JPH07292000A

JPH07292000A - Ｈｉｖに対するヒトモノクローナル抗体

Info

Publication number: JPH07292000A
Application number: JP6290097A
Authority: JP
Inventors: Yasuhiko Masuho; 安彦増保; Toru Sugano; 徹菅野; Yoh-Ichi Matsumoto; 洋一松本; Evan M Hersh; エム．ハーシュエバン; Eskild A Peterson; エー．ピーターソンエスキルド; Douglas Lake; レイクダクラス
Original assignee: Teijin Ltd; University of Arizona Foundation; University of Arizona
Current assignee: Teijin Ltd; University of Arizona Foundation; University of Arizona
Priority date: 1988-03-31
Filing date: 1994-11-24
Publication date: 1995-11-07
Also published as: JPH0753755B2; AU2456888A; JPH02219592A; ATE125870T1; EP0339163B1; KR0149848B1; KR890014730A; DE3854267D1; AU627698B2; US5298419A; EP0339163A2; CA1339858C; EP0339163A3; DE3854267T2

Abstract

(57)【要約】【目的】ＨＩＶに対するヒトモノクローナル抗体の提
供。【構成】ＨＩＶのエンベロープの構造成分である分子
量１２０，０００ダルトンの糖蛋白質（ｇｐ１２０）に
結合するが、ＳＨ試薬で処理したｇｐ１２０には結合し
ないことを特徴とするヒト・モノクローナル抗体、該抗
体を産生するハイブリドーマセルライン、及びそれらの
製造方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はＨＩＶ（ｈｕｍａｎｉ
ｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙｖｉｒｕｓ）に対す
るヒト・モノクローナル抗体（ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ
ａｎｔｉｂｏｄｙ，ＭＣＡと略す）とそれを産生するハ
イブリドーマに関する。その目的とするところは、ＨＩ
Ｖ感染症の診断、予防及び治療に役立つところの、ＨＩ
Ｖに特異的なヒトＭＣＡを提供することにある。

【０００２】

【従来の技術】ＨＩＶは主にヘルパーＴリンパ球に感染
し、それを破壊することによって著しい免疫不全を引き
起こし、ＡＩＤＳ（ａｃｑｕｉｒｅｄｉｍｍｕｎｏｄ
ｅｆｉｃｉｅｎｃｙｓｙｎｄｒｏｍｅ）を発症させ
る。ＨＩＶに感染した初期には、一部の患者において、
発熱、倦怠、頭痛等を伴なう伝染性単核症様の症状を起
こす。その後、患者は無症状であるが、血中に抗ＨＩＶ
抗体を有するキャリヤーとなり、数年の潜伏期を経た
後、ＡＲＣ（ＡＩＤＳ−ｒｅｌａｔｅｄｃｏｍｐｌｅ
ｘ）患者に移行する。

【０００３】ＡＲＣ患者は全身リンパ腺腫脹、発熱、全
身倦怠、体重減少、血小板やリンパ球の減少等の症状を
呈する。これが進行すると、カポジ肉腫や、カリニ肺
炎、真菌症、サイトメガロウイルス感染症等の日和見感
染症を起し、死に至る。最も著しい特徴は、ヘルパーＴ
リンパ球（Ｔ４）が減少し、サプレッサーＴリンパ球
（Ｔ８）との比、Ｔ４／Ｔ８が病気の進行と共に小さく
なっていくことである。

【０００４】ＡＩＤＳは１９８１年に米国で初めて報告
され、現在では米国のみで２０，０００人余の患者が報
告され、キャリヤーは１００万人ともいわれている。米
国と共にアフリカ、ヨーロッパにも多くの患者がおり、
その診断、予防そして治療について膨大な量の研究が進
められている。

【０００５】ＡＩＤＳの病原体であるＨＩＶはレトロウ
イルスの１つであり、約９，７００塩基対のＲＮＡとｇ
ａｇ蛋白質（分子量５５，０００，２４，０００，１
７，０００ダルトンの３種）、逆転写酵素（分子量６
６，０００，５１，０００ダルトンの２種）、エンベロ
ープ（ｅｎｖｅｌｏｐｅ）構成成分の糖蛋白（分子量１
２０，０００と４１，０００ダルトンの２分子とその前
駆体である１６０，０００ダルトンの分子、以下ｇｐ１
２０，ｇｐ４１，ｇｐ１６０と略す）等から成ってい
る。特にウイルス感染とその防御という観点から見る
と、ウイルス表面に露出しているエンベロープが重要な
意味を持っている。

