JP2520464B2 - Ｈｉｖ―１を中和するモノクロ―ナル抗体 - Google Patents

Ｈｉｖ―１を中和するモノクロ―ナル抗体

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Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 後天性免疫不全症候群（または「免疫欠損症候群」と
称す場合あり）は、一般にその頭文字エイズ（AIDS）で
知られており、社会において直面する、多分最も重大な
健康を脅かすものである。この病気は痛く、衰弱させる
過程を進行し、そして通常その被害者を死亡させる。事
実、診断以降から、エイズの被害者の平均寿命は２年よ
り少ない。
今日まで、約40,000のエイズのケースは米国において
報告された。ほぼ2000個体の2/3がこの病気で死亡し
た。
エイズは、種々の時中のヒトＴ細胞リンパ栄養性ウイ
ルスIII型（HTLV III）、またはリンパアデノパシー関
連ウイルス（LAV）と呼ばれて来ているウイルスであ
る。このウイルスは現在ヒト免疫欠損ウイルスＩ（HIV
−１）として知られている。米国の公共健康サービスの
病気抑制センターおよび化学のナショナルアカデミーに
より、米国単独において、約1.5百万の人々が1991年ま
でに感染することが推定された。長期間の疫学の研究か
らの結果によると、感染した群の20〜60％は次の５〜６
年以内にエイズを発現するであろうことが示される。例
えば、病気抑制センターは、1991年間でに約300,000の
エイズのケースが存在するでろうことを推定した。
HIV−１は、また、エイズ関係コンプレックス（ARC）
とし臨床的に定義される、多少重大性に劣る免疫欠損症
候群を引き起こす。ARCはしばしばエイズの開始より先
行する。現在エイズより多くのARCのケースが存在す
る。ケースの数は増加し続けるので、ARCは、それ自
体、極めて経費のかかる、重大な健康の問題となるであ
ろう。
HIV−１による感染は被害者の免疫系を損傷し、そし
て究極的に破壊するので、エイズは生ずる。免疫系は、
被害者がもはや日和見感染を防ぐことができない点まで
減少する。被害者を衰弱させかつ死亡させるのは、しば
しば二次感染である。
エイズの患者は、二次感染に対して感受性であること
に加えて、そうでなければ希な状態を発現する。多数は
カポージ肉腫として知られている皮膚癌の希な形態を発
現する。この状態は、また、ウイルスにより生ずる免疫
欠損から発生すると信じられる。
HIV−１は、Ｔヘルパー／インデューサーリンパ球
（以後「Ｔ細胞」と呼ぶ）を感染および欠失することに
より免疫系を損傷する。Ｔ細胞は、Ｂ細胞による抗体の
産生、マクロファージおよび自然キラー細胞の成熟およ
び活性、および、直接および間接に、免疫系の多数の他
の調節およびエフェクター機能を制御するので、必須で
ある。
Ｔ細胞の感染は、HIV−１が有するエピトープとＴ細
胞表面上に位置する受容体部位との間の相互作用により
起こる。この受容体部位は、CD4抗原として知られてい
るタンパク質分子である。HIV−１上のエピトープは、
エンベロープ糖タンパク質gp120（分子量120,000ダルト
ン）により支持される。糖タンパク質gp120は、Ｔ細胞
において作られる前駆体の糖タンパク質gp160がgp41
（分子量41,000ダルトン）とgp120とに分割されると
き、産生する。gp41はほとんど感染した個体において支
配的な抗体応答を誘発するエピトープを有するが、gp12
0が有するエピトープはCD4抗原に結合し、これによりウ
イルスを細胞中に入らせる。
HIV−１はレトロウイルスである。ウイルスは細胞中
に入った後、逆転写酵素と呼ばれるウイルスの酵素は宿
主細胞の核内でウイルスのゲノムRNAをDNAに転写する。
新しく合成されたDNAは鋳型として作用し、そして感染
したＴ細胞は新しいDNAを転写してメッセンジャーRNAお
よびゲノムRNAのコピーを転写させ始める。ウイルスの
ゲノムRNAは、コアタンパク質、逆転写酵素、およびあ
る種の他のタンパク質と共に詰められている。次いで、
これらは細胞膜の一部により包まれ、そして新しく合成
されたヴイリオンとして細胞から血流中へと出芽する。
これらの新しいヴィリオンは他のＴ細胞中に入り、そし
て感染することができる。
HIV−１を感染した個体の体中のＴ細胞に移す、２つ
の既知の機構が存在する。第１は、遊離のウイルスがＴ
細胞上のCD4抗原に結合するとき起こる。第２の機構
は、ウイルスの直接の細胞対細胞の透過である。
直接の細胞対細胞の透過は、ウイルスのgp120をその
表面上で発現する、感染した細胞が感染しない細胞のCD
4抗原と結合するとき、起こる。結局、２つの細胞は融
合し、そしてヴィリオンは感染しない細胞に行くことが
できる。
直接の細胞対細胞の接触および生ずる融合は、細胞の
感染の有意の源であり、そしてHIV−１感染した個体の
Ｔ細胞の破壊の主要な機構であることができる。感染し
た細胞および感染しない細胞は融合してしばしば大きな
群となり、これによりシンシチア（syncytia）として知
られている、多核化した凝集体を形成する。細胞の融合
はシンシチアにおいて細胞の死亡を引き起こす。参照、
リフソン（Lifson） et al.「HTL/III/LAVエンベロープ
糖タンパク質によりCD4−依存性細胞の融合の誘発（Ind
uction of CD4−Dependent Cell Fusion by the HTL−I
II/LAV Envelope Glycoprotein）」、ネイチャー（Natu
re）、323:725−27（1986）。
細胞の死亡の大部分はシンシチアにおいて起こると信
じられる。この理論は次の理由で当てはまる。有意の感
染は他の源、例えば、血流中の遊離のウイルスから起こ
り得ると思われないからである。感染した個体の血流中
の遊離ウイルスの濃度は典型的には低い。また、有意の
細胞の感染は感染した個体および感染しない細胞の明確
な融合から起こり得ると思われない。１つの研究におい
て、感染した個体において感染Ｔ細胞の比率は、通常1
0,000〜100,000個の白血球につき１個のみであることが
発見された。それにもかかわらず、CD4陽性細胞（すな
わち、Ｔ細胞）の数は徐々に減少することが報告され
た。
HIV−１が感染した患者は、有意の量の中和性抗体を
発生しない。それらは、典型的には、血流中に非常に低
い力価の中和性抗体を有する。こうして、HIV−１を中
和するモノクローナル抗体は、処置に特に有用であろ
う。
モノクローナル抗体はハイブリドーマ細胞により産生
される。ハイブリドーマは、すべて単一の融合した細胞
からクローニングされた細胞である。すべてのクローン
は親と同一である。したがって、同一クローンのすべて
のハイブリドーマは、同一エピトープに結合する同一の
抗体を産生する。
モノクローナル抗体をつく方法は、最初に、ケーラー
（Koehler）およびミルステイン（Milstein）により記
載された。参照、ミルステイン（Milstein） et al.、
ネイチャー（Nature）、256:495−97（1975）；ケーラ
ー（Koehler） et al.、ヨーロピアン・ジャーナル・オ
ブ・イムノロジー（Eur.J.Immunol.）、6:511−19（197
6）。宿主動物、通常マウスを抗原で免疫化し、次いで
殺す。次いで、Ｂ細胞を含有するリンパ球を、通常脾臓
または他のリンパ様組織から取り出す。取り出したリン
パ球を骨髄腫細胞と融合してハイブリドーマを形成す
る。免疫感作する抗原の特定エピトープに対する抗体を
産生するハイブリドーマをクローニングし、そしてスク
リーニングする。次いで、これらのハイブリドーマを使
用して、所望のモノクローナル抗体をつくる。
感染性およびシンシチウムの形成を阻害するモノクロ
ーナル抗体は、他の中和剤（または「剤」を「因子」と
いうこともある）より多くの利点を有するであろう。大
量のモノクローナル抗体を産生することができる。ハイ
ブリドーマは、骨髄腫細胞との融合のために不死であ
り、そしてほとんど無限に再生することができる。
モノクローナル抗体の他の利点は、高い特異性および
高い親和性を有するモノクローナル抗体を種々の反応性
および親和性を有する多数の抗体からスクリーニングす
ることができることである。高い特異性および高い親和
性を得ることができる場合、これは最小量で抗体の治療
学的使用を可能とし、この最小量はちょうど適当なエピ
トープに結合してウイルスを中和しかつシンシチアの形
成を防止するために十分な量である。
モノクローナル抗体の高い特異性は、他の中和因子の
それと対照的である。１つの研究において、gp120を包
含する、HIV−１のエピトープの種々のタンパク質で免
疫化したヤギから抗血清を集めた。この抗血清は低い希
釈のみでHIV−１の感染を効果的に遮断した。参照、S.
D.プトネイ（Putney） et al.、「ウイルスのエピトー
プのE.coli産生断片に対するHTLV−III/LAV中和性抗体
（HTLV−III/LAV−Neutralizing Antibodies to an E.c
oli−Produced Fragment of Virus Envelope）」、サイ
エンス（Science）、234:1392−95（1986）。同様に、
組み換え体gp120で免疫化したウサギおよびモルモット
からの抗血清は、低い希釈のみでHIV−１の中和に有効
であった。参照、L.A.ラスキー（Lasky） et al.、「組
み換え体エンベロープ糖タンパク質に対する抗体による
エイズレトロウイルスの中和（Neutralization of the
AIDS Retrovirus by Antibodies to Recombinant Envel
ope Glycoprotein）」、サイエンス（Science）、233:2
09−212（1986）。これらの研究において使用したポリ
クローナル抗体は、非特異的であり、したがって比較的
大量に使用しなくてはならなかった。
上の結果が示唆するように、全体のgp120および長い
組み換え体ペプチドは、多分「中和性エピトープ」が免
疫原性でないので、高い中和抗体を誘発することができ
ない。そのうえ、抗体は型特異的であり、そして群特異
的ない、すなわち、それらは免疫感作（「免疫化」と称
する場合もある）するHIV−１株（「株」は「菌株」と
称する場合もある）のみと反応し、そして遺伝的に有意
に異なる他の株と反応しないことが発見された。
エイズにおいて治療および予防の目的でモノクローナ
ル抗体を使用するためには、それは種々のHIV−１菌株
およびフィールド（field）のHIV−１分離物の大きい数
および有意の比率に対して保護活性を示さなくてはなら
ない。
要約すると、エイズまたはARCをもつ患者を処置する
ために潜在的価値をもち、無症候性の健康なHIV−１感
染個体におけるエイズの予防において、あるいは高い危
険の群の個体においてHIV−１感染の予防において保護
的価値を有するモノクローナル抗体は、遊離のヴィリオ
ンにより攻撃を経るか、あるいは直接の細胞対細胞の透
過（シンシチウムの形成）により、HIV−１の広い菌株
による感受性細胞の感染を阻害するものである。
発明の要約 HIV−１のウイルスのgp120エンベロープ糖タンパク質
に結合するモノクローナル抗体が分離された。このモノ
クローナル抗体は、遊離ヴィリオンによるＴ細胞の感染
を阻害し、そして、また、シンシチウムの形成を阻害す
る。重要なことには、モノクローナル抗体は群特異的で
あり、そしてHIV−１の異なる菌株または異なる分離物
を中和することができる。
HIV−１中和性抗体は、エイズおよびARCの処置および
HIV−１感染に対する受動免疫化のための使用すること
ができる。これらの手順において、抗体は全抗体とし
て、または抗体断片として使用することができるか、あ
るいは細胞障害性因子または抗ウイルス因子に、か、あ
るいはこのような因子を含有するマイクロキャリヤーと
複合化（また、「複合化」と「接合」もしくは「結合」
と称す場合あり）してこれらの因子を感染した細胞に供
給することができる。治療因子の標的への供給は、ま
た、標的に供給すべき因子に対する第２特異性を与え
た、本発明の抗HIV−１抗体から誘導された二特異的（b
ispecific）抗体を使用して達成することができる。中
和性抗体のパラトープに対するポリクローナル抗体また
はモノクローナル抗体を使用して、HIV−１に対する中
和性免疫応答を刺激することができる。
本発明のモノクローナル抗体は、マウスまたは他の動
物から完全に誘導された抗体として生体内で使用するこ
とができる。あるいは、ことに治療的使用のため、ウイ
ルス中和性抗体は動物／ヒトキメラ抗体の形態でつくる
ことができる。好ましくは、キメラ抗体の定常領域（以
下、「定常」を「一定」と称す場合あり）はヒト誘導性
であり、そして可変領域は動物誘導性である。
本発明のモノクローナル抗体は、連続の、安定な抗体
産生細胞系により産生される。これらの細胞系は、ハイ
ブリドーマ技術により、および遺伝子工学の技術により
作出することができる。
本発明は、また、本発明の抗体により認識されるgp12
0のエピトープセグメントに相当するペプチドに関す
る。ペプチドはHIV−１に対する交差保護性、中和性免
疫応答を発生するためのワクチン組成物において使用す
ることができる。それらは、また、生物学的分野におい
てHIV−１に対する中和性抗体を検出するために使用す
ることができる。
図面の簡単な説明 第１図は、H9細胞のHIV−１感染の中和における本発
明のモノクローナル抗体の４つの相対的有効性を示すプ
ロットである。感染した細胞の百分率は、感染の９日後
に決定した。
第２図は、H9細胞のHIV−１感染の中和における本発
明のモノクローナル抗体の４つの相対的有効性を示すプ
ロットである。感染した細胞の百分率は、感染の13日後
に決定した。
第３図は、キメラHIV−１中和性抗体についての軽鎖
および重鎖をエンコードするキメラ遺伝子の構造の概略
的描写である。（Ａ）プラスミドpSV184ΔHneo.BAT123V
K．CKはヒトCK遺伝子と融合したマウスVKゲノムの4.4kb
pHindIII断片から成るキメラ軽鎖遺伝子の構造を含有す
る。このプラスミドは、neo選択マーカーを含有する。
（Ｂ）プラスミドpSV2ΔHgptBAT123VHhＣγ 1は、ヒトＣ
γ 1ゲノムと融合したマウスVHの4.5kbpのEcoRI断片を含
有する。プラスミドはEcogpt選択マーカーを含有する。
B:BamHI、E:EcoRI、H:HindIII、S:SalI、V:可変領域の
遺伝子、C:一定領域。
第４図は、キメラHIV−１中和性抗体（レーン２）お
よびネズミモノクローナル抗体BAT123（レーン１）の等
電点電気泳動のパターンを示す。Ｓはカソード（上部）
からアノード（下部）へのpI値を使用するpH目盛り定め
標準タンパク質を表す:8.65、8.45、8.15、7.35、6.8
5、6.55、5.85、5.20、4.55および3.50。
第５図は、キメラ免疫グロブリンの電気泳動の分析を
示す。（Ａ）ｒ−プロテインＡ親和クロマトグラフィー
により精製した免疫グロブリンは10％SDS−ポリアクリ
ルアミドゲルの電気泳動により、ジサルファイド結合を
還元するか、あるいはしないで分析した。レーン１、BA
T123、還元した；レーン２、キメラ抗体、還元した；レ
ーン３、BAT123、還元しない；レーン４、キメラ抗体、
還元しない。（Ｂ）抗マウス抗体に対する免疫グロブリ
ンの免疫反応性のウェスタンブロット分析。精製した免
疫グロブリン（２μｇ）を10％のSDS−PAG中和に還元性
条件下に溶解し、ニトロセルロース膜のフィルター上に
電気トラスブロットし、そして抗マウス抗体と反応させ
た。レーン１、BAT123、レーン２、キメラ抗体。（Ｃ）
（Ｂ）からの反復実験のトラスブロットした膜を抗ヒト
抗体と反応させた。レーン１、BAT123;レーン２、キメ
ラ抗体。
第６図は、ELISAにおける抗血清に対するその反応性
によりアッセイした、キメラ抗体のIgGサブクラスを示
す。使用する抗血清は（●）IgG1、（○）抗ヒトIgG3で
あった。
第７図は、キメラ抗体の抗原特異性のウェスタンブロ
ットを示す。（Ａ）SDS−PAGE中に溶解し、そしてニト
ロセルロース膜のフィルター上にトラスブロットしたHI
V−１抗原に対する免疫グロブリンの免疫反応性。スト
リップ１、エイズ患者の血清（1:200希釈）、ストリッ
プ２、BAT123（１μg/ml）；ストリップ３、キメラ抗体
（１μg/ml）。（Ｂ）ニトロセルロース膜のフィルター
上にブロッティングしたHIV−gp120の潜在的抗原決定基
（エピトープ）を表す合成オリゴペプチドに対する抗体
の反応性。ストリップ１、BAT123;ストリップ２、キメ
ラ抗体。
第８図は、HIV−１によるH9細胞の感染へのキメラ抗
体の中和活性を示す。試験した抗体の不存在下におよび
存在下にHIV−１でH9細胞を対抗した後、細胞不含培養
上澄み液を第14日にHIV−１特異的抗原捕捉アッセイの
ために集めた。抗体の濃度の各々を３回の反復実験にお
いて試験した。HIV−１の感染の阻害は、抗体を添加し
ない陰性の対照に対して、抗体の存在下にウイルスで感
染した培養物の抗原捕捉アッセイにおいて得られた光学
密度により計算した。試験した抗体はBAT123（○）、キ
メラ抗体cAG1−54−４（●）、および非反応性ネズミ抗
hcG抗体（△）であった。
