ リーダーで450nMの光学濃度として読み取った。
一つの形質転換体のカルチャー(K24−3bと命名した)が抗体を安定的に生 産し、これをさらに試験すると間接イムノフルオレッセンス法で固定および未固 定のHIV−1感染細胞の両者と反応し、しかしながら未感染細胞と反応しなか った。低細胞濃度によりに24−3b細胞の多数のサブカルチャーを確立したが 、約8ケ月後にこれらの増殖は停止した。もとの細胞は比較的低細胞密度でブレ ーティングされ、そして形質転換の確立は50%より低かったことから、K24 −3b細胞ラインはクローンとして確立された可能性が大きい。
最初に行った慣用ELISAスクリーニングでは、一つのHIV特異性ヒトモノ クローナル抗体しか得られなかったため、別のHIV−1−陽性血清患者からの B細胞をEBVで形質転換したものをスクリーニングするために、新規イムノア ッセイを用いた。このイムノアッセイは、HrVエンベロープの糖蛋白質はその 炭水化物部分を介してCon−Aに結合するという観察(センタニール(M。
ntagnier)ら、1985.Virology、144:283)に基づ く。このイムノアッセイにおいて、血清不含培地中で増殖した感染細胞から放出 されたHIV−1糖蛋白質が、Con−Aコートされたアッセイウェルにアフィ ニティー的に不溶化(immob i I i ze)されている。この方法は 大規模抗体スクリーニングのための、固相糖蛋白質抗原の調製を非常に簡易化す る。このアッセイは高度の感度を持ち、gp120に対する抗体の検出に選択的 である。
ウィルスは精製の必要がなく、Con−Aの不溶化のために十分な量の抗原を得 るために、血清不含培地で増殖した少量の細胞が必要なだけである。事実、多く の血清不含ウィルスストックを、抗原活性の減少なく1:2または1:4に希釈 でき、したがって20〜40の96ウエルELrSAプレートを調製するために 100μlという少量の上清ですむ。
第二の実験において、他のHIV陽性患者からの、EBVに暴露したT細胞−減 少処理PBMCを、2つの96ウエルプレート中で、照射HUCLとともに10 4細胞/ウエルでシードした。形質転換は100%のウェルで生じた。その培養 液を新規ELI SAにより、血清不含培地中のMT4細胞中で増殖したHIV −1のJ62株由来のCon−A不溶化ウィルス糖蛋白質と反応するIgG抗体 の存在に関して、次のようにスクリーニングした。
イムロン−2(Immu l on−2)アッセイプレート(Dynatech )のウェルをPBS中で2008g /mlのCan−Aでコートし、次いで1 %nut r i doma−Huを強化した血清不含RPMI中で2〜3日増 殖したHIV−1生産性細胞ラインを洗剤で破壊したちの100μmとインキュ ベートした。
このカルチャー液中に存在する破壊されたウィルス糖蛋白質は、血清成分の不存 在下で、高感度ELISAにおける固相抗原として作用するのに十分な量でC。
n−Aに結合する。未反応Con−A結合部位はRPMI−10%FC3で1時 間ブロックした。コントロール抗原は同様にして未感染MT4細胞の培養液がら 調製した。形質転換されたB細胞培養液をアッセイプレートの抗原コートしたウ ェルおよびコントロールウェルに移し、これらのプレートを室温で1時間インキ ュベートした。抗体の結合は前記のようにして測定した。このEL ISAは後 の実験において、ヒトモノクローナル抗体と種々のウィルス株からの糖蛋白質と の反応の試験においても用いられた。
10の形質転換カルチャーが、J62糖蛋白質と反応するがコントロール抗原と は反応しないIgG抗体を生産した。7つのカルチャーは2ケ月未満の間抗体を 生産した。それぞれ、N7O−23,aSN70−15.eおよびN7O−19 、bと命名された三つの細胞ラインは、安定な抗体生産株で、ウェルあたり10 細胞でクローン化した。各ラインのクローンは10ケ月以上増殖および抗体生産 に関して安定であった。
各抗体のIgGサブクラスおよび軽鎖タイプの決定は、慣用的アイソタイプ決定 法にしたがって、サンドイッチELISAにより、四つの重鎮サブクラスに対す るネズミモノクローナル抗体(Behring Diagnostics)との 反応性またはラムダおよびカッパ軽鎖に対するポリクローナルヤギ抗体との反応 性により調べた。四つのヒトモノクローナル抗体の全てがIgG1サブクラスで あり;に24−3b、N7O−15,e、およびN7O−19,bはカッパ軽鎖 をモしてN7O−23,aはラムダ軽鎖を有していた。
ウェスタンブロッティングおよびドツトプロットアッセイによるヒトモノクロー ナル几 の のロ 各ヒトモノクローナル抗体(HMab)の抗原特異性は、ドツトプロットおよび ウェスタンプロットを用いて決定した。抗体の最初のスクリーニングにおいて、 ロビンソン博士は12のHIV−1株を標的抗原として用いた:C39,J62 .5A90,5A96.およびL86株は、5人の無症状のHIV−1感染患者 のマイト−ジエンで活性化したT細胞を、インターロイキン−2強化培地中で、 活性化正常T細胞と混合培養して単離された;SA株は同様にエイズ患者から単 離されたHHiTi株はラスヒート(Rasheed)ら、Virology、 1986,154:395−400に記載されている。に3株はLA、ニューオ ーリンズのツレーン・デルタ・ブライメート・センター(Tulane Del ta Primate Center)から入手した。HTLV−I I IB  (ポボビック(Popovic)ら、5cience、1984,224:4 97−500)はブ〕トタイプのHIV−1株であり、ATCCNo、CRL  8543として得られた。HTLV−I I IM、(ガロ(Gallo)ら、 5cience、1984,224:500−502;ショー(Shaw) ら 、5cience、1984,226:1165−1170);バキュロウィル ス−生産組換えLAY gp120 (American Biotechno logies、Inc、、ケンブリッジ、MA)、およびHI V−l5F2  (レビー(Levy)ら、5cience、1984,225:840−842 )からのグリコジル化組換えgp120は、AIDS Re5earch an d Reference Reagent Programから入手した。C3 9,J62,5A96およびSA90株は、MT4細胞中で増殖させた(ハラダ (Harada)ら、5cience、1985,229:563−566); HTLV−IIIB、HTLV−I I T、、、SA3.HiTiおよびに3 は、H9細胞中で増殖させた。
一つのモノクローナル抗体(K24−3b)のB細胞ドナーから単離されたし8 6株は、連続T細胞ライン中で増殖しなかったので、マイト−ジエンで活性化し た謄帯血T細胞中で、100単位/u+1の組換えIL−2を含む培地を用いて 増殖させた。Con−A不溶化のための抗原の調製のため、各ウィルス株で感染 した細胞を、1%Nu t r i d oma−Huで強化した血清不含RP MI培地で2〜3日増殖させた。澄明にした培養液を1%トリトン−Xで処理し 、そして一定量づつ使用まで−20”Cに保存した。
ウェスターンプロットは次のように行った。1−2xlO7HrV−1感染細胞 の抽出物の調製は、細胞を1%トリトン−X中で30分間可溶化し、小型遠心機 で遠心分離して不溶性の物質を除去することにより行った。サンプルを還元剤を 含まないSDSサンプルバッファーと1=1混合し95℃で5分間加熱した。