【０００６】ｇｐ１６０は蛋白分解によって、ｇｐ１２
０とｇｐ４１とに切断される。ｇｐ４１はウイルス・エ
ンベロープの脂質二重層に埋め込まれたトランスメンブ
レンプロティン（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅｐｒｏ
ｔｅｉｎ）であり、ｇｐ１２０の方が外側に露出してお
り、ｇｐ１２０は部分的にウイルスから離脱する。両方
とも糖結合サイトを多く有しており、ｇｐ１２０分子の
約半分は糖から成っている。このｇｐ１２０分子は、ヘ
ルパーＴ細胞等の細胞表面にあるＣＤ４抗原ないしその
近傍に結合し、ウイルスの感染を起すと共に、合胞体形
成（ｓｙｎｃｙｔｉｕｍｆｏｒｍａｔｉｏｎ）を細胞
に引き起す活性を有している。ｇｐ１２０は米国特許N
o. ４，７２５，６６９に詳細に記載されている。

【０００７】例えば、Ｍ．Ｒｏｂｅｒｔ−Ｇｕｒｏｆｆ
ら（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３８，３７３１，１９８
７）は血中にウイルス中和抗体を有する患者は、そうで
ない患者よりも病状の進行が遅いと述べている。また患
者血中の中和抗体はｇｐ１２０に結合すると報告されて
いる（Ｌ．Ａ．Ｌａｓｋｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３
３，２０９、並びに１９８６とＴ．Ｊ．Ｍａｔｔｈｅｗ
らのＰｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，
８３，９７０９，１９８６）。さらに重要なことには、
高力価抗ｐ２４抗体を有する血漿の受動免疫によってＨ
ＩＶ感染患者の抗原血漿の改善及び予後の改善が認めら
れたと報告されている（Ａ．Ｋａｎｐａｓ等、Ｐｒｏ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：９２３
４，１９８８；Ｇ．Ｇ．Ｊａｃｈｓｏｎ等、Ｌａｎｃｅ
ｔ２：６４７，１９８８）。この様に、ウイルス又は
ウイルス感染細胞の表面に露出されているウイルス抗原
に対する中和抗体は当然、感染防御又は治療上重要な意
義をもっている。

【０００８】既に、ｇｐ１２０に対するマウスＭＣＡは
いくつかの研究グループによって報告されている。Ｔ．
Ｃ．Ｃｈａｎｈら（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１
６，１４６５，１９８６）は、ｇｐ１２０のペプチド鎖
の一部を化学的に合成し、これに対するマウスＭＣＡを
作製した。このＭＣＡによる間接蛍光抗体法は、逆転写
酵素測定よりも感度よくＨＩＶの感染を検出したと述べ
ている。また、Ｇｏｓｔｉｎｇら（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉ
ｃｒｏｂｉｏｌ．，２５，８４５，１９８７）は、可溶
化ウイルス抗原をｌｅｎｔｉｌｌｅｃｔｉｎ−Ｓｅｐ
ｈａｒｏｓｅ４Ｂにかけて、その糖蛋白を取り、それを
マウスに免疫し、抗ｇｐ１２０・マウスＭＣＡと抗ｇｐ
４１・マウスＭＣＡを作製した。また松下ら（Ｍｅｄｉ
ｃａｌ

【０００９】Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４，３０７，１９８
７）は抗ｇｐ１２０・マウスＭＣＡにウイルス中和活性
を認めた。これらのＭＣＡはＨＩＶ感染の診断に役立つ
が、感染症の予防や治療という点では不適当である。と
いうのは、マウス蛋白であるために、人体に投与したと
きに異物として人体の免疫により認識されてしまう。そ
の結果、ＭＣＡの活性は生じた抗体等によって阻止され
てしまうのみでなく、アナフィラキシー様の副作用を生
じることになる。そこで、人体に投与し、ＨＩＶ感染症
の予防及び治療に役立てるには、マウス由来でなく、ヒ
ト由来のＭＣＡが不可欠となる。

