JPH05506561A

JPH05506561A - ＨＩＶ―１　ＭＮ　ｇｐ１２０のヒトモノクローナル抗体

Info

Publication number: JPH05506561A
Application number: JP90510360A
Authority: JP
Inventors: スコット，チャールズ・エフ，ジュニアー; カーソン，ヘレン・エフ; ホワイト―シャーフ，メアリー・イー; シルバー，サンドラ; ラシェ，ジェームズ・アール
Original assignee: レプリゲン・コーポレーション
Priority date: 1989-06-05
Filing date: 1990-06-05
Publication date: 1993-09-30
Also published as: CA2058630A1; EP0478689A4; WO1990015078A1; AU6036690A; IL94624A0; PT94276A; EP0478689A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】ＨＩＶ−Ｉ　ＭＮ　ｇｐ１２０のヒトモノクローナル抗体発明の背景本出願は、１９８９年６月５日出願のＵ、Ｓ、Ｓ、　Ｎ、第３６１，５４１号の継続出願の、スコツト（Ｓｃｏｔｔ）ら、１９８９年１１月３日出願のＵ、ＳＳ、　Ｎ、第４３１，２８１号の継続出願である。

本発明は、ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩ　Ｖ）に特異的な抗体に関する。

ＨＩＶは後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の原因となる要素であると提唱されている（ボボビック（Ｐｏｐｏｖｉｃ）ら、１９８４．５ｃｉｅｎｃｅ　２２４：４９７）。別々のＨＩＶ株はウィルスゲノムにコードされている蛋白質のアミノ酸配列、特に外部エンベロープ糖蛋白質ｇｐ１２０のアミノ酸配列が異なる（スターシッチ（Ｓｔａｒｃｉｃｈ）、１９８６．Ｃｅ１ｌ　４５：６３７；バーン（Ｈａｈｎ）　ら、１９８６，５ｃｉｅｎｃｅ　２３２：１５４８）。ｇｐ１２ｏはウィルスＣＤ４の細胞リセブター蛋白質に結合する。エンベロープ蛋白質を発現する細胞は培養液中でＣＤ４を保有する細胞と融合する（リブソン（Ｌｉｐｓｏｎ）ら、１９８６．Ｎａｔｕｒｅ　３２３ニア２５；　ソドロスキー（Ｓｏｄｒｏｓｋｉ）ら、１９８６．　Ｎａｔｕｒｅ　３２２：４７０）ことにより、多核性融合細胞を形成する。天然のｇｐ１２０および組換え体ｇｐ１２０のいずれもがＨＩＶを中和することのできる抗体を細胞培養液中で誘発する（マツューズ（Ｍａ　ｔ　ｈ　ｅｗｓ）　ら、１９８６．Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　１．Ａｃａ、Ｓｃｉ。

８３　：　９７０９　、ラスキー（Ｌ　ａ　ｓ　ｋ　ｅ　ｙ）ら、１９８６．　５ｃｉｅｎｃｅ２３３　：　２０９　、およびピュート＝　−（Ｐｕ　ｔ　ｎ　ｅ　ｙ）ら、１９８６，５ｃｉｅｎｃｅ　２３４：１３９２）。これらの抗体は通常ｇｐ１２０が由来したウィルス変異株のみを中和する。

１００以上のＨＩＶ変異株が同定された；それらのうちにはＲＦＣポポビック（Ｐｏｐｏｖｉｃ）ら、上記）　、ＷＭ　Ｊ−１（バーン（Ｈａｈｎ）ら、上記）、ＬＡＶ　（ウエインーポプリン（Ｗａ　１ｎ−Ｈｏｂｓｏｎ）　ら、１９８５．Ｃｅ１１　４０：９）、ＡＲＶ−２（サンチェーペスカドール（Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｐｅｓｃａｄｏｒ）ら、１９８５，５ｃｉｅｎｃｅ　２２７：４８４）、およびＩＩＩ−Ｂ（ラトナー（Ｒａｔｎｅｒ）　ら、１９８５．Ｎａｔｕｒｅ　３１３：２７７）が含まれる。ＨＩＶ−Ｉ　Ｉ　１．変異株を中和するモノクローナル抗体の多くは、主要中和ドメイン（ＰＮＤ）と呼ばれる、ＩＩｌ、のｇｐ１２０分子の特定領域に結合するが、そのドメインはｇｐ１２０の高頻度可変領域の２４のアミノ酸にマツプされる（マツシタ（Ｍａｔｓｕｓｉｔａ）ら、１９８８．Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、６２：２１０７；およびスキナー（Ｓｋｉｎｎｅｒ）ら、１９８８．ＡＩＤＳ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　ａｎｄ　Ｈｕｍａｎ　Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ　４：１８７）。

上記ラトナー（Ｒａｔｎｅｒ）らのｇｐ１２０の慣用的な番号によれば、ＨＩＶのｇｐ１２０の高頻度可変領域はｇｐ１２０分子の３０３番目から３３８番目の３６のアミノ酸である。完全長のｇｐ１２０のうち、ｇｐ１２０ポリペプチド配列は一つのＨＩＶ変異株の次の世代において約２０％から約２５％変化するが、主要中和配列内のアミノ酸配列は約４０％から約５０％変化する。この高頻度可変領域は保存されている複数のシスティン残基の前後にあり、該残基はジスルフィド結合を形成し、極めて保存されている配列Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙをその中心に含むループ領域を規定する。合成ループ領域のペプチドは８アミノ酸またはそれ以上の長さであり、該ペプチドのアミノ酸配列が由来する単離体またはその変異株からのウィルスのみを中和する抗体の生産を誘発することが分かった。

ＨＩＶ−１蛋白質にたいして反応するヒトモノクローナル抗体はハイブリドーマ形成またはＥＢｖトランスフォーメーションにより生産される（バナボアー（Ｂａｎａｐｏｕｒ）　ら、１９８７．Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、１３９：４０２７；スガノ　（Ｓ　ｕ　ｇ　ａ　ｎ　ｏ）　ら、１９８８．Ｂｉｏｃｈｅｍ、ａｎｄ　Ｂｔｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍ、１５５　：１１０５　；モロウ（Ｍｏ　ｒ　ｒ　ｏｗ）ら、１９８８、Ｊ、ｒｍｍｕｎｏｌ、１４０：９４１；ゴーニー（Ｇｏｒｎｙ）ら、１９８９、Ｐｒｏｃ、ＮａＬ　Ａｃａ、Ｓｃｉ、８６：１６２４；およびアマトリ（Ａｍａｄｏｒｉ）　ら、１９８９．ＡＩＤＳ　Ｒｅｓ、ａｎｄ　Ｈｕｍａｎ　Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ　５ニア３）。

発明の概要本発明は、ＨＩＶのＭＮ変異株がＨＩＶ感染患者に最も多く、我々の推定によればＨＩＶに感染している人の約３０％がＭＮ変異株またはごく近縁の変異株、特にＭＮ変異株と当価の変異株に感染しているという、我々の発見に一部基づいている。

したがって、本発明はＨＩＶのＭＮプロトタイプ、またはＭＮプロトタイプのウィルス変異株を中和できる抗体を特徴とする（ここで使用されているとおり、「中和」は、細胞を含まないピリオン、または感染している細胞と感染していない細胞の融合、またはその両方によりＨＩＶが細胞に感染するのを阻害する、抗体の能力を意味する）。ＭＮプロトタイプウィルスは、主要中和ドメイン（即ち、ｇｐ１２０エンベロープ蛋白質のループ領域）内の特定のアミノ酸配列に準する配列により規定され、その配列はＡ１からＡ１７のに−Ｒ−に−Ｒ−Ｉ−Ｈ−Ｉ −Ｇ−Ｐ−Ｇ−Ｒ−Ａ−Ｆ−Ｙ−Ｔ−Ｔ−にである。ＭＮウィルス変異株はＩ− Ｇ−Ｐ−Ｇ−Ｒ配列、即ちＡ７からＡ１１が完全に同一のアミノ酸配列であり、そして上記ＭＮ配列の残りの１２アミノ酸と少なくとも３６％相同性を示す変異株としてここに規定される。

好ましい態様において、その抗体は広範囲な中和能力を有する（ここで使用されているとおり、「広範囲な中和」は、ＭＮＮプロトタイプおよび／またはＭＮウィルス変異株および他のＨＩＶ株による感染を阻害する、抗体の能力を意味する。広範囲な中和活性を有する抗体は２つまたはそれ以上のＨＩＶ株を中和する能力の証明に際して同定される）。ここで使用されているとおり、広範囲な中和抗体は、表１ａ−ｄに見られるＨＩＶ単離体の少なくとも６０％に存在する一次中和ドメインの中央部のアミノ酸配列を有するＨＩＶ株を中和でき、より好ましくは、その配列はこれらＨＩＶ単離体の７０％に存在する。本発明の広範囲な中和抗体はＨＩＶエンベロープ蛋白質の一次中和ドメイン内にアミノ酸配列Ｇ−Ｐ− Ｇ−Ａ１１−Ａ１２を含む少なくとも２株のＨＩＶを中和できるが、但しＡ１１はＲまたはＲに類似のアミノ酸置換体であり、そしてＡ　ｌ　２はＡまたは八に類似のアミノ酸置換体である。ここで使用されている「類似の」アミノ酸置換体は、親水性、疎水性、芳香性、またはアミノ酸の電荷の特徴か同じ置換体である。

好ましい態様によれば、本発明により、広範囲に中和されるＨＩＶ単離体のＰＮＤアミノ酸配列配列Ｎのコンセンサス配列のＧ−Ｐ−Ｇ−Ｒ−Ａと１００％相同であり、配列Ｉ−Ｇ−Ｐ−Ｇ−Ｒ−Ａまたは配列Ｇ−Ｐ−Ｇ−Ｒ−Ａ−Ｆと１００％相同であることが好ましい。本発明により広範囲に中和される２株の内の一つがＨＩＶのＩ　Ｉ　１．プロトタイプであることが好ましい。

他方、本発明による広範囲な中和抗体により認識されるＰＮＤエピトープはＨＩＶエンベロープ蛋白質の一次中和ドメイン内にアミノ酸配列Ｉ−Ａ’−Ａ’−Ｇ −Ｐ−Ｇ−Ｒを含む隣接しないエピトープであるが、但し各々Ａ６またはＡ７は別個にどのアミノ酸でもよい（ここで使用されている「隣接しないエピトープ」は、Ｇ−Ｐ−Ｇのすぐアミノ側の２つのアミノ酸の位置の一方または両方が抗体の結合を解離させないどのようなアミノ酸置換体も含む。）。本発明の広範囲に中和する抗体はエピトープＩ−Ａ’−Ａ’−Ｇ−Ｐ−Ｇ−Ｒ−Ａ、またはＩ−Ａ ’−Ｉ−Ｇ−Ｐ−Ｇ−Ｒ，またはＩ−Ａ’−Ｉ−Ｇ−Ｐ−Ｇ−Ｒ−Ａが好ましい。これらのエピトープは表１のＨＩＶ単離体の６９％、６８％、および７８％にそれぞれ存在する。

上述のエピトープに隣接した複数のアミノ酸も中和抗体の結合活性に影響する。

ＨＩＶループ領域の配列の相対頻度を表２に示す。

好ましい態様において、本発明により中和されるＭＮウィルス変異株は式（１％式％Ａ”　Ａ”　Ａ１６　Ａ１７のｇｐ１２０ループ領域に準じた配列を有し、但しＡ１Ａ６またはＡ１２　Ａ１７は別個に、どのアミノ酸でもよく、最も好ましくは本発明のＭＮウィルス変異株が式（１）のｇｐ１２０ループ領域に準じた配列を有し、但しＡ”＝に、　Ｔ、　Ａ、　Ｒ，Ｖ、Ｐ、Ｓ、　マタハＩ。

Ａ２＝Ｒ，Ｔ、Ｉ、　Ｍ、またはＫ。

Ａ”＝に、　Ｒ，Ｔ、　Ｎ、またはＡ。

Ａ’＝Ｒ，Ｓ、　Ｇ、またはＨ１Ａ５＝Ｉ、　Ｍ、　またはＬｌＡ’＝Ｈ，Ｐ、Ｓ、　Ｙ、　Ｋ、　Ｎ、またはＲｌＡ”＝Ａ、Ｐ、　Ｔ、Ｓ、またはＫ。

Ａ１３＝Ｆ、　Ｖ、Ｉ、　Ｗ、またはり。

Ａ１４＝Ｙ、　Ｈ，Ｖ、　マタｌ；！Ｆ。

Ａ１５＝Ｔ、　Ｙ、またはＡ。

Ａ”＝Ｔ、　Ａ、Ｇ、　またはＲ１およびＡ１７＝に、　Ｇ、Ｅ、Ｓ、　Ｑ、　Ｒ，Ｔ、またはＡである。

他の好ましい態様において、本発明により中和されるＨＩＶ株は式（２）：Ａ％式％Ａ”　Ａ”　Ａ１７のｇｐ１２０ループ領域に準じた配列を有し、但しＡ１−Ａ６およびＡ１２−Ａ１７は別個に、どのアミノ酸でもよい。

本発明により中和され、そして上記の式（２）に準じた配列を有するＨＩＶ株は、Ａ７が１であり、Ａ１２がＡであり、Ａ１３がどのアミノ酸でもよく、そしてＡ１からＡ６までとＡ　１４からＡ”までを別個に欠失しているアミノ酸配列Ｉ− Ｇ−Ｐ−Ｇ−Ｒ−Ａ−Ａ１３；Ａ”がＦであり、Ａ７またはＡ１４が別個にどのアミノ酸でもよく、そしてＡ１からＡ６までとＡ”からＡ”までを別個に欠失しているアミノ酸配列Ａ７−Ｇ− Ｐ−Ｇ−Ｒ−Ａ−Ｆ−Ａ”。

Ａ５が１であり、Ａ６またはＡ７が別個にどのアミノ酸でもよく、そしてＡ１からＡ４までとＡ”からＡ１７までを別個に欠失しているアミノ酸配列Ｉ　−Ａ’ −Ａ’−Ｇ−Ｐ−Ｇ−Ｒ−Ａ；またはＡ５またはＡ７が別個に１であり、そして八〇がどのアミノ酸でもよい、アミノ酸配列Ｉ−Ａ’−１−Ｇ−Ｐ−Ｇ−Ｒ−Ａの準じた配列である。

本発明の抗体はモノクローナルまたはポリクローナルでありヒトの抗体が好ましい。抗体はヒト以外の種由来の可変領域とヒト由来の定常領域を含むキメラ抗体でもよく、抗体はキャリアーと共に配合してもよい。

抗体がモノクローナルであるならば、（ａ）ｇｐ１２０のＰＮＤ領域のＭＮプロトタイプウィルス配列または上記ＭＮ変異株のアミノ酸配列の一つのどちらかを有するペプチドまたはポリペプチドを用いて咽乳動物を免疫し、また作製された抗体か広範囲に中和するものであれば免疫源をＧ−Ｐ−Ｇ−Ｒ−Ａ−ＦまたはＩ−Ｇ−Ｐ−Ｇ−Ｒ−Ａのどちら力）を含むプロトタイプ配列または上記の他のコンセンサスエピトープ配列にし、（ｂ）免疫化された哺乳動物の牌臓細胞と永久増殖性のセルラインを融合することにより個別のクローンを作製し、そして（Ｃ）モノクロ−チル抗体を産生ずるクローンを選別する。選別段階１！ＥＬＩＳＡによるのが好ましい。選別段階はＭＮプロトタイプまたはＭＮＮ変異株ウィルススまたは頻繁に生じるエピトープ配列、例えば上記のよう１こ規定されたＧ−Ｐ−Ｇ−Ｒ−Ａ−ＦまたはＩ−Ｇ−Ｐ− Ｇ−Ｒ−Ａを含む広範囲のＨＩＶ株による感染を中和する、抗体の能力も含む。

抗体がポリクローナルであるならば、ｇｐ１２０のＰＮＤ領域のＭＮプロトタイプウィルス配列または上記ＭＮ変異株のアミノ酸配列の一つのどちら力１を含むペプチド、または上記のモノクローナルにおいて規定された、ＰＮＤ内（二通常生じるＨＩＶ配列（即ち、Ｇ−Ｐ−Ｇ−Ｒ−Ａ−Ｆを含む配列）と反応する抗体の存在を調べるために、ヒト抗血清により作製される。そして血しよう変換採血法により、これらのペプチドと反応する、高力価の抗体を有するヒト力）ら血しようを除去する。この抗血清のＩｇＧ画分はポリクロ−カル抗体源として使用される。ポリクローナル抗体は慣用的な方法、例えばプロティンＡアフイニテイ力ラムによりさらに精製される。

他の側面において、本発明は上述の広範囲な中和抗体の同定法を特徴とし、（ａ）ＨＩＶエンベロープ蛋白質の一次中和ドメイン内に、Ａ１１はＲまたはＲに類似のアミノ酸置換体であり、Ａ１２はＡまたはＡに類似の置換体であるアミノ酸配列（１）Ｇ−Ｐ−Ｇ−Ａ１１−Ａ”、または旧ｖエンベロープ蛋白質の一次中和ドメイン内に、Ａ６またはＡ７が別個にどのアミノ酸でもよいアミノ酸配列（２）Ｉ−Ａ’−Ａ’−Ｇ−Ｐ−Ｇ−Ｒを含むペプチドまたは蛋白質に結合する能力、または（ｂ）ＨＩｖの中和における生物学的活性のいずれかまたは両方に関して抗体を試験することを含む。

好ましくは、ひとつまたはそれ以上の以下のア・ンセイにおいて抗体を試験することを含む（ａ）ＨＩＶエンベロープ蛋白質の一次中和ドメイン内のアミノ酸配列（１）Ｇ −Ｐ−Ｇ−Ａ１１−Ａ１２、但しＡ１１はＲまたはＲに類似のアミノ酸置換体であり、Ａ１２はＡまたはＡに類似のアミノ酸置換体である、またはＨＩＶエンベロープ蛋白質の一次中和ドメイン内のアミノ酸配列（２）Ｉ−Ａ’−Ａ’−Ｇ− Ｐ−Ｇ−Ｒ，但し各々Ａ６またはＡ７は別個にどのアミノ酸でもよい、を含むペプチドまたは蛋白質への抗体の結合を試験することによるＥＬＩＳＡアッセイ；（ｂ）上記アミノ酸配列（１）または（２）を含む二次ペプチドまたは蛋白質による競合の為に、抗体がペプチドまたは蛋白質に結合できなくなることを試験することによる競合ＥＬ　Ｉ　ＳＡアッセイ；（ｃ）抗体をＨＩＶ感染細胞に加えたとき、少なくとも８０％、好ましくは９０％融合細胞の形成を阻害することによる融合阻害アッセイ、但しＨＩＶは、Ａ１１はＲまたはＲに類似のアミノ酸置換体であり、Ａ１２はＡまたはＡに類似のアミノ酸置換体である、ＨＩＶエンベロープ蛋白質の一次中和ドメイン内のアミノ酸配列（１）Ｇ−Ｐ−Ｇ−Ａ１１− Ａ１２、または各々Ａ６またはＡ７は別個にどのアミノ酸でもよい、ＨＴＶエンベロープ蛋白質の一次中和ドメイン内のアミノ酸配列（２）Ｉ−Ａ’−Ａ７−Ｇ −Ｐ−Ｇ−Ｒを含む。