未感染H9およびMT4細胞の細胞溶解液も同様に調製した。サンプルをバイオ ラッドのミニゲル装置により、7.5%5DS−ポリアクリルアミドゲルで、電 気泳動分離した。続いて蛋白質をニトロセルロース膜に電気泳動的に移動させた 。ウェスタンプロット用のストリップをブロッキングバッファー(1%BSA。
0.5%ツイーン20,0.5MのNaCl、10mMのトリス、pH8)でイ ンキュベートし、最初に各抗体と、次いでヒトもしくはヒツジIgGに対するア ルカリホスファターゼ−結合抗体と、適宜反応させた。ニトロブルー・テトラゾ リウムと5−プロモル4−クロロ−3−インドリル−ホスフェート(NBT−B CIP、Sigma、セントルイス、MO)を基質として用い、呈色バンドを生 じさせた。AIDS Re5earch and Reference Rea gent Programから入手したHTLV−I I IBのgp120に 対するヒツジ抗血清を、gp120/160横120めの陽性コントロールとし て用いた。
図1は、二つのHIV−1株であるHTLv−工IIBおよびJ62の抗原のウ ェスタンプロットへの四つのHMab反応性を示す。パネルAおよびBの各レー ン1−5は次のとおりである:レーン1.に24−3b;レーン2.N7O−2 3、a;レーン3.N7O−15,e;レーン4.N7O−19,b;レーン5 、ヒラ’)抗−HTLV−IIIB gp120゜HTLV−I I IBを標 的抗原とするプロット(パネルA)において、HMab (K24−3bSN7 0−2.3a1およびN70−1.5e)が強く反応し、約120kdの主要バ ンドとこれより弱い160kdのバンドを示した。このプロットにおいてN7O −19,bはgp120と弱く反応する様に見えたが(パネルA、レーン4)、 他のアッセイにおいてはHTLV−I I IBと全く反応しなかった。J62 株を標的抗原として調製したプロットにおいては(パネルB)、四つのHMab の全部が160kdの主要バンドに同程度の結合を示し、その下に約120kd までに広がる拡散バンドが見られた;これはこの株の特徴的パターンであった。
両株のプロット上のgp102に対するポリクローナルヒツジ抗体で得られた染 色パターンは、モノクローナルで観察されたものと等しかった(パネルAおよび Bのレーン5)。HMabは未感染MT4またはH9細胞のプロットとは反応し なかった(図示せず)。
これらの結果は、これら四つのHMabがgp120およびその未分解細胞前駆 体であるgp160と反応することを示した。しかしながら、ある種の市販のH IV−1ウエスタンプロツトストリツプ中でgp160/120と同定されるバ ンドは実際はgp41のマルチマー(mu l t ime r)である可能性 (ゾラーバズラ−(Zo l I a−Pazne r) ら、New Eng l、J、Med。
、1989,320:1280)を考慮シテ、組換えLAV gp120および レンズマメレクチンで精製したJ62R蛋白質のプロットを用いて、gp120 に対するこれら四つのHMabの特異性を試験した。
ドツトプロットアッセイのためには、ニトロセルロースのストリップを、バキュ ロウィルス−生産組換えLAV gp120 (100μg/ml)およびJ6 2エンベロープ糖蛋白質(これは洗剤処理した血清不含培養培地から、センタニ ール(Mon t a gn i e r) ら、Virology、1985 ,144:283−289のレンズマメレクチンのアフィニティークロマトグラ フィーにより部分精製し10μg/mlに濃縮したちの)1μmでドツト処理し た。組換えgp120はまた、2−メルカプトエタノールの存在もしくは不存在 下で95℃に5分間加熱した後にもドツト処理した。ドツトプロットストリップ 上の抗体のアッセイは、ウェスタンプロットと同様に行ったが、陽性コントロー ルとしてはHTLV−I I IBのgp160に対するヤギ抗血清(ルッシエ (Rusche)ら、Proe、Nat 1.Acad、Sci、USA、19 87.84:6924−6928)を用いた。
図2に示すように、四つのHMabのうちの三−)(K24−3b、N7O−2 3、aおよびN7O−15,e)は、組換えgp120と強力に反応した。N7 O−19,bはLAV gp120とは結合しなかったが、しかしながらJ62 抗原とは結合した。図2の記号は次の通りである:”gp120 J62’″は 562株の精製gp120であり、−rgp12OLAV”は非−還元組換えL AV gp120であり、” rgp120還元”ハ還元組換えLAV gp1 20であり、モして”rgp120加熱”は非還元の加熱LAV gp120で ある。ドツトに用いたJ62抗原の量は組換え抗原に比べて約10分の1であり 、この抗原で観察される染色が弱いのはそのためである。したがって、これらの 結果は本発明者らのウェスタンプロットで観察された120および160kdの バンドが、間違いなくgp120/160であることを示している。
予備的ウェスタンプロットの試験では、K24−3bもN7O−23,aも、2 −メルカプトエタノールを含有するサンプルバッファー中で加熱した細胞溶解物 から調製したプロットと反応せず、同定されたエピトープが還元に感受性である ことを示唆した(結果は示さない)。これらのエピトープに対する還元の影響を さらに調べるため、2−メルカプトエタノールの存在もしくは不存在下で95℃ に加熱した組換えgp12OLAVのドツトプロットで試験した。図2に示す結 果は、K24−3bおよびN7O−15,eは還元抗原に結合せず、N−70、 23,aの還元抗原に対する結合は有意に減少したが、加熱単独では抗原活性を ほんのわずか減少させただけであった。N7O−19,bはLAV gp12o に結合しなかったので、そのエピトープに対する還元の影響はこの実験では調べ られなかった。次にN7O−19,bを還元およζ゛非還元J62糖蛋白質のド ツトプロットで試験し、還元抗原では反応性は観察されなかった。したがって、 四つのHMabの全ては還元に感受性のエピトープを認識した。
ELISAによるHMabの の 各無症状のB細胞提供者から単離した多くのウィルス株は、一般に連続細胞ライ ン中で複製せず(チェングーマイヤー(Cheng−Maye r)ら、5ci ence、1988.24−:8O−82)、そしてIL−2依存性の活性化初 代T細胞中または単球中でしか増殖させられないため、間接コーティング法に基 づくスクリーニング用イムノアッセイを開発するために十分な量の固相用抗原の の調製が問題である。Con−A不溶化技術は、大量の精製ウィルス抗原の代わ りに少量のウィルスしか必要としないので、この問題に対する可能な解決を提供 する。
ロビンソン博士は、ELI SAにより四つのHMabと異なる四種のHIV− 1株からのCon−A不溶化ウィルス糖蛋白質との反応性について調べた。理論 的には、Con−Aに対するgp120の結合は、あるエピトープに対する抗体 の接近を阻止できる。しかしながら、ロビンソン博士は、CD4結合領域または ■3超可変領域と反応することが知られているネズミモノクローナル抗体は、C on−A不溶化gp120と強力に反応することを見出しており(未発表)、こ れら二つの領域内のエピトープかこのアッセイで代表されていることが示唆され る。