【００１０】一般に、ヒト由来のＭＣＡは、ＨＩＶ特異
的な抗体産生能力を持つヒトＢリンパ球と、ミエローマ
細胞等のリンパ系樹立細胞との融合によって得られるハ
イブリドーマから産生されるか、または上記ヒトＢリン
パ球を、ＥＢウイルスによって形質転換することによっ
て得られるリンパ芽球様細胞から産生される。１９８０
年頃から現在に至るまで、多くのヒトＭＣＡ作製研究が
行なわれてきたが、上記の両方法ともそれぞれ固有の問
題をかかえており、マウスＭＣＡのように確立した技術
となっていない。

【００１１】１９８７年に、ＨＩＶに対するヒトＭＣＡ
に関し２つの報告があった。Ｌ．Ｅｖａｎｓら（Ｐｒｏ
ｃｅｅｄｉｎｇｓｏｆｔｈｅｔｈｉｒｄＣｏｎ
ｇｒｅｓｓｏｎＡＩＤＳ，ＴＰ１３０，１９８７）
は、ＨＩＶ感染患者のリンパ球をＥＢウイルスで形質転
換し、５５，４１及び２５キロダルトンのｇａｇ蛋白に
反応するヒトＭＣＡを得た。このヒトＭＣＡはＩｇＧ４
であり、ウイルス中和活性はなかった。また、Ｂ．Ｂａ
ｎａｐｏｕｒら（ｉｂｉｄ，ｔｐ１１４）は、ＨＩＶ抗
体陽性者のリンパ球をＥＢウイルスで形質転換し、さら
にヘテロミエローマ細胞と融合し、ｇｐ４１に対するヒ
トＭＣＡを得ている。

【００１２】このＭＣＡはＩｇＧであるが、サブクラス
の種類は報告されておらず、また中和活性はなかった。
両報告とも共通してＥＢウイルスによる形質転換法を用
いている。本方法は、極めて効率よくヒトＢリンパ球を
免疫感作する点で、細胞融合法よりもずっと優れてい
る。しかしながら、得られたリンパ芽球細胞株は、ＥＢ
ウイルスを産生したり、産生していなくとも産生しうる
ＤＮＡを組み込んでいる。ＥＢウイルスはリンパ球を形
質転換、ひいては癌化させる能力を持っており、人体に
投与する医薬品を生産するということを考えたとき、安
全性上問題がある。

【００１３】ＥＢウイルスによって形質転換したリンパ
芽球細胞は、ＨＩＶにも感染することが知られており、
ヒトＭＣＡを産生する細胞株がＥＢウイルスと共に、Ｈ
ＩＶにも感染している惧れがある。また、リンパ芽球細
胞株の抗体産生は一般にハイブリドーマのそれよりも量
が少なく、かつ不安定であるという欠点を持っている。
Ｂａｎａｐｏｕｒらが、リンパ芽球細胞株をさらに細胞
融合しているのは、抗体産生能を改善するための１つの
試みである。

【００１４】以上のように、もし細胞融合により効率よ
くヒトＢリンパ球を免疫感作でき、かつＨＩＶに対する
ヒトＭＣＡ産生能のあるハイブリドーマが得られるなら
ば、これから得られるＭＣＡは生産性が高くかつ医薬品
としての安全性上も望ましいものとなる。また、ＩｇＧ
のサブクラスとしては、補体を活性化する活性を有し、
そしてマクロファージやリンパ球のＦｃリセプターに結
合するサブクラスが望ましい。クラシック経路（Ｃｌａ
ｓｓｉｃａｌｐａｔｈｗａｙ）で補体を活性化できる
のはＩｇＧ１とＩｇＧ３であり、ＩｇＧ２とＩｇＧ４は
活性化できない（Ｊ．Ｌ．Ｗｉｎｋｅｌｈａｋｅ，Ｉｍ
ｍｕｎｏｃｈｅｍ．，１５，６９５，１９７８）。