（ｄ）上記の（１）または（２）に規定されたアミノ酸配列を有するペプチドと抗体をインキュベートすることにより、抗体が融合細胞の形成を阻害できなくなることを試験し、そして抗体をＨＩＶ感染細胞に加えることによる競合融合阻害アッセイ；（ｅ）抗体をＨＩＶとインキュベートし、そしてＨＩＶに感染しゃすい細胞に加えたとき、抗体がＨＩＶの感染を中和することによるＨＩＶ感染中和アッセイ；および（ｆ）抗体をＨＩＶとインキュベートし、そしてＨＩＶに感染しゃすい細胞に加えたとき、抗体がＨＩＶの力価を低下させることによるＨＩＶ感染性低下アッセイである。

本発明は、（ａ）ＭＮプロトタイプウィルスまたはそのＭＮ変異株ウィルス、但しＨＩＶエンベロープ蛋白質の一次中和ドメイン内のアミノ酸配列が、−次中和ドメインのＡＸ　ＡＲＴの位置のアミノ酸残基に−Ｒ−に−Ｒ−Ｉ−Ｈ−Ｉ−Ｇ−Ｐ−Ｇ− Ｒ−Ａ−Ｆ−Ｙ−Ｔ−Ｔ−Ｋに準じた配列、およびＡ　７−　Ａ　１１の位置のＩ　−Ｇ−Ｐ−Ｇ−Ｒ残基と完全に相同な配列であり、ＭＮプロトタイプに準じた配列の残りの残基が少なくとも３６％相同であることからなる、ＭＮ変異株に準じた、対応するアミノ酸配列を含み、そして（ｂ））（ＩＶエンベロープ蛋白質の一次中和ドメイン内にアミノ酸配列Ｇ−Ｐ（、−ＡＩ　Ｌ　Ａ　１２を含む少なくとも２つのＨＩＶ株、但しＡ”はＲまたはＲに類似のアミノ酸置換体であり、Ａ１２はＡまたはＡに類似のアミノ酸置換体である、または（Ｃ）ＨＩＶエンベロープ蛋白質の一次中和ドメイン内にアミノ酸配列Ｉ−Ａ’ −Ａ’−Ｇ−Ｐ−Ｇ−Ｒを含む少なくとも２つのＨＩＶ株、但し各々Ａ６またはＡ７は別個にどのアミノ酸でもよいを中和できる抗体を患者に投与することを含む、患者へのＨＩＶ感染の治療法または予防法も特徴とする。

抗体はモノクローナルまたはポリクローナルであることが好ましい。

他の側面において、本発明は、真核生物細胞への感染に際して、二次ＨＩＶ株の一次中和ドメインを含む一次株のＨＩＶエンベロープ蛋白質を発現できる組換え体ワクシニアウィルスを特徴とする。ウィルスはエンベロープ蛋白質をコードするＤＮＡを含み、ＤＮＡは二次ＨＩＶ株の一次中和ドメインを含む一次株のＨＩＶエンベロープ蛋白質をコードするＤＮＡ配列を含み、エンベロープ蛋白質をコードするＤＮＡはワクシニアウィルスプロモーターの転写制御下にある。

ＨＩＶエンベロープ蛋白質をコードする、組換え体ウィルスのＤＮＡは組換え体ベクター由来であることが好ましい。ベクターはエンベロープ蛋白質をコードするＤＮＡ配列を含み、そしてＤＮＡは二次ＨＩＶ株の一次中和ドメインを含む一次株のＨＩＶエンベロープ蛋白質をコードするＤＮＡ配列を含み、そしてＤＮＡはワタシニアウイルスゲノム内にエンベロープ蛋白質をコードするＤＮＡを挿入できる。

ＨＩＶエンベロープ蛋白質をコードするＤＮＡは雑種配列、即ち一次中和ドメインをコードする配列と残りの配列か別のＨＩＶ株由来である。即ち、例えば、それか由来するウィルスまたはベクターは、所望の株からの一次中和ドメインをコードする領域か、ウィルスまたはベクターの他の部分を変化させることなしに、エンベロープをコートする領域の残りを含んで挿入され得ることにより、カセットとして機能できる。コートされたエンベロープ蛋白質は、その雑種か自然によるにもかかわらず、−次中和ドメインをコードする配列が由来した株のＨＩＶ中和に関して、免疫的な特徴を呈する。換言すれば、例えば−次中和ドメインがＭＮまたはＭＮ変異株であれば、コードされるエンベロープ蛋白質はＭＮ変異株に特異的な抗体により特異的に中和され；また、例えば−次中和ドメインがｇｐ１２０のチップ、即ちＧ−Ｐ−Ｇ−Ｒ−Ａ−Ｆの右側由来であるならば、コードされたエンベロープ蛋白質はＭＮ株またはＭＮ変異株の両方およびＧ−Ｐ−Ｇ−Ｒ −Ａ−Ｆ配列を含む他のＨＩＶ株を中和できる広範囲な中和抗体により中和される。したがって、雑種エンベロープをコードするウィルスは、真核生物細胞の表面に雑種エンベロープ蛋白質を発現させる能力を該真核生物細胞に付与できる感染性の因子として使用できる。雑種エンベロープをコードするベクターを使用することにより、どのようなＨＩＶ株をも中和でき、一つの株、例えばＲＦ、ＷＭＪ−１，ＬＡＶ、またはＡＲＶ−２より多くの株を中和するのに有効な抗体を同定する能力に関して抗体をスクリーニングできる。

他の側面において、本発明は、ヒト免疫不全ウイルスタイブエのＭＮ変異株を特異的に中和し、そして広範囲なＨＩＶ株、例えば上記の配列を含む株を中和できるヒトモノクローナル抗体、およびＨＩＶに感染した患者に対してウィルスを中和できる量の抗体を投与するための治療法を特徴とする。

より好ましい態様によれば、抗体はＨＩＶに感染した患者由来の固定化Ｂ細胞により生産され、該Ｂ細胞はエプスタインパールウィルスを用いた感染により固定化される。他の好ましい態様によれば、該ヒトモノクローナル抗体を薬学的に受容可能なキャリアー物質と化合した組成物を投与することにより患者を治療する。

該組成物は、Ｔ（ｒＶエンベロープ蛋白質の一次中和ドメイン内のアミノ酸配列（１）Ｇ−Ｐ−Ｇ−Ａ”−Ａ１２、但しＡ１１はＲまたはＲに類似のアミノ酸置換体であり、Ａ１２はＡまたはＡに類似のアミノ酸置換体である、またはＨＩＶエンベロープ蛋白質の一次中和ドメイン内のアミノ酸配列（２）Ｉ−Ａ’−Ａ７ −Ｇ−Ｐ−Ｇ−Ｒ，但し各々Ａ６またはＡ７は別個にどのアミノ酸でもよい、を含む少なくとも２つのＨＩＶ株を中和できる抗体を含む。

本発明は、通常生じるエピトープ、例えば上記のようなＧ−Ｐ−Ｇ−Ｒ−Ａ−ＦまたはＩ−Ｇ−Ｐ−Ｇ−Ｒ−Ａを含むＨＩＶ株を中和できる、広範囲に中和する抗体でもあるＨ　Ｉ　ＶＭ、を中和できるヒトモノクローナル抗体を得る方法も特徴とし、その方法は抗ＨＩＶモノクロ−士ル抗体を付与する段階、およびＨＩ　ＶＭ。

のｇｐ１２０エンベロープ蛋白質の断片に結合する能力のあるモノクローナル抗体を最初に試験することを含み、但し該断片は一次中和ドメインからなり、結合は抗体がＨＩＶＭＮを中和する能力を示す。

好ましい態様によれば、抗体は、ＨＩＶエンベロープ蛋白質の一次中和ドメイン内のアミノ酸配列（１）Ｇ−Ｐ−Ｇ−Ａ１１−Ａ”、但しＡ１１はＲまたはＲに類似のアミノ酸置換体であり、Ａ１２はＡまたはＡに類似のアミノ酸置換体である、またはＨＩＶエンベロープ蛋白質の一次中和ドメイン内のアミノ酸配列（２）Ｉ−Ａ６−Ａ’−Ｇ−Ｐ−Ｇ−Ｒ，但し各々Ａ６またはＡ７は別個にどのアミノ酸でもよい、からなる少なくとも２株のＨＴＶを中和できる。ＭＮ変異株への結合能力を試験するために使用される断片は、上記のような通常生じるＰＮＤエピトープ配列のうちの一つからなる断片であるか、またはすべての断片、またはアミノ酸配列Ｉ−Ｇ−Ｐ−Ｇ−Ｒ，Ｉ−Ｇ−Ｐ−Ｇ−Ｒ−Ａ、Ｇ−Ｐ−Ｇ−Ｒ− Ａ−ＦＳ　Ｉ−Ａ’−Ａ’−Ｇ−Ｐ−Ｇ−Ｒ−Ａ、Ｉ−Ａ’−Ｉ−Ｇ−Ｐ−Ｇ− Ｒ，Ｉ−Ａ’−Ｉ−Ｇ−Ｐ−Ｇ−Ｒ−Ａ、またはに−Ｒ−に−Ｒ−Ｉ−Ｈ−１− Ｇ−Ｐ−Ｇ−Ｒ−Ａ−Ｆ−Ｙ−Ｔ−Ｔ−に、但しこれらの配列はＭＮｇｐ１２０蛋白質の一次中和ドメインに含まれる、に類似の原型ＭＮｇｐ１２０ＰＮＤ領域に類似の断片である。該方法は最初の試験段階の前または後に、例えば融合の形成の阻害を確認することにより、モノクローナル抗体がＨＩＶ。Ｎを中和する能力を試験する二番目の試験段階をさらに含み、そして最初および二番目の試験段階の前または後に、該抗体が広範囲なＨＩＶ株を中和する能力を試験する三番目の段階をさらに含む。該断片はｇｐ１２０のＰＮＤ由来のペプチドであり、より好ましくは閉環したループペプチドであることが好ましい。

該方法は最初および二番目の試験段階の前または後に、抗体がＨＩ　Ｖ、、以外の少なくとも一つのＨＩＶ株を中和する能力を試験する三番目の段階をさらに含むことが好ましいが、但し上記株はＨＩＶエンベロープ蛋白質の一次中和ドメイン内のアミノ酸配列（１）Ｇ−Ｐ−Ｇ−Ａ１１−Ａ”、但しＡ１１はＲまたはＲに類似のアミノ酸置換体であり、Ａ１２はＡまたはＡに類似のアミノ酸置換体である、またはＨｒＶエンベロープ蛋白質の一次中和ドメイン内のアミノ酸配列（２）Ｉ−Ａ’−Ａ７−Ｇ−Ｐ−Ｇ−Ｒ，但し各々Ａ６またはＡ７は別個にどのアミノ酸でもよい、を含む。

より好ましくは、該配列がＲ−１−Ｈ−ｒ−Ｇ−Ｐ−Ｇ−Ｒ−Ａ−Ｆを含み、ＭＮプロトタイプ配列に準じた配列の残りの配列の相同性が３６％未満であるが、但しプロトタイプに準じた配列はに−Ｒ−に−Ｒ−Ｉ−Ｈ−Ｉ−Ｇ−Ｐ−Ｇ−Ｒ −Ａ−Ｆ−Ｙ−Ｔ−Ｔ−Ｋを含む。

本発明の抗体を使用することにより、ＨＩＶに感染しているかまたは感染している疑いのある患者におけるＨＩＶ感染を予防できる。感染性因子に暴露まはた擬似暴露した直後に、患者にヒト抗体を投与すれば、ウィルスによる感染の定着を阻害する。例えば患者が偶然ＨｒＶで汚染された血液、血液製剤、または体の分泌物に接触する。抗体は、妊娠の前または妊娠中に抗体を投与することにより、および／または出産時およびその後子供に投与することにより、血清に陽性の妊婦からのＨＩＶの子供への移入も阻害する。該抗体は受け身の免疫治療にも使用され、例えば依然としてＨｒＶ陰性のハイリスクグループの人々に一定の間隔で抗体調製物を用いて治療することにより、慢性ＨＩＶ感染の定着を阻害できる本発明の抗体は、感染した人々にＭＮ変異株が広く分配されるために、生物学的な試料内のＨＩＶの検出、血液供給物のスクリーニング、およびもしかすると高いパーセンテージのＨＩＶ感染患者の治療に有用である。

本発明の広範囲に中和する抗体は、ＩｖｆＮまたはＭＮ変異株の両方および通常のエピトープ配列を含むＨＩＶ株をｒＡＭａするため特に上記の応用に有用である。

本発明の他の特徴および利点は、以下のその好ましい態様の記述および請求項により明らかにされる。

好ましい態様の詳細な説明図面の簡単な説明する。

図１は、ヒトモノクローナル抗体（ＨＭａｂ）と２株のＨＩＶ−１との反応性を示す、ウェスタンプロット分析である。

図２は、４つのＨＭａｂと別のＨＩＶ株のｇｐ１２０との反応性を示すドツトプロットである。

図３は、図２の２つの抗体、Ｘ２４−３ｂおよびＮ７Ｏ−２３゜ａと９株のＨＩＶ−１のＣｏｎ−Ａ固定化ｇｐ１２０とのＥＬＩＳＡ反応性を示すグラフである。

図４は、Ｎ７Ｏ−２３，ａ、Ｎ７Ｏ−１５，ｅ、Ｎ７ＣＬ−１９，ｂ　ＨＭａｂと９株のＨＩＶ−１のＣｏｎ−Ａ固定化ｇｐ１２０とのＥＬＩＳＡ反応性を示すグラフである。

図５は、Ｘ２４−３ｂおよびＮ７Ｏ−２３，ａ　ＨＭａｂと８株のＨＩＶ−１との反応性を示す、ウェスタンプロット分析である。

我々は以下に本発明の抗体の製造法および使用法を記述する。

免長原Ω製造汰本発明の抗体を生成するために使用される免疫源は合成ペプチド、蛋白質断片、ＭＮプロトタイプまたはＭＮ変異株のｇｐ１６０ポリペプチドであり得、または大多数のＨＩＶ株に共通のＭＮプロトタイプ配列に準じた配列を含む。免疫するペプチド、ポリペプチド、または蛋白質は少なくとも８、より好ましくは少なくとも１７の長さのアミノ酸がよく、上記の同定されたｇｐ１２０内のＭＮプロトタイプ中和ドメインに準じた配列と１００％相同な５以上のアミノ酸配列を含むかまたは中心の５つのアミノ酸が１００％相同でその周りのアミノ酸が少なくとも３６％相同なアミノ酸配列がより好ましい。本発明の広範囲に中和する抗体を生成するために使用される免疫源は中心の６つのアミノ酸がＧ−Ｐ−Ｇ−Ｒ−Ａ −Ｆまたはｒ−Ｇ−Ｐ−Ｇ−Ｒ−Ａであるアミノ酸でもよい。

免疫するペプチド、ポリペプチド、または蛋白質は直鎖状で、別法としてＰＮＤ配列の末端のシスティン残基間でジスルフィド結合を形成することにより閉環ループ内に形成される、−次中和ドメイン部分を含む。免疫するペプチドがひとつより多くのＰＮＤを含むのならば、各々はジスルフィド結合により別々にループを形成する。

ＨＩＶ−ＭＮウィルスプロトタイプまたはＭＮウィルス変異株のｇｐ１６０−次中和ドメインのアミノ酸配列を完全に含むか、または配列Ｇ−Ｐ−Ｇ−Ｒ−Ａ− Ｆまたはｒ−Ｇ−Ｐ−Ｇ−Ｒ−Ａを含む合成ペプチドは、自動ペプチド合成機を使用して自動化されたペプチド合成により合成された。さらに、完全なエンベロープポリペプチドはバキュロウィルスの発現系を使用して昆虫細胞において生産され、そして１９８７年８月３１日出願のルッシエ（Ｒｕｓｃｈｅ）ら、Ｕ。

Ｓ、Ｓ、　Ｎ、０９１．　４８１　（本願発明と同じ承継人であり、その記載は引用により本明細書の一部をなす）に記述されているとおりに精製された。ＦＢＩと示された（ピュートニ−（ＰＩ、Ｉ　ｔ　ｎ　ｅ　ｙ）　ら、１９８６，５ｃｉｅｎｃｅ　２３４：１３９２）、−次中和ドメインのアミノ酸配列を含む１８０アミノ酸の蛋白質断片は、Ｕ、Ｓ、Ｓ、Ｎ、１０７，７０３　（１９８７年１０月９日出願、本願発明と同じ承継人であり、その記載は引用により本明細書の一部をなす）に記述されているとおりに、完全長の且ユヱ遺伝子をＰｖｕＩＩおよびＢｇｌｌｌで切断することにより生成された約５４０ｂｐのＤＮＡ断片から発現された。免疫源として使用された合成ペプチドまたは蛋白質断片は、以下のとおり、サクシニルマレイミドメチルシクロヘキサニルカルボキシレート（ＳＭＣＣ）を化合因子として使用して、免疫原性キャリアー、例えばキーホールリンベットへマドシアニン（ＫＬＨ）またはオバルミンと化合してもよい（ヨシタケ（Ｙｏｓｈｉｔａｋｅ）ら、１９８２．Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、、９２：１４１３−１４２４）。

簡単に言えば、５０μｌのジメチルホルムアミドに溶解した１ｍｇのＳＭＣＣを６ｍｇのキャリアー（０，ＬＭ　ＮａＰＯ，、ｐＨ６，５に１０−２０ｍｇ／ｍ１の濃度で）に加え、室温において０．５時間インキュベートした。溶液をセファデックスＧ−２５カラムに通すことにより、過剰の未反応のＳＭＣＣを除去し、そして２ｍｇのペプチドを加えた（脱気した０、ＬＭ　ＮａＰＯ４，ｐＨ８，１ｍＭ　ＥＤＴＡに１０ｍｇ／ｍｌの濃度で懸濁した）。溶液を窒素ガスと混合し、そして４℃において一部インキユベートした。沈殿が溶解するまで試料を６Ｍ尿素、Ｏ，ＬＭ　ＮａＰＯ，、ｐＨ７に対して透析し、そして６Ｍ尿素、Ｏ、ＩＭ　ＮａＰＯ，で平衡化したバイオミルＰ−４０カラムにより溶出した。溶出した蛋白質を集め、そして蒸留水に対して透析した。

ＲＰ１４２．ＲＰ７０．ＲＰ３４２．ＲＰｌｏｏ、ＲＰ１０２．ＲＰ１０８゜ＲＰ１２３ｃおよびＲＰ１７４ｃと名付けられたこれら免疫源の多くは、表３に示すとおりｇｐ１２０のループ領域の中和ドメインに準じたアミノ酸配列をもつペプチドＲＰ７０．ＲＰ１２３ｃ、およびＲＰ１７４ｃは該アミノ酸の末端近辺の２つのシスティン残基間のジスルフィド結合の形成により、閉環ループになる。

そのような結合の形成法はザング（Ｚ　ｈ　ａ　ｎ　ｇ）ら（１９８８，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２７：３７８５−３７９４）により記述されている。

ペプチドは標準的な技術により、フロイント完全アジュバント内で乳化することにより免疫化のために製造された（ＣＦＡ、Ｄｉｆｃｏ　Ｌａｂｓ、Ｇｒａｎｄ　ｌ５ｌａｎｄ、ＮＹ）。