図3に説明されているとおり、一つの株(L 86)は、血清不存在下でIL− 2依存性の活性化初代T細胞中で増殖し、そして培地中に放出されたgp120 はCo n−A不溶化アッセイで良好に機能した。無症状B細胞提供者から単離 した他の株でも同様の結果が得られるであろう;そしてホモロガスな単離物の抗 原と反応する抗体のスクリーニングが可能になろう。
一つの実験(図3)において、ロビンソン博士によりに24−3bおよびN7O −23,aの培養液およびHIV−1陽性コントロール血清(H72)が、9つ の異なる株のパネルについて試験された;そのパネルの中にはB細胞提供者に2 4−3bから単離された株であるL86も含まれていた。N7O−23,aは9 株全てと反応した。結果はミロの測定の平均CD値で、標準偏差のバーと一緒に 示されている。この抗体のパネルへの結合には多少の相違があるものの、一般に 陽性コントロール血清については並行的相違が観察された。したがって、N7O −23,aおよびH72血清両者の結合レベルは、各株から不溶化されたgp1 20量の相対指標を提供する。陽性血清と比べてN7O−23,aがL86株に はるかに弱い反応性をもつ理由は不明であるが、L86のみが連続細胞ラインよ りもウィルス放出量の少ないIL−2依存性初代T細胞中で増殖された株であっ たためかもしれない。L86ウイルス調製物ではgp120よりもgp41が多 く不溶化され、gp41に対する抗体が血清の大きい反応性の原因であった可能 性がある。
N7O−23aと比べて、K24−3bモノクローナル抗体は、これらのウィル スとの反応性に顕著な変動を示した。この抗体は9株のうち6つに反応したが、 SAS株またはに3株には結合せず、そして5A96にたいして最小限の結合を 示した。N7O−23,aおよびに24−3bの両者とL86および562株と の反応性は非常に同様であったが、K24−3bの5A90とC39株への結合 はN7O−23,aよりはるかに弱く、その相違は5A90で大きかった。これ らの観察は、抗原のバッチをかえて行ったアッセイでも再現性があった。これら 二つの抗体の結合に関する相違が僅かであることはHiTiおよびHTLV−I II株についても明らかであった。これらの相違は抗体の濃度に関するものでは なかった・なぜならこれらのアッセイに用いた両抗体の調製物は、不溶化抗原の 利用可能な抗原サイトを飽和するようであったためである:162単離物にたい して試験したとき、両抗体の1:32希釈までの連続希釈列で得られたオプティ カル・デンシティ−は非常によくにていた(データは示さない)。これらのデー タは、N7O−23,aは保存されたエピトープを認識し、K24−3bはこの ウィルス株パネル中で異種性に発現された変異エピトープを認識することを示唆 する。
図4は同様の実験の結果であるが、ここではロビンソン博士は8株由来のC。
n−A不溶化糖蛋白質とN7O−15,eおよびN7O−19,bの反応性を比 較している(結果は一回の測定による)。この実験で、N7O−23,aを陽性 コントロールとして用いた。N7O−45,eおよびN7O−23,aの両者は 8株の全てと強く反応したが、N7O−19,bは抗体製造のための最初のB細 胞培養のスクリーニングに用いた株であるJ62のみと反応した。この結果はN 7O−23,aと同様にN7O−15,8はこれまで試験した全ての株に共有さ れているエピトープと反応し、N7O−19,bは株−限定エピトープと反応す ることを示唆する。本発明者らは、さらに二つの標的gp160抗原(HIV− IIIM、および組換えHIV 1SF□)を用いて、四つのHMabの反応性 を調査した。表14に示す結果は、N7O−19,bならびに他の三つのHMa bは、HIV−I I LNおよびHI V ISF□からのCon−Aに不溶 化した糖蛋白質と、ELISAにおいて強く反応したことを示す。この実験から は、ヒトモノクローナル抗体がMNもしくはSF2 gp160分子のどの部分 に結合するかは明らかでない。
ウェスタンプロット によるHMabのy四つのHMabの内二つ(K24−3 bおよびN7O−23,a)の株特異性も、上記HIV−1株のパネルから調製 されたウェスタンプロットでロビンンン博士により試験された。図5に示すその 結果は、ELrSAで得られた結果と一致した。図5のパネルAはに24−3b の反応性を、<′+、/i、BはN7O−23゜aの反応性を示す。各プロット のレーンの頂部に株か明記されており、IIIBはHTLV−I I IB−? ?ある。N7O−23,aは8株全て(7)gp120/160と反応した。K 24−3bはそれがELI SAで認識したのと同じgp120/160と反応 した。同様にに24−3bはSA3およびに3とは反応せず、5A96とは写真 の感度以下の最小限の反応を示した。N7O−15,eおよびN7O−19,b は全てのウィルスについてウェスタンプロットによる同様の試験を行っていない が、EL I SAで観察されたN7O−19,bの株限定反応性は、該抗体が ドツトプロットアッセイにおいて組換えLAV gp120と反応しないことに より確認された。
さらに二つの形質転換実験(一つはN70提供者からのB細胞を含む)は、60 を超える形質転換B細胞カルチャーを生じ、その中には下記で議論する抗−HI V−抗体生産性クローンN7O−41,3aが含まれており、このクローンはC on−Aに不溶化されたHIV糖蛋白質と特異的に反応するIgG抗体を生産し た。これらのカルチャーの約30%が安定な抗体生産性クローンを生じ、したが って、相当数のHMabのHMabの発生の可能性を示し、これらは全体として 、無症状感染の間にgp120の変異体および保存されたエピトープに対するヒ トの抗体応答の広範な発生を示す。
HTV、N のスクリーニング 本発明者らは、ELISAおよびウェスタンプロット(WB)アッセイを用いて 、ロビンソン博士が同定したgp160−結合性ヒトモノクローナル抗体のいく つか(N70−19.b、N7O−15,e、に24−3bおよびN70− I I、3a)を、gp160分子のMNプロトタイプに特異的なものがあるか調べ るため再スクリーニングした。ELISAにおいては、本発明者らは5つの異な る組換え蛋白質もしくはそのフラグメント(gp160−11 IB、gp16 0−RF、PB−1−r I r B、PB−1−RFおよびP B−1−MN )を抗原として用いた。ウェスタンプロットにおいては、本発明者らは3つの異 なる試験抗原(g p 160−r I IB、1)B−1−II IBおよび P B−1−MN)を用いた。完全gp160ポリペプチドは昆虫細胞内でバキ ュロウィルス発現システムを用いて生産し、そして1987年8月31日に出願 され本発明と同じ出願人に譲渡されたルッンエ(Rusche)らの米国特許出 願091,481に記載された様にして精製した。その記載は本発明明細書に含 まれているものとする。PBlと呼ばれる主中和領域(ブトネイ(Putney )ら、1986,5cience、234・1392)にまたがるアミノ酸配列 を有する180アミノ酸の蛋白質フラグメントは、完全長のenv遺伝子のPv ull+Bgl II開裂で生じた約540bpのDNA配列から、1987年 10月9日に出願され、本願出願人に譲渡された米国特許出願第107,703 の記載のようにして発現された;その米国特許出願の内容は本明細書に含まれて いるものとする。