発明の詳細な説明 Ａ、使用した手順の要約 本発明のモノクローナル抗体はウイルスのエピトープ
糖タンパク質gp120に結合する。感染したＴ細胞におけ
るHIV−１特異的エピトープタンパク質の処理におい
て、gp41はトランスメンブレンドメインであり、そして
露出していない。対照的に、gp120は細胞外である外部
エンベロープタンパク質である。こうして、感染したＴ
細胞において、gp120タンパク質は本発明のモノクロー
ナル抗体のための結合性エピトープを提供する。
本発明のモノクローナル抗体は、感染の阻害およびシ
ンシチウムの形成の阻害において有効であることが分か
った。これが示すように、それらは、細胞の死亡の大部
分がシンシチウムにおいて起こると信じられるので、生
体内中和のために非常に有効であるであろう。重要なこ
とには、抗体はHIV−１の異なる菌株または異なる分離
物を中和することができる（すなわち、抗体群特異的で
ある）。抗体はウイルスの異なる菌株または異なる分離
物による細胞の感染を中和する。中和性抗体は、また、
gp120のアミノ酸配列中に実質的な程度の異質性を有す
るHIV−１の種々の菌株によりシンシチウムの形成を阻
害する。これらの結果が示すように、抗体は交差保護性
であり、そして集団中のウイルスの種々の菌株に対して
保護することができる。
本発明の中和性抗体は感染の中和において高い効能を
有することができる。例えば、モノクローナル抗体は、
９日のアッセイにおいて20倍のTCID50においてHIV−1B
による感受性ヒトＴ細胞系の感染を、10μg/mlより低い
IC50で、阻害することができる。
抗体の産生の一般手順を下に記載する。
本発明のモノクローナル抗体は、ハイブリドーマの産
生において普通の使用される慣用の手順によってつくっ
た。簡単に述べると、マウスを不活性化したHIV−１で
免疫化した。免疫化したマウスの脾臓から取ったＢ細胞
をNS−１骨髄腫細胞と融合した。カルシウムマグネシウ
ム不含リン酸塩緩衝液（PBS）中のジメチルスルホキシ
ド（DMSO）と混合したポリエチレングリコールを、融合
試薬として使用した。次いで、融合から発生したハイブ
リドーマを96ウェルのマイクロタイタープレートに移
し、そして増殖させた。
HIV−１を中和するモノクローナル抗体を産生するハ
イブリドーマを、１系列のスクリーニング手順により分
離した。第１に、酵素結合免疫吸収アッセイ（ELISA）
をすべてのウェルにおけるクローンについて実施した。
この試験において、これらのクローンにより産生された
モノクローナル抗体が精製したgp120に結合するかどう
かを決定した。gp120との最高の反応性を示すウェルか
らのクローンを、免疫蛍光アッセイによるそれ以上のス
クリーニングのために選択した。
免疫蛍光アッセイを実施して、ELISA陽性のモノクロ
ーナル抗体のどれが完全な生きている感染したＴ細胞に
対して特異的に結合するが、感染しないＴ細胞に結合す
るかを決定した。免疫蛍光陽性であることが分かったク
ローン、すなわち、感染した細胞に対して特異的である
抗体を産生したものを単一の細胞のクローニングにおい
て使用した。
単一の細胞のクローニングにおいて、クローンを希釈
して、所定の体積に当り数個の細胞が存在するようにす
る。次いで、この体積をウェルに添加し、そして細胞を
増殖させる。この目的は、あるウェルにおいて、単一の
細胞のコロニー／ウェルのみを二項分布により不規則に
達成することである。細胞のコロニーを顕微鏡で視的に
監視して、それがモノクローナルであるかどうかを決定
する。
ELISA陽性のクローンを、また、ウェスタンブロット
分析において試験した。この手順において,HIV−１タン
パク質のリゼイトをゲル電気泳動により分離し、そして
ニトロセルロースのストリップ上に移した。次いで、EL
ISA陽性ウェルの上澄み液を、ストリップ上でgp120タン
パク質バンドとの反応性について試験する。
これらのスクリーニング工程の結論において、gp120
および感染した細胞に対して特異的であるモノクローナ
ル抗体は分離された。
次いで、免疫蛍光陽性のハイブリドーマをマウスの腹
腔中に注入して、腹水から大量のモノクローナル抗体を
産生した。次いで、抗体を中和のアッセイのために精製
した。
上の免疫化、融合、スクリーニング、および抗体産生
の方法のある数の変更は可能である。例えば、マウス以
外の動物を免疫化に使用することができる。次いで、Ｂ
細胞は融合のために使用するために免疫化した動物から
得ることができる。
さらに、前述のもの以外の試薬を化学的融合に使用す
ることができる。別の方法はハイブリドーマの形成に化
学的融合以外の電気的融合を使用することである。この
技術はよく知られている。融合の代わりに、例えば、エ
プステインバールウイルスまたは遺伝子の形質転換を使
用して、不死にすることができる。［例えば、Ｂ細胞の
形質転換法、参照、「前以て決定した特異性の抗体を合
成するヒト細胞系の連続的増殖（Continuos Proliferat
ing Human Cell Lines Syntetizing Antibody of Prede
termined Specificity）」、ズラワキ（Zurawaki）、V.
R. et al.、モノクローナル抗体（Monoclonal Antibodi
es）、ケンネンット（Kennet）R.H.編、Plenum Press、
ニューヨーク、19−33ページ。］ ELISA、免疫蛍光アッセイ、およびウェスタンブロッ
ト分析に関して、すべての工程のいつかの変更は可能で
あることに注意すべきである。スクリーニングの工程の
数を増減することができる。あるいは、記載したものの
代わりに、他のスクリーニング手順、例えば、ラジオイ
ムノアッセイ、または免疫組織化学的染色技術を使用す
ることができる。重要な考察は次のことである。すなわ
ち、gp120に対して特異的でありかつHIV−１感染したＴ
細胞の細胞表面に特異的に結合するモノクローナル抗体
を分泌するハイブリドーマについて、この手順は選択す
る。
単一の細胞のクローニング手順は、種々の数の細胞を
ウェルの各々中に配置するように変更することができ
る。事実、ウェルの各々にだだ１つのクローンが存在す
るかどうかについての試験は、また、ある数の方法によ
り実施することができる。
モノクローナル抗体を産生する方法、すなわち、マウ
スへのハイブリドーマの注入は、また、変更することが
できる。パフュージョンまたは中空繊維の技術を使用す
る培養において、大量のモノクローナル抗体を増殖する
ことは可能である。
gp120および完全な、生きている感染した細胞に対し
て特異的なモノクローナル抗体の前述の方法による分離
後、HIV−１の中和において抗体の有効性を試験した。
免疫蛍光陽性であったクローンの各々からのモノクロー
ナル抗体を分離した。モノクローナル抗体の存在または
不存在でHIV−１により感染した細胞の数を比較した。
抗体の各々の異なる力価を使用して、それらの効能を比
較した。中和アッセイを免疫蛍光技術により監視した。
中和の第２試験はシンシチウムの阻害による。シンシ
チウム阻害のアッセイにおいて、CD4遺伝子およびそれ
らの表面上のCD4抗原で人工的にトランスフェクション
した、トランスフェクションしたHeLa細胞を接種したウ
ェルに、感染したＴ細胞を添加した。細胞表面上のCD4
抗原は感染したＴ細胞と融合して、多核化した巨大細胞
を形成した。異なる力価の免疫蛍光陽性抗体が巨大細胞
の形成を阻害するかどうかを決定した。
中和アッセイおよびそれらの監視手順の大量の変更は
可能である。例えば、シンシチウムの形成のみに関し、
そして遊離ヴィリオン粒子による感染に無関係である場
合、一方のみを試験し、他方は試験することは望ましく
ないであろう。
抗体をこれらのアッセイにおいて、異なる菌株および
分離物の中和について試験する。
結論において、本発明の産生物の種々の調製および試
験の方法は可能であり、そして本発明の範囲内である。
本発明のモノクローナル抗体の利点および使用をここで
説明する。
Ｂ、利点および使用 前述のように、モノクローナル抗体の１つの利点はそ
れらの特異性である。この特異性は治療における本発明
のモノクローナル抗体の使用に高度に関係する、なぜな
ら、それはより低い投与量を使用することができること
を意味するからである。
本発明のモノクローナル抗体の治療的使用は、生体内
の免疫治療および体外の免疫治療の両者を包含する。本
発明のモノクローナル抗体を使用する直接生体内処置
は、それらを内部に、好ましくは静脈内注射を経て投与
することを包含する。脳内の感染した細胞の処置が必要
である場合、血液−脳バリヤーの通過を可能とする因
子、例えば、ある種の親油性物質にモノクローナル抗体
を結合することができる。本発明の抗体はHIV−１の異
なる菌株または異なる分離物を中和するすることがで
き、こうして、患者の集団において直面するウイルスの
異なる菌株または異なる分離物に対して有効的に保護す
ることができる。
体外の治療において、血液白血球を患者から取り出
し、そして中和性抗体で処理する。次いで、モノクロー
ナル抗体を白血球に添加する。白血球は、また、免疫強
化剤、例えば、インターロイキン−２で刺激することが
できる。次いで、白血球を患者に戻す。
本発明のマウス誘導モノクローナル抗体は、直接の生
体内および体外の免疫治療の両者のために使用すること
ができる。しかしながら、マウス誘導モノクローナル抗
体を治療剤としてヒトにおいて使用するとき、患者はヒ
ト抗マウス抗体を産生することが観察された。こうし
て、マウス誘導モノクローナル抗体は、少なくともある
場合において、制限された治療的価値を有すると言え
た。参照、V.T.オイ（Oi） et al.、「キメラ抗体（Chi
meric Antibody）」、バイオテクニークス（Bio Techni
ques）、4（３）:214−221（1986）。しかしながら、発
表された遺伝子工学の技術を使用すると、動物誘導部分
およびヒト誘導部分を有する抗体をつることができる。
キメラ抗体は、動物抗体から誘導された抗原結合（可
変）領域およびヒト抗体から誘導された一定領域からな
る。ウイルス中和性抗体の産生を下に記載する。
モノクローナル抗体の他の別の形態は、二特異的抗体
である。二特異的抗体は２つの異なる抗原結合部分を有
し、両者は異なる特異性をもつ。二特異的モノクローナ
ル抗体は、本発明のモノクローナル抗体から誘導された
１つの抗原結合部分、および特定の部位に対して標的化
すべき因子に対して特異的である第２抗原結合部分を有
することができる。例えば、第２特異性はヒトＴ細胞ま
たはマクロファージ、例えば、CD4分子の表面エピトー
プに対することができる。これらの二特異的抗体はＴ細
胞またはマクロファージをHIV−１感染した細胞に向け
て標的化するために使用できる。
二特異的抗体は単一の、雑種抗体または二特異性を有
する抗体断片であることができる［参照、M.ブレンナン
（Brennan）、「マウスモノクローナルIgG1のFab′断片
からの二特異的抗体の調製のための化学的技術（Chemic
al Techneque for the Preparation of Bispecific Ant
ibodies from Fab′ Fragment of Mouse Monclonal IgG
1）」、バイオテクニークス（Bio Techniques）、4
（３）:424−27（1986）］か、あるいはそれらは各々が
異なる特異性を有する２つの抗体の異質凝集体であるこ
とができる。
免疫治療抗体処置を受ける潜在的な患者の集団は、エ
イズまたはARCを有する患者を包含する。種々の治療は
受動免疫化による保護である。本発明の抗体は、集団に
おける異なる菌株のHIV−１に対して交差保護性である
ことができるので、受動免疫化にとくに適当である。こ
の手順において、無症候性である（エイズまたはARCの
症候をまだ示さない）か、あるいは血清陰性であるが、
高い危険の群である患者を処置して感染を阻害すること
ができる。標的はHIV−１キャリヤーの母親の中の胎児
またはその子供およびエイズの患者または血液製品とと
もに働く専門家、例えば、歯科医および看護婦を包含す
る。処置のための因子は、再び、本発明のモノクローナ
ル抗体、キメラのネズミ／ヒトモノクローナル抗体、ま
たは二特異的モノクローナル抗体であることができる。
エイズを停止しようとする努力における研究の大部分
は、ワクチン組成物の研究に集中されてきた。提案され
たワクチン組成物の１つの型において、免疫化因子はHI
V−１の一部であり、それは非感染性であるが、それに
もかかわらず抗体の産生を誘発する。HIV−１を中和す
るモノクローナル抗体はこのワクチン組成物の研究を助
けることができる。それらは、モノクローナル抗体と結
合するHIV−１上の「中和性」エピトープを探索し、同
定し、そして研究することを助けることができる。これ
らのエピトープは非感染性であるが、それにもかかわら
ず分子の免疫原性部分であるようである。これらのエピ
トープは、エピトープと同一であるか、あるいはそれと
免疫学的に同等である構造をもつ、非病原性免疫原の合
成を可能とする。例えば、免疫原は、HIV−１を中和す
る抗HIV−１抗体により結合されたエピトープと同一で
あるか、あるいはそれに類似する、アミノ酸配列からな
るペプチドであることができる。
今回、本発明の中和性抗体の２つは、次のアミノ酸配
列を有するgp120の領域に位置するエピトープを認識す
ることが発見された： RPNNNTRKSIRIQRGPGRAFVTIGK このセグメントはgp120の25アミノ酸残基長さのセグメ
ント（残基＃284−残基＃308）を表す。１つの抗体（BA
T267）は配列RPNNNTRKSIRIQRG（ペプチドａ）と反応
し、そして他方の抗体（BAT123）はRIQRGPGRAFVTIGK
（ペプチドｂ）と反応する。
これらの２つの15アミノ酸残基の長さのペプチドは、
HIV−1Bのgp120の２つの隣接し、オーバーラップするセ
グメントを表す。ペプチド「ａ」は残基＃294−残基＃3
08のセグメントを表し、そしてペプチド「ｂ」は残基＃
304−残基＃318を表す。BAT267はペプチド「ａ」と反応
し、そして５つのアミノ酸RIQRGを共有するペプチド
「ｂ」、またはペプチド「ａ」に隣接するgp120のセグ
メント（残基＃284−残基＃298）を表しかつ５つのRPNN
Nを共有する他の15アミノ酸長さのペプチドと反応しな
い。これらの結果が示唆するように、BAT267はエピトー
プを認識し、このエピトープは５アミノ酸残基TRKSIの
すべてまたは一部により完全に支持されるか、あるいは
これらの５アミノ酸のすべてまたは一部と幾つかのフラ
ンキングアミノ酸残基とで形成される。同様な結果に基
づいて、BAT123は、PGRAFのすべてまたは一部により支
持されるか、あるいはPGRAFのすべてまたは一部と幾つ
かのフランキングアミノ酸残基とにより形成されるエピ
トープと反応するものとみなされる。
BAT085抗体は、アミノ酸配列VQKEYAFFYKLDIIPを有す
るペプチドと反応する。
本発明のペプチドの免疫原は、上に同定したアミノ酸
配列またはそれらの免疫化学的および免疫原的同等体か
らなる。これらの同等体は、例えば、これらの配列のい
ずれかの実際のエピトープ部分、種々のHIV−１菌株か
らの対応するペプチド領域および種々の変化により発生
したペプチド、例えば、インターフェロン、欠失体およ
びアミノ酸の置換体を包含する。
本発明のペプチドは一緒に結合して、より大きい、多
価のオリゴペプチドを形成することができる。
ペプチドは化学的合成により調製することができる。
あるいは、それらは組み換えDNA技術により調製するこ
とができ、ここでペプチドをエンコードするDNA配列をH
IV−1 DNAから合成し、そして適当な発現系において発
現させる。
ペプチドは、また、個々にまたは組み合わせで使用し
て、HIV−１に対する免疫応答を誘発することができ
る。この目的で、ペプチドを一般に投与のためのワクチ
ン組成物中で、１μｇ〜20mg/kg宿主の濃度で配合する
ことができる。生理学的に許容されうるベヒクル、例え
ば、水、生理食塩水（以下、「生理的塩類溶液」と称す
場合もある）、またはリン酸緩衝化生理食塩溶液（以
下、「リン酸塩緩衝塩類溶液」という場合もある）を配
合において使用することができる。アジュバント、例え
ば、アルミニウム水酸化物のゲルを、また、使用するこ
とができる。投与のルートは筋肉内、腹腔内、皮下また
は静脈内であることができる。組成は１回または多数回
で、通常１〜４週の間隔で投与することができる。
ワクチン組成物の好ましい実施態様において、ペプチ
ドを担体タンパク質、例えば、異質キーホールリンペッ
トのヘモシアニン（keyhole limpet hemocyanin）に結
合する。これはハプテンタンパク質の免疫原性を増大す
る。
ペプチドはイムノアッセイにおいて使用して、中和性
抗体を同定するか、あるいは血清中の中和性抗体の存在
をスクリーニングすることができる。
HIV−１を中和するモノクローナル抗体が可能とする
ワクチンの他の型は、抗イディオタイプ抗体である。抗
体は、それら自体抗原性であり、かつ抗体の産生を刺激
することができる領域、「イディオタイプ」を、それら
の抗原認識部位付近に有する。抗原結合部位に対して特
異的である抗体は、パロトープ（parotope）特異的抗イ
ディオタイプ抗体と呼ぶ。これらの抗体は、最初に抗体
の産生を刺激した抗原と同一のコンフォメーションを有
する。参照、J.L.マルクス（Marx）、「抗原なしの抗体