ヒト塩　のＭＮ　的モノクローナル　の１″マウスの株（Ｂａ　Ｉｂ／ｃ、Ｃ５７ＢＬ／６．Ａ、ＳＷ、ＢＩＯ，ＢＲ，またはＢＩＯ，Ａ、Ｊａｃｋｓｏｎ　Ｌａｂｓ、、Ｂａｒ　Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ）を上述のペプチドのうちのひとつにより、マウスあたり１０−５０μｇの濃度で、腹腔内で免疫した。該マウスに対して、フロイント不完全アジュバントの乳化または可溶性の形のいずれかで、最初の免疫から２〜４週間後に２〜３回、免疫源の追加免疫を行った。該マウスから採血し、血清について免疫源と反応性のある抗体の存在をアッセイした。強い免疫的応答を示すマウスは３−５日後に追加免疫され、これらのマウスの牌臓細胞をコーラ−（Ｋｏｈｌｅｒ）およびミルスタイン（Ｍｉ　ｌ５ｔｅｉｎ）、Ｎａｔｕｒｅ　（１９７５）２５６：４９５の方法に基づいた標準的な方法により、重鎮と軽鎖イムノグロブリン鎖を分泌できる、Ｎ５−１　（Ａ、Ｔ、Ｃ，Ｃ，Ｎｏ、ＴｌＢ１８）　、５Ｐ２−０　（Ａ、Ｔ、Ｃ，Ｃ。

Ｎｏ、ＣＲＬ８２８７．ＣＲＬ８００６）　、またはＰ３．Ｘ６３．ＡＣ３，６５３ミエローマ細胞と融合させた（キア＝−（Ｋｅａ　ｒｎｅｙ）ら、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｔ、、１９７９，１２３：１５４８）。

融合後６−２１日目に現れたハイブリトーマの上清について、表３に示したひとつまたはそれ以上のペプチドと反応する抗体の生産を、以下に示すＥＬＩＳＡスクリーニング分析によりスクリーニングした。

９６ウエルのコスタ−（Ｃｏｓｔａｒ）平底マイクロタイタープレートの各プレートに、ペプチドを含むＰＢＳ溶液の５０Ａｔ＋アリコートを入れ、各ウェルの最終濃度が０．１−１０Ｍｇ／ｍｌになるようにしてペプチドをコートした。ペプチド溶液を吸引し、そしてＰＢＳ＋０．５％ＢＳＡで置換した。インキュベート後、ウェルを吸引し、洗浄し、そしてハイブリドーマの上清を加えた。インキュベート後、ウェルを３回ＰＢＳで洗浄し、そして羊抗マウスイムノグロブリンをセイヨウワサビ（Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ）パーオキシダーゼ（ＨＲＰ、ｚｙｍｅｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｓａｎ　Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）と化合した特定の希釈液５０μｌとインキュベートした。ウェルを再びＰＢＳで３回洗浄し、そして５０μｍの１ｍＭ　ＡＢＴＳ　（０，１Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ４，２に溶解し３０％Ｈｘ　Ｏ２を加えることにより１：１０００に希釈した、２．２　アジノービス（３−エチルベンズチアゾリン−６−スルフォン酸））をＨＲＰの基質として加えて、抗体の結合を検出した。そしてＡＢＴＳ試料の０Ｄ４１０をグイナテック（Ｄｙｎａｔｅｃｈ）分光光度計自動読み取り機（バージニア（Ｖｉｒｇｉｎｉａ））により測定した。

ＥＬＩＳＡ法により陽性と判定されたハイブリドーマについて、以下のようにして融合形成の阻害をアッセイした。通常、興味あるＨＩＶ株のエンベロープ遺伝子を発現する組換え体ワクシニアウィルス（例えば、ｖ　ａ　ｃ−ｅ　ｎ　ＣＭＮ）を使用してＣＤ４＋ヒトＴ−リンパ腫ラインＣＥＭ　（Ａ、　Ｔ、　Ｃ，Ｃ，寄託番号ＣＣＬ１１９）細胞に感染させ、そしてハイブリドーマの上清を該細胞に加えることにより、モノクロ−カル抗体によるＨＴｖエンベロープを介した細胞融合の妨害をスクリーニングした。

え　ワクシニアウィルス　ＨＩＶエンヘローフヲコード　るベクターのワクシニアウィルスプロモーターから完全長のＨＩＶエンベロープ遺伝子を発現できる組換え体ワクシニアウィルスの構築は欧州特許第０　２４３　０２９号に記述されておりその内容は引用により本明細書の一部をなす。二次ワクシニアウィルスプロモーターから発現されるＨＩＶｅｎｖ遺伝子および大腸画工ａｃＺ遺伝子、およびチミジンキナーゼ（Ｔ　Ｋ）をコードする、ワクシニアウィルスの周辺配列を含む組換え体ベクターｐＳＣ２５を使用して組換え体ウィルスを製造した。

本発明の目的のために、ＨＩＶ−ＭＮ変異株に特異性を有するエンベロープ遺伝子をコードするＤＮＡを含む組換え体ベクターを構築することが必要であった。

このために、ｐＳＣ２５の一次中和ドメインの領域を含むＨＩＶ−ＩＩｌ、ｅユヱ遺伝子から５７０ｂｐのＢｇｌＩＩ断片（１８０アミノ酸をコードする）を除去し、そしてＨＩＶ−ＭＮｅｎヱ遺伝子由来の、対応するＢｇｌｌＩ断片でそれを置換した。その結果得られたプラスミドｐｓｃＲ２５０２はエンベロープ蛋白質をコードする雑種エンベロープ遺伝子を含み、該蛋白質はＭＮウィルスの一次中和ドメインとＨＩＶ−Ｉ　Ｉ　１．エンベロープの！１二遺伝子配列を有した。

ＨＩＶ−ＭＮｇｐ１６０の同じ領域を前述の１８０アミノ酸に置き換えて使用できる。例えば、３６アミノ酸の一次中和ドメインをコードするＤＮＡを対応するＩ　Ｉ　１．ＤＮＡ配列に代えてエンベロープをコードするＤＮＡに挿入でき、またすべてのＨＩＶｅｎｖ遺伝子由来のＰＮＤを他のすべての変異株のＰＮＤで置き換えられる。別法として、完全なＨＩＶ−ＭＮｅｎｖ遺伝子を含む組換え体を使用できる。多目的な、ＨＩＶエンベロープを発現する株は、抗体が広範囲な中和活性を有するかどうかを決定するのに有用である。

組換え体ベクターｐＳＣＲ２５ｏ２で、完全なＴＫ遺伝子を含むワクシニアウィルスを予め感染させたＣＶ−１宿主細胞をトランスフェクションした。ＨＩＶエンベロープ遺伝子はベクター上のＴＫ配列とウィルスゲノム内のＴＫ配列との間の相同組換えによりウィルスＤＮＡに挿入された。ＨＩＶエンベロープ遺伝子を含む組換え体はＴＫ−細胞に感染させ、そしてブロモデオキシウリジン（ＢＵｄＲ）およびＸ−ｇａｌを含む培地にプレートすることにより選択された。ＢＵｄＲはＴＫゝ細胞に有毒であるために、ＴＫ−組換え体の選択に使用され、Ｘ−ｇａｌは青いプラークの生産をもたらす上ｌ仝Ｚ遺伝子産物により分解される色原体であり、±ａｃＺ遺伝子が発現されることにより、ＨＩＶ−ｅユヱ遺伝子も含む組換え体ウィルスか同定される。

且旦ヱ遺伝子を発現する組換え体ウィルスを使用してＣＤ４＋細胞に感染させた。これら細胞の表面上に存在するＨＩＶエンベロープ蛋白質はＣＤ４の細胞表面リセブターに結合することにより細胞融合し、そして融合細胞と呼ばれる巨大多核細胞を形成する。

融合細胞の形成は連続に希釈したハイブリドーマ上清または精製されたモノクローナル抗体の存在下または非存在下においてアッセイされた。形成された融合細胞の数は２４時間後の感染において定量された。陽性のハイブリドーマ上清、即ち中和活性を有する上清は少なくとも９０％融合の形成を阻害するものとして規定された。

ペプチド結合（ＥＬＩＳＡアッセイ）および中和活性（融合の形成の阻害）の両方に関して陽性と判定されたハイブリドーマを限定希釈法によりサブクローン化した。ハイブリドーマ細胞および免疫化していない同系マウスの照射した牌臓細胞（立方あたりの最終濃度はそれぞれ５細胞、および２．５Ｘ１０’細胞）を混合し、そして混合された懸濁液２００μｍをマイクロタイターウェルにプレートすることにより、ウェルあたり１ハイブリドーマ細胞になるようにした。７−１４日後に現れたサブクローンを再び上述のＥＬ　Ｉ　ＳＡ法によりアッセイした。

個々の陽性サブクローンをもう一部サブクローンした。

ハイブリドーマを分泌する多くの陽性モノクローナル抗体が得られた。抗体のアイソタイプは、５つの主要マウスイムノグロブリンアイソタイプ（ＩｇＭ、ＩｇＧ１．ＩｇＧ２Ａ、ＩｇＧ２Ｂおよび１ｇＧ３）それぞれに対応する羊抗マウスＨＲＰ調製物を使用してＥＬ　Ｔ　ＳＡ法により決定された。

モノクローナル几　の声６および　Ｉ精製された抗体は、ＥＬＩ　ＳＡおよび融合阻害により再度陽性と判定されたハイブリドーマをブリステンープライムド（ｐｒｉｓｔａｎｅ−ｐｒｉｍｅｄ）同系マウスの腹腔内に注射することにより調製した。発達した腹水を注射後２から３週間後に回収し、そしてモノクローナル抗体を以下のように抗体のアイソタイプに依存した方法により精製した。溶出後、すべてのＩｇＧ抗体をＰＢＳに対して透析した。

ＩｇＭ抗体は対応するハイブリドーマ細胞を注射したマウスの腹水を５０％ＮＨ２Ｓ○４で沈殿させることにより精製し、そして沈殿物を４ｘＰＢＳに対して透析した。そして透析した抗体を４ｘＰＢＳにより平衡化したウルトロゲル（Ｕｌ　ｔ　ｒｏｇｅ　Ｉ）Ａ−６カラム（バイオテクニクス（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｃｓ）社、Ｖｉ　ｌ　Ｉｅｎｅｕｖｅ−Ｌａ−Ｇａｒｅｎｎｅ、　フランス）に通した。抗体を含む画分をＥＬＩＳＡにより同定した。

Ｉ　ｇＧ１抗体を含む腹水をＯ，ＩＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、３Ｍ　ＮａＣｌ、ｐＨ８，９により４倍に希釈し、そして同じＴｒｉｓ−ＮａＣ１緩衝液により平衡化したプロティンＡアフィニティ力ラムを通して単離した。抗体は０．ＩＭ　クエン酸ナトリウム、ｐＨ６，０により溶出した。

ＩｇＧ２抗体を含む複水をＰＢＳにより２倍に希釈し、そしてＰＢＳにより平衡化したプロティンＡアフィニティカラムに結合させた。そして０．１５ＭＮａｃｌ、Ｏ，１Ｍ酢酸、ｐＨ３，０を用いてカラムから溶出した。溶出後、１ＭＮａ２ＨＣＯｓにより抗体をすぐに中和した。

Ｉ　ｇＧ３抗体を含む腹水をＯ，ＬＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、３Ｍ　ＮａＣｌ、ｐＨ８，９により４倍に希釈し、プロティンＡアフィニティカラムを通し、そして０．１５Ｍ　ＮａＣ１，Ｏ，１Ｍ酢酸を用いてプロティンＡカラムか、ら溶出した別法として、すべてのＩｇＧサブクラスを以下の方法により精製できる。腹水を０．ＬＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、３Ｍ　ＮａＣ１，ｐＨ８，９により２倍に希釈し、プロティンＡセファロースアフィニティ力ラムを通し、そして０．１５ＭＮａＣ１，Ｏ，１Ｍ酢酸を用いて溶出した。

精製襄れム仄体二投盈モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体について、結合特異性およびＨＩＶで誘導された融合細胞の妨害における能力およびＨＩＶ感染能力に関する特徴を明らかにした。抗体の潜在的な治癒値は最初に生化学的（即ち結合）アッセイおよび生物学的（即ちウィルスの中和）アッセイの組み合わせにより決定し、その結果から抗体調製物の能力および特異性が示される。

持金里位Ωヱエ旦乞グ本発明の抗体の結合部位は標準のＥＬＩＳＡアッセイ（上述）、競合ＥＬＩＳＡアッセイ、および上述のペプチドを使用した競合融合阻害アッセイにより決定された。３つのグループのペプチド、即ち：（１）さまざまなＨＩＶ変異株のＰＮＤ配列の２４マーまたは２５マーのシリーズ（表５）。

（２）ＭＮの置換体のシリーズであるが、ＭＮ　ＰＮＤチップ配列（Ｃ）−に− Ｒ−Ｉ−Ｈ−Ｉ−Ｇ−Ｐ−Ｇ−Ｒ−Ａ−Ｆ−Ｙ−Ｔ−Ｔ−（Ｃ）に対応する１２マーのシリーズで、各々はアミノ酸の一つをアラニン残基で置換され、最初がアルギニン（Ｒ）で始まり、チロシン（Ｙ）で終わる（表６）。（自然に生じるアラニンはグリシノにより置換された。）ＭＮ配列内に含まれるエピトープの抗体の認識は、アラニンで置換されたペプチドに対して抗体が結合できなくなることにより明らかにされ、アラニンの置換により結合関係が壊された；そして（３）ＰＮＤループのチップにおいて頻繁に生じる配列に対応したペプチドのシリーズ（表７）を使用した。

競合ＥＬＩＳＡアッセイは標準のＥＬＩＳＡアッセイに以下の修飾をして実施された。抗体をプレートにぬる前に、抗体調製物を１０μＭから０．００４５μＭの濃度の上記グループの試験ペプチドと共にインキュベートした。試験ペプチドが抗体への結合に関して固定化免疫源と競合するならば、抗体がプレートにほとんど結合しないかまたは全ぐ結合しないことがＥＬ　Ｉ　ＳＡにより明らかにされる。

の力　と　性の　定本発明の抗体の力価または相対中和活性は、三種の生物学的測定法で決定した。

第一に、組換えワクチニアウイルスンンンチウムアッセイは、巨大細胞形成を９０％抑制する抗体のエンドポイントの濃度を測定する。サンプルを含む抗体を連続希釈し、各希釈物を融合抑制活性の試験に用いる。サンプルの力価は、シンシチウムの形成が少なくとも９０％抑制される濃度として表される。

さらに、上記の標準的シンシチウム抑制アッセイを次のように改変した、競合ジンシチウム抑制アッセイを行った。ｇｐ１６０を発現するＣＤ４″″細胞のカルチャーに抗体を添加する前に、抗体を被検ペプチドと１００−０．１μｇ／ｍｌの濃度範囲で混合した。もし被検ペプチドか中和抗体との結合に関して細胞の表面のｇｌ）１６０エピトープと競合すれば、シンジチアが形成されるであろう。

逆に、被検ペプチドが中和抗体との結合に関して細胞表面のエピトープと競合しなければ、シンジチアの形成は抑制されるであろう。このアッセイは、実際にウィルスの単離物を用いることなしに、生物学的活性を阻止するウィルスポリペプチド配列の検索を可能にする。

第二の生物学的測定は、ＨＩＶ中和アッセイである。抗体の希釈物をＨＩＶとインキュベートし、ＨＩＶに感受性のＣＤ４＋細胞に添加する。ウィルス蛋白質の製造を９０％減少させる抗体希釈率がエンドポイント希釈率と定義される。このアッセイに関する概略はロベイ（Ｒｏｂｅｙ）ら、１９８６．Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、８３ニア０３２．およびロバートーグロフ（Ｒｏｂｅｒｔ−Ｇｕｒｏｆｆ）、１９８５．Ｎａｔｕｒｅ、３１６：７２に記載されている。

第三の生物学的測定は、感染性減少アッセイ（Ｉｎｆｅｃｔｊｖｊｔｙ　Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ　Ａｓ５ａｙ：　ＩＲＡ）であり、これは標準希釈の抗体の存在および不存在下の組織培養中で、感染性のウィルス量の差を測定する。抗体の力価は、トータルウィルスタイターの減少の量により測定される。このアッセイにおいては、上記標準血清中和アッセイとは対照的に、細胞分裂およびウィルス複製を促進するＩＲＡアッセイ条件のため、１０感染単位の１００％阻止は高度に有意である。

ネズミ　モノクローナル几　の５足拭体調製物を同定するためのステップは表８に示す。表８には上記アッセイも記載されている。表３は免疫源として用いられた、またはスクリーニング試薬として用いられたペプチドの例を示す。以下の実施例は、ネズミおよびヒトＨＩＶ中和抗体ならびに広範な中和を示す特異的抗体の同定を記載する。

Ｐ２Ｈ４の　１および合、性マウスへのＲＰ１４２ペプチドの免疫により、Ｐ２Ｈ４（またはＦ　４／Ｐ　７　Ｅ４）と命名されたハイブリトーマクローンが得られた。

抗−ＲＰ１１２　１ｇＭ抗体を生産するＰ７Ｅ４クローンをＢａ１ｂ／ｃマウスの腹腔内投与により増殖させた。マウスから腹水を回収し、そして上記の様にしてゲル濾過クロマトグラフィーにより精製した。

この精製Ｐ７Ｅ４抗体を、ＥＬＩＳＡによりＭＮ　（ＲＰ１４２．ＲＰ７０．ＲＰ３４２）、ＩＩＩＢ　（ＲＰ１３５）およびＲＦ　（ＲＰ３３９）変異体からのループ含有ペプチド配列との結合について試験した（表９）。Ｐ２Ｈ４は試験した全部のペプチドと結合可能であった。

ＭＮ変異体のエンベロープを発現する組換えワクシニアウィルスに基づくシンシチウム抑制アッセイにおいて、観察された中和活性はタイプに特異的であった（表１０）。ＣＥＭ細胞は、ＩＩＩＢ、、ＲＦまたはＭＮ変異体のいずれかの主中和ドメインを有するエンベロープを発現する組換えワクシニアウィルスで感染された。モノクローナル抗体Ｐ７Ｅ４またはＦＥＩ１５Ｃ５（ＲＰ１３５に結合し、モしてＨＩＶのＩＩＩＢ変異体を中和するネズミＩｇＧ２ａ）は、培養の開始時に添加した。各ウェルのシンシチウムの数は２４時間後に測定した。結果は、抗体の存在下に生じたシンシチウムの数／抗体の不在下に生じたシンシチウムの数として表される。

モノクローナル　の　１および　Ａ、ＭＮ　ロモノクローナル以下の融合物（Ｆ３１、Ｆ２Ｏ、Ｆ５２、Ｆ１ａ）において、マウスへのＲＰ７０ペプチドの免疫により、ＭＮ特異的なＦ３１／Ｐ２Ｂ１０．、Ｆ５０／Ｐ８Ｄ１０、Ｆ５２／Ｐ７Ｆ１２、Ｆ５２／Ｐ８Ｃ９、Ｆ５２／Ｐ７Ｂ９、Ｆ　５２／Ｐ５Ｅ９、Ｆ５２／Ｐ６Ｅ９、Ｆ５２／Ｐ８Ｇ１ｏおよびＦ５２／Ｐ８Ｆ１１と命名されたハイブリドーマが得られた。