ELrSAは次のようにして行った。96−ウェルのコスタ−(costar) 平底マイクロタイタープレートの各ウェルに最終抗原濃度が2〜10μg/ml の抗原を含むPBS溶液を50μm加えて、各ウェルを抗原でコーティングした 。抗原(蛋白質もしくはペプチド)は精製され、したがって抗体の結合に十分量 で不溶化されたので、上記のCon−A法は用いなかった。抗原溶液を吸引除去 してPBS+0,5%BSAに置きかえ、1時間インキュベートした。インキュ ベーションの後、ウェルを吸引し、洗浄し、そして抗体50μmを加えた。イン キュベートの後、ウェルをPBSで3回洗浄し、そしてセイヨウワサビベルオキ シターゼ(HRP、西ドイツ、ベーリンガー・マンハイム)と結合したヤギ抗− ヒトイムノグロブリンの適当希釈物50μmと共に30分間インキュベートした 。ウェルを再度PBSで3回洗浄し、HRPの基質として1 : 1000希釈 の30%H2O2を添加したO、LMのクエン酸ナトリウム、p)(4,2中の 1mMのABTS (2,2−アジノービス(3−エチルベンズチアゾリン 6 −スルホン酸)を50μm添加して、結合した抗体を検出した。次にABTSサ ンプルの0D410をダイナチック・スペクトロフォトメトリック・オートリー ダー(Virginia)で読み取った。
表15−18はELI SAの結果である。表15にはウェスタンプロットの結 果も与えられている。表15の数値は、陽性例数/試験例数を示す。このELI SAの陽性コントロールおよび陰性コントロールは、それぞれHIV十血清およ びHIV−血清であり、ウェスタンプロットでの陽性コントロールはヤギ抗−g p160I I IB抗血清である。
このELISAにおいて、5つの抗体のうちN7O−19,bが組換え蛋白質P B−IMNI:陽性であった。この結果はウェスタンプロット(表15)で明ら かに確認され、そして表16および17に結果を示すELT SAにおいては、 試験の結合用抗原として、種々のHIV変異体株(T I IB、RF、および MN)のエンベロープ蛋白質からのPB−17ラグメントを用いた。表15〜1 7に記載した実験においては、試薬は還元バッファー中のものを用いた。このこ とが、表6と表15−17との間における一見して矛盾する抗体結合の結果を説 明できるであろう;即ち、表14のELISAは還元バッファーを含まずその結 果ぜんぶの抗体がg p 120/160と結合した。本発明者らは還元バッフ ァーの存在は抗体のより選択的結合をもたらすと結論した。
表15−17の結果は、N7O−19,bは特異的にMNプロトタイプに結合す るが、しかしgp160分子のTrIBまたはRFプロトタイプには結合しない ことを示す。表10は、別のELI SAの結果を示し、ここではN7O−19 、b、N7O−15,e、およびN7O−Il、3aを、HIV−MN株または I(IV−II IB株のいずれかからのエンベロープ蛋白質のフラグメントに 結合する能力に関して調べた。”RP70”は°MNエンベロープ蛋白質の主中 和領域(principal neutralizing domain:PN D)からの完全−閉鎖ループ”であり、”RP142”は開環24marであり 、そして”RP135”はIIIB株のPNDからの24merである。これら のフラグメントは、表3に規定されたgp120ループ領域の中和領域サブ配列 内のアミノ酸配列を含んでいる。表18に示す結果は、N7O−19,bモノク ローナル抗体はHIVMN gp160分子の主中和領域またはループ領域に( RP70、RP142)結合スル力、IIIB変異体ノPND (RP 135 ) ニハ結合しないことを示している。
旦エヱ肚Ω虫担 次に本発明者らは二つの抗体(そのうちの一つはN7O−19,bである)のI (IV感染中和能力に関して試験した。本発明者らが用いたアッセイは、HIV MN感染した細胞によるシンシチウム形成の阻止である。このアッセイにおいて 、前記の通り、興味あるH I VMN株のエンベロープ遺伝子を発現する組換 えワクシニアウィルスをCD4+ヒトT−リンホーマラインCEM (ATCC 寄託番号No、CCL119)の細胞を感染させるために使用し、次いで抗体を 細胞に加えて、HIVエンベロープが介在しておこる細胞融合の阻止をスクリー ニングした。抗体がウィルスを中和する能力を示唆する陽性結果は、シンシチウ ム形成を少なくとも90%阻害する能力と定義した。
CEM細胞を、MNのPB−17ラグメントを含むプラスミドpscR2502 に由来し、gp160の残部がIIIB由来であるE(IVエ g160を発現 する組換えワクシニアウィルスで感染させた。このアッセイにおいて、シンシチ ウムが誘発され、この誘発はPNDに対する抗血清またはモノクローナル抗体で 抑制可能である。その結果、表19に示すとおり、N7O−19,bはある範囲 の濃度にわたる抗体濃度においてワクシニアgp160−MNにより誘発される シンシチウムの抑制を示したが、N7O−15,eはシンシチウムの形成を抑制 しなかった。
里塗 本発明のモノクローナル抗体は、慣用の医薬製剤としてHIVに苦しむヒトの治 療に、またはそのような感染の危険をもつヒトの予防のために用いることができ る。さらに、そのような製剤はこの分野で公知の薬学的に許容される担体、希釈 剤、塩および他の材料を含むことができる。等張塩類、滅菌水、10%マルトー ス、ヒト血清アルブミン、グリシンまたは他の薬学的に許容される材料を、希釈 剤、担体または溶媒として本発明の抗体を含む医薬製剤を調製できる。
HIVに感染しまたはエイズに悩む患者の治療に用いるに際しては、本発明のヒ トモ)’ya−ナル抗体は受動免疫剤(passive immunizati on agent)として、約200mgないし約15gのひろい投与範囲、そ して好ましくは50mgないし1gの範囲の有効量で投与できる。
受動免疫に用いるための多価免疫グロブリンは、ウマを免疫しまたは免疫ヒト血 清をプールし、プラズマまたは血清からIgG成分を分画することにより調製で きる。ヒトまたはマウスモノクローナル抗体を生産する細胞ラインは、標準的形 質転換技術およびハイブリドーマ技術で調製できる(Methods inEn zymology、121巻、セクションIおよびH,1986,ランボンおよ びブナキス(Langone and Vunakis)編集、アカデミツクプ レス)。HIVモノクローナル抗体は、マツシタ(Matsushita)ら、 1988.J、Virol、62:2107;または1988年12月21日公 開のEPO295,803の記載にしたがって調製できる。大部分のモノクロー ナル抗体はヒト以外の動物種により生産されるので、しばしばヒトに対して免疫 性である。ヒトの治療のためにこれらのモノクローナル抗体を成功裡に使用する ためには、キメラ抗体分子の造成が必要であろう;キメラ抗体はリガンドとの結 合に関与するポリペプチド部分(可変領域)が一つの動物種に由来し、構造安定 性および他の生物学的機能の付与に関与する部分(定常領域)はヒト抗体に由来 する。可変領域が一つの宿主に由来しそして定常領域が第二の宿主に由来するキ メラ抗体の製造は、当業者によく知られている。例えば、ノイベルガー(Neu berger)ら、PCT国際公開86101533 (優先臼1984年9月 3日)およびモリソン(Morrison)ら、EP公開0,173,494( 優先権1984年8月27日)を参照。代替法として、可変領域の相補性決定領 域(complementarity determining regi。