の産生（Making Without Antigens）」、サイエンス（S
cience）、288:162−65（1986）。
こうして、HIV−１と同一の構造を部分的にもつ、パ
ロトープ特異的抗イディオタイプ抗体は、動物をHIV−
１に対するモノクローナル抗体で免疫化することによっ
てつくることができる。これらの抗イディオタイプ抗体
は、ウイルスの免疫原性部分と同一のある種の構造を有
し、免疫応答を引き起こすであろうから、ワクチンとし
て使用するために適するであろう。有利には、これらの
抗イディオタイプ抗体はタンパク質から成り、そしてウ
イルスの核酸もたないので、病原性にほとんど無関係で
あろう。可変領域がマウスモノクローナル抗イディオタ
イプ抗体であり、そして一定領域がヒト免疫グロブリン
である、キメラマウス／ヒト抗イディオタイプ抗体はよ
り好ましい。
本発明のモノクローナル抗体は、例えば、マイクロキ
ャリヤーまたはリポソーム中に組み込むことによって、
細胞障害因子または抗ウイルス因子を供給することを促
進するために使用することができる。細胞障害因子の例
は、細胞障害性ステロイド、ガラニン、アブリン、リシ
ンおよびホスホリパーゼを包含する。抗ウイルス因子は
インターフェロン、アジドチミジンおよびリボビリンで
ある。また再び、キメラマウス／ヒトモノクローナル抗
体、または二特異的モノクローナル抗体は、また、薬物
の供給の促進に適する。
普通の意味において、モノクローナル抗体を包含する
抗体は、体液性免疫の仲介因子と呼ばれる。しかしなが
ら、標的細胞上の独特の細胞表面抗原に対して特異的で
ある抗体は、細胞溶解因子または細胞障害性因子に接合
することができるので、生ずる免疫毒素は実際に細胞性
免疫を仲介することができる。細胞障害性Ｔリンパ球
は、抗原特異的細胞免疫性の重要な仲介体であり、ウイ
ルス感染した細胞を認識しそして溶菌する。こうして、
適切な操作を使用すると、感染した細胞表面上で発現さ
れたウイルスの抗原エピトープは、細胞障害性Ｔリンパ
球の主要な機能を達成することができる。
Ｃ、キメラウイルス中和性抗体（免疫グロブリン）の産
生 本発明のキメラウイルス中和性免疫グロブリンは、キ
メラの免疫グロブリンの重鎖および軽鎖から構成されて
いる。キメラ鎖の各々は、非ヒト可変領域およびヒト一
定領域を有する、隣接するポリペプチドである。キメラ
の重鎖および軽鎖は関連して、機能的な抗原結合領域を
もつ分子を形成する。
キメラ免疫グロブリンは一価、二価または多価である
ことができる。一価の免疫グロブリンはキメラの軽鎖
（Ｌ）と関連した（ジサルファイド架橋を通して）キメ
ラの重鎖（Ｈ）から形成された二量体（HL）である。二
価の免疫グロブリンは２つの関連する二量体から形成さ
れたテトラマー（H2L2）である。多価の抗体は、例え
ば、凝集する重鎖の一定領域（例えば、mu型一定領域）
を使用することによって産生することができる。
キメラ免疫グロブリンは抗原結合断片として産生する
ことができる。断片、例えば、Fab、Fab′またはＦ（a
b′）2は適当に切頭した重鎖一定領域を使用することに
よって産生することができる。
キメラ免疫グロブリンの可変領域は、所望のウイルス
特異性およびウイルス中和性を有する、非ヒト免疫グロ
ブリンから誘導される。好ましい実施態様において、親
抗ウイルス免疫グロブリンはウイルスの異なる菌株また
は異なる分離物を中和する。これは、ウイルスの集団に
おいて直面する、異なる型、菌株および分離物のウイル
スに対する交差保護性を提供する。
キメラウイルス中和性抗体を産生することができる、
重要な病原性ウイルスは、HIV、ヒトＴ細胞リンパ栄養
性ウイルスＩ（成人のＴ細胞白血病の病原性因子）、お
よびＢ型肝炎ウイルスである。
HIV中和性免疫グロブリンは前述した。これらのHIV中
和性抗体は、HIV−１の糖タンパク質gp120と特異的に反
応する；それらは遊離ヴィリオンによるＴ細胞の感染を
阻害し、そしてHIV−１感染細胞との融合によるＴ細胞
の感染を阻害する。抗体は、交差中和性であるので、す
なわち、HIV−１の異なる菌株または異なる分離物を中
和するので、好ましい。例えば、抗体BAT123は、中和活
性および交差菌株反応性をもつので、好ましい。BAT123
抗体は、10ng/mlより低いIC50で、９日のアッセイにお
いてTCID50の20倍でHTLV−111 B菌株による、感受性ヒ
トＴ細胞系、H9の感染を阻害する。抗体は、また、幾つ
かの他のクローニングしたHIV−１菌株を阻害し、そし
て患者からの広い、新しく分離したフィルドHIV−１試
料の生体外複製を阻害する。
キメラ免疫グロブリンの重鎖一定領域は、５つのアイ
ソタイプのアルファ、デルタ、エプシロン、ガンマまた
はミューから選択することができる。種々のサブクラス
（例えば、IgGサブクラス１〜４）の重鎖を使用するこ
とができる。重鎖の異なるクラスおよびサブクラスは異
なるエフェクター機能において含まれ、こうして、重鎖
の一定領域の型を選択することによって、所望のエフェ
クター機能をもつキメラ抗体を産生することができる。
本発明のキメラ免疫グロブリンは、遺伝子操作技術によ
り産生される。適当な受容体細胞を、好ましくは所望の
キメラ軽鎖または重鎖をエンコードする核酸構成体、例
えば、DNAでトランスフェクションする。一般に、キメ
ラ免疫グロブリンの軽鎖および重鎖の構成体の各々のた
めのDNA構成体は第1DNAセグメントおよび第2DNAセグメ
ントからなり、前記第1DNAセグメントは可変領域の少な
くとも機能的部分をエンコードし、そして第2DNAセグメ
ントに結合し、そして第2DNAセグメントは一定領域の少
なくとも一部分をエンコードする。融合した遺伝子を、
適当な受容体細胞のトランスフェクションのための発現
ベクターにアセンブリングするか、あるいはその中に挿
入する。
好ましい実施態様において、融合した遺伝子構成体
は、免疫グロブリン鎖ん一定領域をエンコードする遺伝
子に結合した、ウイルス中和性免疫グロブリンの鎖の可
変領域をエンコードする、機能的に再配置された遺伝子
からなる。構成体は、また、可変領域エンコード遺伝子
のための内因性プロモーターおよびエンハンサーを包含
するであろう。例えば、可変領域エンコード遺伝子は、
リーダーペプチド、軽鎖のためのVJ遺伝子（接合する
（Ｊ）セグメントをもつ機能的に再配置された可変
（Ｖ）領域）または重鎖のためのVDJ遺伝子、およびこ
れらの遺伝子のための内因性プロモーターおよびエンハ
ンサーからなる、DNA断片として得ることができる。こ
れらの可変領域の遺伝子は、標準のDNAクローニング手
順によりジサルファイドウイルス中和性抗体を産生す
る、抗体産生細胞から得ることができる。参照、モレキ
ュラー・クローニング（Molecular Cloning）:A Labora
tory Manual、,T.Maniatis et al.、コールド・スプリ
ング・ハーバー・ラボラトリー、コールド・ハーバー
（Cold Spring Harbor Laboratory）（1982）。機能的
に再配置された可変領域のためのゲノムのライブラリー
のスクリーニングは、適当なDNAプローブ、例えば、マ
ウス生殖系列のＪ領域DNA配列および下流の配列を使用
して達成することができる。次いで、正しいクローンの
同定および確証は、クローニングした遺伝子のDNA配列
決定および完全な長さの適切に切継ぎされたmRNAの対応
する配列に対する前記配列の比較により達成される。機
能的に再配置された可変領域の遺伝子を含有するDNA断
片を、所望の一定領域（またはその一部分）をエンコー
ドする遺伝子を含有するDNA断片に結合する。
抗体の軽鎖および重鎖をエンコードする遺伝子は、一
般に、免疫グロブリン産生リンパ様細胞から得ることが
できる。所望のウイルスに対する抗体を産生するハイブ
リドーマの細胞系は、標準の手順によりつくるすること
ができる。参照、コプロウスキー（Koprowski） et a
l.、米国特許第4,196,265号。一般に、これらは、動物
をウイルスまたは精製もしくは部分的に精製したウイル
ス抗原で対抗させ、免疫化した動物から取った抗体産生
細胞を適合性の骨髄腫細胞と融合してハイブリドーマ細
胞を形成し、生ずるハイブリドーマ細胞をクローニング
し、そしてウイルスに対する抗体を産生するクローンを
選択することを伴う。ハイブリドーマのクローンは、特
定のウイルスに対する中和活性について試験することに
より、ウイルス中和性抗体の産生についてスクリーニン
グすることができる。例えば、HIV中和抗体接合体につ
いての幾つかの生体外アッセイをここに記載する。
ヒト一定領域は、標準の遺伝子クローニング技術によ
り抗体産生細胞から得るすることができる。ヒト軽鎖の
２つのクラスおよびヒト重鎖の５つのクラスのための遺
伝子をクローニングし、こうして、ヒト由来の一定領域
はこれらのクローンから容易に入手可能である。キメラ
免疫グロブリンの断片、例えば、一価のFv、FabまたはF
ab′断片または二価のＦ（ab′）2断片は、切頭した形
態でキメラ重鎖遺伝子を設計することによって調製する
ことができる。例えば、Ｆ（ab′）2重鎖をエンコード
するキメラ遺伝子は、CH1ドメンをエンコードするDNA配
列および重鎖のヒンジ領域の少なくともスルフヒドリル
含有部分を包含する。
軽鎖または重鎖のいずれかをエンコードする融合した
遺伝子を、受容体細胞中への組み込みのために、発現ベ
クターにアセンブリングするか、あるいはその中に挿入
する。キメラ遺伝子構成体のための適当なベクターは、
型pBR322、pEMBLおよびpUCのプラスミドを包含する。プ
ラスミドベクター中への遺伝子構成体の導入は、標準手
順により達成することができる。
好ましい実施態様において、発現ベクターは２つの選
択可能な遺伝子のマーカーを含有するように設計し、１
つは原核生物（バクテリア）系において選択のためのも
のであり、そして他方は真核生物系における選択のため
のものである。融合した遺伝子は、バクテリア系におい
て産生しかつ増幅し、引き続いて組み込み、そして真核
生物の細胞において選択することができる。原核生物系
のために選択可能な例は、アンピシリン抵抗性を与える
遺伝子およびクロラムフェニコール抵抗性を与える遺伝
子である。真核生物のトランスフエクシヨン体の選択の
ための２種の遺伝子、（ｉ）キサンチン−グアニンホス
ホリボシル−トランスフェラーゼ遺伝子（gptと表示す
る）および（ii）Tn5からのホスホトランスフェラーゼ
遺伝子（neoと表示する）が好ましい。gptを使用する選
択は、この遺伝子によりエンコードされた酵素がキサン
チンをプリンヌクレオチド合成のための基質として使用
する能力に基づく；類似の内因性酵素はそれが不可能で
ある。キサンチンおよびイノシンモノホスフェートのモ
ノホスフェートへの転化を遮断するミコフェノール酸を
含有する媒質において、gpt遺伝子を発現する細胞のみ
は生存することができる。neoの産生物は、抗生物質G41
8およびそのクラスの他の抗生物質により引き起こされ
る真核生物の細胞における、タンパク質の合成阻害をブ
ロツクする。
キメラの軽鎖および重鎖は、受容体細胞を同時転移す
るために使できる、２つの異なる発現ベクター中に配置
することができる。この場合において、ベクターの各々
は真核生物のトランスフェクション体のための異なる選
択可能な遺伝子を有するように設計する。これにより、
受容体細胞を同時トランスフェクションすることがで
き、そして同時トランスフェクションした細胞（すなわ
ち、両者のベクターを受け取った細胞）を選択すること
ができる。同時トランスフェクションした細胞の選択
は、両者の選択可能なマーカーについて選択することに
よって達成され、これは同時にあるいは順次に実施する
ことができる。
受容体細胞系は一般にリンパ様細胞である。好ましい
受容体細胞は骨髄腫である。骨髄腫は、トランスフェク
ションした遺伝子によりエンコードされる免疫グロブリ
ンを合成、組み立ておよび分泌することができる。とく
に好ましい受容体細胞は骨髄腫Sp/0であり、これは通常
内因性面絵区グロブリンを産生しない。トランスフェク
ションしたとき、細胞はトランスフェクションした遺伝
子構成体によりエンコードされる免疫グロブリンのみを
産生するであろう。トランスフェクションした骨髄腫は
培養物中であるいはマウスの腹膜中で増殖することがで
き、腹膜において分泌された免疫グロブリンは腹水から
回収することができる。他のリンパ様細胞、例えば、Ｂ
リンパ球またはハイブリドーマは受容体細胞として使用
することができる。
リンパ様細胞をキメラＬ鎖およびＨ鎖の遺伝子を含有
するベクターでトランスフェクションする方法は、いく
つか存在する。リンパ様細胞中へベクターを導入する好
ましい方法は、グラハム（Graham）およびバン・デル
（van der）Eb.（1973）Virology、52:456に記載されて
いるリン酸カルシウム沈澱手順である。他の方法はエレ
クトロポレイション（electropolation）である。この
手順において、受容体細胞中に組み込むべきDNAの存在
下に電気パルスを細胞にかける。参照、ポッター（Pott
er） et al.（1984）PNAS 81:7161。DNAの導入の他の方
法は、プロトプラストの融合による。リゾチームを使用
して、キメラ鎖遺伝子をもつ組み換えベクターを含有す
るバクテリアから細胞壁を消化して、スフェロプラスト
を産生する。スフェロプラストをリンパ様細胞と融合す
る。プロトプラスト融合後、トランスフェクション体を
選択し、そして分離する。（Oi、et al.（1983）PNAS 8
0:825）。最後に、クレン（Cullen） et al.（1984）ネ
イチャー（Nature）、307:241に記載されているDNA−デ
キストラン手順を、また、使用することができる。
本発明のキメラウイルス中和性免疫グロブリンは、抗
ウイルス療法および予防のために有用である。本発明の
キメラ免疫グロブリンを使用する直接の治療は、それら
を内部に、製剤学的に許容されうるベヒクル、好ましく
は、例えば、無菌の生理的塩類溶液中で静脈内注射によ
り投与することからなる。抗体は他の抗ウイルス因子組
み合わせて投与することができる。
免疫治療の変法は受動免疫化による保護である。この
モードにおいて、抗体は病原性ウイルスの感染の危険が
ある人に投与して感染に対して保護する。
キメラHIV中和免疫グロブリンを使用して、エイズの
患者またはHIVキャリヤーである人を処置することがで
きる。前述のように、キメラ免疫グロブリン（例えば、
HIV中和性免疫グロブリン、例えば、BAT123から形成し
た本発明の）は、HIV−１の異なる菌株または異なる分
離物を中和することができる。さらに、これらの免疫グ
ロブリンはシンチア形成によるウイルスの透過を阻害す
ることができる。キメラ免疫グロブリンはエイズ患者に
おいてウイルスの荷重を減少しかつ病気のそれ以上の進
行を遅延するために投与することができる。免疫グロブ
リンは他の抗エイズ因子、例えば、AZTと組み合わせて
投与することができる。さらに、いくつかの異なるキメ
ラHIV中和免疫グロブリンを一緒に投与することができ
る。
ある種の患者の集団において、キメラHIV中和免疫グ
ロブリンを使用する受動免疫化は適当であることがあ
る。この手順において、無症候性である（なおエイズま
たはARCの症候を示さない）か、あるいは血清陰性であ
るが、高い危険の群にある患者を処置して感染を阻害す
る。標的はHIV−１キャリヤーの母内の胎児またはその
子供、エイズの患者、または血液製品とともに作業する
健康な専門家、例えば、歯科医および看護婦を包含す
る。
本発明を下記の実施例によりさらに説明する。
実施例I:ハイブリドーマおよびモノクローナル抗体（以
後「単クローン抗体」と称す場合あり）の製造 ａ）ウィルスの製造 不活性化されたHIV−１の供給を維持するために、下
記の如くしてウィルス株を製造した。HT細胞系（M.ロバ
ート−グロッフナ（Rober-Guroff）他、前記のネーチャ
ー（Nature）、316:72−74により記されている）のH9ク
ローンを培養体中に保った。これらのH9クローンに、メ
リーランド州ロックヴィルのバイオテク・リサーチ・ラ
ボラトリイのR.チン（Ting）博士から寄贈されたHIV−
１（HTLV IIIB）を感染させた。感染させたH9細胞を培
養体中に保つと、細胞が再生しそして連続的にHIV−１
供給体を合成した。H9細胞を5mMのＬ−グルタミン酸、5
mMのHEPES、50単位/mlのペニシリンおよび50mg/mlのス
トレプトマイシンが補充されている20％FBS（熱で不活
性化された）RPMI1640の成長媒体中で培養した。
最初に細胞培養体を1000gで10分間にわたり遠心して
細胞および残屑を除去することにより、精製されたHIV
−１が得られた。上澄み液を次に90,000gで１時間にわ
たり遠心した。ウィルス粒子を最少量の燐酸塩で緩衝さ
れているpH7.4の食塩水中に再懸濁させ、そしてあらか
じめ形成されているスクロース勾配（20％−60％）を有
する遠心管上に充填した。試料を次に100,000gで16時間
にわたり遠心した。ウィルスを38％勾配のところで集め
た。ウィルスを次に部分標本としそして蛋白質含有量を
測定した後に−80℃で凍結した。
ｂ）免疫法の工程 雄のバルブ/cハツカネズミを免疫法用に使用した。各
ハツカネズミに100μｇの不活性化されたHIV−１を与え
た。ウィルスの不活性化はFDAの認可した工程成績表に
従い紫外線照射および洗剤であるノニデットＰ−40（0.