抗−ＲＰ７０　ＩｇＧ２ａ抗体を生産したクローンをヌードマウスへの腹腔内注射で増殖させた。腹水を集め、上記のようにしてゲル濾過クロマトグラフィーで抗体を精製した。

Ｆ３１、Ｆ２ＯおよびＦ５２融合物から単離したＭＮ中和抗体に関して、結合特異性をアッセイした。表１１に示す結果は、これらＭＮ抗体がＭＮループの左側、即ちＲ−Ｉ−Ｈ−Ｉ−Ｇ配列に特異性を有したことを示す。

組換えワクシニアウィルスがＮＭ変異体のエンベロープ（ｖ　ａ　ｃ−ｅ　ｎ　ｖＭＮ）を発現することに基づくシンシチウム抑制アッセイにおいては、全ての抗体は０．５μｇ／ｍｌまたはそれ以下の濃度でンンシチウムの形成を阻害できた。

さらなる融合は、Ｃ５７／ＢＬ６マウスをＫＬＨにコンジュゲートさせた線状ペプチドで免疫した後行った。Ｆ　５４／Ｐ　５　Ｆ　４およびＦ５６／Ｐ６Ｇ４と命名したハイブリドーマクローンは、それぞれＲＰ１０８−ＫＬＨおよびＲＰｌｏｏ−ＫＬＨの免疫で得られた。さらに、Ｆ　６０／Ｐ　５　Ｃ２と命名されたハイブリド−たクローンは、ＢＡＬＢ／ＣマウスをＲＰｌｏｏ−ＫＬ）（で免疫して得られた。これらのクローンにより生産される抗体について、ＥＬＩ　ＳＡによるＭＮ特異性およびｖａｃ−ｅｎｖアッセイでのシンシチウム抑制について試験した。これら抗体の各々により認識されるＰＮＤエピトープの地図を、前記のようにして作製した。抗体Ｆ　５４／Ｐ　５　Ｆ　４はＨ−１−Ｇ−Ｐ−Ｇ −Ｒ−Ａ−Ｆ−Ｙを認識し、Ｆ５６／Ｐ６Ｇ４はＨ−Ｅ−Ｇ−Ｐ−Ｇ−Ｒ−Ａを認識し；そり、てＦ６０／Ｐ５Ｃ２はＩ−Ｈ−Ｉ−Ｇ−Ｐ−Ｇ−Ｒを認識する。

広堺虫租仄体融合物Ｆ５８、Ｆ５９およびＦ６４は、Ｂ　Ｌ　Ａ　Ｂ／Ｃマウスへ閉じたループの免疫源ＲＰ７０を免疫して得られ、そしてＦ１ａはＣ５７Ｂ１／６マウスヘＲＰ１０２−ＫＬＨを免疫して得られた。Ｆ５９／Ｐ７Ｅ３．Ｆ５９／Ｐ５Ｂ３．Ｆ６４／Ｐ６Ｇ５　（６４，１０）およびＦ５３／Ｐ７Ｃ４（５３，４）、と命名された抗体は、広域中和性の抗体の能力をもつことが判明した。これらの抗体のうちの二つＦ　５９／Ｐ　７　Ｅ　３およびＦ５９／Ｐ５Ｂ３は、ＰＮＤループの先端の右側の配列に相当するアミノ酸配列を有するペプチドであるＲＰ１０８に対する、顕著なＥＬＩＳＡタイターを示した。Ｆ　５９／Ｐ　７　Ｅ　３およびＦ５９／Ｐ５Ｂ３抗体への結合に関してＲＰ７０と競合する能力を持ったアラニン−置換ペプチドは、Ｇ−Ｐ−Ｇ−Ｒ−Ａ−Ｆ配列内にアラニン置換を有しなかった。同様に、Ｇ−Ｐ−Ｇ−Ｒ−Ａ−Ｆ配列を有したペプチドは、Ｆ５９／Ｐ７Ｅ３またはＦ５９／Ｐ　５　Ｂ　３抗体への結合に関してＲＰ７０と競合する能力を有したが、この配列（即ち、ＲＰ１２９およびＲＰ１７５）を含まないものは競合不可能であった。

これらの結果は、Ｆ　５９／Ｐ　７　Ｅ　３およびＦ５９／Ｐ５Ｂ３抗体が、Ｇ −Ｐ−Ｇ〜Ｒ−Ａ−Ｆエピトープを認識することを示唆する。この配列を広範なＨＩＶ変異体中に存在する。Ｆ６４抗体は不連続（ｎｏｎ−ｃｏｎｔ　ｉｇｕｏｕｓ）な、ｒ−Ａ’−Ａ７−Ｇ−Ｐ−Ｇ−Ｒエピトープを認識し、そしてＩＩＩＢおよびＭＮ株を中和する。Ｆ５３．４抗体はＴ−Ｇ−Ｐ−Ｇ−Ｒ−Ａ−Ｆエピトープを認識し、そしてＭＮおよびＷＭＪ株を中和する。共通配列を認識する抗 −ＨＩＶ抗体は、広域中和能力をもつ可能性がより大きい。本発明の抗体の中和の範囲は、ＭＮ株および他のいくつかのＨＩＶ株を用いたシンシチウム抑制アッセイによって試験することができる。

Ｆ５９／Ｐ７Ｅ３およびＦ５９／Ｐ５Ｂ３抗体は、前記の組換えワクシニアウイルスシンシチウム抑制アッセイにより広域中和能力について試験され、モしてＩＩｌ、、ＭＮまたはＷＭＪ２エンベロープを発現する組換えワクシニア〔６−’ Ｈ）６Ｒ−ＢＩ３を中和する能力を持つことが示された（表１２）。さらに、これらのモノクローナル抗体はＨＩＶ感染性減少アッセイによって試験され、ＨＩＶ変異体Ｉ　Ｉ　ＩＢ、ＭＮ、ＳＦ２、およびＷＭＪ２のタイターを減少させた。

本発明の抗体が、ＭＮプロトタイプ配列（もしくはＭＮ変異体配列）をもつウィルスおよびＧ−Ｐ−Ｇ−Ｒ−Ａ−Ｆを含有するＨＩＶ株を中和できることは、広域中和活性の証明である。この結合および中和バタンをもつ他のモノクローナル抗体は、Ｆ６４．８、Ｆ６４．９およびＦ６４．１０である。（表１３（ａおよびｂ）はこれらのモノクローナル抗体を生産する細胞ラインの現在および過去の名称の検索キーである）本発明の抗体のもう一つの特異性は、エピトープＩ−Ｇ−Ｐ−Ｇ−Ｒ−Ａに向けられている。これらの抗体はＧ−Ｐ−Ｇ−Ｒ−Ａ−Ｆ−に向けられた抗体に比べて若干大きい百分率のＨＩＶ単離物に結合して中和すると期待される（表２を参照）。本発明者らは、抗体Ｆ５３．４を単離同定し、この抗体は配列Ｉ　−Ｇ− Ｐ−Ｇ−Ｒ−Ａに結合する抗体に期待される結合および中和特性を示した（表１２）。この抗体タイプの一つの特徴的性質は、Ｒ−Ｇ−Ｐ−Ｇ−Ｒ−Ａ配列を含むＨＩＶ−ＩＩｌ、単離物を中和する能力を持たないことである。

したがって、本発明者らは二つの最も頻繁に生じるＨＩＶの主中和ドメインのヘキサマーエピトープ（試験した単離物中に６４％の頻度で出現するＩ　−Ｇ−Ｐ −Ｇ−Ｒ−Ａ、および６０％の頻度で出現するＧ−Ｐ−Ｇ−Ｒ−Ａ−Ｆ）に対する抗体を突き止めて同定した。これらの特性は、これらの抗体がＨＩＶ感染の予防および／または治療のための医療用途に適することを意味する。

ＨＩＶ、、を中和するヒトモノクローナル抗体を生産する細胞ラインＮ７Ｏ−１９、ｂ　（ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ１０２９０）は、ルイジアナ州立医科大学のジ工−ムズ　Ｅ　ロビンソン博士から入手した。ロビンソン博士の方法は、ＨＩＶ感染に無症状であるがＦ（ｒＶ−１−陽性血清のヒト患者からリンパ球を単離し、この細胞をエプスタインパールウィルス（ＥＢＶ）で形質転換して不滅化し、そしてｇｐ１２０特異性に対する初期スクリーニングを含んだ。次に本発明者らは、生じたリンパ芽球細胞ラインの抗−ＨＩＶ、、抗体生産をスクリーニングした。

ヒトリンパ　のンＨＩＶ−１感染患者からの末梢血Ｂ細胞は、それらのＥＢＶ形質転換に対する感受性が大きく変動することが知られている（ゴルニー（Ｇｏｒｎｙ）ら、１９８９、前記；ヤルコウン（Ｙａｒｃｈｏａｎ）ら、Ｊ、Ｃｌ１ｎ、Ｉｎｖｅｓｔ、、１９８６，７８：４３９−４４７）。一般に、免疫機能がひどく損なわれ、ＣＤ４細胞数が比較的少ない患者のＢ細胞は最も形質転換に抵抗性であるのに対して、無症状でＣＤ４細胞数が比較的高い患者のＢ細胞はより容易に形質転換される傾向がある。しかしながら、外見上健康な無症状の患者の中でも形質転換率は変動し、そのようなグループからのヒトモノクローナル抗体（ＨＭａｂ）の製造の試みの全てが成功したわけではない。

本発明者らは、ＨＩｖＭＮからの主中和ドメインを含むｇｐ１２０エンベロープ蛋白質を用いたＥＬＩ　ＳＡによりＮ７Ｏ−１９，ｂの抗原特異性を決定し、そしてこの抗体のＨＩＶ中和活性をシンシチウム形成の抑制により調べた。Ｎ７Ｏ −１９、ｂにより認識されるエピトープはＮ７０ドナーに感染したウィルス株により発現されると期待される。

ＨＩＶ−ＭＮのＰＤＮを認識し、ＨＴＶのＭＮ変異体を中和できる他のヒトモノクローナル抗体は、）（ＩＶ−１−１１性血清患者からの野外単離されたヒトＢ細胞を形質転換し、そして抗体生産細胞をＨＩＶエ　ｇｐ１６０またはそのＰＮＤ含有断片との結合能またはＨＩ　Ｖ、、感染の中和能でスクリーニングして下記のように見つけることか可能である。

二人の成人ＨＩＶ−１陽性血清の男性患者からの末梢血単球（ＰＢＭＣ）のエプスタインパールウィルス形質転換は、Ｊ、ロビンソン博士により次のようにして行われた。ＰＢＭＣをフィコール−ハイパツク（Ｆ　ｉ　ｃｏ　Ｉ　Ｉ−Ｈｙｐａｑｕｅ）グラジェント上で単離し、間接バンニング法（ウィソッキ（Ｗｙｓｏｃｋｉ）ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、１９８０．７５：２８４４−２８４８）（この方法では０ＫＴ３モノクローナル抗体と反応する細胞を、マウスＴｇＧに対するＦ（ａｂ）２抗体でコートしたベトリ皿に吸着させる）でＣＤ３陽性Ｔ細胞を減少させた。Ｂ細胞が富化された非−吸着細胞に、Ｂ９５−８株のＥＢＶ　（ミラー（Ｍｉ　Ｉ　ｌ　ｅ　ｒ）ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ。

Ｓｅｔ、ＵＳＡ、１９７３，７０：１９０−１９４）を接種し、９６ウエルの組織培養プレートで照射請帯血リンパ球（ＨＵＣＬ）（ウェルあたり１０’細胞）をフィーダー細胞として、ウェルあたり１０３ないし１０’細胞でブレーティングした。カルチャーを、５％ウシ胎児血清（Ｆ　ＣＳ）および低蛋白質含有の血清代替物であるＮｕ　ｔ　ｒ　ｉ　ｄｏｍａ−Ｈｕ　（ベーリンガーーマンハイム）を１％含有するＲＰＭＩ１６４０中に維持した。

生産Ｂ　ラインのヒトモノクローナル抗体生産を困難にする要因は、何方もの小ウェルカルチャーの抗体生産をスクリーニングするための効率的で感度のよいイムノアッセイの入手性である。血清学的テストのための大部分の市販ＥＬＩ　ＳＡキットの基礎となる慣用的ＥＬＩ　ＳＡにおいては、精製されたウィルス抗原はＥＬ　ＩＳＡプレートのウェルに受動的にコートされていた。このアッセイのための抗原の調製は非常に大量のウィルスを生産し、これを精製し、不活性化することを必要とした。

ウィルス精製の工程はｇｐ１２０の顕著な損失を引き起こすおそれがある。したがって、このようなアッセイはｇｐ１２０に対する抗体の検出および他のＨＩＶ抗原に対する抗体の検出においては不十分である。このことが、且ｌ（蛋白質またはｇｐ４１と反応するヒトモノクローナル抗体（バナポー（Ｂａｎａｐｏｕｒ）ら、１９８７、前記；スガノ（Ｓ　ｕ　ｇ　ａ　ｎ　ｏ）ら、１９８８．前記；モロ−（Ｍｏｒｒｏｗ）ら、１９８８．前記：ゴーニーら、１９８８．前記、アマトリ（、Ａｍａｄｏｒｉ）ら、１９８９．前記）が優勢であることの理由の一部であろう。慣用の抗体スクリーニングアッセイを用いて、一つのヒトモノクローナル抗体を次のようにして単離した。

ロビンソン博士の最初の形質転換実験において、ＨＩＶ−１ｇ染提供者からのＴ細胞−減少ＰＢＭＣをＥＢＶに暴露して、照射されたＨＵＣＬフィーダー細胞を含む９６ウエル培養プレートのウェルに１０３細胞づつブレーティングした。

カルチャーの約５０％が４〜Ｓ週間後に形質転換された。次に培養液を用いてＥＬＩＳＡにより固定、不溶化ＨＩＶ−感染Ｈ９細胞と反応するＩｇＧ抗体のスクリーニングを次のように行った。

ＨＩＶ−１感染Ｈ９細胞を、コンカナバリン−Ａ　（Ｃａｎ−Ａ）コートしたアッセイウェルに不溶化し、次に１：１アセトン−メタノールで固定した。ウェルをＲＰＭＩ−１０％ＦＣ３で１時間ブロックした。９６のウェルのカルチャーからの液を、アッセイブレートのウェルに移した。１時間後、ウェルをリン酸緩衝塩類液ＣＰＢＳ）　に０．１％ト！Ｊ　ト：／−Ｘ　１００を加えた液（ＰＢＳ −ＴＸ）で洗浄し、そしてヒトＩｇＧに対するペルオキシダーゼ−結合抗体（Ｐｒｏｔ。

ｓ　Ｌａｂｓ、サンフランシスコ、ＣＡ）と反応させた。１００μｍのテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）−Ｈ２０□を基質として発色させた。反応をＨ，ＳＯ４の添加により終了し、呈色をタイターチック・マルチスキャン・ＥＬＩＳＡ・リーダーで４５０ｎＭの光学濃度として読み取った。

一つの形質転換体のカルチャー（Ｋ２４−３ｂと命名した）が抗体を安定的に生産し、これをさらに試験すると間接イムノフルオレッセンス法で固定および未固定のＨＩＶ−１感染細胞の両者と反応し、しかしながら未感染細胞と反応しなかった。低細胞濃度によりに２４−３ｂ細胞の多数のサブカルチャーを確立したが、約８ケ月後にこれらの増殖は停止した。もとの細胞は比較的低細胞密度でブレーティングされ、そして形質転換の確立は５０％より低かったことから、Ｋ２４ −３ｂ細胞ラインはクローンとして確立された可能性が大きい。

最初に行った慣用ＥＬＩＳＡスクリーニングでは、一つのＨＩＶ特異性ヒトモノクローナル抗体しか得られなかったため、別のＨＩＶ−１−陽性血清患者からのＢ細胞をＥＢＶで形質転換したものをスクリーニングするために、新規イムノアッセイを用いた。このイムノアッセイは、ＨｒＶエンベロープの糖蛋白質はその炭水化物部分を介してＣｏｎ−Ａに結合するという観察（センタニール（Ｍ。

ｎｔａｇｎｉｅｒ）ら、１９８５．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１４４：２８３）に基づく。このイムノアッセイにおいて、血清不含培地中で増殖した感染細胞から放出されたＨＩＶ−１糖蛋白質が、Ｃｏｎ−Ａコートされたアッセイウェルにアフィニティー的に不溶化（ｉｍｍｏｂ　ｉ　Ｉ　ｉ　ｚｅ）されている。この方法は大規模抗体スクリーニングのための、固相糖蛋白質抗原の調製を非常に簡易化する。このアッセイは高度の感度を持ち、ｇｐ１２０に対する抗体の検出に選択的である。

ウィルスは精製の必要がなく、Ｃｏｎ−Ａの不溶化のために十分な量の抗原を得るために、血清不含培地で増殖した少量の細胞が必要なだけである。事実、多くの血清不含ウィルスストックを、抗原活性の減少なく１：２または１：４に希釈でき、したがって２０〜４０の９６ウエルＥＬｒＳＡプレートを調製するために１００μｌという少量の上清ですむ。

第二の実験において、他のＨＩＶ陽性患者からの、ＥＢＶに暴露したＴ細胞−減少処理ＰＢＭＣを、２つの９６ウエルプレート中で、照射ＨＵＣＬとともに１０４細胞／ウエルでシードした。形質転換は１００％のウェルで生じた。その培養液を新規ＥＬＩ　ＳＡにより、血清不含培地中のＭＴ４細胞中で増殖したＨＩＶ −１のＪ６２株由来のＣｏｎ−Ａ不溶化ウィルス糖蛋白質と反応するＩｇＧ抗体の存在に関して、次のようにスクリーニングした。

イムロン−２（Ｉｍｍｕ　ｌ　ｏｎ−２）アッセイプレート（Ｄｙｎａｔｅｃｈ）のウェルをＰＢＳ中で２００８ｇ　／ｍｌのＣａｎ−Ａでコートし、次いで１％ｎｕｔ　ｒ　ｉ　ｄｏｍａ−Ｈｕを強化した血清不含ＲＰＭＩ中で２〜３日増殖したＨＩＶ−１生産性細胞ラインを洗剤で破壊したちの１００μｍとインキュベートした。

このカルチャー液中に存在する破壊されたウィルス糖蛋白質は、血清成分の不存在下で、高感度ＥＬＩＳＡにおける固相抗原として作用するのに十分な量でＣ。

ｎ−Ａに結合する。未反応Ｃｏｎ−Ａ結合部位はＲＰＭＩ−１０％ＦＣ３で１時間ブロックした。コントロール抗原は同様にして未感染ＭＴ４細胞の培養液がら調製した。形質転換されたＢ細胞培養液をアッセイプレートの抗原コートしたウェルおよびコントロールウェルに移し、これらのプレートを室温で１時間インキュベートした。抗体の結合は前記のようにして測定した。このＥＬ　ＩＳＡは後の実験において、ヒトモノクローナル抗体と種々のウィルス株からの糖蛋白質との反応の試験においても用いられた。

１０の形質転換カルチャーが、Ｊ６２糖蛋白質と反応するがコントロール抗原とは反応しないＩｇＧ抗体を生産した。７つのカルチャーは２ケ月未満の間抗体を生産した。それぞれ、Ｎ７Ｏ−２３，ａＳＮ７０−１５．ｅおよびＮ７Ｏ−１９、ｂと命名された三つの細胞ラインは、安定な抗体生産株で、ウェルあたり１０細胞でクローン化した。各ラインのクローンは１０ケ月以上増殖および抗体生産に関して安定であった。