ns:cDRs)のみを所望抗原特異性を有する免疫グロブリンのCDR5に置 換することにより、抗体を調製する方法は、ウィンター(Wi n t e r )により記載されている(GB公告2,188,638、優先権1986年3月 27日)。ネズミモノクローナル抗体は、ヒトFc部分を含む抗体にして、ヒト の治療用途に適合させることができる(モリソン(Morrison)、198 5,5cience、229:1202)。確立されている方法で、そのような ハイブリッドモノクローナル抗体を製造、発現および精製することが可能であろ う。免疫グロブリンを治療的に投与する処方は、既に多くの感染症に関して行わ れている本発明の抗体は非経口的に、静脈投与または筋肉内投与ルートで行われ る。典型的治療処方は、有効量の抗体を約1週間から約6ケ月投与することより なるであろう。患者の症状をコントロールするために必要な治療の種類は、治療 を受ける各患者の感受性および病気のステージ並びに各患者の体質に応じて個々 の患者により変化(7うる。各治療に必要な用量は、何回かに分割してまたは1 回で投与される。ヒトモノクローナル抗体は、単独でもしくは他のHJV冶療剤 例えばAZTと一緒に、患者の症状をコントロールするために投与できる。本発 明の抗−HIV治療は、患者の症状および患者の症状のステージに応じて、1週 間に1ままたは2回またはそれ以上行う。
本発明の抗体は、これを母親、新生児、または両者に投与することにより、母親 から新生児へのHIVの垂直感染を防止するためにも使用可能である。
他の悪血 他の態様は請求の範囲の記載に含まれている。抗体は担体例えば、ある種の分子 、リポソーム、または他の抗体(即ちヘテロコンジュゲートにする)と結合させ て、その活性を改善することができよう。例えば、抗体を細胞毒性物質に結合さ せてイムノトキシンとして使用したり(ビテタ(V i t e t t a) ら、1987.5cience、238:1098)、または抗−HIV薬剤ま たは毒素を含むリポソームの表面に含ませて、感染細胞をそのような薬剤または 毒素の特異的な標的とすることができる。ここで、イムノトキシンとは抗体と一 つ以上の毒素、薬剤、放射性核種、または細胞毒性物質との複合体を意味する。
本発明の抗体と複合体を形成させることのできる細胞毒性物質としては、リシン 、ジフテリア毒素および放射性核種が挙げられる。リシンは豆科植物Ricin us c。
mmunisにより生産される極めて強力な毒素である。本発明の抗体をイムノ トキシンとして用いる典型的治療においては、抗体(HIV−感染細胞で発現さ れる蛋白質に結合する抗体)を、HIV−感染細胞(および非−感染細胞に対し ても)毒性である毒素(例えばリシン)と複合体にする。細胞毒性物質を抗体に 結合させることにより、非−特異的毒性を顕著に低めて、毒素の有効性レベルを 高めることができる。毒性物質の使用が可能になるのは該物質を結合させた抗体 が、該物質を直接標的(この場合、HIV−感染細胞)に運んで、これにより非 −感染細胞を毒素から保護できるからである。抗体を細胞毒性物質と複合体にす るために使用できる技術は前記ビテタらおよび1988年8月24日に公開され たヨーロッパ特許出願279,688に詳細に記載されている。
表10 表1d 表18 HIv−1エンベロープの主中和領域内のヘキサマー配列の頻度1)IIGPG RAFY 65 27 IHIGPG 93 38 HIGPGR923B rGPGRA + 56 64 GPGRAF + 46 60 RP142 Y N K II K RI HI G P G RA F Y  T T K N I I G(C) RP342 I HI G P G RA F Y TRP70 I N CT  RP N Y N 11: RK RI HI G P G RA F YT TKNIIGTIRQAHflIS RPloo (S G G) T FI K G r HI G P G R^ I Y (G G S C)RP102 (S G G) T RK S r  S r G P G RA F (G G S C)RPI08 (S G G ) HI G P G RA F Y A T G (G G S C)RPJ 23c (C) HI G P G RA F (C)G (C) RPT74c (C)N N T RK S I R10RG P G RA  F V T I GK I G (C) RP339 (RF @il物) I T )l: G P G RV I Y (C)カッコ内のアミノ酸は天然 配列の一部ではない表4 株 融合番号 免疫源 旺Is^での反応性 アイソタイプBa1b/c F4 /P7ε4 KLH−142+ + 十 + + 工9HBalb/c F5/ PIG2 KL)I−142+ + + + + IgMBalb/c F7/ P4D8 RP70 + + + + + IBM810、BRF8/P9D+ l RP 70Balb/c F+O/B4Ell RP142 IgMC57 /Ell FIO/C3112RPI42 + −−−rgMBalb/c F I3/P3AII RP708alb/c Flコ/P4ε7RP70Balb /c F13/P7E2 RP 70Balb/c F13/PIllB2 R P 70Balb/c FI3/P8D8 RP 70Balb/CFI3/P 8F2 RP 70 +/ −BlO,BRF14/P2Fll RP70BI O,BRF14/P4B2 RP 70BIO,BRF14/P6D12 RP 70BIO,BRFI47PIOB+2 RP 70BlO,BRFI4/P+ 6D2 RP 70C57/BL/6 F31/P2BIORP70 + 十  NO−NOIgG2aA、SW F50/P8DIORP70 + + NO− ND IgG2a表5 ペプチド 配列 RP135 NNTRKSIRIQRGPGRAFVTIGKIGCIIP+4 1 NNVRR5LSIGPGRAFRTRErIGCRP142 YNKRK RIHIGPGRAFYTTKNNIIGCRP143 NNTTR5I)II GPGRAFYATGDIIGCRP+44 NNTSRGIRIGPGRAI LATERIIGCRP+45 NNTRKGIHIGPGRAFYATGDI IGCRP+46 NNTKKGIRIGPGRAVYTARRIIGCRP  +47 NNTRKGIYVGSGRKVYTR)IKI IGCRP148  εNTKRSLYIGPGRRFHVTKAITGCRP149 NNTRR5 IHIGPGRWSVHTTGEIVGCRP150 NNTRKSIYIGP GRAF)!TTGRIIGCRP151 NNTKKGrArGPGRTLY AREK:HGCRP l 52 NNTRKRVTMGPGRWYTTI:、 EIVGCRP I 53 NNTRARLS rGPGR5FYATRNfV GCRPI54 5NVRNRIHIGPGRAFHTTKRITGCRP16 2 NNTRKSIPIGPGRAFYATGDIIGCRP163 NNTR ICGIFIGPGRNIYTTGNIIGCエピトーブマブビングペプチド HP l 7セチルーc K RI HI G P G RA F Y T T  CMN−14merMP 7 7+チル−CKRIHIGAGRAFYTTC HP 8 アセチル−CKRIHIGP^RAFYTTC表フ ループ先端ペプチド RP142 YNKAKRTHIGPGRAFYTTKNIIGCRP102  (SGG)TRKSISIGPGRAF(GC,5C)RPTO8H!GPGR AFYAT(GGSC)RP+29 [RIHIGPG]3 RP342 IHIGPGRAFYTCRP17S [IGPGRAF3 RPT76 (SGG) IGPGRAF(GGSC)RP+77 [IGPG RAF]3 RPI IS [GPGRAF]3 カブコ内のアミノ酸は天然配列の一部でLit;L’表8 1、 ペプチドへの直接結合 5、 ペプチド競合シンシチウム椹11表9 一抗体−ペプチド反応性(00,、。)