1％）の添加により行われた。１匹のハツカネズミ当た
り100μｇのウィルスを含有する量の懸濁液を200μｌの
燐酸塩で緩衝されている食塩水（PBS）中に懸濁させ、
そして等量の完全フロイントアジュバントを用いて乳化
させた。
各ハツカネズミに100μｇのウィルスを皮下注射して
免疫を与えた。ハツカネズミの数箇所の部位、例えば肢
および胴の交差点の下側、に高濃度のリンパ腺腫を注射
した。一ヶ月後に、ハツカネズミの同じ部位に同量のウ
ィルスの皮下増強注射をした。増強注射は不完全フロイ
ントアジュバントを用いて製造されたこと以外は、この
増強注射は最初の注射と本質的には同じ方法で製造され
た。
一ヶ月後に、各ハツカネズミにPBS中に懸濁されてい
る100μｇのウィルスを皮下注射して再び免疫を与え
た。各ハツカネズミはそれぞれの肢と胴の交差点で皮下
に、そして腹腔内に注射された。最後の注射から３日後
に、ハツカネズミを殺しそしてそれらの脾臓を取り出し
た。脾臓細胞に次に下記の工程により骨髄腫細胞を融合
させた。
ｃ）融合 ５対１比の脾臓細胞対骨髄腫細胞を含有している懸濁
液を製造した。選択された骨髄腫はNS−１であった。NS
−１細胞を調整して約17時間の倍加時間とした。それら
を対数期になった時に使用した。NS−１細胞を、細菌学
用平板（100mm）中で、６×104細胞/mlの濃度におい
て、５％の牛の胎児血清（FBS）、100単位/mlのペニシ
リンおよび100マイクログラム/mlのストレプトマイシン
を含有している10mlのダルベッコ改質イーグル媒体（DM
EM）中で継代培養した。媒体を３日毎に交換した。他方
では、細胞を1.54×105細胞/mlにおいて10mlの同じ媒体
中で継代培養しそして媒体は２日毎に交換した。
脾臓を細菌学用平板（100mm）の上に置きそして20ml
のカルシウムとマグネシウムを含まないPBS（CMF−PB
S）を脾臓の両端に注射して脾臓細胞を灌流させること
により、脾臓細胞を製造した。灌流された脾臓細胞を次
に50mlの遠心管に移した。
脾臓細胞を400gで５分間遠心し、そして次に5mlの0.8
3％ NH4Cl（0.155M）中に室温で10分間にわたり懸濁さ
せて、赤血球を溶解させた。5mlのGMF−PBSを管に加え
て溶解を停止させた。細胞を次に粒子状にし、そして10
mlのGMF−PBS中に再懸濁させた。
40マイクロリットルの細胞懸濁液を10mlの食塩水に３
滴のザップ−オグロビンTMと一緒に加えることにより、
赤血球の濃度を測定した。赤血球数は血球計算盤を用い
て計数され、そしてこの値から細胞濃度が測定された。
この濃度に次に250の希釈係数をかけて、懸濁液中の実
際の細胞濃度を与えた。
NS−１細胞を５個の細菌学用平板（100mm）から50ml
の遠心管に移した。細胞濃度を上記の係数技術を用いて
測定した。５×107のNS−１細胞を次に10mlのGMF−PBS
中に懸濁させ、そして50mlの遠心管中で2.5×108個の脾
臓細胞と混合した。
細胞を回転させそして10mlのGMF−PBSで洗浄した。上
澄み液をガラス製のパスチュールピペットを用いてでき
るだけ多く吸引した。管を静かに開けて、細胞粒子を取
り出した。
細胞を製造する前に、融合混合物を下記の如くして製
造した。5gのポリエチレングリコール1450（コダックか
ら販売）を5mlのGMF−PBSおよび0.5mlのDMSOと混合し
た。混合物を次に56℃に暖めてそれを融解させ、滴定し
て7.0の最終的pHとし、そしてそれを殺菌するために0.2
2ミクロンのミリポア（Millipore）フィルターを通して
濾過した。1.0mlの部分標本をクリオチューブに加え、
そしてこれらを−70℃において貯蔵した。
使用する融合混合物を製造するため、凍結管中の部分
標本を37℃に加熱することにより融解させた。別個に、
1mlのDMEM（血清なし）を含有している管を37℃に加熱
した。
1.0mlのポリエチレングリコール融合混合物の部分標
本を細胞懸濁液に加え、そして懸濁液をよく混合した。
ポリエチレングリコール融合混合物を加えてから45分後
に、2.0mlの予備加熱されたDMEM（血清なし）を混合し
ながら滴々添加した。残りの8mlの予備加熱されたDMEM
（血清なし）を次に加えた。細胞を室温で10分間放置し
た。
2.0mlのFBSを懸濁液に加えそして懸濁液をよく混合し
た。FBSおよびGMF−PBSの混合物が、細胞の試験管壁に
対する付着防止を助けた。懸濁液を400gで４分間にわた
り遠心した。
回転させた後に、５％のFBS、100単位/mlのペニシリ
ン、100マイクログラム/mlのストレプトマイシン、およ
びリットルフィールドのヒポキサンチン、アミノプテリ
ンおよびチミジン（HAT）が補充されている116mlの改質
された媒体中に細胞を懸濁させた。
細胞懸濁液の濃度を200マイクロリットルの懸濁液当
たり3.3×105個の脾臓細胞に調節した。200マイクロリ
ットルの懸濁液の部分標本を次に96ウエル微量滴定の各
ウエルに分配した。17個のそのような板を製造した後
に、板を培養器に移しそして５％CO2中で37℃に保っ
た。
細胞を板の中で７日間保ち、次に成長媒体を除去し、
そして新しい媒体を加えた。それから４日後に、媒体を
再び交換した。４日後に、酵素結合された免疫吸収剤効
力検定（ELISA）をウエル中の抗体に付して実施してど
れがHIV−１のgp120蛋白質を結合しているかを測定し
た。ELISAは下記の如くして実施された。
ｄ）ELISA工程 精製されたgp120蛋白質は、W.G.ロベイ（Robey）、
「人間の免疫不足ウィルス感染の予防の展望：精製され
た230−kDエンペロープグリコ蛋白質が抗体の中和を誘
発する（Prospect for Prevention of Human Immunodef
iciency Virus Infection:Purified 120-kD Envelope G
lycoprotein Induces Neutralizing Antibody）」、プ
ロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミイ
・オブ・サイエンス・オブ・ザ・ユナイテッド・ステー
ツ・オブ・アメリカ（Proc.Natl.Acad.Sci.）、米国、8
3:7023−27（1986）に記されている如くして製造しさ
れ。50μｌのgp120懸濁液（0.1〜1.0μg/mlの濃度）を1
2−チャンネルピペット付き96−ウエル・イミュロンＩ
板のウエルに加えた。板を覆いそして蛋白質が板に結合
できるようにして４℃で18時間にわたり培養した。
板の液体内容物を次に空にし、そして板の上の残りの
結合位置を飽和させるために200μｌの0.1M NH4Clを各
ウエルに加えた。NH4Cl溶液をウエル中で室温において1
3分間放置した。
NH4Cl溶液を次に除去し、そしてウエルをPBSおよびツ
イーン20で３回洗浄した。下記の抗体懸濁液を加えるま
で、PBS/0.05％ツイーン20溶液の一部は残されていた。
17個の96ウエル板の各ウエルからの50μｌの細胞融合
上澄み液をイミュロンＩ板上の各ウエルに加え、そして
１時間にわたり培養した。培養後に、未結合抗体を除去
するために板をPBS/0.05％ツイーン20溶液で３回すすい
だ。
細胞融合上澄み液は、96ウエル板中で種々のハイブリ
ドーマにより製造された抗体を含有しているであろう。
gp120に特異性である抗体はそれに結合しているであろ
う。gp120がイミュロンＩ板に結合している限り、gp120
に特異性である抗体も板に結合し始めるであろう。
次の階段は、各ウエルの結合された抗体の量を示すマ
ーカーを加えることである。選択されるマーカーはセイ
ヨウワサビペルオキシダーゼであった。このマーカーを
山羊の抗−ハツカネズミIgGと結合させて、ペルオキシ
ダーゼ−結合された山羊の抗−ハツカネズミIgGを製造
した。山羊の抗−ハツカネズミIgGは、板と結合されて
いるハツカネズミ単クローン抗体と結合するであろう。
ペルオキシダーゼ−マーカーを次に活性化させて酵素反
応により結合された抗体の量を示すことができる。
各ウエルにPBS−0.05％ツイーンおよび１％BSA中で1:
1000に希釈された100マイクロリットルのペルオキシダ
ーゼ−結合された山羊の抗−ハツカネズミIgGを加える
ことにより、マーカーが加えられた。板を室温で１時間
にわたり培養した。その後、板をPBS/0.05％ツイーンで
３回洗浄して未結合の山羊の抗−ハツカネズミIgG結合
物を除去した。
次の段階は、山羊の抗−ハツカネズミIgGに結合され
たペルオキシダーゼマーカーを活性化することである。
これは、200マイクロリットルの３′,3′,5′,5′テト
ラメチルベンジジン基質溶液を各ウエルに加えそして室
温で30分間にわたり培養することにより、行われた。50
マイクロリットルの2.0M H2SO4の添加により、色反応を
停止させた。
色強度をELISA読み取り器を用いて450nmで測定した。
gp120に特異性である抗体の量は色強度に比例してい
る。
gp120に少なくともある程度結合されている抗体を生
成した約200個のウエルが96ウエル微量滴定板中にあっ
たことが見られた。これらの200個のウエルの中で、最
も高い色強度を示した抗体を生成した39個を別のスクリ
ーニング段階用に選択した。
ｅ）生存Ｔ−細胞を使用する免疫蛍光効力検定 ELISA中のgp120と反応性であった抗体がHIV−１で誘
発された生存H9細胞と特異性があるように結合するかど
うかを測定するために、免疫蛍光効力検定を行った。H9
細胞線はHIV−１による持続的感染が可能であった。こ
の細胞線はメリーランド、ロックヴィルのアメリカン・
タイプ・カルチャー・コレクションから得られた。感染
した細胞と結合していたが未感染の細胞とは結合してい
ない抗体は多分細胞膜の細胞外側上のHIV−１エンベロ
ープ蛋白質の領域に対して選択的であるのであろう。免
疫蛍光効力検定は、HIV−１ウィルス粒子上のエピトー
プの中和を認識する高い能力を有するgp120反応性抗体
を選択することおよび感染されたＴ−細胞によるシンシ
チウム生成を抑制することを助ける。
感染されたH9細胞の培養体は上記の「ウィルスの製
造」の項のようにして保たれた。効力検定の実施工程を
以下に記す。
（ｉ）効力検定工程 ５×106個の細胞/ml濃度の感染H9細胞懸濁液の50マイ
クロリットル部分標本を19個の1.5mlマイクフュージ管
のそれぞれに加えた。ELISA陽性クローンを含有してい
る39個のウエルから上澄み液の50μｌ部分標本を次に各
管に加えた。H9細胞と反応する上澄み液中の抗体は管中
にあるH9細胞と結合するであろう。
管を次に室温で30分間にわたり培養した。培養後に、
管を回転させ、上澄み液を除去し、細胞を２％の牛の胎
児血清および0.1％のナトリウムアジドを含有しているR
PMI1640の混合物で３回洗浄した。管を次に開けて細胞
粒子をばらばらにした。
10μｌのラベルのついた抗体すなわち蛍光性イソチオ
シアネート（FITC）と結合された山羊の抗−ハツカネズ
ミIgGを各試験管に１対200の希釈度で加えた。このラベ
ルのついた抗体はHIV−１感染H9細胞と結合している単
クローン抗体と結合しそしてこれらの単クローン抗体の
同定用手段となる。
管を室温で30分間にわたり再び培養した。管を遠心
し、そして細胞を前と同じ媒体で洗浄した。細胞を次に
PBS中に再懸濁させ、個々のスライドの上に置き、そし
てカバーガラスをかぶせた。細胞を蛍光顕微鏡で見た。
39個の選択されたウエルのどれが未感染のH9細胞と結
合した抗体を含んでいるかを測定するために、代わりに
感染されたH9細胞を使用して上記のものと本質的に同一
の工程を行った。
（ii）結果 試験した39個のウエルの中の７個が、生存感染H9細胞
と結合しているが未感染のH9細胞とは結合していない単
クローン抗体を生成したクローンを含有していた。すな
わち、これらの７個のウエルからの抗体を使用した時に
は、感染細胞は蛍光を発したが未感染の細胞は発しなか
った。
免疫蛍光陽性クローンを含有している７個のウエルか
らの細胞および抗体を集めた。これらのハイブリドーマ
および抗体はメリーランド、ロックヴィルのアメリカン
・タイプ・カルチャー・コレクションに保管されてお
り、そして本出願の審査継続中は特許庁による調査用に
入手可能である。
ｆ）単一細胞クローニング 39個のELISA陽性ウエルのそれぞれからの細胞懸濁液
を24個のウエル板のウエル中で広げた。23個のウエル板
中での５日間の成長後に、７個のウエルからの細胞懸濁
液を１ミリリットル当たり30、50および100個の細胞に
希釈されている感染H9細胞に対して免疫反応性試験をし
た。0.1mlの希釈された細胞懸濁液（それぞれ、平均
３、５および10個のクローンを含有していた）を96個の
ウエル板のウエルの中に入れた。ウエルはあらかじめヒ
ストンでコーテイングされたいた。
各細胞が成長したコロニーを形成し始めた後に、細胞
を顕微鏡下で検査した。各コロニーの細胞は移動してお
らずそして衛星コロニーを形成していた。ELISAおよび
免疫蛍光における最も強い反応性を示す７個のクローン
のそれぞれから単一細胞クローンを選択しそして培養体
中に広げた。
ｇ）ドデシル−硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル
電気泳動（SDS−PAGE）およびウェスタンブロット工程 ウェスタンブロット分析では、ウィルスをそれの成分
である蛋白質中に溶解させた。HIV−１（gp120）の外部
エンベロープ蛋白質と結合する単クローン抗体を生成す
るクローンは、希望のものであった。工程を以下に記
す。
30マイクログラムのHIV−１を試料緩衝液（２％のSDS
および５％のベータ−メルカプトエタノールを含有して
いた）中で100℃に５分間加熱することにより溶解させ
た。それを次に12％の1.5mm厚さのスラブポリアクリル
アミド上に充填した。ゲルを35mVの一定電圧において室
温で８時間泳動させた。工程はメリーランド・ロックヴ
ィルのバイオテク・リサーチ・ラボラトリイにより発行
された「HTLV−III抗体のウェスタンブロット検出の調
合工程（Procedure for Preparation of Gels for West
ern Blot Detection of HTLV-III Antibodies）」中に
記されていた。電力を30ボルト（約0.1A）に設定しそし
て室温で16時間実施することにより、蛋白質帯をニトロ
セルロース紙の上に移入させた。翌朝、電圧を60ボルト
（約0.2A）に高め、そして移入を１−２時間にわたり行
ってgp120およびgp160の移入を最大にした。移入緩衝液
は24gのトリス塩基、57.6gのグリシンおよび800mlのメ
タノールを含有していた。水を加えて溶液を４リットル
までにした。
ニトロセルロースシートを次にPBS/0.05％ツイーン20
ですすぎ、そしてブロット緩衝液を含有しているトレー
の中に入れた。トレーを室温で２時間にわたり静かに振
った。ブロット緩衝液は50gの非−脂肪ドライミルク、
1.0gの発泡防止剤Ａ（任意）、0.1gのメルチオレート、
および1.0リットルの最終的量になるのに十分なPBSから
なっていた。緩衝液のpHを7.0に調節した。
ニトロセルロースシートを次にPBS/0.05％ツイーン20
ですすぎ、そして重量測定された樹脂ガラス板間の紙タ
オルの上で乾燥した。ニトロセルロースシートを次に0.