各抗体のＩｇＧサブクラスおよび軽鎖タイプの決定は、慣用的アイソタイプ決定法にしたがって、サンドイッチＥＬＩＳＡにより、四つの重鎮サブクラスに対するネズミモノクローナル抗体（Ｂｅｈｒｉｎｇ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）との反応性またはラムダおよびカッパ軽鎖に対するポリクローナルヤギ抗体との反応性により調べた。四つのヒトモノクローナル抗体の全てがＩｇＧ１サブクラスであり；に２４−３ｂ、Ｎ７Ｏ−１５，ｅ、およびＮ７Ｏ−１９，ｂはカッパ軽鎖をモしてＮ７Ｏ−２３，ａはラムダ軽鎖を有していた。

ウェスタンブロッティングおよびドツトプロットアッセイによるヒトモノクローナル几　の　のロ各ヒトモノクローナル抗体（ＨＭａｂ）の抗原特異性は、ドツトプロットおよびウェスタンプロットを用いて決定した。抗体の最初のスクリーニングにおいて、ロビンソン博士は１２のＨＩＶ−１株を標的抗原として用いた：Ｃ３９，Ｊ６２．５Ａ９０，５Ａ９６．およびＬ８６株は、５人の無症状のＨＩＶ−１感染患者のマイト−ジエンで活性化したＴ細胞を、インターロイキン−２強化培地中で、活性化正常Ｔ細胞と混合培養して単離された；ＳＡ株は同様にエイズ患者から単離されたＨＨｉＴｉ株はラスヒート（Ｒａｓｈｅｅｄ）ら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１９８６，１５４：３９５−４００に記載されている。に３株はＬＡ、ニューオーリンズのツレーン・デルタ・ブライメート・センター（Ｔｕｌａｎｅ　Ｄｅｌｔａ　Ｐｒｉｍａｔｅ　Ｃｅｎｔｅｒ）から入手した。ＨＴＬＶ−Ｉ　Ｉ　ＩＢ　（ポボビック（Ｐｏｐｏｖｉｃ）ら、５ｃｉｅｎｃｅ、１９８４，２２４：４９７−５００）はブ〕トタイプのＨＩＶ−１株であり、ＡＴＣＣＮｏ、ＣＲＬ　８５４３として得られた。ＨＴＬＶ−Ｉ　Ｉ　ＩＭ、（ガロ（Ｇａｌｌｏ）ら、５ｃｉｅｎｃｅ、１９８４，２２４：５００−５０２；ショー（Ｓｈａｗ）　ら、５ｃｉｅｎｃｅ、１９８４，２２６：１１６５−１１７０）；バキュロウィルス−生産組換えＬＡＹ　ｇｐ１２０　（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ、、ケンブリッジ、ＭＡ）、およびＨＩ　Ｖ−ｌ５Ｆ２　（レビー（Ｌｅｖｙ）ら、５ｃｉｅｎｃｅ、１９８４，２２５：８４０−８４２）からのグリコジル化組換えｇｐ１２０は、ＡＩＤＳ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　ａｎｄ　Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　Ｒｅａｇｅｎｔ　Ｐｒｏｇｒａｍから入手した。Ｃ３９，Ｊ６２，５Ａ９６およびＳＡ９０株は、ＭＴ４細胞中で増殖させた（ハラダ（Ｈａｒａｄａ）ら、５ｃｉｅｎｃｅ、１９８５，２２９：５６３−５６６）；ＨＴＬＶ−ＩＩＩＢ、ＨＴＬＶ−Ｉ　Ｉ　Ｔ、、、ＳＡ３．ＨｉＴｉおよびに３は、Ｈ９細胞中で増殖させた。

一つのモノクローナル抗体（Ｋ２４−３ｂ）のＢ細胞ドナーから単離されたし８６株は、連続Ｔ細胞ライン中で増殖しなかったので、マイト−ジエンで活性化した謄帯血Ｔ細胞中で、１００単位／ｕ＋１の組換えＩＬ−２を含む培地を用いて増殖させた。Ｃｏｎ−Ａ不溶化のための抗原の調製のため、各ウィルス株で感染した細胞を、１％Ｎｕ　ｔ　ｒ　ｉ　ｄ　ｏｍａ−Ｈｕで強化した血清不含ＲＰＭＩ培地で２〜３日増殖させた。澄明にした培養液を１％トリトン−Ｘで処理し、そして一定量づつ使用まで−２０”Ｃに保存した。

ウェスターンプロットは次のように行った。１−２ｘｌＯ７ＨｒＶ−１感染細胞の抽出物の調製は、細胞を１％トリトン−Ｘ中で３０分間可溶化し、小型遠心機で遠心分離して不溶性の物質を除去することにより行った。サンプルを還元剤を含まないＳＤＳサンプルバッファーと１＝１混合し９５℃で５分間加熱した。

未感染Ｈ９およびＭＴ４細胞の細胞溶解液も同様に調製した。サンプルをバイオラッドのミニゲル装置により、７．５％５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで、電気泳動分離した。続いて蛋白質をニトロセルロース膜に電気泳動的に移動させた。ウェスタンプロット用のストリップをブロッキングバッファー（１％ＢＳＡ。

０．５％ツイーン２０，０．５ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのトリス、ｐＨ８）でインキュベートし、最初に各抗体と、次いでヒトもしくはヒツジＩｇＧに対するアルカリホスファターゼ−結合抗体と、適宜反応させた。ニトロブルー・テトラゾリウムと５−プロモル４−クロロ−３−インドリル−ホスフェート（ＮＢＴ−ＢＣＩＰ、Ｓｉｇｍａ、セントルイス、ＭＯ）を基質として用い、呈色バンドを生じさせた。ＡＩＤＳ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　ａｎｄ　Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　Ｒｅａｇｅｎｔ　Ｐｒｏｇｒａｍから入手したＨＴＬＶ−Ｉ　Ｉ　ＩＢのｇｐ１２０に対するヒツジ抗血清を、ｇｐ１２０／１６０横１２０めの陽性コントロールとして用いた。

図１は、二つのＨＩＶ−１株であるＨＴＬｖ−工ＩＩＢおよびＪ６２の抗原のウェスタンプロットへの四つのＨＭａｂ反応性を示す。パネルＡおよびＢの各レーン１−５は次のとおりである：レーン１．に２４−３ｂ；レーン２．Ｎ７Ｏ−２３、ａ；レーン３．Ｎ７Ｏ−１５，ｅ；レーン４．Ｎ７Ｏ−１９，ｂ；レーン５、ヒラ’）抗−ＨＴＬＶ−ＩＩＩＢ　ｇｐ１２０゜ＨＴＬＶ−Ｉ　Ｉ　ＩＢを標的抗原とするプロット（パネルＡ）において、ＨＭａｂ　（Ｋ２４−３ｂＳＮ７０−２．３ａ１およびＮ７０−１．５ｅ）が強く反応し、約１２０ｋｄの主要バンドとこれより弱い１６０ｋｄのバンドを示した。このプロットにおいてＮ７Ｏ −１９，ｂはｇｐ１２０と弱く反応する様に見えたが（パネルＡ、レーン４）、他のアッセイにおいてはＨＴＬＶ−Ｉ　Ｉ　ＩＢと全く反応しなかった。Ｊ６２株を標的抗原として調製したプロットにおいては（パネルＢ）、四つのＨＭａｂの全部が１６０ｋｄの主要バンドに同程度の結合を示し、その下に約１２０ｋｄまでに広がる拡散バンドが見られた；これはこの株の特徴的パターンであった。

両株のプロット上のｇｐ１０２に対するポリクローナルヒツジ抗体で得られた染色パターンは、モノクローナルで観察されたものと等しかった（パネルＡおよびＢのレーン５）。ＨＭａｂは未感染ＭＴ４またはＨ９細胞のプロットとは反応しなかった（図示せず）。

これらの結果は、これら四つのＨＭａｂがｇｐ１２０およびその未分解細胞前駆体であるｇｐ１６０と反応することを示した。しかしながら、ある種の市販のＨＩＶ−１ウエスタンプロツトストリツプ中でｇｐ１６０／１２０と同定されるバンドは実際はｇｐ４１のマルチマー（ｍｕ　ｌ　ｔ　ｉｍｅ　ｒ）である可能性（ゾラーバズラ−（Ｚｏ　ｌ　Ｉ　ａ−Ｐａｚｎｅ　ｒ）　ら、Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌ、Ｊ、Ｍｅｄ。

、１９８９，３２０：１２８０）を考慮シテ、組換えＬＡＶ　ｇｐ１２０およびレンズマメレクチンで精製したＪ６２Ｒ蛋白質のプロットを用いて、ｇｐ１２０に対するこれら四つのＨＭａｂの特異性を試験した。

ドツトプロットアッセイのためには、ニトロセルロースのストリップを、バキュロウィルス−生産組換えＬＡＶ　ｇｐ１２０　（１００μｇ／ｍｌ）およびＪ６２エンベロープ糖蛋白質（これは洗剤処理した血清不含培養培地から、センタニール（Ｍｏｎ　ｔ　ａ　ｇｎ　ｉ　ｅ　ｒ）　ら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１９８５，１４４：２８３−２８９のレンズマメレクチンのアフィニティークロマトグラフィーにより部分精製し１０μｇ／ｍｌに濃縮したちの）１μｍでドツト処理した。組換えｇｐ１２０はまた、２−メルカプトエタノールの存在もしくは不存在下で９５℃に５分間加熱した後にもドツト処理した。ドツトプロットストリップ上の抗体のアッセイは、ウェスタンプロットと同様に行ったが、陽性コントロールとしてはＨＴＬＶ−Ｉ　Ｉ　ＩＢのｇｐ１６０に対するヤギ抗血清（ルッシエ（Ｒｕｓｃｈｅ）ら、Ｐｒｏｅ、Ｎａｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、１９８７．８４：６９２４−６９２８）を用いた。

図２に示すように、四つのＨＭａｂのうちの三−）（Ｋ２４−３ｂ、Ｎ７Ｏ−２３、ａおよびＮ７Ｏ−１５，ｅ）は、組換えｇｐ１２０と強力に反応した。Ｎ７Ｏ−１９，ｂはＬＡＶ　ｇｐ１２０とは結合しなかったが、しかしながらＪ６２抗原とは結合した。図２の記号は次の通りである：”ｇｐ１２０　Ｊ６２’″は５６２株の精製ｇｐ１２０であり、−ｒｇｐ１２ＯＬＡＶ”は非−還元組換えＬＡＶ　ｇｐ１２０であり、”　ｒｇｐ１２０還元”ハ還元組換えＬＡＶ　ｇｐ１２０であり、モして”ｒｇｐ１２０加熱”は非還元の加熱ＬＡＶ　ｇｐ１２０である。ドツトに用いたＪ６２抗原の量は組換え抗原に比べて約１０分の１であり、この抗原で観察される染色が弱いのはそのためである。したがって、これらの結果は本発明者らのウェスタンプロットで観察された１２０および１６０ｋｄのバンドが、間違いなくｇｐ１２０／１６０であることを示している。

予備的ウェスタンプロットの試験では、Ｋ２４−３ｂもＮ７Ｏ−２３，ａも、２ −メルカプトエタノールを含有するサンプルバッファー中で加熱した細胞溶解物から調製したプロットと反応せず、同定されたエピトープが還元に感受性であることを示唆した（結果は示さない）。これらのエピトープに対する還元の影響をさらに調べるため、２−メルカプトエタノールの存在もしくは不存在下で９５℃ に加熱した組換えｇｐ１２ＯＬＡＶのドツトプロットで試験した。図２に示す結果は、Ｋ２４−３ｂおよびＮ７Ｏ−１５，ｅは還元抗原に結合せず、Ｎ−７０、２３，ａの還元抗原に対する結合は有意に減少したが、加熱単独では抗原活性をほんのわずか減少させただけであった。Ｎ７Ｏ−１９，ｂはＬＡＶ　ｇｐ１２ｏに結合しなかったので、そのエピトープに対する還元の影響はこの実験では調べられなかった。次にＮ７Ｏ−１９，ｂを還元およζ゛非還元Ｊ６２糖蛋白質のドツトプロットで試験し、還元抗原では反応性は観察されなかった。したがって、四つのＨＭａｂの全ては還元に感受性のエピトープを認識した。

ＥＬＩＳＡによるＨＭａｂの　の各無症状のＢ細胞提供者から単離した多くのウィルス株は、一般に連続細胞ライン中で複製せず（チェングーマイヤー（Ｃｈｅｎｇ−Ｍａｙｅ　ｒ）ら、５ｃｉｅｎｃｅ、１９８８．２４−：８Ｏ−８２）、そしてＩＬ−２依存性の活性化初代Ｔ細胞中または単球中でしか増殖させられないため、間接コーティング法に基づくスクリーニング用イムノアッセイを開発するために十分な量の固相用抗原のの調製が問題である。Ｃｏｎ−Ａ不溶化技術は、大量の精製ウィルス抗原の代わりに少量のウィルスしか必要としないので、この問題に対する可能な解決を提供する。

ロビンソン博士は、ＥＬＩ　ＳＡにより四つのＨＭａｂと異なる四種のＨＩＶ− １株からのＣｏｎ−Ａ不溶化ウィルス糖蛋白質との反応性について調べた。理論的には、Ｃｏｎ−Ａに対するｇｐ１２０の結合は、あるエピトープに対する抗体の接近を阻止できる。しかしながら、ロビンソン博士は、ＣＤ４結合領域または ■３超可変領域と反応することが知られているネズミモノクローナル抗体は、Ｃｏｎ−Ａ不溶化ｇｐ１２０と強力に反応することを見出しており（未発表）、これら二つの領域内のエピトープかこのアッセイで代表されていることが示唆される。

図３に説明されているとおり、一つの株（Ｌ　８６）は、血清不存在下でＩＬ− ２依存性の活性化初代Ｔ細胞中で増殖し、そして培地中に放出されたｇｐ１２０はＣｏ　ｎ−Ａ不溶化アッセイで良好に機能した。無症状Ｂ細胞提供者から単離した他の株でも同様の結果が得られるであろう；そしてホモロガスな単離物の抗原と反応する抗体のスクリーニングが可能になろう。

一つの実験（図３）において、ロビンソン博士によりに２４−３ｂおよびＮ７Ｏ −２３，ａの培養液およびＨＩＶ−１陽性コントロール血清（Ｈ７２）が、９つの異なる株のパネルについて試験された；そのパネルの中にはＢ細胞提供者に２４−３ｂから単離された株であるＬ８６も含まれていた。Ｎ７Ｏ−２３，ａは９株全てと反応した。結果はミロの測定の平均ＣＤ値で、標準偏差のバーと一緒に示されている。この抗体のパネルへの結合には多少の相違があるものの、一般に陽性コントロール血清については並行的相違が観察された。したがって、Ｎ７Ｏ −２３，ａおよびＨ７２血清両者の結合レベルは、各株から不溶化されたｇｐ１２０量の相対指標を提供する。陽性血清と比べてＮ７Ｏ−２３，ａがＬ８６株にはるかに弱い反応性をもつ理由は不明であるが、Ｌ８６のみが連続細胞ラインよりもウィルス放出量の少ないＩＬ−２依存性初代Ｔ細胞中で増殖された株であったためかもしれない。Ｌ８６ウイルス調製物ではｇｐ１２０よりもｇｐ４１が多く不溶化され、ｇｐ４１に対する抗体が血清の大きい反応性の原因であった可能性がある。

Ｎ７Ｏ−２３ａと比べて、Ｋ２４−３ｂモノクローナル抗体は、これらのウィルスとの反応性に顕著な変動を示した。この抗体は９株のうち６つに反応したが、ＳＡＳ株またはに３株には結合せず、そして５Ａ９６にたいして最小限の結合を示した。Ｎ７Ｏ−２３，ａおよびに２４−３ｂの両者とＬ８６および５６２株との反応性は非常に同様であったが、Ｋ２４−３ｂの５Ａ９０とＣ３９株への結合はＮ７Ｏ−２３，ａよりはるかに弱く、その相違は５Ａ９０で大きかった。これらの観察は、抗原のバッチをかえて行ったアッセイでも再現性があった。これら二つの抗体の結合に関する相違が僅かであることはＨｉＴｉおよびＨＴＬＶ−ＩＩＩ株についても明らかであった。これらの相違は抗体の濃度に関するものではなかった・なぜならこれらのアッセイに用いた両抗体の調製物は、不溶化抗原の利用可能な抗原サイトを飽和するようであったためである：１６２単離物にたいして試験したとき、両抗体の１：３２希釈までの連続希釈列で得られたオプティカル・デンシティ−は非常によくにていた（データは示さない）。これらのデータは、Ｎ７Ｏ−２３，ａは保存されたエピトープを認識し、Ｋ２４−３ｂはこのウィルス株パネル中で異種性に発現された変異エピトープを認識することを示唆する。

図４は同様の実験の結果であるが、ここではロビンソン博士は８株由来のＣ。

ｎ−Ａ不溶化糖蛋白質とＮ７Ｏ−１５，ｅおよびＮ７Ｏ−１９，ｂの反応性を比較している（結果は一回の測定による）。この実験で、Ｎ７Ｏ−２３，ａを陽性コントロールとして用いた。Ｎ７Ｏ−４５，ｅおよびＮ７Ｏ−２３，ａの両者は８株の全てと強く反応したが、Ｎ７Ｏ−１９，ｂは抗体製造のための最初のＢ細胞培養のスクリーニングに用いた株であるＪ６２のみと反応した。この結果はＮ７Ｏ−２３，ａと同様にＮ７Ｏ−１５，８はこれまで試験した全ての株に共有されているエピトープと反応し、Ｎ７Ｏ−１９，ｂは株−限定エピトープと反応することを示唆する。本発明者らは、さらに二つの標的ｇｐ１６０抗原（ＨＩＶ− ＩＩＩＭ、および組換えＨＩＶ　１ＳＦ□）を用いて、四つのＨＭａｂの反応性を調査した。表１４に示す結果は、Ｎ７Ｏ−１９，ｂならびに他の三つのＨＭａｂは、ＨＩＶ−Ｉ　Ｉ　ＬＮおよびＨＩ　Ｖ　ＩＳＦ□からのＣｏｎ−Ａに不溶化した糖蛋白質と、ＥＬＩＳＡにおいて強く反応したことを示す。この実験からは、ヒトモノクローナル抗体がＭＮもしくはＳＦ２　ｇｐ１６０分子のどの部分に結合するかは明らかでない。

ウェスタンプロット　によるＨＭａｂのｙ四つのＨＭａｂの内二つ（Ｋ２４−３ｂおよびＮ７Ｏ−２３，ａ）の株特異性も、上記ＨＩＶ−１株のパネルから調製されたウェスタンプロットでロビンンン博士により試験された。図５に示すその結果は、ＥＬｒＳＡで得られた結果と一致した。図５のパネルＡはに２４−３ｂの反応性を、＜′＋、／ｉ、ＢはＮ７Ｏ−２３゜ａの反応性を示す。各プロットのレーンの頂部に株か明記されており、ＩＩＩＢはＨＴＬＶ−Ｉ　Ｉ　ＩＢ−？？ある。Ｎ７Ｏ−２３，ａは８株全て（７）ｇｐ１２０／１６０と反応した。Ｋ２４−３ｂはそれがＥＬＩ　ＳＡで認識したのと同じｇｐ１２０／１６０と反応した。同様にに２４−３ｂはＳＡ３およびに３とは反応せず、５Ａ９６とは写真の感度以下の最小限の反応を示した。Ｎ７Ｏ−１５，ｅおよびＮ７Ｏ−１９，ｂは全てのウィルスについてウェスタンプロットによる同様の試験を行っていないが、ＥＬ　Ｉ　ＳＡで観察されたＮ７Ｏ−１９，ｂの株限定反応性は、該抗体がドツトプロットアッセイにおいて組換えＬＡＶ　ｇｐ１２０と反応しないことにより確認された。