ザ士猛 翌匹 せl徂 ザエ狙 ぜI狙  至4F31゜P2B101.74 1.65 No 、08 No 、030 F50.P8D+O+、7 1.7 No 、08 No 、030表10 表11 F31.P2BIOC57/8L6 RP70 IgG2a O,I RIHI GF50.P8DIO^、S)I RP70 IgG2a O,I RTHIG FS2.P7n2 ^、S14 RP70 IgG2a O,25−0,5RI HIGF52.P8C9^、謂 RP70 IgG2a O,1−0,25RI HLGF52.P7B9^、5klRPフOIgG2aO,5RIHIGFS2 .PSE9 A、SW RP70 IgG2a O,25−0,5RIHIGF 52.P6E9 ^、SM RP70 IgG2a O,5R1)IIGF52 .P8CIOA、514 RP70 IgG2a O,25−0,5RIHIG F52.Pl]FI l ^、5’@ RP70 l9G2a O,25RIH IGFS3.PIB6 C57BL/6 RP102−KLH1gG3 10. 0−20.0 1GPGRAFF5]、P7C4C578L/6 RP102− KL)l 1gG3 1.0 1GPGRAFF54.PSF4 C57BL/ 6 RP108−にLJI 1qG3 S HIGPGRAFYFS6.P6G 4 C57BL/6 RPloo−KL)l 19G2b 2.5 HIGPG R^F58.P6F2. 8^LB/CRP70 rgc+ 1.0 1c、P GRFS9.PSB3 ” RP70 1gG+ 10 GPGRAFFS9. P7E3 ’ RP70 1gGI 10 ’ GPGRAFF60.P5C2 ”RP!00−KIJIIgG2b1.01HIGPGRF64.P6G5 B 10.BRRP70 IgG2a 1.0 1XXGPGR表12 RP142 (MN) RIHIGPGRAFYTTに、、。
RP+35 (IIIB) 5IRIQRGPGRAFVTIG、、、 −RP +41 (四、1−2) 、。5LSIGPGRAFRTRE、 、 。
RPI 16 (GPGRAF)s RPT23c HrIGPGRAF(c)1’JP+43.、.5IHIGPG RAFYA丁(、、、、+N、D。
RP145 、、、GI)IIGPGRAFYATG、、。
RP162 、、.5IPIGPG触FYATG、、、 N、D。
RP190 、、、SI丁rGPGRAFYATG、、。
RI’+54 、、、IIIHIGPGRAFHTTに0.。
Rp+so 、、、5IYIGPGRAFHTTG、、。
RP168 、、、GIHIGPGRAIYATG、、、 N、D。
RPI46 、、、GrRIGPGI’lAl/YTAR,、。
RP144 ’、、、GIRIGPGFLlすLATE、、。
RP149 、、.5IHIGPGRWSVHTT、、。
RP1411 、、.5LYIGPGRRFHVTK、、。
RP153 ’、、、RLSrGPGR5FYATR,、、+1−RP151  、、、GIAIGPGRTLYARε1.。
RP170 、、、RITKGPGRVIYATG、、。
RPT52 、、、RVTMGPGRVWYTTG、、、 +/−十RP147  、、、GfYVGSGRKl/YTRH,、。
WMJ−2: 2.5 5 ペプチドConc、 −50¥Ig/m1表13 (a) F27.P2F4 RIV3−27.1F31.P2BIO,C3R/V3−3 1.1自F31.P3C6,A9 R/V3−31.2F50.P[1DIOR /V3−50.1”FSl、F188 R/V3−51.IF51.P7F6  R/V3−51.2F52.PSE9 R/V3− 52.1會F52.P6E 9 R/V3−52.2”F52.P2S5 R/V3−52.3゜F52.P IF]2 R/V3−52.4”F52.P8C9R/V3−52.5”F52 .P8FTl R/V3−52.5”F52.P8G+OI’l/V3−52. 7”F53.PI36’ R/V3−53.1”F53.P5GTT R/V3 −53.2F53.P6A+ R/V3−51.3F53.P7C4R/V3−  rh314″F54.P5F4 R/V3−54.11FS6.P6G4 R /Vl−56,1”FSll、P2EI R/V3−513.1”F58.P6 F2 RIV3−5B、2”F5B、PBA5 R/V3−58.3FS9.P SB3 R/V3−59.1” +F59.P7E3 R/V3−59.2”  +F59.P5GB R/V3−59.3”−F59.P8S3 R/V3−5 9.41F59.P8Gll R/V3−59.5F60.P5C2R/V3− 60.1”F60.F5)+9 R/V3−60.2F62.P5F+O,Al 1 R/V3−62.1”表15 ELISA W、B。
HIV十 威C青 4/4 3/3 1/3 313 3/3 N、D。
HIV−4青 0/4 0/3 0/3 0/3 0/3 N、D。
ヤギαgp160(IIIB>血清 N、0. 2/2 1/iN、D。
K24−3B O/4 0/3 0/3 0/3 0/3 0/2 0/I O /lN7O−15,eo/4 0/3 0/3 0/3 0/3 1/2 σI I: O/1、非常rJい陽性 表16 應捗け Pa−I lll5 Pa−I RF Pa−I MN BSA無し  、162 .039 .04+ −,003HIV−serum l:1ooo  、2B2 .277 .25+ 、124HIV+ S5!rum I :1 OO0,299,27B 、308 、143N70−19.b 、241 . 274 .659 .155N70−−Il、3a 、263 .250 .2 96 .181に24−38 .294 .297 .302 .145870 −IS、e 、261 .287 .298 .158表17 EXI)、2 捕捉された抗原 HIV−血清 1:sOo 、491 .20+ 、233 .060870− T1.3a、 、lT5 、+67 .164 .062に24−38 .10 5 .190 .162 .077870−15.e 、14B 、204 . 170 .082表18 試薬 RP70 RP70 RP+42 RPI3S 8SA無し 、002  N、D・ HIVイ謂 Igloo 、03B 、+20 .139 .159 .083 HIV+4’J I:lOO、里 1里 、−m−・239 ・・133N70 −1−9.b 、266 .475 .574 .223 .164N70−1 5.e 、146 .1+0 .235 .147 .058N70−IIja  −,002N、D。
表19 抗体 濃度 50 pg/mL 10 pg/mL 5 pg/mLN70−19.b OO 0 N70−15.e 68 79 N、D。