5cm幅の片に切断し、それぞれに連続番号をつけた。片
をすぐに使用することもでき、またはそれを乾燥状態で
そして暗所で１ヶ月まで貯蔵することもできた。gp120
帯を有する片は次の段階で使用するためのものであっ
た。
gp120ニトロセルロースを次に製造して、単クローン
抗体を蛋白質帯に結合させた。これらの片の中の40個を
個別にスロットトレーの指定スロット中に入れ、そして
PBS/0.3％ツイーン20中で20分間にわたり予備石鹸洗浄
した。予備石鹸洗浄溶液をクロロックスTM含有トラップ
中に吸引した。片ウエルを次にPBS/0.05％ツイーン20で
１回すすぎ、トレーを５、６回振り、そして溶液を吸引
除去した。
１個の片に2.0mlのブロット緩衝液/4％の山羊血清
（これは100mlのブロット緩衝液および4mlの熱不活性化
された正常な山羊血清と混合することにより製造され
た）を加えそしてその後10マイクロリットルの熱不活性
化されたエイズ患者の血清をウエルに加えて、陽性対照
物を製造した。2.0mlの上澄み液をELISA陽性クローンを
含有している微量滴定板中の39個のウエルのそれぞれか
ら取り出した。2.0mlの上澄み液、５％の非−脂肪ドラ
イミルク、50マイクロリットルの1M HEPES（pH8.0）、
およびメルチオレートからなる混合物を製造した。
上澄み液の部分標本を片を含有している各片ウエルの
中に加えた。混合物を次にクロロックスTM含有トラップ
中に吸引した。片ウエルを次にPBS/0.05％ツイーン20で
１回すすぎ、手で５、６回ゆすり、そして洗浄緩衝液と
共に吸引除去した。片を次にPBS/0.05％ツイーン20で30
回すすぎ、各すすぎには５分間かけた。
片を次に染色試薬と反応させ、それによりgp120と結
合する特異性抗体を可視化した。選択された試薬はセイ
ヨウワサビペルオキシダーゼであった。この試薬は、10
mlのpH7.4のPBS、2.0mlの基質株、および4.0マイクロリ
ットルの30％H2O2からなっている活動基質と接触した時
に、発色する。基質株は、0.3gの４−クロロ−１−ナフ
トールを100mlの無水メタノール中に溶解させることに
より、製造された。
1:100のビオチニル化された山羊の抗ハツカネズミIgG
を含有している2.0mlのブロット/4％の山羊血清を次に
それぞれの片ウエルに加えた。トレーを室温で30分間に
わたりゆれている台の上で培養した。山羊の抗ハツカネ
ズミIgG結合体はもちろん片上のgp120と結合している単
クローン抗体と結合するであろう。
片を次にPBS/0.05％ツイーン20で１回すすぎ、そして
手で５、６回振って過剰の山羊の抗ハツカネズミIgG結
合体を除去した。洗浄緩衝液を廃棄した。片ウエルを次
にPBS/0.05％ツイーン20で３回洗浄した。各洗浄は５分
間続けられた。
1:1000のセイヨウワサビペルオキシダーゼ−アビジン
Ｄ結合体を含有している2.0mlのブロット/4％の山羊血
清をそれぞれの片ウエルに加えた。この結合体中のアビ
ジンは山羊の抗ハツカネズミIgG結合体中のビオチンと
結合する。従って、セイヨウワサビペルオキシダーゼマ
ーカーは山羊の抗ハツカネズミIgGと結合し始めそして
それにより結合された抗体にラベルを付ける。結合体の
添加後に、トレーを室温においてゆれている台の上で30
分間にわたり培養した。
それぞれの片ウエルをPBS/0.05％ツイーン20で１回の
洗浄当たり５分間にわたり３回洗浄し、次にPBSで１回
洗浄した。2.0mlの活動酵素基質を各ウエルに加え、そ
してトレーを室温で発色するまで培養した。活動基質溶
液はpH7.4の燐酸塩緩衝食塩水中に0.05％の４−クロロ
−１−ナトリウムおよび0.01％のH2O2を含有していた。
（iii）結果 以上で論じられている如く、ウェスタンブロット分析
は39個のELISA陽性ウエルからの抗体を使用して行われ
た。ウェスタンブロット分析では、これらの39個のウエ
ルの中の６個からの抗体だけがgp120と反応することが
見いだされた。これらのウエルの中の６個全部が免疫蛍
光効力検定で免疫蛍光陽性であると見いだされている７
個のウエル中のものであった。従って、７個の免疫蛍光
陽性中の１個だけがウェスタンブロット分析で陽性では
なかった。
ｈ）単クローン抗体の製造および精製 希望する単クローン抗体を大量に製造するために、下
記の工程を行った。
第二の24個のウエル板中のウエルの中に置かれている
７個の免疫蛍光陽性クローンを100mmの組織培養板中で
成長させた。選択された７個の単一細胞クローンの広げ
られた培養体を次に別個に１匹のハツカネズミ当たり50
0万個の細胞を用いてプリスタン処置されたハツカネズ
ミの腹腔内に注射した。７日後に、各ハツカネズミの腹
水流体を集めそして凍結した。
腹水流体中の単クローン抗体を下記の如く精製した。
凍結された腹水流体を解凍し、そしてナイロン布を通し
て濾過して粘着物質を除去した。0.1mMの最終濃度にな
るのに充分なフェニルメチルスルホニルフルオライドを
腹水流体に加えた。１ミリリットルの腹水流体に対して
0.05mlの1.2M酢酸塩緩衝液（pH4.0）を加えた。酢酸塩
緩衝液の最終濃度は60mMであった。pHを4.5に調節し
た。
１ミリリットルの処理した腹水流体に対して25μｌの
カプリル酸（144.21の分子量、0.91の密度）を激しく攪
拌しながら滴々添加した。懸濁液を室温に保ちそしてさ
らに30分間攪拌した。
沈澱を除去するために、懸濁液を次に15,000gで10分
間にわたり遠心した。IgGを含有している上澄み液を、
上澄み液量の1/10に等しい量の1M HEPES緩衝液（pH8.
0）の添加により、中和した。IgGを次に50％(NH4)2SO4
を用いて沈澱させた。
沈澱を次にHEPES食塩水緩衝液中に溶解させた。IgGか
ら(NH4)2SO4を除去するために、この溶液をHEPES食塩水
緩衝液に対して一夜透析した。HEPES食塩水緩衝液は透
析中２回交換された。透析後に、HEPES食塩水緩衝液は
精製された溶解したIgGを含有していた。精製されたIgG
を下記の感染効力検定およびシンシチウム生成効力検定
において使用した。
実施例II:本発明の効果の証明 ａ）中和効力検定 HIV−１ウィルス粒子によるＴ−細胞感染の抑制にお
ける本発明の単クローン抗体の効果を測定するために、
効力検定を行った。HIV−１だけを細胞培養体に加えた
時に感染された細胞数をHIV−１および本発明の単クロ
ーン抗体を加えた時に感染された数と比較した。中和効
力検定用に選択された細胞はHT細胞線のH9クローンであ
った。
ｉ）ウィルス、抗体および細胞の製造 細胞培養体をH9成長媒体で洗浄することにより、H9細
胞を製造した。H9成長媒体はRPMI 1649中20％FBS（熱不
活性化された）、5mMのＬ−グルタミン、50単位/mlのペ
ニシリン、50mg/mlのストレプトマイシン、および5mMの
HEPESを含有していた。細胞を次に２×106個の細胞/ml
の最終濃度まで再懸濁させた。懸濁液を次に水浴中で37
°において２マイクログラム/mlのポリブレンと共に20
分間にわたり培養した。
培養後に、細胞を700gで７分間回転させた。上澄み液
を次に廃棄し、細胞をH9成長媒体中に再懸濁させ、そし
て再び洗浄してポリブレンを除去した。細胞を次に成長
媒体中で２×106の細胞/mlとなるまで再懸濁させた。
７個の免疫蛍光陽性クローン中の６個を中和効力検定
で使用するために選択した。生成された腹水（上記）か
らの抗体を0.22ミクロンの微孔フィルターを通すことに
より殺菌した。溶液を次にH9成長媒体中で希釈して、10
0、10、１、0.1および0.01マイクログラム/mlの種々の
最終濃度とした。
H9細胞の感染では20TCID50すなわちTCID50値の20倍の
ウィルスを使用した。ウィルス調剤のTCID50値は前の感
染効力検定におけるものと同じ実験条件下で測定され
た。それは実験ウエルの50％が感染された時のウィルス
滴定量であると定義されている。20TCID50は大体4.72×
10-5希釈度のウィルス株に等しい。
感染効力検定では、30μｌのウィルス懸濁液および30
μｌの各抗体溶液を微量滴定板のウエル中で４℃におい
て１時間にわたり混合した。各ウエルにつき２回ずつ行
われた。板を次に培養器中で37℃および５％COにおいて
30分間暖めた。30μｌのポリブレン処置されたH9細胞懸
濁液を次に各ウエルに加えた。
微量滴定板を次に培養器中で37℃において１時間培養
した。110μｌの成長媒体を各ウエルに加えて200μｌの
合計量にした。板を３日間培養し、そして新しい成長媒
体を３日毎に交換した。細胞を３、６、９および13日目
に集めた。
本発明の抗−HIV−１抗体の１種の代わりにヒト絨毛
性性腺刺激ホルモン（抗−HcG）に対するマウスの単ク
ローン抗体を使用して上記と同一の工程を行った。抗HC
G抗体で処理された細胞は陰性対照物とされた。
ii）感染細胞の免疫蛍光効力検定 ９日目から13日目に集められた細胞懸濁液の100μｌ
の部分標本を3mlのPBSで洗浄した。細胞懸濁液を700gで
６分間遠心し、そして再びPBS中で洗浄した。細胞を最
後に５μｌのPBS中に再懸濁させ、そして10μｌの懸濁
液をガラススライド上に滴下した。この懸濁液を空気乾
燥し、次に1:1アセトン／メタノールを用いて10分間に
わたり固定させ、空気乾燥し、そして効力検定まで−20
℃で貯蔵した。
効力検定は、固定された細胞をPBS中で20分間にわた
り再水和し、そして次にPBS中でさらに30分間にわたり
５％の正常山羊血清と共に培養した。過剰の正常山羊血
清を滴々除去した後に、細胞を室温で１時間にわたり２
％の正常山羊血清を含有している抗−p24単クローン抗
体と共に（1:100の希釈度で）培養した。この抗体はHIV
−１のp24芯蛋白質と特異性があるように結合する。ス
ライドを湿度調節器中に保って乾燥を避けた。培養後
に、スライドをPBS中で合計30分間にわたり３回すすい
だ。次にフルオレスセイン結合された山羊の抗ハツカネ
ズミIgG（Ｆ（ab′）2）断片を1:20の希釈度で加えた。
スライドを室温で１時間培養した。スライドを次にBPS
を３回交換しながら30分間すすぎ、0.5％のエヴァンス
ブルーで５分間にわたり対比染色し、洗浄し、そしてフ
ルオロマウントＧ中に置いた。この細胞を次に蛍光顕微
鏡下で観察した。
感染細胞数を400xの倍率で数えた。視界内の不規則的
試料採取により、各スライドから４個のデータ点を集め
た。
iii）結果 結果は第１および２図にグラフで示されており、そこ
では免疫蛍光細胞の百分率が懸濁液中の抗体濃度に対し
てプロットされている。第１図の結果は９日目に集めら
れた細胞からのものである。第２図では、細胞は13日目
に集められた。
第１および２図に関すると、試験した６種類の抗体の
中の４種（BAT123、267、509および085と称されてい
る）が感染抑制において有効であった。特に、BAT123は
９日目にほとんど完全な感染抑制を示した。この結果
は、事実上抑制を示さなかった陰性対照物である抗−Hc
G抗体と対照的である。抗−HcG抗体で処理された細胞の
ほとんど100％が抗体の濃度に関係なく免疫蛍光性であ
った。gp120とは反応性であるが中和活性を示さない単
クロール抗体BAT496を用いても同様な結果が得られた。
この理由のため、BAT496は13日目には効力検定されず、
従って第２図には示されていない。
他の抗体であるBAT401を中和に関して試験したことに
注目すべきである。しかしながら、結果はシンシチウム
生成抑制において効果が小さかったことが見いだされた
ため第１および２図には示されていない。
第１および２図を比較すると、時間がたつにつれて懸
濁液中で多くの細胞が感染され始めることが示されてい
る。この結果は予測されていた。ウィルスを中和するた
めに利用できる懸濁液中の抗体の量は媒体の交換により
そして多分減成または内部移行によっても減少してい
る。しかしながら、感染H9細胞は絶えずさらに多くのウ
ィルスを生成しており、そしてこのウィルスは実際に全
ての細胞に感染する。
第１および２図中の点は、抗体の濃度が減少するにつ
れてより多量の細胞が感染されることを示している。こ
れは、抗体の中和効果が投与量依存性であることを示し
ている。細胞の50％が感染されている時点の投与量であ
る各単クローン抗体のIC50値が計算された。９日目に採
取された結果を下表Ｉに示す。
表Ｉ 単クローン抗体 IC50 抗−HcG（陰性対照物） １×105ηg/ml BAT085 100ηg/ml BAT123 10ηg/ml BAT267 10ηg/ml BAT509 30ηg/ml BAT496 １×105ηg/ml 抑制において最も有効である単クローン抗体（BAT12
3、267および509）がナノグラム量であることがわか
る。このことは、これらの単クローン抗体が生体内での
エイズ治療用に少量で非常に有効であることを示してい
る。そのような少ない投与量の使用は公知の治療剤より
相当有利となるであろう。
ｂ）シンシチウム生成の抑制 本発明の単クローン抗体に関する別の試験は、それら
がシンシチウム生成を抑制するかどうかを測定すること
である。生体内での細胞感染および細胞死滅の大部分が
シンシチウムにより生じると信じられているであるた
め、シンシチウム生成の抑制は抗体の治療価値を強化す
るであろう。
シンシチウム効力検定は、感染H9細胞中のウィルスの
外部エンベロープ蛋白質がＴ細胞により運ばれるCD4抗
原と結合するという仮定に基づいている。効力検定で
は、CD4DNIトランスフェクション処理されたヘラ（HeL
a）細胞を含有しているウエルに感染H9細胞を加えた。
ヘラ細胞は単層でウエルの底に付着するため、それらが
使用された。これらのトランスフェクション処理された
ヘラ細胞はそれらの細胞表面上にCD4を大量に表示す
る。従って、それらは感染H9細胞と融合する能力を有す
る。従って、シンシチウム生成が生じるなら、ヘラおよ
びH9細胞がウエルに結合されるであろう。これらの多核
化された巨細胞は容易に観察できそして計数することが
できる。
シンシチウム生成効力検定に関する原案を以下に示
す。
（ｉ）シンシチウム生成効力検定用の工程 ヘラT4細胞（これは表面上のCD4抗原を表わす）を、D
MEM中５％FBS（熱不活性化された）、5mMのＬ−グルタ
ミン、50単位/mlのペニシリン、50mg/mlのストレプトマ
イシンおよび5mMのHEPESを含有しているヘラ−T4成長媒
体中で成長させた。細胞をトリプシン処理により回収し
てフラスコから細胞を除去し、そして洗浄した。細胞を