さらに二つの形質転換実験（一つはＮ７０提供者からのＢ細胞を含む）は、６０を超える形質転換Ｂ細胞カルチャーを生じ、その中には下記で議論する抗−ＨＩＶ−抗体生産性クローンＮ７Ｏ−４１，３ａが含まれており、このクローンはＣｏｎ−Ａに不溶化されたＨＩＶ糖蛋白質と特異的に反応するＩｇＧ抗体を生産した。これらのカルチャーの約３０％が安定な抗体生産性クローンを生じ、したがって、相当数のＨＭａｂのＨＭａｂの発生の可能性を示し、これらは全体として、無症状感染の間にｇｐ１２０の変異体および保存されたエピトープに対するヒトの抗体応答の広範な発生を示す。

ＨＴＶ、Ｎ　のスクリーニング本発明者らは、ＥＬＩＳＡおよびウェスタンプロット（ＷＢ）アッセイを用いて、ロビンソン博士が同定したｇｐ１６０−結合性ヒトモノクローナル抗体のいくつか（Ｎ７０−１９．ｂ、Ｎ７Ｏ−１５，ｅ、に２４−３ｂおよびＮ７０−　ＩＩ、３ａ）を、ｇｐ１６０分子のＭＮプロトタイプに特異的なものがあるか調べるため再スクリーニングした。ＥＬＩＳＡにおいては、本発明者らは５つの異なる組換え蛋白質もしくはそのフラグメント（ｇｐ１６０−１１　ＩＢ、ｇｐ１６０−ＲＦ、ＰＢ−１−ｒ　Ｉ　ｒ　Ｂ、ＰＢ−１−ＲＦおよびＰ　Ｂ−１−ＭＮ）を抗原として用いた。ウェスタンプロットにおいては、本発明者らは３つの異なる試験抗原（ｇ　ｐ　１６０−ｒ　Ｉ　ＩＢ、１）Ｂ−１−ＩＩ　ＩＢおよびＰ　Ｂ−１−ＭＮ）を用いた。完全ｇｐ１６０ポリペプチドは昆虫細胞内でバキュロウィルス発現システムを用いて生産し、そして１９８７年８月３１日に出願され本発明と同じ出願人に譲渡されたルッンエ（Ｒｕｓｃｈｅ）らの米国特許出願０９１，４８１に記載された様にして精製した。その記載は本発明明細書に含まれているものとする。ＰＢｌと呼ばれる主中和領域（ブトネイ（Ｐｕｔｎｅｙ）ら、１９８６，５ｃｉｅｎｃｅ、２３４・１３９２）にまたがるアミノ酸配列を有する１８０アミノ酸の蛋白質フラグメントは、完全長のｅｎｖ遺伝子のＰｖｕｌｌ＋Ｂｇｌ　ＩＩ開裂で生じた約５４０ｂｐのＤＮＡ配列から、１９８７年１０月９日に出願され、本願出願人に譲渡された米国特許出願第１０７，７０３の記載のようにして発現された；その米国特許出願の内容は本明細書に含まれているものとする。

ＥＬｒＳＡは次のようにして行った。９６−ウェルのコスタ−（ｃｏｓｔａｒ）平底マイクロタイタープレートの各ウェルに最終抗原濃度が２〜１０μｇ／ｍｌの抗原を含むＰＢＳ溶液を５０μｍ加えて、各ウェルを抗原でコーティングした。抗原（蛋白質もしくはペプチド）は精製され、したがって抗体の結合に十分量で不溶化されたので、上記のＣｏｎ−Ａ法は用いなかった。抗原溶液を吸引除去してＰＢＳ＋０，５％ＢＳＡに置きかえ、１時間インキュベートした。インキュベーションの後、ウェルを吸引し、洗浄し、そして抗体５０μｍを加えた。インキュベートの後、ウェルをＰＢＳで３回洗浄し、そしてセイヨウワサビベルオキシターゼ（ＨＲＰ、西ドイツ、ベーリンガー・マンハイム）と結合したヤギ抗− ヒトイムノグロブリンの適当希釈物５０μｍと共に３０分間インキュベートした。ウェルを再度ＰＢＳで３回洗浄し、ＨＲＰの基質として１　：　１０００希釈の３０％Ｈ２Ｏ２を添加したＯ、ＬＭのクエン酸ナトリウム、ｐ）（４，２中の１ｍＭのＡＢＴＳ　（２，２−アジノービス（３−エチルベンズチアゾリン　６ −スルホン酸）を５０μｍ添加して、結合した抗体を検出した。次にＡＢＴＳサンプルの０Ｄ４１０をダイナチック・スペクトロフォトメトリック・オートリーダー（Ｖｉｒｇｉｎｉａ）で読み取った。

表１５−１８はＥＬＩ　ＳＡの結果である。表１５にはウェスタンプロットの結果も与えられている。表１５の数値は、陽性例数／試験例数を示す。このＥＬＩＳＡの陽性コントロールおよび陰性コントロールは、それぞれＨＩＶ十血清およびＨＩＶ−血清であり、ウェスタンプロットでの陽性コントロールはヤギ抗−ｇｐ１６０Ｉ　Ｉ　ＩＢ抗血清である。

このＥＬＩＳＡにおいて、５つの抗体のうちＮ７Ｏ−１９，ｂが組換え蛋白質ＰＢ−ＩＭＮＩ：陽性であった。この結果はウェスタンプロット（表１５）で明らかに確認され、そして表１６および１７に結果を示すＥＬＴ　ＳＡにおいては、試験の結合用抗原として、種々のＨＩＶ変異体株（Ｔ　Ｉ　ＩＢ、ＲＦ、およびＭＮ）のエンベロープ蛋白質からのＰＢ−１７ラグメントを用いた。表１５〜１７に記載した実験においては、試薬は還元バッファー中のものを用いた。このことが、表６と表１５−１７との間における一見して矛盾する抗体結合の結果を説明できるであろう；即ち、表１４のＥＬＩＳＡは還元バッファーを含まずその結果ぜんぶの抗体がｇ　ｐ　１２０／１６０と結合した。本発明者らは還元バッファーの存在は抗体のより選択的結合をもたらすと結論した。

表１５−１７の結果は、Ｎ７Ｏ−１９，ｂは特異的にＭＮプロトタイプに結合するが、しかしｇｐ１６０分子のＴｒＩＢまたはＲＦプロトタイプには結合しないことを示す。表１０は、別のＥＬＩ　ＳＡの結果を示し、ここではＮ７Ｏ−１９、ｂ、Ｎ７Ｏ−１５，ｅ、およびＮ７Ｏ−Ｉｌ、３ａを、ＨＩＶ−ＭＮ株またはＩ（ＩＶ−ＩＩ　ＩＢ株のいずれかからのエンベロープ蛋白質のフラグメントに結合する能力に関して調べた。”ＲＰ７０”は°ＭＮエンベロープ蛋白質の主中和領域（ｐｒｉｎｃｉｐａｌ　ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ　ｄｏｍａｉｎ：ＰＮＤ）からの完全−閉鎖ループ”であり、”ＲＰ１４２”は開環２４ｍａｒであり、そして”ＲＰ１３５”はＩＩＩＢ株のＰＮＤからの２４ｍｅｒである。これらのフラグメントは、表３に規定されたｇｐ１２０ループ領域の中和領域サブ配列内のアミノ酸配列を含んでいる。表１８に示す結果は、Ｎ７Ｏ−１９，ｂモノクローナル抗体はＨＩＶＭＮ　ｇｐ１６０分子の主中和領域またはループ領域に（ＲＰ７０、ＲＰ１４２）結合スル力、ＩＩＩＢ変異体ノＰＮＤ　（ＲＰ　１３５）　ニハ結合しないことを示している。

旦エヱ肚Ω虫担次に本発明者らは二つの抗体（そのうちの一つはＮ７Ｏ−１９，ｂである）のＩ（ＩＶ感染中和能力に関して試験した。本発明者らが用いたアッセイは、ＨＩＶＭＮ感染した細胞によるシンシチウム形成の阻止である。このアッセイにおいて、前記の通り、興味あるＨ　Ｉ　ＶＭＮ株のエンベロープ遺伝子を発現する組換えワクシニアウィルスをＣＤ４＋ヒトＴ−リンホーマラインＣＥＭ　（ＡＴＣＣ寄託番号Ｎｏ、ＣＣＬ１１９）の細胞を感染させるために使用し、次いで抗体を細胞に加えて、ＨＩＶエンベロープが介在しておこる細胞融合の阻止をスクリーニングした。抗体がウィルスを中和する能力を示唆する陽性結果は、シンシチウム形成を少なくとも９０％阻害する能力と定義した。

ＣＥＭ細胞を、ＭＮのＰＢ−１７ラグメントを含むプラスミドｐｓｃＲ２５０２に由来し、ｇｐ１６０の残部がＩＩＩＢ由来であるＥ（ＩＶエ　ｇ１６０を発現する組換えワクシニアウィルスで感染させた。このアッセイにおいて、シンシチウムが誘発され、この誘発はＰＮＤに対する抗血清またはモノクローナル抗体で抑制可能である。その結果、表１９に示すとおり、Ｎ７Ｏ−１９，ｂはある範囲の濃度にわたる抗体濃度においてワクシニアｇｐ１６０−ＭＮにより誘発されるシンシチウムの抑制を示したが、Ｎ７Ｏ−１５，ｅはシンシチウムの形成を抑制しなかった。

里塗本発明のモノクローナル抗体は、慣用の医薬製剤としてＨＩＶに苦しむヒトの治療に、またはそのような感染の危険をもつヒトの予防のために用いることができる。さらに、そのような製剤はこの分野で公知の薬学的に許容される担体、希釈剤、塩および他の材料を含むことができる。等張塩類、滅菌水、１０％マルトース、ヒト血清アルブミン、グリシンまたは他の薬学的に許容される材料を、希釈剤、担体または溶媒として本発明の抗体を含む医薬製剤を調製できる。

ＨＩＶに感染しまたはエイズに悩む患者の治療に用いるに際しては、本発明のヒトモ）’ｙａ−ナル抗体は受動免疫剤（ｐａｓｓｉｖｅ　ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ　ａｇｅｎｔ）として、約２００ｍｇないし約１５ｇのひろい投与範囲、そして好ましくは５０ｍｇないし１ｇの範囲の有効量で投与できる。

受動免疫に用いるための多価免疫グロブリンは、ウマを免疫しまたは免疫ヒト血清をプールし、プラズマまたは血清からＩｇＧ成分を分画することにより調製できる。ヒトまたはマウスモノクローナル抗体を生産する細胞ラインは、標準的形質転換技術およびハイブリドーマ技術で調製できる（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１２１巻、セクションＩおよびＨ，１９８６，ランボンおよびブナキス（Ｌａｎｇｏｎｅ　ａｎｄ　Ｖｕｎａｋｉｓ）編集、アカデミツクプレス）。ＨＩＶモノクローナル抗体は、マツシタ（Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａ）ら、１９８８．Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、６２：２１０７；または１９８８年１２月２１日公開のＥＰＯ２９５，８０３の記載にしたがって調製できる。大部分のモノクローナル抗体はヒト以外の動物種により生産されるので、しばしばヒトに対して免疫性である。ヒトの治療のためにこれらのモノクローナル抗体を成功裡に使用するためには、キメラ抗体分子の造成が必要であろう；キメラ抗体はリガンドとの結合に関与するポリペプチド部分（可変領域）が一つの動物種に由来し、構造安定性および他の生物学的機能の付与に関与する部分（定常領域）はヒト抗体に由来する。可変領域が一つの宿主に由来しそして定常領域が第二の宿主に由来するキメラ抗体の製造は、当業者によく知られている。例えば、ノイベルガー（Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ）ら、ＰＣＴ国際公開８６１０１５３３　（優先臼１９８４年９月３日）およびモリソン（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ）ら、ＥＰ公開０，１７３，４９４（優先権１９８４年８月２７日）を参照。代替法として、可変領域の相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ　ｒｅｇｉ。

ｎｓ：ｃＤＲｓ）のみを所望抗原特異性を有する免疫グロブリンのＣＤＲ５に置換することにより、抗体を調製する方法は、ウィンター（Ｗｉ　ｎ　ｔ　ｅ　ｒ）により記載されている（ＧＢ公告２，１８８，６３８、優先権１９８６年３月２７日）。ネズミモノクローナル抗体は、ヒトＦｃ部分を含む抗体にして、ヒトの治療用途に適合させることができる（モリソン（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ）、１９８５，５ｃｉｅｎｃｅ、２２９：１２０２）。確立されている方法で、そのようなハイブリッドモノクローナル抗体を製造、発現および精製することが可能であろう。免疫グロブリンを治療的に投与する処方は、既に多くの感染症に関して行われている本発明の抗体は非経口的に、静脈投与または筋肉内投与ルートで行われる。典型的治療処方は、有効量の抗体を約１週間から約６ケ月投与することよりなるであろう。患者の症状をコントロールするために必要な治療の種類は、治療を受ける各患者の感受性および病気のステージ並びに各患者の体質に応じて個々の患者により変化（７うる。各治療に必要な用量は、何回かに分割してまたは１回で投与される。ヒトモノクローナル抗体は、単独でもしくは他のＨＪＶ冶療剤例えばＡＺＴと一緒に、患者の症状をコントロールするために投与できる。本発明の抗−ＨＩＶ治療は、患者の症状および患者の症状のステージに応じて、１週間に１ままたは２回またはそれ以上行う。

本発明の抗体は、これを母親、新生児、または両者に投与することにより、母親から新生児へのＨＩＶの垂直感染を防止するためにも使用可能である。

他の悪血他の態様は請求の範囲の記載に含まれている。抗体は担体例えば、ある種の分子、リポソーム、または他の抗体（即ちヘテロコンジュゲートにする）と結合させて、その活性を改善することができよう。例えば、抗体を細胞毒性物質に結合させてイムノトキシンとして使用したり（ビテタ（Ｖ　ｉ　ｔ　ｅ　ｔ　ｔ　ａ）ら、１９８７．５ｃｉｅｎｃｅ、２３８：１０９８）、または抗−ＨＩＶ薬剤または毒素を含むリポソームの表面に含ませて、感染細胞をそのような薬剤または毒素の特異的な標的とすることができる。ここで、イムノトキシンとは抗体と一つ以上の毒素、薬剤、放射性核種、または細胞毒性物質との複合体を意味する。

本発明の抗体と複合体を形成させることのできる細胞毒性物質としては、リシン、ジフテリア毒素および放射性核種が挙げられる。リシンは豆科植物Ｒｉｃｉｎｕｓ　ｃ。

ｍｍｕｎｉｓにより生産される極めて強力な毒素である。本発明の抗体をイムノトキシンとして用いる典型的治療においては、抗体（ＨＩＶ−感染細胞で発現される蛋白質に結合する抗体）を、ＨＩＶ−感染細胞（および非−感染細胞に対しても）毒性である毒素（例えばリシン）と複合体にする。細胞毒性物質を抗体に結合させることにより、非−特異的毒性を顕著に低めて、毒素の有効性レベルを高めることができる。毒性物質の使用が可能になるのは該物質を結合させた抗体が、該物質を直接標的（この場合、ＨＩＶ−感染細胞）に運んで、これにより非 −感染細胞を毒素から保護できるからである。抗体を細胞毒性物質と複合体にするために使用できる技術は前記ビテタらおよび１９８８年８月２４日に公開されたヨーロッパ特許出願２７９，６８８に詳細に記載されている。