一 浄書(内容に変更なし) @ @ @ @ rgp120LAV シ ・ rgp120 nD 胛− ォアティ刀1ノ、:iンシT4− (450nmlオアティカル・テパンシティ ー B e39 lll5 MITt J62 5A90 1A96 Q !&3Fig urJ!5 手続補正M(方式) %式% 工 事件の表示 PCT/”’US90/’03157 平成 2年特許願第510360号 2、発明の名称 HIV−I MN gp120のヒトモノクローナル抗体3、補正をする者 事件との関係 特許出願人 住所 名 称 レプリゲ′シ・・ニーボレーション4、代理人 住 所 東京都千代田区大手町二丁目2番1号新大手町ビル 206区 5、補正命令の日付 平成 4年 9月22日 (発送日)6、補正の対象 ■ 出願人の代表音名を記載した国内書面■ 委任状及び別訳文 ■ 適正な図面 ■ 特許出願人名義変更届 国際調査報告 °゛r:八゛Sへ凸’01157

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 1.MNプロトタイプの主中和領域内のアミノ酸配列が、該主中和領域のA1− A17位置に下記のアミノ酸配列: K−R−K−R−I−H−I−G−P−G−R−A−F−Y−T−T−Kのサブ 配列を含み、そして下記MN変異体の相当するアミノ酸サブ配列が、A7−A1 1位置の上記I−G−P−G−R残基と完全にホモロガスな配列を含み且つ残り の残基については前記MNプロトタイプのサブ配列と少なくとも36%のホモロ ジーを有する、HIVのMNプロトタイプまたはそのMN変異体ウイルスを中和 する能力を有する抗体。 2.該抗体が広域中和性であり、該広域中和には、該抗体がHIVエンベロープ 蛋白質の主中和領域内にアミノ酸配列:G−P−G−A11−A12 (式中、A11はRまたはRを保存的に置換する任意のアミノ酸であり、そして A12はAまたはAを保存的に置換する任意のアミノ酸である。)を含む少なく とも二種のHIV株を中和する能力が含まれる、請求項1記載の抗体。 3.該アミノ酸配列がG−P−G−R−Aを含む請求項2記載の抗体。 4.該アミノ酸配列がG−P−G−R−A−Fを含む請求項3記載の抗体。 5.該アミノ酸配列がI−G−P−G−R−Aを含む請求項3記載の抗体。 6.前記抗体が広域中和性であり、該広域中和性には、該抗体がHIVエンベロ ープ蛋白質の主中和領域内にアミノ酸配列:I−A6−A7−G−P−G−R (式中、A6およびA7は各々独立に任意のアミノ酸を表す)を含む少なくとも 二種のHIV株を中和する能力が含まれる、請求項1記載の抗体。 7.該アミノ酸配列がI−A6−A7−G−P−G−R−Aを含む、請求項2ま たは6記載の抗体。 8.該アミノ酸配列がI−A6−I−G−P−G−Rを含む、請求項6記載の抗 体。 9.該アミノ酸配列がI−A6−I−G−p−G−R−Aを含む、請求項7記載 の抗体。 10.該株の一つがHIVのIIIBプロトタイプである、請求項2記載の抗体 。 11.該MN変異体のサブ配列が式: A1−A2−A3−A4−A5−A6−I−G−P−G−R−A12−A13− A14−A15−A16−A17(式中、A1−A6およびA12−A17は、 各々独立に任意のアミノ酸残基を表す)の配列である、請求項I記載の抗体。 12.A1=K、T、A、R、V、P、SまたはIであり、A2=R、T、I、 MまたはKであり、A3=K、R、T、NまたはAであり、A4=R、S、Gま たはHであり、 A5=I、Mまたはしであり、 A6=H、P、S、Y、K、NまたはRであり、A12=A、P、T、Sまたは Kであり、A13=F、V、I、Wまたはしであり、A14=Y、H、Vまたは Fであり、 A15=T、YまたはAであり、 A16=T、A、GまたはRであり、そしてA17=K、G、E、S、Q、R、 TまたはAである、請求項11記載の抗体。 13.HIV株の配列がアミノ酸配列:A1−A2−A3−A4−A5−A6− A7−G−P−G−R−A13−A14−A15−A16−A17(式中、A1 −A7およびA13−A17は各々独立して任意のアミノ酸残基を表すかまたは 削除されている。)を含む、請求項3記載の抗体。 14.A7がIであり、A13が任意のアミノ酸であり、そしてA1からA6の 各々ならびにA14からA17の各々が独立に削除されており、該アミノ酸配列 がI−G−P−G−R−A−A13を含む、請求項13記載の抗体。 15.A13がFであり、A7およびA14が各々独立して任意のアミノ酸であ り、そしてA1ないしA6の各々およびA15ないしA17の各々が独立に削除 されており、該アミノ酸配列がA7−G−P−G−R−A−F−A4を含む、請 求項13記載の抗体。 16.A5がIであり、A6およびA7が各々独立に任意のアミノ酸であり、そ してA1からA4およびA13からA17が各々独立に削除されており、そして 該アミノ酸配列がI−A6−A7−G−P−G−R−Aを含む、請求項I3記載 の抗体。 17.A5およびA7が各々独立にIであり、そしてA5が任意のアミノ酸であ り、そして該アミノ酸配列がI−A6−I−G−P−G−R−Aを含む、請求項 13記載の抗体。 18.該抗体がモノクローナル抗体である、請求項1ないし請求項17のいずれ か1項記載の抗体。 19.該抗体がヒトモノクローナル抗体である、請求項18記載の抗体。 20.該抗体がヒト以外の種由来の可変領域およびヒト由来の定常領域を有する キメラ抗体である、請求項1ないし請求項17のいずれか1項記載の抗体。 21.該抗体がヒトポリクローナル抗体である、請求項1ないし請求項17のい ずれか1項記載の抗体。 22.該抗体が担体に結合されている、請求項1ないし請求項17のいずれか1 項記載の抗体。 23.下記(a)および(b)の一方または双方を調べることよりなる、請求項 2−17に記載した広域中和抗体を検出する方法:(a)(1)HIVエンベロ ープ蛋白質の主中和領域内の式:G−P−G−A11−A12 (式中、A11はRまたはRと保存的に置換する任意のアミノ酸を表し、そして A12はAまたはAと保存的に置換する任意のアミノ酸を表す)で表されるアミ ノ酸配列、または (2)HIVエンベロープ蛋白質の主中和領域内の式:I−A6−A7−G−P −G−R (式中、A6およびA7は各々独立に任意のアミノ酸を表す)で表されるアミノ 酸配列、 を含むペプチドまたは蛋白質に結合する能力、または(b)HIV中和のための 生物学的活性。 24.該抗体を次のアッセイの一つまたはそれ以上で調べることよりなる、請求 項23記載の方法: (a)(1)HIVエンベロープ蛋白質の主中和領域内の式:G−P−G−A1 1−A12 (式中、A11はRまたはRと保存的に置換する任意のアミノ酸を表し、そして A12はAまたはAと保存的に置換する任意のアミノ酸を表す)で表されるアミ ノ酸配列、または (2)HIVエンベロープ蛋白質の主中和領域内の式:I−A6−A7−G−P −G−R (式中、A6およびA7は各々独立に任意のアミノ酸を表す)で表されるアミノ 酸配列、 を含むペプチドまたは蛋白質に結合する能力を調べるELISAアッセイ;(b )上記(1)または(2)(これら式中、どのアミノ酸残基もアラニンで置換さ れていてもよい)のアミノ酸配列からなる第二のペプチドまたは蛋白質による競 合のために、該抗体がペプチドまたは蛋白質に結合出来なくなることを調べる競 合ELISAアッセイ; (c)該抗体がHIV感染細胞に添加された時シンシチウムの形成を少なくとも 90%抑制するシンシチウム抑制アッセイ(ここで、該HIVは、(1)HIV エンベロープ蛋白質の主中和領域内の式:G−P−G−A11−A12 (式中、A11はRまたはRと保存的に置換する任意のアミノ酸を表し、そして A12はAまたはAと保存的に置換する任意のアミノ酸を表す)で表されるアミ ノ酸配列、または(2)HIVエンベロープ蛋白質の主中和領域内の式:I−A 6−A7−G−P−G−R (式中、A6およびA7は各々独立に任意のアミノ酸を表す)で表されるアミノ 酸配列を含む); (d)該抗体が、前記アミノ酸配列(1)または(2)を有するペプチドととも にインキュベートしてからHIV感染細胞に添加されたとき、シンシチウム抑制 能力がないことを試験する、競合シンシチウム抑制アッセイ;(e)該抗体が該 HIVとインキュベートされ、HIV感受性細胞に添加された時該HIVの感染 力を中和する、HIV感染中和アッセイ;および(f)該抗体が、該HIVとイ ンキュベートされ、HIV感受性細胞に添加された時該HIVのタイターを減少 させる、HIV感染力減少アッセイ。 