次に96ウエル微量滴定板の上で１個のウエル当たり10,0
00個の細胞密度で種つけした。90％の融合に達するまで
板を37℃で26時間にわたり培養した。
感染および未感染H9細胞を次に製造した。これらの細
胞を製造するためには、細胞懸濁液を最初にH9成長媒体
（DMEM 1640中20％FBS、5mMのＬ−グルタミン、50単位/
mlのペニシリン、50mg/mlのストレプトマイシンおよび5
mMのHEPES）で２回洗浄した。細胞を次にヘラ−T4中に4
0万/mlの濃度で再懸濁させた。
中和効力検定で使用された７種の抗体溶液に対して最
初に殺菌濾過を行うことにより、抗体を製造した。これ
らの溶液の中の６種は本発明の抗体を含有しており、そ
して７番目は抗−HcGを含有していた。各溶液を次に1.0
および10μg/mlの最終濃度にした。
50マイクロリットルの各抗体溶液および50マイクロリ
ットルの感染H9細胞懸濁液を種々の微量滴定板のウエル
に加えた。微量滴定板ウエルはヘラT4細胞でコーテイン
グされていた。別のヘラT4でコーテイングされたウエル
では、感染H9細胞懸濁液を抗体を添加せずに加えた。こ
のウエルを陽性対照物として使用した。さらに別のコー
テイングされたウエルでは、未感染H9細胞懸濁液を加え
た。このウエルを陰性対照物とし使用した。実験は３回
ずつ行われた。
板を次に37℃および５％CO2において18時間にわたり
培養した。未結合H9細胞を除去するために、板をDMEMで
２回静かに洗浄した。DMEMを除去し、そして１個のウエ
ル当たり200μｌのメタノールを加えることにより細胞
を固定させた。メタノールを除去した後に、細胞を空気
乾燥し、そして100μｌの1.4％メチレンブルーで10分間
にわたり染色した。細胞を蒸留水で３回すすいだ。
染色後に、細胞を次に逆転顕微鏡下で（100倍の倍率
で）観察し、そして視界当たりのシンシチウム数を測定
した。５個より多い核が存在しているなら、ウエルの集
合体がシンシチウムであるとみなされた。各ウエルを不
規則的に３回計数した。
（ii）結果 陰性対照物ウエルはシンシチウム生成を示さなかっ
た。残りのウエルに関する結果は平均±標準偏差で表さ
れて下表IIに示されている。
表IIからこれらの結果が上記の方法によるスクリーニ
ングが治療用途用に最良の抗体を同定するのに必須であ
ることを示唆していることがわかる。遊離HIV−１ウィ
ルスの感染性を低下させた同じ抗体（第１および２図に
示されている）もシンシチウム生成の抑制において有効
であった。BAT123、267および509は両方の適用で特に有
効であった。BAT496は両方の適用でほとんど無効であ
り、もちろん陰性対照物である抗−HcGでもそうであっ
た。BAT085は中和においては有効であったが、シンシチ
ウム抑制では最も有効なもののではなかった。
BAT401はシンシチウム抑制において非常に有効なもの
ではなかったが、中和効力検定では有効であった。この
結果は、HIV−１感染の抑制において有効である抗体が
必ずしもシンシチウム生成の抑制では有効ではないこと
を示している。従って、HIV−１ウィルス粒子による感
染およびシンシチウム生成の両方の抑制において最も有
効である本発明の３種の単クローン抗体（BAT123、264
および509）をメリーランド州、ロックヴィルにあるア
メリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに保管し
た。それらは本出願の審査継続中は特許庁により調査の
ために入手可能である。
表IIは、表Ｉに示されている中和と同様にシンシチウ
ムも投与量依存性であることを示している。10マイクロ
グラム/mlの抗体を有する溶液は一般的に１マイクログ
ラム/mlの溶液より有効であった。
実施例III:HIV−１の異なる株および単離体の中和 数種の抗体が遊離HIV−１ウィルス粒子の感染およびH
IV−1B感染ヘラ−CD4＋細胞とH9細胞との間のシンシチ
ウム生成を抑制することが見いだされた。ゲノム分析で
はウィルスが生体内および試験管内の両者でかなり突然
変異することが示されているため（アリゾン（Alizo
n）,M.、ウェイン−ホブソン（Wain-Hobson）,S.、モン
タグリール（Montagnier）,L.およびソニゴ（Sonigo）,
P.（1986）、セル（Cell）、46:63−74;スタルシッヒ
（Starcich）,B.R.、ハーン（Hahn）,B.H.、シャウ（Sh
aw）,G.M.、マックニーリイ（McNeely）,P.D.、モドロ
ウ（Modrow）,S.、ウルフ（Wolf）,H.、パークス（Park
s）,E.S.、パークス（Parks）,W.P.、ヨセフス（Joseph
s）,S.F.、ガロ（Gallo）,R.C.およびワン−スタール
（Wong-Staal）,F.（1986）セル（Cell）45:637−64
8）、これらの中和用単クローン抗体の治療および予防
剤としての適用はそれらが属−特異性であるかどうかお
よび集団中の大割合のウィルス株により生じるHIV−１
感染を予防するかどうかに非常に依存している。BAT123
および我々が挙げた他の中和用単クローン抗体がHIV−
１の異なる株の中で保存されたアミノ酸配列順序を有す
るウィルスエンペロープ蛋白質gp120中にある１種以上
の顕著な中和エピトープを認識するかどうかを知ること
が重要である。抗体のこれらの特徴を理解するために、
我々はこれらの抗体がgp120のアミノ酸配列順序におい
て相当程度の異種（RF、AL、MN、Z84およびZ34）（上記
のスタルシッヒ）を有するHIV−１の他の株によるシン
シチウム生成を抑制できるかどうかを研究した。この研
究では中和用抗体BAT123が選択され、その理由はそれが
ウィルスの中和において最も高い能力を誘発させること
が示されているからである。感染集団中に存在している
異なるHIV−１変種に対する中和用抗体の効果を評価す
るために、我々は種々の疾病症状の感染患者（テキサス
州ヒューストン、カリフォルニア州ロスアンジェルス、
マサチューセッツ州ボストン）から不規則的に血液試料
を集め、そして共生培養実験によりリンパ球調合物中で
のウィルス感染に対するBAT123の効果を試験した。
ａ）シンシチウム生成効力検定 シンシチウム生成効力検定は実施例２中に記されてい
る如くして実施された。
ｂ）共生培養効力検定 使用された工程は前記のものと同様であり、30mlのヘ
パリン処理された患者の血液を新鮮なまま集めそして密
度−勾配遠心により単核白血球に関して処理した。簡単
に述べると、全血を等量の燐酸塩で緩衝されている食塩
水（PBS）で希釈した。25mlの希釈された血液を10mlの
フコール−パク（ファーマシア）上に置き、そして1500
×ｇで30分間遠心し、遠心の終わりに単核白血球を含有
している界面を取り出し、そしてPBSで２回洗浄した。
単核白血球を次に0.5−１×106/mlにおいて15％の熱−
活性化された牛の胎児血清、2mMのＬ−グルタミン酸、1
0％のインターロイキン−２（細胞状生成物）、25中和
単位/mlの羊の抗−ヒトアルファインターフェロン（イ
ンターフェロン・サイエンス）、100単位/mlのペニシリ
ン、100μg/mlのストレプトマイシンおよび２μg/mlの
ポリブレンが補充されているRPMI 1640媒体中で培養し
た。等量の正常供血者からの単核白血球を１日間にわた
りあらかじめ２μg/mlのPHA−Ｐ（シグマ）を用いて刺
激した。それらをPBS中で２回洗浄して、レクチンを除
去した。BAT123を試験培養体に10μg/mlの最終濃度で加
えた。培養体の合計量は10mlであった。5mlに細胞培養
体を３−４日間隔で取り出し、1,500×ｇにおいて15分
間遠心して細胞および残屑を除去した。上澄み液を集め
そして10％ポリエチレングリコール（PEG）を使用する
ウィルスの沈澱後に逆転写酵素活性に関して効力検定し
た（グプタ（Gupta）,P.、ガラチャンドラン（Galachan
dran）,R.、グロヴィット（Grovit）,K.、ウェブスター
（Webster）,Dおよびリナルディ（Rinaldi）,C.Jr.（19
87）、ザ・ジャーナル・オブ・クリニカル・マイクロバ
イオロジイ（J.Clin.Microbiology）、25:1122−112
5）。
ｃ）逆転写酵素効力検定 逆転写酵素活性の測定工程はこれまでに記されている
（バレ−シヌーシ（Barre-Sinoussi）,F.、チャーマン
（Chermann）,J.C.、レイ（Rey）,F.、ヌゲイレ（Nugey
re）,M.T.、チャーマレット（Charmaret）,S.、グルー
スト（Gruest）,J.、ドーネット（Daugnet）,C.、アッ
クスラー−ブリン（Axler-Blin）,C.、ヴェチネット−
ブルン（Vezinet-Brun）,F.、ロンジオウ（Ronziou）,
C.、サイエンス（Sience）、220:86−87）。簡単に述べ
ると、PEG−沈澱させたウィルスを0.1％のトリトンＸ−
100、2mMのジチオスレイトール、0.12mMのロイペプチン
および50mMのアミノ−ｎ−カプロン酸を含有している10
0μｌのトリス−緩衝されている食塩水（pH8.2）中の20
分間にわたり溶解させた。効力検定では、8mMのMgCl2、
20μCiの3H−チミジントリホスフェート（2mCi/ml）、
0.05単位のテンペレート−プライマーポリ（rA）を含有
している50mMのpH8.2のトリス−HCl中の100μｌの基質
溶液を25μｌの溶解されたウィルスに加えた。対応する
対照物にはテンペレート−プライマーは加えなかった
が、その代わりに蒸留水を加えた。反応混合物を37℃で
１時間培養し、５％の冷たいトリクロロ酢酸の添加によ
り反応を停止させ、ファットマンGF/Cフィルター上で最
終的に濾過し、それを充分洗浄し、そしてシンチレーシ
ョン計数器を用いて放射活性に関して計数した。特異性
逆転写酵素活性を、テンペレート−プライマーを加えた
時の放射活性における差として計算した。
結果および議論 我々は、特許を請求している中和用単クロール抗体を
それらのウィルスに対する属特異性並びに６種のHIV−
１株（HIV−1B、HIV−1RF、HIV−1AL、HIV−1MN、HIV−
1Z84、およびHIV−1Z34）に対する交差防御に関して研
究した。それぞれこれらのHIV−１株を用いて慢性的に
感染させたヘラーCD4＋細胞とH9細胞の間のシンシチウ
ム生成効力検定では、BAT123は25μg/mlにおいてシンシ
チウム生成を約80％抑制した。それはHIV−1MN、 HIV−1AL、HIV−1RFおよびHIV−1Z34で感染させたH9細
胞のシンシチウム生成を約50％、そしてHIV−1Z84で感
染させたH9細胞のシンシチウム生成を23％、減少させ
た。
陽性の無症候性状態であるエイズまたはアーク（AR
C）と臨床的に診断された患者の末梢血液から単離され
た白血球を使用する共生培養実験では、試験した32人の
患者血液被検物で逆転写活性に関して測定した18個の試
料からウィルスを単離した。実験の間中に10μg/mlのBA
T123を培養媒体中に加えた時には、18個のウィルス−陽
性培養体の全てでウィルス複製が抑制された。抑制の程
度は43.7〜100％の範囲であった。18個の試料の中で、
８個の試料が90％以上有効抑制された。（表IV参照）。
我々の試験官内実験からの結果は、中和用単クローン
抗体BAT123は属−特異性でありそしてシンシチウム生成
抑制効力検定において多種のHIV−１株を交差−防御す
ることが可能でありしかも患者の血液被検物中のウィル
ス感染を抑制できることが示唆される。
実施例IV:単クローン抗体と反応性であるGp120のペプチ
ドフラグメントの測定 単クローン抗体により認識されているHIV−１のgp120
上でエピトープ地図を作成するために、我々はウェスタ
ンブロット効力検定を用いて数種の単クローン片の反応
性を測定した。片はデラウェア州、ウィルミントンのデ
ュポン・デ・ネモアス・アンド・カンパニー、医薬品部
門のスティーブ・ペッテウェイ（Steve Petteway）博士
から入手した。片上の合成ペプチドは８−20のアミノ酸
基の長さであった。これらのペプチドHIV−1B株のgp120
の全長を越える重複ペプチドフラグメントを表してい
る。数十種のペプチド溶液を等間隔に離されている区域
中の個々の片の上に吸着させ、そして片は乾燥状態で供
給された。
ニトロセルロース片を使用する免疫ブロット工程は、
単クローン抗体が前章に記されているgp120と反応する
かどうかを測定するために使用されたウェスタンブロッ
ト工程と同じであった。
結果 単クローン抗体の中の３種、すなわちBAT123、BAT267
およびBAT085、がウェスタンブロット効力検定において
特定にペプチドとの非常に明白な特異性である反応性を
示した。
BAT267 RPNNNTRKSIRIQRG（残基 ＃244−308） BAT123 RIQRGPGRAFVTIGK（残基 ＃304−318） BAT083 VQKEYAFFYKLDIIP（残基 ＃174−188） BAT267およびBAT123と反応性である15アミノ酸長さの
ペプチド類は５個のアミノ酸分だけ重なっている。しか
しながら、抗体はそれらの中の１個だけと反応しそして
他とは測定可能な程度には反応しない。抗体は別の端部
で重なっているペプチドとは反応せず、すなわちBAT267
はLNQSVRINCTRPNNNと反応せずそしてBAT123はVTIGKIGNM
RQAHCNと反応しない。これらの結果は、抗体が中間の５
個のアミノ酸またはこれらのアミノ酸と側部アミノ酸の
一部との組み合わせの全部または一部により生じるエピ
トープと反応することを示唆している。同様な所見はBA
T085に対してもなされ、そしてそれに対しても同様な結
論を出すことができる。
実施例V:BAT123の機能的に転位されたVLおよびVH遺伝子
のクローニングおよび同定 BAT123の機能的に転位されたVLおよびVH遺伝子のクロ
ーニングは、オイ（Oi）およびモリソン（Morrison）
（バイオテクニクス（Biotechniques）、4:214−221）
により記されているのと同じ方式で適当なモレキユラー
プローブ（以下、「プローブ」を「探針」という場合有
り）を用いてBAT123ゲノム・ライブラリイのスクリーニ
ングにより実施された。クローニングされた遺伝子フラ
グメントの同定および最終的確認は、BAT123免疫グロブ
リン分子に関するmRNAのヌクレオチド配列順序により行
うことができた。この理論は、k鎖転位の場合に可変部