表１０表１ｄ表１８ＨＩｖ−１エンベロープの主中和領域内のヘキサマー配列の頻度１）ＩＩＧＰＧＲＡＦＹ　６５　２７ＩＨＩＧＰＧ　９３　３８ＨＩＧＰＧＲ９２３ＢｒＧＰＧＲＡ　＋　５６　６４ＧＰＧＲＡＦ　＋　４６　６０ＲＰ１４２　Ｙ　Ｎ　Ｋ　ＩＩ　Ｋ　ＲＩ　ＨＩ　Ｇ　Ｐ　Ｇ　ＲＡ　Ｆ　Ｙ　Ｔ　Ｔ　Ｋ　Ｎ　Ｉ　Ｉ　Ｇ（Ｃ）ＲＰ３４２　Ｉ　ＨＩ　Ｇ　Ｐ　Ｇ　ＲＡ　Ｆ　Ｙ　ＴＲＰ７０　Ｉ　Ｎ　ＣＴ　ＲＰ　Ｎ　Ｙ　Ｎ　１１：　ＲＫ　ＲＩ　ＨＩ　Ｇ　Ｐ　Ｇ　ＲＡ　Ｆ　ＹＴＴＫＮＩＩＧＴＩＲＱＡＨｆｌＩＳＲＰｌｏｏ　（Ｓ　Ｇ　Ｇ）　Ｔ　ＦＩ　Ｋ　Ｇ　ｒ　ＨＩ　Ｇ　Ｐ　Ｇ　Ｒ＾Ｉ　Ｙ　（Ｇ　Ｇ　Ｓ　Ｃ）ＲＰ１０２　（Ｓ　Ｇ　Ｇ）　Ｔ　ＲＫ　Ｓ　ｒ　Ｓ　ｒ　Ｇ　Ｐ　Ｇ　ＲＡ　Ｆ　（Ｇ　Ｇ　Ｓ　Ｃ）ＲＰＩ０８　（Ｓ　Ｇ　Ｇ）　ＨＩ　Ｇ　Ｐ　Ｇ　ＲＡ　Ｆ　Ｙ　Ａ　Ｔ　Ｇ　（Ｇ　Ｇ　Ｓ　Ｃ）ＲＰＪ２３ｃ　（Ｃ）　ＨＩ　Ｇ　Ｐ　Ｇ　ＲＡ　Ｆ　（Ｃ）Ｇ　（Ｃ）ＲＰＴ７４ｃ　（Ｃ）Ｎ　Ｎ　Ｔ　ＲＫ　Ｓ　Ｉ　Ｒ１０ＲＧ　Ｐ　Ｇ　ＲＡ　Ｆ　Ｖ　Ｔ　Ｉ　ＧＫ　Ｉ　Ｇ　（Ｃ）ＲＰ３３９　（ＲＦ　＠ｉｌ物）Ｉ　Ｔ　）ｌ：　Ｇ　Ｐ　Ｇ　ＲＶ　Ｉ　Ｙ　（Ｃ）カッコ内のアミノ酸は天然配列の一部ではない表４株　融合番号　免疫源　旺Ｉｓ＾での反応性　アイソタイプＢａ１ｂ／ｃ　Ｆ４／Ｐ７ε４　ＫＬＨ−１４２＋　＋　十　＋　＋　工９ＨＢａｌｂ／ｃ　Ｆ５／ＰＩＧ２　ＫＬ）Ｉ−１４２＋　＋　＋　＋　＋　ＩｇＭＢａｌｂ／ｃ　Ｆ７／Ｐ４Ｄ８　ＲＰ７０　＋　＋　＋　＋　＋　ＩＢＭ８１０、ＢＲＦ８／Ｐ９Ｄ＋ｌ　ＲＰ　７０Ｂａｌｂ／ｃ　Ｆ＋Ｏ／Ｂ４Ｅｌｌ　ＲＰ１４２　ＩｇＭＣ５７／Ｅｌｌ　ＦＩＯ／Ｃ３１１２ＲＰＩ４２　＋　−−−ｒｇＭＢａｌｂ／ｃ　ＦＩ３／Ｐ３ＡＩＩ　ＲＰ７０８ａｌｂ／ｃ　Ｆｌコ／Ｐ４ε７ＲＰ７０Ｂａｌｂ／ｃ　Ｆ１３／Ｐ７Ｅ２　ＲＰ　７０Ｂａｌｂ／ｃ　Ｆ１３／ＰＩｌｌＢ２　ＲＰ　７０Ｂａｌｂ／ｃ　ＦＩ３／Ｐ８Ｄ８　ＲＰ　７０Ｂａｌｂ／ＣＦＩ３／Ｐ８Ｆ２　ＲＰ　７０　＋／　−ＢｌＯ，ＢＲＦ１４／Ｐ２Ｆｌｌ　ＲＰ７０ＢＩＯ，ＢＲＦ１４／Ｐ４Ｂ２　ＲＰ　７０ＢＩＯ，ＢＲＦ１４／Ｐ６Ｄ１２　ＲＰ７０ＢＩＯ，ＢＲＦＩ４７ＰＩＯＢ＋２　ＲＰ　７０ＢｌＯ，ＢＲＦＩ４／Ｐ＋６Ｄ２　ＲＰ　７０Ｃ５７／ＢＬ／６　Ｆ３１／Ｐ２ＢＩＯＲＰ７０　＋　十　ＮＯ−ＮＯＩｇＧ２ａＡ、ＳＷ　Ｆ５０／Ｐ８ＤＩＯＲＰ７０　＋　＋　ＮＯ− ＮＤ　ＩｇＧ２ａ表５ペプチド　配列ＲＰ１３５　ＮＮＴＲＫＳＩＲＩＱＲＧＰＧＲＡＦＶＴＩＧＫＩＧＣＩＩＰ＋４１　ＮＮＶＲＲ５ＬＳＩＧＰＧＲＡＦＲＴＲＥｒＩＧＣＲＰ１４２　ＹＮＫＲＫＲＩＨＩＧＰＧＲＡＦＹＴＴＫＮＮＩＩＧＣＲＰ１４３　ＮＮＴＴＲ５Ｉ）ＩＩＧＰＧＲＡＦＹＡＴＧＤＩＩＧＣＲＰ＋４４　ＮＮＴＳＲＧＩＲＩＧＰＧＲＡＩＬＡＴＥＲＩＩＧＣＲＰ＋４５　ＮＮＴＲＫＧＩＨＩＧＰＧＲＡＦＹＡＴＧＤＩＩＧＣＲＰ＋４６　ＮＮＴＫＫＧＩＲＩＧＰＧＲＡＶＹＴＡＲＲＩＩＧＣＲＰ　＋４７　ＮＮＴＲＫＧＩＹＶＧＳＧＲＫＶＹＴＲ）ＩＫＩ　ＩＧＣＲＰ１４８　 εＮＴＫＲＳＬＹＩＧＰＧＲＲＦＨＶＴＫＡＩＴＧＣＲＰ１４９　ＮＮＴＲＲ５ＩＨＩＧＰＧＲＷＳＶＨＴＴＧＥＩＶＧＣＲＰ１５０　ＮＮＴＲＫＳＩＹＩＧＰＧＲＡＦ）！ＴＴＧＲＩＩＧＣＲＰ１５１　ＮＮＴＫＫＧｒＡｒＧＰＧＲＴＬＹＡＲＥＫ：ＨＧＣＲＰ　ｌ　５２　ＮＮＴＲＫＲＶＴＭＧＰＧＲＷＹＴＴＩ：、ＥＩＶＧＣＲＰ　Ｉ　５３　ＮＮＴＲＡＲＬＳ　ｒＧＰＧＲ５ＦＹＡＴＲＮｆＶＧＣＲＰＩ５４　５ＮＶＲＮＲＩＨＩＧＰＧＲＡＦＨＴＴＫＲＩＴＧＣＲＰ１６２　ＮＮＴＲＫＳＩＰＩＧＰＧＲＡＦＹＡＴＧＤＩＩＧＣＲＰ１６３　ＮＮＴＲＩＣＧＩＦＩＧＰＧＲＮＩＹＴＴＧＮＩＩＧＣエピトーブマブビングペプチドＨＰ　ｌ　７セチルーｃ　Ｋ　ＲＩ　ＨＩ　Ｇ　Ｐ　Ｇ　ＲＡ　Ｆ　Ｙ　Ｔ　Ｔ　ＣＭＮ−１４ｍｅｒＭＰ　７　７＋チル−ＣＫＲＩＨＩＧＡＧＲＡＦＹＴＴＣＨＰ　８　アセチル−ＣＫＲＩＨＩＧＰ＾ＲＡＦＹＴＴＣ表フループ先端ペプチドＲＰ１４２　ＹＮＫＡＫＲＴＨＩＧＰＧＲＡＦＹＴＴＫＮＩＩＧＣＲＰ１０２　（ＳＧＧ）ＴＲＫＳＩＳＩＧＰＧＲＡＦ（ＧＣ，５Ｃ）ＲＰＴＯ８Ｈ！ＧＰＧＲＡＦＹＡＴ（ＧＧＳＣ）ＲＰ＋２９　［ＲＩＨＩＧＰＧ］３ＲＰ３４２　ＩＨＩＧＰＧＲＡＦＹＴＣＲＰ１７Ｓ　［ＩＧＰＧＲＡＦ３ＲＰＴ７６　（ＳＧＧ）　ＩＧＰＧＲＡＦ（ＧＧＳＣ）ＲＰ＋７７　［ＩＧＰＧＲＡＦ］３ＲＰＩ　ＩＳ　［ＧＰＧＲＡＦ］３カブコ内のアミノ酸は天然配列の一部でＬｉｔ；Ｌ’表８１、　ペプチドへの直接結合５、　ペプチド競合シンシチウム椹１１表９一抗体−ペプチド反応性（００，、。）ザ士猛　翌匹　せｌ徂　ザエ狙　ぜＩ狙　至４Ｆ３１゜Ｐ２Ｂ１０１．７４　１．６５　Ｎｏ　、０８　Ｎｏ　、０３０Ｆ５０．Ｐ８Ｄ＋Ｏ＋、７　１．７　Ｎｏ　、０８　Ｎｏ　、０３０表１０表１１Ｆ３１．Ｐ２ＢＩＯＣ５７／８Ｌ６　ＲＰ７０　ＩｇＧ２ａ　Ｏ，Ｉ　ＲＩＨＩＧＦ５０．Ｐ８ＤＩＯ＾、Ｓ）Ｉ　ＲＰ７０　ＩｇＧ２ａ　Ｏ，Ｉ　ＲＴＨＩＧＦＳ２．Ｐ７ｎ２　＾、Ｓ１４　ＲＰ７０　ＩｇＧ２ａ　Ｏ，２５−０，５ＲＩＨＩＧＦ５２．Ｐ８Ｃ９＾、謂　ＲＰ７０　ＩｇＧ２ａ　Ｏ，１−０，２５ＲＩＨＬＧＦ５２．Ｐ７Ｂ９＾、５ｋｌＲＰフＯＩｇＧ２ａＯ，５ＲＩＨＩＧＦＳ２．ＰＳＥ９　Ａ、ＳＷ　ＲＰ７０　ＩｇＧ２ａ　Ｏ，２５−０，５ＲＩＨＩＧＦ５２．Ｐ６Ｅ９　＾、ＳＭ　ＲＰ７０　ＩｇＧ２ａ　Ｏ，５Ｒ１）ＩＩＧＦ５２．Ｐ８ＣＩＯＡ、５１４　ＲＰ７０　ＩｇＧ２ａ　Ｏ，２５−０，５ＲＩＨＩＧＦ５２．Ｐｌ］ＦＩ　ｌ　＾、５’＠　ＲＰ７０　ｌ９Ｇ２ａ　Ｏ，２５ＲＩＨＩＧＦＳ３．ＰＩＢ６　Ｃ５７ＢＬ／６　ＲＰ１０２−ＫＬＨ１ｇＧ３　１０．０−２０．０　１ＧＰＧＲＡＦＦ５］、Ｐ７Ｃ４Ｃ５７８Ｌ／６　ＲＰ１０２− ＫＬ）ｌ　１ｇＧ３　１．０　１ＧＰＧＲＡＦＦ５４．ＰＳＦ４　Ｃ５７ＢＬ／６　ＲＰ１０８−にＬＪＩ　１ｑＧ３　Ｓ　ＨＩＧＰＧＲＡＦＹＦＳ６．Ｐ６Ｇ４　Ｃ５７ＢＬ／６　ＲＰｌｏｏ−ＫＬ）ｌ　１９Ｇ２ｂ　２．５　ＨＩＧＰＧＲ＾Ｆ５８．Ｐ６Ｆ２．　８＾ＬＢ／ＣＲＰ７０　ｒｇｃ＋　１．０　１ｃ、ＰＧＲＦＳ９．ＰＳＢ３　”　ＲＰ７０　１ｇＧ＋　１０　ＧＰＧＲＡＦＦＳ９．Ｐ７Ｅ３　’　ＲＰ７０　１ｇＧＩ　１０　’　ＧＰＧＲＡＦＦ６０．Ｐ５Ｃ２ ”ＲＰ！００−ＫＩＪＩＩｇＧ２ｂ１．０１ＨＩＧＰＧＲＦ６４．Ｐ６Ｇ５　Ｂ１０．ＢＲＲＰ７０　ＩｇＧ２ａ　１．０　１ＸＸＧＰＧＲ表１２ＲＰ１４２　（ＭＮ）　ＲＩＨＩＧＰＧＲＡＦＹＴＴに、、。

ＲＰ＋３５　（ＩＩＩＢ）　５ＩＲＩＱＲＧＰＧＲＡＦＶＴＩＧ、、、　−ＲＰ＋４１　（四、１−２）　、。５ＬＳＩＧＰＧＲＡＦＲＴＲＥ、　、　。

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ＲＰ１６２　、、．５ＩＰＩＧＰＧ触ＦＹＡＴＧ、、、　Ｎ、Ｄ。

ＲＰ１９０　、、、ＳＩ丁ｒＧＰＧＲＡＦＹＡＴＧ、、。

ＲＩ’＋５４　、、、ＩＩＩＨＩＧＰＧＲＡＦＨＴＴに０．。

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ＲＰＩ４６　、、、ＧｒＲＩＧＰＧＩ’ｌＡｌ／ＹＴＡＲ，、。

ＲＰ１４４　’、、、ＧＩＲＩＧＰＧＦＬｌすＬＡＴＥ、、。

ＲＰ１４９　、、．５ＩＨＩＧＰＧＲＷＳＶＨＴＴ、、。

ＲＰ１４１１　、、．５ＬＹＩＧＰＧＲＲＦＨＶＴＫ、、。

ＲＰ１５３　’、、、ＲＬＳｒＧＰＧＲ５ＦＹＡＴＲ，、、＋１−ＲＰ１５１　、、、ＧＩＡＩＧＰＧＲＴＬＹＡＲε１．。

ＲＰ１７０　、、、ＲＩＴＫＧＰＧＲＶＩＹＡＴＧ、、。

ＲＰＴ５２　、、、ＲＶＴＭＧＰＧＲＶＷＹＴＴＧ、、、　＋／−十ＲＰ１４７　、、、ＧｆＹＶＧＳＧＲＫｌ／ＹＴＲＨ，、。

ＷＭＪ−２：　２．５　５ペプチドＣｏｎｃ、　−５０￥Ｉｇ／ｍ１表１３　（ａ）Ｆ２７．Ｐ２Ｆ４　ＲＩＶ３−２７．１Ｆ３１．Ｐ２ＢＩＯ，Ｃ３Ｒ／Ｖ３−３１．１自Ｆ３１．Ｐ３Ｃ６，Ａ９　Ｒ／Ｖ３−３１．２Ｆ５０．Ｐ［１ＤＩＯＲ／Ｖ３−５０．１”ＦＳｌ、Ｆ１８８　Ｒ／Ｖ３−５１．ＩＦ５１．Ｐ７Ｆ６　Ｒ／Ｖ３−５１．２Ｆ５２．ＰＳＥ９　Ｒ／Ｖ３−　５２．１會Ｆ５２．Ｐ６Ｅ９　Ｒ／Ｖ３−５２．２”Ｆ５２．Ｐ２Ｓ５　Ｒ／Ｖ３−５２．３゜Ｆ５２．ＰＩＦ］２　Ｒ／Ｖ３−５２．４”Ｆ５２．Ｐ８Ｃ９Ｒ／Ｖ３−５２．５”Ｆ５２．Ｐ８ＦＴｌ　Ｒ／Ｖ３−５２．５”Ｆ５２．Ｐ８Ｇ＋ＯＩ’ｌ／Ｖ３−５２．７”Ｆ５３．ＰＩ３６’　Ｒ／Ｖ３−５３．１”Ｆ５３．Ｐ５ＧＴＴ　Ｒ／Ｖ３ −５３．２Ｆ５３．Ｐ６Ａ＋　Ｒ／Ｖ３−５１．３Ｆ５３．Ｐ７Ｃ４Ｒ／Ｖ３− 　ｒｈ３１４″Ｆ５４．Ｐ５Ｆ４　Ｒ／Ｖ３−５４．１１ＦＳ６．Ｐ６Ｇ４　Ｒ／Ｖｌ−５６，１”ＦＳｌｌ、Ｐ２ＥＩ　Ｒ／Ｖ３−５１３．１”Ｆ５８．Ｐ６Ｆ２　ＲＩＶ３−５Ｂ、２”Ｆ５Ｂ、ＰＢＡ５　Ｒ／Ｖ３−５８．３ＦＳ９．ＰＳＢ３　Ｒ／Ｖ３−５９．１”　＋Ｆ５９．Ｐ７Ｅ３　Ｒ／Ｖ３−５９．２”　＋Ｆ５９．Ｐ５ＧＢ　Ｒ／Ｖ３−５９．３”−Ｆ５９．Ｐ８Ｓ３　Ｒ／Ｖ３−５９．４１Ｆ５９．Ｐ８Ｇｌｌ　Ｒ／Ｖ３−５９．５Ｆ６０．Ｐ５Ｃ２Ｒ／Ｖ３− ６０．１”Ｆ６０．Ｆ５）＋９　Ｒ／Ｖ３−６０．２Ｆ６２．Ｐ５Ｆ＋Ｏ，Ａｌ１　Ｒ／Ｖ３−６２．１”表１５ＥＬＩＳＡ　Ｗ、Ｂ。

ＨＩＶ十　威Ｃ青　４／４　３／３　１／３　３１３　３／３　Ｎ、Ｄ。

ＨＩＶ−４青　０／４　０／３　０／３　０／３　０／３　Ｎ、Ｄ。

ヤギαｇｐ１６０（ＩＩＩＢ＞血清　Ｎ、０．　２／２　１／ｉＮ、Ｄ。

Ｋ２４−３Ｂ　Ｏ／４　０／３　０／３　０／３　０／３　０／２　０／Ｉ　Ｏ／ｌＮ７Ｏ−１５，ｅｏ／４　０／３　０／３　０／３　０／３　１／２　σＩＩ：　Ｏ／１、非常ｒＪい陽性表１６應捗け　Ｐａ−Ｉ　ｌｌｌ５　Ｐａ−Ｉ　ＲＦ　Ｐａ−Ｉ　ＭＮ　ＢＳＡ無し　、１６２　．０３９　．０４＋　−，００３ＨＩＶ−ｓｅｒｕｍ　ｌ：１ｏｏｏ　、２Ｂ２　．２７７　．２５＋　、１２４ＨＩＶ＋　Ｓ５！ｒｕｍ　Ｉ　：１ＯＯ０，２９９，２７Ｂ　、３０８　、１４３Ｎ７０−１９．ｂ　、２４１　．２７４　．６５９　．１５５Ｎ７０−−Ｉｌ、３ａ　、２６３　．２５０　．２９６　．１８１に２４−３８　．２９４　．２９７　．３０２　．１４５８７０ −ＩＳ、ｅ　、２６１　．２８７　．２９８　．１５８表１７ＥＸＩ）、２　捕捉された抗原ＨＩＶ−血清　１：ｓＯｏ　、４９１　．２０＋　、２３３　．０６０８７０− Ｔ１．３ａ、　、ｌＴ５　、＋６７　．１６４　．０６２に２４−３８　．１０５　．１９０　．１６２　．０７７８７０−１５．ｅ　、１４Ｂ　、２０４　．１７０　．０８２表１８試薬　ＲＰ７０　ＲＰ７０　ＲＰ＋４２　ＲＰＩ３Ｓ　８ＳＡ無し　、００２　Ｎ、Ｄ・ＨＩＶイ謂　Ｉｇｌｏｏ　、０３Ｂ　、＋２０　．１３９　．１５９　．０８３ＨＩＶ＋４’Ｊ　Ｉ：ｌＯＯ、里　１里　、−ｍ−・２３９　・・１３３Ｎ７０ −１−９．ｂ　、２６６　．４７５　．５７４　．２２３　．１６４Ｎ７０−１５．ｅ　、１４６　．１＋０　．２３５　．１４７　．０５８Ｎ７０−ＩＩｊａ　−，００２Ｎ、Ｄ。

表１９抗体　濃度５０　ｐｇ／ｍＬ　１０　ｐｇ／ｍＬ　５　ｐｇ／ｍＬＮ７０−１９．ｂ　ＯＯ０Ｎ７０−１５．ｅ　６８　７９　Ｎ、Ｄ。

一浄書（内容に変更なし）＠　＠　＠　＠　ｒｇｐ１２０ＬＡＶシ　・　ｒｇｐ１２０　ｎＤ　胛− ォアティ刀１ノ、：ｉンシＴ４−　（４５０ｎｍｌオアティカル・テパンシティーＢｅ３９　ｌｌｌ５　ＭＩＴｔ　Ｊ６２　５Ａ９０　１Ａ９６　Ｑ　！＆３ＦｉｇｕｒＪ！５手続補正Ｍ（方式）％式％工　事件の表示ＰＣＴ／”’ＵＳ９０／’０３１５７平成　２年特許願第５１０３６０号２、発明の名称ＨＩＶ−Ｉ　ＭＮ　ｇｐ１２０のヒトモノクローナル抗体３、補正をする者事件との関係　特許出願人住所名　称　レプリゲ′シ・・ニーボレーション４、代理人住　所　東京都千代田区大手町二丁目２番１号新大手町ビル　２０６区５、補正命令の日付　平成　４年　９月２２日　（発送日）６、補正の対象 ■　出願人の代表音名を記載した国内書面■　委任状及び別訳文 ■　適正な図面 ■　特許出願人名義変更届国際調査報告 °゛ｒ：八゛Ｓへ凸’０１１５７