25.下記(a)ないし(c)の何れかを中和する能力を有する抗体を患者に投 与することよりなる、該患者のHIV感染を治療または抑制する方法:(a)M Nプロトタイプの主中和領域内のアミノ酸配列が、該主中和領域のA1−A17 位置に下記のアミノ酸配列: K−R−K−R−I−H−I−G−P−G−R−A−F−Y−T−T−Kのサブ 配列を含み、そして下記MN変異体の相当するアミノ酸サブ配列が、A7−A1 1位置の上記I−G−P−G−R残基と完全にホモロガスな配列を含み且つ残り の残基については前記MNプロトタイプのサブ配列と少なくとも36%のホモロ ジーを有するウイルスのMNプロトタイプまたはそのMN変異体ウイルス;(b )HIVエンベロープ蛋白質の主中和領域内にアミノ酸配列:G−P−G−A1 1−A12 (式中、A11はRまたはRを保存的に置換する任意のアミノ酸であり、そして A12はAまたはAを保存的に置換する任意のアミノ酸である。)を含む少なく とも二種のHIV株;または (c)HIVエンベロープ蛋白質の主中和領域内にアミノ酸配列:I−A6−A 7−G−P−G−R (式中、A6およびA7は各々独立に任意のアミノ酸を表す)を含む少なくとも 二種のHIV株。 26.該抗体がモノクローナルである、請求項25記載の方法。 27.該抗体がポリクローナルである、請求項25記載の方法。 28.真核細胞に感染したとき、第二のHIV株の主中和領域を含む第一のHI V株のHIVエンベロープ蛋白質を発現できる、組換えワクシニアウイルスであ って、該ウイルスは該エンベロープ蛋白質をコードするDNAを含み、該DNA は該第二のHIV株の主中和領域をコードするDNA配列を含み、該エンベロー プ蛋白質コードDNAはワクシニアウイルスプロモーターの転写支配下にある、 上記組換えワクシニアウイルス。 29.該ウイルスの該HIVエンベロープ蛋白質をコードするDNAが組換えベ クター由来であり、該ベクターが該エンベロープ蛋白質をコードするDNA配列 を含んでおり、該DNAが該第二HIV株の該中和領域をコードするDNA配列 および該エンベロープ蛋白質ーコードDNAの該ワクシニアウイルスヘの組み込 みを生じさせる能力を持つDNAを含んでいる、請求項28記載の組換えウイル ス。 30.該主中和領域が、さらに第三のHIV株からの少なくとも5つのアミノ酸 を含む、請求項28記載の組換えウイルス。 31.請求項I記載の抗体の有効量を含んでなる、HIVに感染した患者を治療 するための医薬組成物。 32.さらに薬学的に許容される担体も含む、請求項31記載の組成物。 33.ヒト免疫不全症ウイルスタイプ1のMN変異体を中和する、ウイルス中和 量のヒトモノクローナル抗体を、薬学的に許容される担体物質と共に含有する、 ヒト免疫不全症ウイルスに感染したヒト患者の治療剤。 34.該抗体が、(1)HIVエンベロープ蛋白質の主中和領域内にアミノ酸配 列: G−P−G−A11−A12 (式中、A11はRまたはRを保存的に置換する任意のアミノ酸であり、そして A12はAまたはAを保存的に置換する任意のアミノ酸である);または(2) HIVエンベロープ蛋白質の主中和領域内にアミノ酸配列:I−A6−A7−G −P−G−R (式中、A6およびA7は各々独立に任意のアミノ酸を表す);を含む少なくと も二種のHIV株を中和することもできる、請求項33記載の組成物。 35.該抗体がHIVに感染したヒト患者に由来する不滅化B細胞により生産さ れる、請求項33または34記載の組成物。 36.該B細胞がエプスタイン・バール・ウイルス(EpsteinBarrV irus)の感染により不滅化されたものである、請求項33または34記載の 組成物。 37.ヒト患者にウイルスを中和する量の請求項33記載のヒトモノクローナル 抗体を投与することよりなる、ヒト免疫不全症ウイルスに感染したヒト患者の治 療方法。 38.抗一HIVモノクローナル抗体を用意しIそして該モノクローナル抗体が 該HIVMNのgp120エンベロープ蛋白質の主中和傾城を含むフラグメント に結合する能力を試験し、該結合を該抗体がHIVMNを中和する能力の指標と する; 工程からなる、HIVMN中和能をもつヒトモノクローナル抗体の入手方法。 39.該抗体がさらに、(1)HIVエンベロープ蛋白質の主中和領域内に式; G−P−G−A11−A12 (式中、A11はRまたはRと保存的に置換する任意のアミノ酸を表し、そして A12はAまたはAと保存的に置換する任意のアミノ酸を表す)で表されるアミ ノ酸配列、または (2)HIVエンベロープ蛋白質の主中和領域内に式:I−A6−A7−G−P −G−R (式中、A6およびA7は各々独立に任意のアミノ酸を表す)で表されるアミノ 酸配列を含む、少なくとも二種のHIV株を中和する能力を有する、請求項38 記載の方法。 40.該フラグメントが次のもの: G−P−G−R−A、G−P−G−R−A−F、I−G−P−G−R−A、I− A6−A7−G−P−G−R−A、I−A6−I−G−P−G−R、I−A6− I−G−P−G−R−AおよびK−R−K−R−I−H−I−G−P−G−R− A−F−Y−T−T−Kからなる群から選択される、請求項39記載の方法。 41.第一の試験工程に先立ちもしくはひき続いて、該抗体がHIVMNを中和 する能力を調べる第二の試験工程をさらに含む、請求項38または39記載の方 法。 42.該第二の試験工程がシンシチウム形成の抑制に関する試験工程である、請 求項41記載の方法。 43.該フラグメントがgp120のPNDに由来するペプチドである、請求項 38または39記載の方法。 44.該フラグメントが閉じたループを含む、請求項43記載の方法。 45.該第一または第二試験工程に先立ちもしくはひき続いて、(1)HIVエ ンベロープ蛋白質の主中和領域内に式:G−P−G−A11−A12 (式中、A11はRまたはRと保存的に置換する任意のアミノ酸を表し、そして A12はAまたはAと保存的に置換する任意のアミノ酸を表す)で表されるアミ ノ酸配列、または(2)HIVエンベロープ蛋白質の主中和領域内に式:I−A 6−A7−G−P−G−R (式中、A6およびA7は各々独立に任意のアミノ酸を表す)で表されるアミノ 酸配列を含む少なくとも一つのHIVMN以外のHIV株を中和する能力を、該 抗体が持つか否か調べる第三の試験工程をさらに含む、請求項41記載の方法。 46.該配列が、R−I−H−I−G−P−G−R−A−Fを含みそして該MN プロトタイプのサブ配列の残りの残基と36%より低いホモロジーを有し、ここ で該サブ配列がK−R−K−R−I−H−I−G−P−G−R−A−F−Y−T −T−Kを含む、請求項45記載の方法。
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