の遺伝子フラグメントが適当にＪ部位遺伝子と結合され
ている時またはＨ鎖転位の場合に適当なVDJ結合が生じ
る時にのみ、それが抗体生成細胞中で合成された全長の
そして適当に継ぎ合わされたmRNAであるという事実に基
づいている。
mRNA分子の直接的配列によりまたはcDNAクローンから
測定されたこれらのmRNAの配列順序は、従って機能的に
転位された可変部遺伝子の選択および確認用の指針とし
て作用するのに最も適している。RNA配列順序と同一の
配列順序を有する遺伝子フラグメントは機能的に転位さ
れたと考えられる。
可変部に対応するmRNA分子の配列順序は、プライマー
延長／ジデオキシヌクレオチド終結方法によりBAT123ハ
イブリドーマ細胞のポリゾームから製造されたmRNAを使
用して測定された。この直接的RNA配列方式はmRNA配列
順序を誘導するための一般的方式における中間生成物で
あるcDNAクローニング段階を省略しており、従って、RN
A配列順序を測定するための比較的迅速な方法を与え
る。
このRNA配列用に使用されるプライマーはＬ鎖mRNAに
対しては５′dTGGATGGTGGGAAGATG3′、そしてＨ鎖mRNA
に対しては５′dGGCCAGTGGATAGAC3′であった（両方の
プライマーともニュージャージー州のファーマシアから
得られた）。これらのオリゴヌクレオトドは分子のＪお
よびＣ区域の結合近くの位置で一定区域内でmRNA配列順
序を相補していた。プライマー延長はAMV逆転写酵素を
使用して行われ、そしてジデオキシヌクレオチドにより
終結された。mRNAのヌクレオチド配列順序はゲル電気泳
動およびその後のオートラジオグラフィーにより測定さ
れた。
BAT123細胞用のゲノムDNAライブラリーはラムダファ
ージベクトルλ2001（カリン（Karin）,J.ナッチェス
（Natthes）,W.D.H.、ガイト（Gait）,M.J.、ブレナー
（Brenner）,S.（1984）、ジン（Gene）、32:217−27
4）中で作成された。BAT123ハイブリドーマ細胞からの
高分子量ゲノムDNAを制限エンドヌクレアーゼSau3AIを
用いて部分的に消化させそして10−40％スクロース密度
勾配で寸法分別した。18−23キロベース対（Kbp）のDNA
フラグメントをλ2001/BamH1アーム（カリフォルニア州
ラジョラのストラタゲン・クローニング・システム）を
用いて結合させ、そしてギガパック・ゴールド・パッキ
ング抽出物（ストラタゲン）を使用することにより包装
した。このゲノム・ライブラリーを最初にBAT123L鎖（V
L）の機能的に転位された可変部遺伝子に対してスクリ
ーニングした。このスクリーニング用に使用された探針
は、ハツカネズミゲルムラインカッパ（k）鎖結合用区
域J1−J5（Jk探針；マックス（Max）,E.E.、マイゼル
（Maizel）,J.V.、およびリーダー（Leder）,P.（198
1）、ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミス
トリイ（J.Biol.Chem.）、256:5116−5120）およびBAT1
23L鎖mRNAのヌクレオチド配列順序から誘導される２種
のオリゴヌクレオチド探針であるVk−１およびVk−２の
全てを含有している2.7KbpヒンドIII DNAフラグメント
を含んでいる。これらのオリボヌクレオチド探針の配列
順は、Vk−1:5′dTTTGCTGACAGTAATAGG3′およびVk−2:
5′dATATAACTATCACCATCA3′である。アプライド・バイ
オシステムスDNAシンセサイザーモデル381上で燐アミダ
イトを使用することにより、探針を合成した。
約５×105ファージ組換え体を最初に32P−ラベルの付
いたハツカネズミJkDNAプローでスクリーニングした。
プラークハイブリッド形成を5xSSC中で50％（容量／容
量）ホルムアミド中で42℃において16時間にわたり行っ
た（1xSSC＝0.15M NaCl、0.015M クエン酸ナトリウ
ム）。最終的洗浄は0.2xSSC/0.1％SDS中で行われた。２
種の陽性クローンが得られた。それらを32P−ラベルの
付いたオリゴヌクレオチド探針Vk−１およびVk−２を使
用してスクリーニングした。オリゴ探針を用いるハイブ
リッド形成は5xSSC中で37℃において18時間実施され、
そして洗浄は2xSSC/0.1％SDS中で室温において実施され
た。これらのクローン中では、Vk−123−23がJkDNA探針
および２種のオリゴヌクレオチド探針とハイブリッドを
形成することが示された。ジデオキシヌクレオチド終結
方法によるこのクローンのDNA配列順序の測定は、それ
がBAT123L鎖mRNAから測定されたものと同一の配列順序
を有するVL遺伝子フラグメントを有することを示してい
た。このクローンをハツカネズミ／ヒトのキメラ性Ｌ鎖
遺伝子のその後の作成において使用した。
BAT123に関する機能的に転位された可変部のクローニ
ングのために、Ｈ鎖（VH）の部分的ゲノム性ライブラリ
ーを製造した。JH探針を有するEcoR1消化体のゲノム性
サザンブロット（下記を参照のこと）はあらかじめBAT1
23中で,BAT123の融合親すなわちNS−１から多分誘導さ
れた6.6Kbpフラグメントの他に２種の陽性に機能的に転
位されたVH遺伝子を示しており、それらの一方は7.5Kbp
でありそして他方は4.5Kbpである。これらのDNA帯を含
有している２種の部分的ライブラリーを製造した。高分
子量DNAをEcoR1を用いて消化完了させ、そして0.7％ア
グロースゲル上で分別した。寸法４−6Kbpおよび６−Kb
pのDNAフラグメントを単離し、そしてラムダベクトルλ
gtWESλＢと結合させた（リーダー（Leder）,P.、チメ
イアー（Timeier）,D.およびエンクイースト（Enquies
t）,L.（1977）、サイエンス（Science）、196:175−17
7）。結合されたDNAを包装しそして組換え体プラークを
スクリーニングした。使用したプローブはハツカネズミ
Ｈ鎖結合部位J3およびJ4を含んでいる2KbpBamHI−EcoRI
DNAフラグメント（JHプローブ；ガウフ（Gough）,N.M.
およびベルナルド（Bernard）,O.（1981）、プロシーデ
ィングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミイ・オブ・
サイエンス・オブ・ザ・ユナイテッド・ステーツ・オブ
・アメリカ（Proc.Natl.Acad.Sci.）、米国、78:509−5
13）並びにBAT123mRNA配列順序から誘導されたオリゴヌ
クレオチド探針VH−１である５′dAGTGTGGCTGTGTCCTC
3′を含んでいる。これらのプローブに対するハイブリ
ッド形成はk鎖に関して以上で記されている如くであっ
た。JH探針を用いるこれらの２種のEcoRI部分的ライブ
ラリーのスクリーニングで7.5Kbp、6.6Kbpまたは4.5Kbp
を含有している３種の独立ファージクローンを単離し
た。オリボヌクレオチド探針VH−１を使用するその後の
ハイブリッド形成では、4.5Kbpを中に含有しているファ
ージすなわちクローンVH123−E3だけが探針とハイブリ
ッド形成したことが示された。このクローンのDNAスク
リーニングは、それがBAT123のVHmRNAからのものと同一
のVH配列順序を含んでいたことを示した。このクローン
をハツカネズミ／ヒトのキメラ性Ｌ鎖遺伝子のその後の
作成において使用した。
マウスＶとヒトＣエクソンの融合およびマウス骨髄種中
への加入 BAT細胞から単離された機能的に転位されたＬおよび
Ｈ鎖Ｖ遺伝子を、それぞれ優性の選択可能マーカーであ
るneo（サザーン（Southern）,P.J.およびベルグ（Ber
g）,P.（1981）、J.Mol.Appl.Gemet.、1:327−341）並
びにgpt（ムリガン（Mulligan）,R.C.およびベルグ（Be
rg）,P.（1981）、プロシーディングス・オブ・ザ・ナ
ショナル・アカデミイ・オブ・サイエンス・オブ・ザ・
ユナイテッド・ステーツ・オブ・アメリカ（Proc.Natl.
Acad.Sci.）、米国、78:2072−2076）を含んでいる表示
ベクトル中で、ヒトkおよびrlC部位遺伝子と結合させ
た。希望するキメラ遺伝子を作成するために、ダンシル
−特異性VL遺伝子を含有しているpV184ΔHneo.DNSVL−h
Ck（オイ（Oi）,V.T.およびモリソン（Morrison）,S.L.
（1986）、バイオテクニクス（Biotechniques）、4:214
−221）をクローンVk123−23から誘導されたBAT123のＬ
鎖遺伝子を含有している4.4KbpHindIIIフラグメントで
置換した。生成したプラスミドであるpSV184ΔHneo.BAT
123.VkhCkの構造は第1A図に示されている。
キメラ性Ｈ鎖遺伝子はダンシル−特異性VH遺伝子を含
有しているpSV2ΔHgpt.DNSVH.hCγｌプラスミド中のEco
RIフラグメントをファージクローンVH123−E2から誘導
された機能的に転位されたBAT123H鎖遺伝子を含有して
いる4.5−kbpEcoRIフラグメントで置換することにより
作成された。生成したプラスミドであるpSV2ΔHgpt.BAT
123.VH.hCγｌの構造は第1B図に示されている。
第３図に示されているＬおよびＨ鎖キメラ遺伝子を使
用してマウス骨髄種細胞にトランスフェクションした。
選択された骨髄種細胞であるSp2/0は、それ自身の免疫
グロブリン分子を生成しない非分泌細胞系であった（シ
ュルマン（Shulman）,M.、ウィルデ（Wilde）,C.および
コーラー（Kohler）,G.（1978）、ネーチャー（Natur
e）、276:269−270）。燐酸カルシウム沈澱方法（グラ
ハム（Graham）およびファンデルエブ（van der Eb）
（1973）、ヴィロロジー（Virology）、52;456）を適用
してキメラ遺伝子をSp2/0細胞中に移入させた。
DNAトランスフェクションを促進させるために、Sp2/0
細胞をあらかじめヒストン（ミズーリ州セントルイスの
シグマ・ケミカル・カンパニイ）で処理されている100m
mのペトリ皿当たり５×106細胞の割合で種つけし、そし
て37℃で16時間培養した。約7.5×107個のSp2/0細胞をC
sCl−エチジウムブロマイド勾配で精製されているpSV18
4ΔHneo.BAT123.VkhCk（150μｇ）およびpSV2ΔHgpt.BA
T123−VH.hCγｌ（150μｇ）と共に燐酸カルシウム沈澱
方法を使用してトランスフェクションした。トランスフ
ェクションから２日後に、細胞を微量滴定板中で１個の
ウエル当たり１×105個の細胞の密度において400μg/ml
のG418および0.8μg/mlのミコフェノール酸を含有して
いる培養体中で継代培養した。２種の選択薬品に対する
トランスフェクタントの頻度は約２×10-5であった。
安定なトランスフェクタント（トランスフェクトー
マ）を、BAT123の顕著な特性である精製されたHIVgp120
に対するそれらの親和力によって、分泌された機能的キ
メラ抗体を製造するためにスクリーニングした。精製さ
れたgp120は微量滴定板の上で固定され、そしてそれは
トランスフェクタントからの培養上澄み液と反応するこ
とができた。抗原−抗体複合体をヒトのIgGに特異性で
あるアルカリ性ホスファターゼ−結合された抗血清を用
いて検出した。表Ｖに示されている如く、試験した1200
種のトランスフェクタントの中の707種がELISA中で陽性
信号を与え、それは完全なキメラ抗体が分泌されたこと
およびこの蛋白質がHIVgp120を結合する能力を保有して
いることを示している。トランスフェクションされてい
ない親細胞系は陰性の結果を与えた。
トランスフェクトーマはELISA中でそれらのODを基にし
て目盛り付けされている。「陰性」は0.0〜0.1のODであ
ると定義され、「弱陽性」は0.1〜0.2を示し、そして
「陽性」は0.2−3.0を示している。
トランスフェクトーマ細胞系からのキメラ抗体の製造 ELISA中で1.0より大きいODを示す70本のトランスフェ
クトーマ系を選択し、そして単独細胞クローニング技術
によりキメラ抗体生成用細胞を精製し、そこから12本の
安定な細胞系を制定した。これらのトランスフェクトー
マ細胞系を次に分泌薬品であるG418およびミコフェノー
ル酸の不存在下でキメラ抗体生成安定性に関して試験し
た。細胞を媒体中で２種の選択薬品中で２週間の間隔で
段階的に減少させながら培養して、薬品を完全に除去し
た。薬品の各減少中、これらの細胞系中のキメラ抗体の
製造をELISAにより監視した。これらの細胞系の中の３
本は選択圧力を除くとキメラ抗体を分泌するそれらの能
力を失った。残りの９本の細胞系は培養媒体中での選択
薬品の完全除去から５週間後もキメラ抗体の製造におい
て安定なままであった。
キメラ抗体製造水準を評定しそして別の同定用に抗体
を製造するために、トランスフェクトーマ系CAG1−51−
４を広げそして組織培養媒体中で成長させた。約600ml
の培養媒体を集めそしてそこから14.4mg（イリノイ州ロ
ックフォード、ピアースのBCA蛋白質効力検定により評
定されている）のキメラ抗体をｒ−蛋白質Ａ−セファロ
ース親和力カラム（マサチューセッツ州ケンブリッジの
レプリゲン・コーポレーション）の利用により精製し
た。このトランスフェクトーマ細胞系の培養上澄み液中
のIgG濃度は従って24μg/mlであると評定され、それはB
AT123ハイブリドーマ細胞により生じる水準（20μg/m
l）より幾分高い水準であった。
キメラ抗体の生化学的分析 精製されたキメラ免疫グロブリンを使用して、キメラ
抗体の生化学的性質を同定した。
Ａ）等電点 精製されたキメラ抗体の等電焦点用（IEF）ゲルのパ
ターンをBAT123のものと一緒に第４図に示す。IEFパタ
ーンはファーマシアのファストシステムTM上での精製さ
れた抗体試料の適用により得られ、そしてIEFは製作者
の推薦する工程に従い実施された。IEFパターンは、キ
メラ抗体はpH6.8−7.2の範囲にpIを有する２種の主要種
を含有しているが対応するBAT123分子はpH5.6−5.8の範
囲のpIを表示すること示していた。従ってマウスからヒ
トへの免疫グロブリン分子の一定区域の置換がIEFパタ
ーンに反映される抗体の組成を大きく変更させた。
Ｂ）抗−マウスおよび抗−ヒト抗結成に対するキメラ抗
体の反応性 キメラ抗体を還元性条件（レンムリ（Laemmli）.U.K.