Claims

【特許請求の範囲】１．ＭＮプロトタイプの主中和領域内のアミノ酸配列が、該主中和領域のＡ１− Ａ１７位置に下記のアミノ酸配列：Ｋ−Ｒ−Ｋ−Ｒ−Ｉ−Ｈ−Ｉ−Ｇ−Ｐ−Ｇ−Ｒ−Ａ−Ｆ−Ｙ−Ｔ−Ｔ−Ｋのサブ配列を含み、そして下記ＭＮ変異体の相当するアミノ酸サブ配列が、Ａ７−Ａ１１位置の上記Ｉ−Ｇ−Ｐ−Ｇ−Ｒ残基と完全にホモロガスな配列を含み且つ残りの残基については前記ＭＮプロトタイプのサブ配列と少なくとも３６％のホモロジーを有する、ＨＩＶのＭＮプロトタイプまたはそのＭＮ変異体ウイルスを中和する能力を有する抗体。２．該抗体が広域中和性であり、該広域中和には、該抗体がＨＩＶエンベロープ蛋白質の主中和領域内にアミノ酸配列：Ｇ−Ｐ−Ｇ−Ａ１１−Ａ１２（式中、Ａ１１はＲまたはＲを保存的に置換する任意のアミノ酸であり、そしてＡ１２はＡまたはＡを保存的に置換する任意のアミノ酸である。）を含む少なくとも二種のＨＩＶ株を中和する能力が含まれる、請求項１記載の抗体。３．該アミノ酸配列がＧ−Ｐ−Ｇ−Ｒ−Ａを含む請求項２記載の抗体。４．該アミノ酸配列がＧ−Ｐ−Ｇ−Ｒ−Ａ−Ｆを含む請求項３記載の抗体。５．該アミノ酸配列がＩ−Ｇ−Ｐ−Ｇ−Ｒ−Ａを含む請求項３記載の抗体。６．前記抗体が広域中和性であり、該広域中和性には、該抗体がＨＩＶエンベロープ蛋白質の主中和領域内にアミノ酸配列：Ｉ−Ａ６−Ａ７−Ｇ−Ｐ−Ｇ−Ｒ（式中、Ａ６およびＡ７は各々独立に任意のアミノ酸を表す）を含む少なくとも二種のＨＩＶ株を中和する能力が含まれる、請求項１記載の抗体。７．該アミノ酸配列がＩ−Ａ６−Ａ７−Ｇ−Ｐ−Ｇ−Ｒ−Ａを含む、請求項２または６記載の抗体。８．該アミノ酸配列がＩ−Ａ６−Ｉ−Ｇ−Ｐ−Ｇ−Ｒを含む、請求項６記載の抗体。９．該アミノ酸配列がＩ−Ａ６−Ｉ−Ｇ−ｐ−Ｇ−Ｒ−Ａを含む、請求項７記載の抗体。１０．該株の一つがＨＩＶのＩＩＩＢプロトタイプである、請求項２記載の抗体。１１．該ＭＮ変異体のサブ配列が式：Ａ１−Ａ２−Ａ３−Ａ４−Ａ５−Ａ６−Ｉ−Ｇ−Ｐ−Ｇ−Ｒ−Ａ１２−Ａ１３− Ａ１４−Ａ１５−Ａ１６−Ａ１７（式中、Ａ１−Ａ６およびＡ１２−Ａ１７は、各々独立に任意のアミノ酸残基を表す）の配列である、請求項Ｉ記載の抗体。１２．Ａ１＝Ｋ、Ｔ、Ａ、Ｒ、Ｖ、Ｐ、ＳまたはＩであり、Ａ２＝Ｒ、Ｔ、Ｉ、ＭまたはＫであり、Ａ３＝Ｋ、Ｒ、Ｔ、ＮまたはＡであり、Ａ４＝Ｒ、Ｓ、ＧまたはＨであり、Ａ５＝Ｉ、Ｍまたはしであり、Ａ６＝Ｈ、Ｐ、Ｓ、Ｙ、Ｋ、ＮまたはＲであり、Ａ１２＝Ａ、Ｐ、Ｔ、ＳまたはＫであり、Ａ１３＝Ｆ、Ｖ、Ｉ、Ｗまたはしであり、Ａ１４＝Ｙ、Ｈ、ＶまたはＦであり、Ａ１５＝Ｔ、ＹまたはＡであり、Ａ１６＝Ｔ、Ａ、ＧまたはＲであり、そしてＡ１７＝Ｋ、Ｇ、Ｅ、Ｓ、Ｑ、Ｒ、ＴまたはＡである、請求項１１記載の抗体。１３．ＨＩＶ株の配列がアミノ酸配列：Ａ１−Ａ２−Ａ３−Ａ４−Ａ５−Ａ６− Ａ７−Ｇ−Ｐ−Ｇ−Ｒ−Ａ１３−Ａ１４−Ａ１５−Ａ１６−Ａ１７（式中、Ａ１ −Ａ７およびＡ１３−Ａ１７は各々独立して任意のアミノ酸残基を表すかまたは削除されている。）を含む、請求項３記載の抗体。１４．Ａ７がＩであり、Ａ１３が任意のアミノ酸であり、そしてＡ１からＡ６の各々ならびにＡ１４からＡ１７の各々が独立に削除されており、該アミノ酸配列がＩ−Ｇ−Ｐ−Ｇ−Ｒ−Ａ−Ａ１３を含む、請求項１３記載の抗体。１５．Ａ１３がＦであり、Ａ７およびＡ１４が各々独立して任意のアミノ酸であり、そしてＡ１ないしＡ６の各々およびＡ１５ないしＡ１７の各々が独立に削除されており、該アミノ酸配列がＡ７−Ｇ−Ｐ−Ｇ−Ｒ−Ａ−Ｆ−Ａ４を含む、請求項１３記載の抗体。１６．Ａ５がＩであり、Ａ６およびＡ７が各々独立に任意のアミノ酸であり、そしてＡ１からＡ４およびＡ１３からＡ１７が各々独立に削除されており、そして該アミノ酸配列がＩ−Ａ６−Ａ７−Ｇ−Ｐ−Ｇ−Ｒ−Ａを含む、請求項Ｉ３記載の抗体。１７．Ａ５およびＡ７が各々独立にＩであり、そしてＡ５が任意のアミノ酸であり、そして該アミノ酸配列がＩ−Ａ６−Ｉ−Ｇ−Ｐ−Ｇ−Ｒ−Ａを含む、請求項１３記載の抗体。１８．該抗体がモノクローナル抗体である、請求項１ないし請求項１７のいずれか１項記載の抗体。１９．該抗体がヒトモノクローナル抗体である、請求項１８記載の抗体。２０．該抗体がヒト以外の種由来の可変領域およびヒト由来の定常領域を有するキメラ抗体である、請求項１ないし請求項１７のいずれか１項記載の抗体。２１．該抗体がヒトポリクローナル抗体である、請求項１ないし請求項１７のいずれか１項記載の抗体。２２．該抗体が担体に結合されている、請求項１ないし請求項１７のいずれか１項記載の抗体。２３．下記（ａ）および（ｂ）の一方または双方を調べることよりなる、請求項２−１７に記載した広域中和抗体を検出する方法：（ａ）（１）ＨＩＶエンベロープ蛋白質の主中和領域内の式：Ｇ−Ｐ−Ｇ−Ａ１１−Ａ１２（式中、Ａ１１はＲまたはＲと保存的に置換する任意のアミノ酸を表し、そしてＡ１２はＡまたはＡと保存的に置換する任意のアミノ酸を表す）で表されるアミノ酸配列、または（２）ＨＩＶエンベロープ蛋白質の主中和領域内の式：Ｉ−Ａ６−Ａ７−Ｇ−Ｐ −Ｇ−Ｒ（式中、Ａ６およびＡ７は各々独立に任意のアミノ酸を表す）で表されるアミノ酸配列、を含むペプチドまたは蛋白質に結合する能力、または（ｂ）ＨＩＶ中和のための生物学的活性。２４．該抗体を次のアッセイの一つまたはそれ以上で調べることよりなる、請求項２３記載の方法：（ａ）（１）ＨＩＶエンベロープ蛋白質の主中和領域内の式：Ｇ−Ｐ−Ｇ−Ａ１１−Ａ１２（式中、Ａ１１はＲまたはＲと保存的に置換する任意のアミノ酸を表し、そしてＡ１２はＡまたはＡと保存的に置換する任意のアミノ酸を表す）で表されるアミノ酸配列、または（２）ＨＩＶエンベロープ蛋白質の主中和領域内の式：Ｉ−Ａ６−Ａ７−Ｇ−Ｐ −Ｇ−Ｒ（式中、Ａ６およびＡ７は各々独立に任意のアミノ酸を表す）で表されるアミノ酸配列、を含むペプチドまたは蛋白質に結合する能力を調べるＥＬＩＳＡアッセイ；（ｂ）上記（１）または（２）（これら式中、どのアミノ酸残基もアラニンで置換されていてもよい）のアミノ酸配列からなる第二のペプチドまたは蛋白質による競合のために、該抗体がペプチドまたは蛋白質に結合出来なくなることを調べる競合ＥＬＩＳＡアッセイ；（ｃ）該抗体がＨＩＶ感染細胞に添加された時シンシチウムの形成を少なくとも９０％抑制するシンシチウム抑制アッセイ（ここで、該ＨＩＶは、（１）ＨＩＶエンベロープ蛋白質の主中和領域内の式：Ｇ−Ｐ−Ｇ−Ａ１１−Ａ１２（式中、Ａ１１はＲまたはＲと保存的に置換する任意のアミノ酸を表し、そしてＡ１２はＡまたはＡと保存的に置換する任意のアミノ酸を表す）で表されるアミノ酸配列、または（２）ＨＩＶエンベロープ蛋白質の主中和領域内の式：Ｉ−Ａ６−Ａ７−Ｇ−Ｐ−Ｇ−Ｒ（式中、Ａ６およびＡ７は各々独立に任意のアミノ酸を表す）で表されるアミノ酸配列を含む）；（ｄ）該抗体が、前記アミノ酸配列（１）または（２）を有するペプチドとともにインキュベートしてからＨＩＶ感染細胞に添加されたとき、シンシチウム抑制能力がないことを試験する、競合シンシチウム抑制アッセイ；（ｅ）該抗体が該ＨＩＶとインキュベートされ、ＨＩＶ感受性細胞に添加された時該ＨＩＶの感染力を中和する、ＨＩＶ感染中和アッセイ；および（ｆ）該抗体が、該ＨＩＶとインキュベートされ、ＨＩＶ感受性細胞に添加された時該ＨＩＶのタイターを減少させる、ＨＩＶ感染力減少アッセイ。２５．下記（ａ）ないし（ｃ）の何れかを中和する能力を有する抗体を患者に投与することよりなる、該患者のＨＩＶ感染を治療または抑制する方法：（ａ）ＭＮプロトタイプの主中和領域内のアミノ酸配列が、該主中和領域のＡ１−Ａ１７位置に下記のアミノ酸配列：Ｋ−Ｒ−Ｋ−Ｒ−Ｉ−Ｈ−Ｉ−Ｇ−Ｐ−Ｇ−Ｒ−Ａ−Ｆ−Ｙ−Ｔ−Ｔ−Ｋのサブ配列を含み、そして下記ＭＮ変異体の相当するアミノ酸サブ配列が、Ａ７−Ａ１１位置の上記Ｉ−Ｇ−Ｐ−Ｇ−Ｒ残基と完全にホモロガスな配列を含み且つ残りの残基については前記ＭＮプロトタイプのサブ配列と少なくとも３６％のホモロジーを有するウイルスのＭＮプロトタイプまたはそのＭＮ変異体ウイルス；（ｂ）ＨＩＶエンベロープ蛋白質の主中和領域内にアミノ酸配列：Ｇ−Ｐ−Ｇ−Ａ１１−Ａ１２（式中、Ａ１１はＲまたはＲを保存的に置換する任意のアミノ酸であり、そしてＡ１２はＡまたはＡを保存的に置換する任意のアミノ酸である。）を含む少なくとも二種のＨＩＶ株；または（ｃ）ＨＩＶエンベロープ蛋白質の主中和領域内にアミノ酸配列：Ｉ−Ａ６−Ａ７−Ｇ−Ｐ−Ｇ−Ｒ（式中、Ａ６およびＡ７は各々独立に任意のアミノ酸を表す）を含む少なくとも二種のＨＩＶ株。２６．該抗体がモノクローナルである、請求項２５記載の方法。２７．該抗体がポリクローナルである、請求項２５記載の方法。２８．真核細胞に感染したとき、第二のＨＩＶ株の主中和領域を含む第一のＨＩＶ株のＨＩＶエンベロープ蛋白質を発現できる、組換えワクシニアウイルスであって、該ウイルスは該エンベロープ蛋白質をコードするＤＮＡを含み、該ＤＮＡは該第二のＨＩＶ株の主中和領域をコードするＤＮＡ配列を含み、該エンベロープ蛋白質コードＤＮＡはワクシニアウイルスプロモーターの転写支配下にある、上記組換えワクシニアウイルス。２９．該ウイルスの該ＨＩＶエンベロープ蛋白質をコードするＤＮＡが組換えベクター由来であり、該ベクターが該エンベロープ蛋白質をコードするＤＮＡ配列を含んでおり、該ＤＮＡが該第二ＨＩＶ株の該中和領域をコードするＤＮＡ配列および該エンベロープ蛋白質ーコードＤＮＡの該ワクシニアウイルスヘの組み込みを生じさせる能力を持つＤＮＡを含んでいる、請求項２８記載の組換えウイルス。３０．該主中和領域が、さらに第三のＨＩＶ株からの少なくとも５つのアミノ酸を含む、請求項２８記載の組換えウイルス。３１．請求項Ｉ記載の抗体の有効量を含んでなる、ＨＩＶに感染した患者を治療するための医薬組成物。３２．さらに薬学的に許容される担体も含む、請求項３１記載の組成物。３３．ヒト免疫不全症ウイルスタイプ１のＭＮ変異体を中和する、ウイルス中和量のヒトモノクローナル抗体を、薬学的に許容される担体物質と共に含有する、ヒト免疫不全症ウイルスに感染したヒト患者の治療剤。３４．該抗体が、（１）ＨＩＶエンベロープ蛋白質の主中和領域内にアミノ酸配列：Ｇ−Ｐ−Ｇ−Ａ１１−Ａ１２（式中、Ａ１１はＲまたはＲを保存的に置換する任意のアミノ酸であり、そしてＡ１２はＡまたはＡを保存的に置換する任意のアミノ酸である）；または（２）ＨＩＶエンベロープ蛋白質の主中和領域内にアミノ酸配列：Ｉ−Ａ６−Ａ７−Ｇ −Ｐ−Ｇ−Ｒ（式中、Ａ６およびＡ７は各々独立に任意のアミノ酸を表す）；を含む少なくとも二種のＨＩＶ株を中和することもできる、請求項３３記載の組成物。３５．該抗体がＨＩＶに感染したヒト患者に由来する不滅化Ｂ細胞により生産される、請求項３３または３４記載の組成物。３６．該Ｂ細胞がエプスタイン・バール・ウイルス（ＥｐｓｔｅｉｎＢａｒｒＶｉｒｕｓ）の感染により不滅化されたものである、請求項３３または３４記載の組成物。３７．ヒト患者にウイルスを中和する量の請求項３３記載のヒトモノクローナル抗体を投与することよりなる、ヒト免疫不全症ウイルスに感染したヒト患者の治療方法。３８．抗一ＨＩＶモノクローナル抗体を用意しＩそして該モノクローナル抗体が該ＨＩＶＭＮのｇｐ１２０エンベロープ蛋白質の主中和傾城を含むフラグメントに結合する能力を試験し、該結合を該抗体がＨＩＶＭＮを中和する能力の指標とする；工程からなる、ＨＩＶＭＮ中和能をもつヒトモノクローナル抗体の入手方法。３９．該抗体がさらに、（１）ＨＩＶエンベロープ蛋白質の主中和領域内に式；Ｇ−Ｐ−Ｇ−Ａ１１−Ａ１２（式中、Ａ１１はＲまたはＲと保存的に置換する任意のアミノ酸を表し、そしてＡ１２はＡまたはＡと保存的に置換する任意のアミノ酸を表す）で表されるアミノ酸配列、または（２）ＨＩＶエンベロープ蛋白質の主中和領域内に式：Ｉ−Ａ６−Ａ７−Ｇ−Ｐ −Ｇ−Ｒ（式中、Ａ６およびＡ７は各々独立に任意のアミノ酸を表す）で表されるアミノ酸配列を含む、少なくとも二種のＨＩＶ株を中和する能力を有する、請求項３８記載の方法。４０．該フラグメントが次のもの：Ｇ−Ｐ−Ｇ−Ｒ−Ａ、Ｇ−Ｐ−Ｇ−Ｒ−Ａ−Ｆ、Ｉ−Ｇ−Ｐ−Ｇ−Ｒ−Ａ、Ｉ− Ａ６−Ａ７−Ｇ−Ｐ−Ｇ−Ｒ−Ａ、Ｉ−Ａ６−Ｉ−Ｇ−Ｐ−Ｇ−Ｒ、Ｉ−Ａ６− Ｉ−Ｇ−Ｐ−Ｇ−Ｒ−ＡおよびＫ−Ｒ−Ｋ−Ｒ−Ｉ−Ｈ−Ｉ−Ｇ−Ｐ−Ｇ−Ｒ− Ａ−Ｆ−Ｙ−Ｔ−Ｔ−Ｋからなる群から選択される、請求項３９記載の方法。４１．第一の試験工程に先立ちもしくはひき続いて、該抗体がＨＩＶＭＮを中和する能力を調べる第二の試験工程をさらに含む、請求項３８または３９記載の方法。４２．該第二の試験工程がシンシチウム形成の抑制に関する試験工程である、請求項４１記載の方法。４３．該フラグメントがｇｐ１２０のＰＮＤに由来するペプチドである、請求項３８または３９記載の方法。４４．該フラグメントが閉じたループを含む、請求項４３記載の方法。４５．該第一または第二試験工程に先立ちもしくはひき続いて、（１）ＨＩＶエンベロープ蛋白質の主中和領域内に式：Ｇ−Ｐ−Ｇ−Ａ１１−Ａ１２（式中、Ａ１１はＲまたはＲと保存的に置換する任意のアミノ酸を表し、そしてＡ１２はＡまたはＡと保存的に置換する任意のアミノ酸を表す）で表されるアミノ酸配列、または（２）ＨＩＶエンベロープ蛋白質の主中和領域内に式：Ｉ−Ａ６−Ａ７−Ｇ−Ｐ−Ｇ−Ｒ（式中、Ａ６およびＡ７は各々独立に任意のアミノ酸を表す）で表されるアミノ酸配列を含む少なくとも一つのＨＩＶＭＮ以外のＨＩＶ株を中和する能力を、該抗体が持つか否か調べる第三の試験工程をさらに含む、請求項４１記載の方法。４６．該配列が、Ｒ−Ｉ−Ｈ−Ｉ−Ｇ−Ｐ−Ｇ−Ｒ−Ａ−Ｆを含みそして該ＭＮプロトタイプのサブ配列の残りの残基と３６％より低いホモロジーを有し、ここで該サブ配列がＫ−Ｒ−Ｋ−Ｒ−Ｉ−Ｈ−Ｉ−Ｇ−Ｐ−Ｇ−Ｒ−Ａ−Ｆ−Ｙ−Ｔ −Ｔ−Ｋを含む、請求項４５記載の方法。