（1970）、ネーチャー（Nature）、227:680−685）下で
10％SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけた時
には、２種の帯が観察された（第5A図、レーン２）。5
3,000ダルトンの分子量の蛋白質帯はキメラＨ鎖に相当
しており、そしてBAT123免疫グロブリンのＨ鎖（第5A
図、レーン１）とほとんど同様の寸法を示した。約23,0
00ダルトンの寸法を有する蛋白質帯は抗体のＬ鎖を示し
た。キメラＬ鎖に対して観察されたわずかにゆっくりし
た移動度が他のキメラ抗体中でも見られ、そしてそれは
必ずしもヒトＬ鎖k一定部位（hCk）のマウスのそれより
大きい寸法によるものではないかもしれない。免疫グロ
ブリンを10％SDS−PAGE中に非還元条件下で溶解させた
時には、キメラ抗体のH2L2分子と似ているIEFパターン
はBAT123（分子量146,000ダルトン）のものと同一の移
動度を示した（第5A図、レーン３および４）。
キメラ抗体がヒト免疫グロブリンの一定部位に実際に
入ったかどうかを試験するために、バイオラド・ミニ−
プロテインIIジュアル・スラブ・セル装置中で蛋白質を
10％SDS−PAGE中に還元条件下で溶解させた後に、２μ
ｇのキメラ抗体およびBAT123をニトロセルロース膜の上
でエレクトロブロットした（100ボルト、１時間、25mM
のトリス−HCl、192mMのグリシン、20％（容量／容量）
のメタノールからなるpH8.3のトランスブロット緩衝液
中）。複製膜フィルターの一方はビオチニル化された抗
−マウス抗体（カリフォルニア州バーリンガムのベクト
ル・ラボラトリイ）と反応させたが、他方のフィルター
は燐酸塩で緩衝されている食塩水（PBS）中の５％の無
脂肪ドライミルクからなるブロット緩衝液中でビオチニ
ル化された抗−ヒト抗体と反応させた。37℃における１
時間の培養後に、膜フィルターをPBS＋0.1％ツイーン20
（PBST）を２回交換して洗浄し、そして両方の膜をブロ
ット中で室温においてセイヨウワサビペルオキシダーゼ
−アビジン結合体と30分間にわたり反応させた。PBSTを
用いた最終的洗浄の後に、反応性蛋白質帯を４−クロロ
−１−ナフトール（４−CN）および過酸化水素を使用す
る発色により可視化した。第5B図に示されている如く、
BAT123免疫グロブリンは引き続いて抗−マウス抗血清と
反応性であったが、キメラ抗体は該血清とほとんど反応
性でなかった。一方、キメラ抗体は抗−ヒト抗血清と強
く反応したが、BAT123は抗血清とは認められる反応性を
示さなかった（第5C図）。この結果は、キメラ抗体分子
の一部が実際にヒト免疫グロブリンから誘導されたこと
を示している。
Ｃ）キメラ抗体のIgGサブクラス Ｈ鎖キメラ遺伝子は、BAT123のVH遺伝子をヒトＣγ１
部位のコード配列中に組み継ぐことにより、製造され
た。生成したキメラ抗体は従ってIgG1サブクラスのもの
であると予測された。予測された製造されたキメラ抗体
のアイソタイプを確認するために、下記の実験を行っ
た。マウスの抗−ヒトIgG1およびIgG3抗−血清（フィッ
シャー・バイオテク）を別個に微量滴定ウエル上に一連
の２倍希釈度でコーテイングした。20μg/mlのキメラ抗
体をこれらのウエルに加え、そして37℃で１時間培養し
た。PBSTで洗浄した後に、山羊の抗−ヒト−セイヨウワ
サビペルオキシダーゼ結合体（ベクトル）を用いる培養
およびその後の発色により複合体を検出した。結果（第
６図に示されている）は、キメラ抗体がIgG1サブクラス
のものであることを、明らかに示している。
Ｄ）キメラ抗体の抗原特異性 抗原結合位置の生成に直接かかわっている免疫グロブ
リン分子内のアミノ酸残基は一般的に、免疫グロブリン
の可変領域（Ｖ）内に存在している相補性決定部位（CD
R）中にあると信じられている。キメラ抗体が親抗体の
抗原特異性を保有しているかどうかを測定するために、
下記の実験を行った。第一の実験ではキメラ抗体をSDS
−PAGE中に溶解されている精製HIVの全ての抗原を含有
している市販の免疫ブロット片（バイオテク・リサーチ
・ラボスのロバート・チン博士の寄贈）と反応させ、そ
の後ニトロセルロース膜フィルター上で等電トランスブ
ロットを行った。反応はブロット緩衝液中で室温におい
て16時間行われた。反応性複合体を次に最初にビオチニ
ル化された抗−ヒト抗血清（ベクトル）を用いそしてそ
の後アビジン−セイヨウワサビペルオキシダーゼを用い
て培養し、各培養段階の間に洗浄し、そして最後に酵素
基質である４−CNおよび過酸化水素を用いて発色するこ
とにより検出した。結果は第7A図に示されている。キメ
ラ抗体と反応する抗原帯（レーン３）は平行反応中でBA
T123抗体により検出されたもの（レーン２）と同一であ
り、そしてエイズ患者からの対照用血清との反応により
示されるウィルス抗原プロフィル中のウィルスエンベロ
ープグリコ蛋白質gp120に相当していた。この結果、キ
メラ抗体がHIV−gp120を結合させるBAT123の抗原特異性
を保有していることを示していた。
キメラ抗体がBAT123と同様にgp120内の抗原決定基
（エピトープ）を認識するかどうかをさらに試験するた
めに、抗体をgp120中の潜在的な抗原決定基の存在する
一連の32重複オリゴペプチド類を含有している膜片（デ
ュポンのS.ペッテウェイの寄贈）と反応させた。培養工
程は本質的にウィルス抗原の免疫ブロット片のものと同
一であった。結果（第7B図に示されている）は、キメラ
抗体がArg.Ile.Gln.Alg.Gly.Pro.Cly.Arg.Ala.Phe.Val.
Thr.Ile.Gly.Lysのアミノ酸配列を有するBAT123と同じ
オリゴペプチドと結合することを示している。
マウス抗体BAT123の抗原特異性は従ってマウス／ヒト
キメラ抗体への転化においても良好に保存されていた。
キメラ抗体の生物学的活性 Ａ）キメラ抗体によるH9細胞に対するHIV−１感染の中
和 H9細胞に対するHIV−１感染を中和するキメラ抗体の
能力をこれまでに記されているのと同様な工程を使用し
て測定した（1987年５月29日に出願された米国特許出願
番号057,445の一部継続出願である1987年12月24日に出
願された米国特許出願番号137,861）。使用したウィル
スは、HTLV−IIIBを感染させたＨ細胞の培養上澄み液か
ら製造された。40mlの細胞を含まない上澄み液を35,000
×ｇで３時間遠心した。粒子を3mlの成長媒体中に再懸
濁させた。ウィルスの滴定量は、H9細胞にウィルス株を
10倍の連続的希釈度で感染させることにより、測定され
た。ウィルス株のTCID50は、微量培養体数の半分が感染
した時の感染投与量として測定された。
中和効力検定では、20倍のTCID50に等しい感染投与量
を使用した。50μｌの60TCID50のウィルス株を96−ウエ
ル板の微量培養ウエル中で試験された50μｌの抗体と共
に使用した。試験した抗体はキメラ抗体CAG1−51−４、
マウスの単クローン抗体BAT123およびヒト絨毛性性腺刺
激ホルモンに対するマウスの単クローン抗体（抗−hC
G）であった。対照用では、50μｌの抗体なしの成長媒
体を使用した。混合物を５％CO2培養器中で37℃に１時
間保った。抗体の最終的濃度は100、50、25、12.5およ
び6.25μg/mlであった。試験抗体の各濃度について３回
ずつ実施した。培養終了時に、50μｌの４×106/mlのH9
細胞を加えた。H9細胞は対数相で回収され、そしてあら
かじめ混合物に加えられてある15％の熱−不活性化され
た牛の胎児血清を含有しているRPMI−1640成長媒体中で
１時間にわたり37℃において２μg/mlのポリブレンと共
に予備培養した。培養終了時に、各微量培養ウエル中の
細胞を再懸濁させ、40μｌの細胞懸濁液を別の微量培養
板の対応するウエル中で200μｌの新しい成長媒体に加
えた。微量培養板を培養器中で５％CO2中に37℃に保っ
た。３、５、７、９、11および14日目に、150μｌの各
微量培養体からの細胞懸濁液を取り出し、そして別の96
−ウエル板のＵ底ウエル中に入れた。板を200xgで５分
間にわたり遠心した。HIV−１ウィルス抗原捕獲効力検
定用に、上澄み液を集めた。ウエルを150μｌの新しい
成長媒体と共に供給した。
抗原捕獲効力検定においては、細胞を含まない上澄み
液中のHIV−１特異性抗原をエイズ患者からの免疫グロ
ブリンに対するそれらの親和力により測定した。100μ
ｌの希釈された精製エイズ患者免疫グロブリン（1:200
0、約５μg/ml）をコビンド板の各ウエルに加え、そし
て37℃で２時間培養した。次にウエルを200μｌの燐酸
塩で緩衝されている食塩水（PBS）で２回すすいだ。ウ
エルをPBS中で220μｌの１％牛血清アルビミン（BSA）
で１時間にわたり37℃で遮蔽した。ウエルを次に空にし
た。50μｌの試験試料（未希釈のまたは適当に希釈され
たもの）を50μｌのPBSTB（１％のBSAおよび0.1％のツ
イーン20を含有しているPBS）と共にウエルに加えた。
陰性対照物は50μｌの成長媒体を含有していた。板を37
℃で１時間培養した。次にそれをPBSTで３回すすいだ。
100μｌの希釈されたペルオキシダーゼ結合されたエイ
ズ患者の免疫グロブリンを各ウエルに１時間にわたり室
温で加えた。板を次にOBSTで３回すすいだ。100μｌの
基質溶液（20mMのpH6.0の酢酸ナトリウム緩衝液、0.001
％の3,3′,5,5′テトラメチルベンジジンおよび0.001％
の過酸化水素を含有している）を各ウエルに加え、そし
て室温で30分間培養した。次に50μｌの2M H2SO4を各ウ
エルに加えて反応を停止させた。490nmにおいて吸収が
読み取られた。３回の読み取り値を平均し、そして中和
用抗体を加えた時の抑制率に関して対照用と試験抗体を
比較した。結果（第８図）は、全ての希釈度で14日の効
力検定においてキメラ抗体はH9細胞に対するHIV−１感
染を完全に中和したことを示している。対照用のマウス
抗体（抗−hCG）および成長媒体は抑制活性を示さなか
った。
Ｂ）キメラ抗体のシンシチウム生成の抑制 キメラ抗体のHIV−中和活性も、それがシンシチウム
生成を抑制する能力により評価された。細胞融合により
HIV−１伝播に対するキメラ抗体の効果を、接触時に融
合しそして培養体中でシンシチウムを生成するHIV−１
感染H9細胞およびCD4−発現ヘラ細胞（ヘラ−CD4＋）を
使用して研究した。ヘラ−CD4＋はそれのゲノム中にト
ランスフェクションにより加えられたCD4コード化DNAを
含有しており、従って、それはそれの細胞表面上でCD4
抗原を発現する。ヘラ−CD4＋細胞系はデイヴィッド（D
avid）,D.ホー（Ho）（ロスアンジェルスのカリフォル
ニア大学）から寄贈された。ヘラ−CD4＋細胞の培養体
を96−ウエル微量培養板のウエルの上に１個のウエル当
たり20,000個の細胞の割合で置いた。板を36時間にわた
り培養し、そしてこの時までに単層上皮細胞はほとんど
コンフルエントとなあった。１×104個の感染H9細胞を
融合性ヘラ−CD4＋細胞に加えた時に、生成した細胞は
接触し、融合し、そして18時間以内に多核化された巨細
胞（シンシチウム）が生成した。５個より多い核を有す
るこれらのシンシチウムは容易に同定および計数でき
て、シンシチウム生成の定量的測定値を与える。シンシ
チウム生成に対するキメラ抗体の効果を研究する時に
は、種々の濃度の抗体を感染H9細胞と混合しそしてヘラ
−CD4＋細胞に加えた。１個のウエル当たりの培養媒体
の最終的な合計量は200μｌであった。37℃における18
時間の培養時間の終了時に、ウエルをPBSで洗浄し、メ
タノールで固定し、空気乾燥し、そしてメチレンブルー
で染色した。細胞を100X倍率で検査し、そしてシンシチ
ウム（５個より多い核のもの）数を４種の不規則的に選
択された視界で測定し、そして平均した。表VIに示され
ているように、キメラ抗体CAG1−51−４はそれぞれ20μ
g/ml、10μg/ml、および５μg/mlの水準においてはH9細
胞およびヘラ−CD4＋細胞の間で生成したシンシチウム
数での89.1％、65.7％、および58.6％の減少を与えた。
この効果はBAT123により生じるものと本質的に同一であ
り、そしてそれはキメラ抗体がHIV伝播用の主要方式の
一種であるHIV−感染細胞および未感染の細胞の間の融
合を抑制する活性を保有していたことを示している。
対照用のマウス抗体抗−hCGはシンシチウム生成に効
果を与えなかった。
評価 当技術の専門家は日常的な実験をもはや使用せずにこ
こに記されている本発明の特定態様と同等な多くの態様
を認識したりまたはつきとめたりできるであろう。その
ような同等な態様も特許請求の範囲により包括されるも
のとする。
フロントページの続き (72)発明者 フン，セク・シー アメリカ合衆国テキサス州77025ヒユー ストン・デイール3511 (72)発明者 スン，セシリイ・ロウ‐ユン アメリカ合衆国テキサス州77005ヒユー ストン・ノツチンガムブールバード3103 (72)発明者 スン，ビル・ナイ‐チヤウ アメリカ合衆国テキサス州77005ヒユー ストン・ノツチンガムブールバード3103 (72)発明者 チヤン，ナンシイ・テイ アメリカ合衆国テキサス州77005ヒユー ストン・ロビンフツド3323 (72)発明者 リオウ，ルエイ・シヤン アメリカ合衆国テキサス州77478シユガ ーランド・リバーベンドクロシング1814 (72)発明者 ローゼン，エドワード・エム アメリカ合衆国テキサス州77030ヒユー ストン・サウスブレイズウツドブールバ ード2207 (56)参考文献 特表 昭62−500592（ＪＰ，Ａ) 国際公開87−2775（ＷＯ，Ａ) Ｓｃｉｅｎｃｅ，234，12Ｄｅｃｅｍ ｂｅｒ1986，Ｐ．1392−1395 Ｎａｔｕｒｅ，324，11Ｄｅｃｅｍｂ ｅｒ1986，Ｐ．572−575

Claims (6)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】HIV−１のgp120の部分配列であつて、 RPNNNTRKSIRIQRG;または VQKEYAFFYKLDIIP で示される配列のペプチドに結合し、HIV−１感染を阻
    害するモノクローナル抗体。
  2. 【請求項２】HIV−１のgp120の部分配列であつて、 RIQRGPGRAFVTIGK で示される配列のペプチドに結合し、HIV−１感染を阻
    害するモノクローナル抗体または他のHIV−１株由来の
    対応する配列に結合する、HIV感染を阻害するモノクロ
    ーナル抗体。
  3. 【請求項３】請求項１または２のモノクローナル抗体を
    産生する細胞系であって、 （Ａ）不活性化HIV−１により免疫感作したマウスから
    脾臓細胞を調製する工程、 （Ｂ）骨髄腫NS−１細胞を調製する工程、 （Ｃ）工程（Ａ）および工程（Ｂ）でそれぞれ得られる
    細胞を融合する工程、 （Ｄ）工程（Ｃ）で得られる融合細胞から、それらが産
    生する抗体のgp120に対する結合性が陽性を示す融合細
    胞を選択する工程、 （Ｅ）工程（Ｄ）で選択される融合細胞から、さらにそ
    れらが産生する抗体のHT細胞系のHIV−１感染細胞に対
    する結合性が陽性を示す融合細胞を選択する工程、 （Ｆ）工程（Ｅ）で選択される融合細胞から、それらが
    産生する抗体の請求項１および２に記載の配列ペプチド
    から選ばれるいずれか１のペプチドに対する結合性が陽
    性を示す融合細胞を選択する工程、 を含んでなる方法によって得ることができる前記細胞
    系。
  4. 【請求項４】マウス起源の可変領域とヒト起源の定常領
    域を有するキメラマウス／ヒト型の請求項１または２記
    載の抗体。
  5. 【請求項５】細胞障害性剤、抗ウイルス剤または血液の
    脳バリヤーの通過を促進する剤と複合化された請求項
    １、２または４のいずれか１項に記載の抗体を含んでな
    る抗体複合体。
  6. 【請求項６】有効成分として、請求項１、２、４または
    ５のいずれか１項に記載の抗体を含んでなるHIV−１感
    染症を予防または処置するための医薬組成物。
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