【００１５】また、モノサイトのＦｃリセプターへの結
合も、ＩｇＧ１とＩｇＧ３が強い親和性を持っている
（Ｃｏｓｉｏら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．，４４，７７３，１
９８１）。従って、感染防御上ＩｇＧ１とＩｇＧ３が望
ましい。しかし、ＭＣＡ精製の過程では、プロティンＡ
によるアフィニティークロマトグラフィーが有効である
ことが非常に多いが、プロティンＡにＩｇＧ１は結合
し、ＩｇＧ３は結合しないので、精製しやすいという点
ではＩｇＧ１サブクラスのヒトＭＣＡがより望ましいこ
とになる。

【００１６】

【発明が解決しようとする課題】従って本発明は、ＨＩ
Ｖ粒子の表面に結合することができるＩｇＧ１サブクラ
スに属するモノクローナル抗体、及び該ハイブリドーマ
の製造方法に関する。

【００１７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、抗ＨＩＶ
・ヒトＭＣＡを取得することを目的として鋭意研究を行
なった結果、ＨＩＶ抗体陽性患者のリンパ節又は脾臓由
来リンパ球と、マウス・ミエローマ細胞とを融合させる
方法によって、ｇｐ１２０に対するヒトＭＣＡ（ＩｇＧ
１サブクラス）を産生するハイブリドーマ、ｇｐ１２０
とｇｐ４１の両方に反応するヒトＭＣＡ（ＩｇＧ１サブ
クラス）を産生するハイブリドーマ、及びｇｐ１２０に
反応するヒトＭＣＡ（ＩｇＧ１サブクラス）を産生する
ハイブリドーマを得ることができた。そして、このハイ
ブリドーマ及び／又はそれに由来する細胞株を培養し、
その培養上清から抗ＨＩＶ・ヒトＭＣＡを採取すること
ができた。

【００１８】即ち、本発明は、ＨＩＶに特異的な、サブ
クラスがＩｇＧ１であるヒト・モノクローナル抗体に関
し、そして特にＨＩＶのｇｐ１２０に結合するがＳＨ試
薬で処理されたｇｐ１２０には結合しないモノクローナ
ル抗体ＨＩＶのｇｐ１２０とｇｐ４１の両方に結合する
ＩｇＧ１抗体に関する。また、本発明は、ヒト・リンパ
球とマウス・ミエローマ細胞との融合によって形成され
た、上記の各抗体を産生するハイブリドーマに関する。

【００１９】これらのハイブリドーマは、ＡＴＣＣにＨ
Ｂ９６６９，ＨＢ９６７０等として寄託されている。か
かるハイブリドーマは、ヒト・リンパ球を、補体と抗ヒ
トＴリンパ球マウスＭＣＡとにより、あるいはＡＥＴ
（Ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌｉｓｏｔｈｉｏｕｒｏｎｉｕｍ
ＢｒｏｍｉｄｅＨｙｄｒｏｂｒｏｍｉｄｅ）処理赤
血球とＦｉｃｏｌｌとによりあらかじめ処理し、この処
理されたヒト・リンパ球とマウス・ミエローマ細胞とを
融合することによって、効率よく製造することができる
が、これもまた本発明の１つである。

【００２０】

【具体的な説明】本発明において用いられるヒト・リン
パ球は、抗体陽性患者の脾臓、リンパ節、末梢血、骨
髄、扁桃、アデノイド等の中に含まれている。本発明の
目的のためには、いかなる材料のリンパ球でも用いるこ
とができるが、望ましくは抗体陽性患者又はリンパ腺肥
大症患者由来のリンパ節、脾臓、扁桃である。

【００２１】マウスのミエローマ細胞としては、８−ア
ザグアニン耐性株を用いるのが有利であり、公知のもの
としては、ＢＡＬＢ／ＣマウスのＰ３×６５Ａｇ８株、
Ｐ３−ＮＳ１／１−Ａｇ４−１株、Ｐ３×６３ＡｇＵ１
株、ＳＰ２／ＯＡｇ１４株、Ｐ３×６３Ａｇ８．６．
５．３．株、ＭＰＣ１１−４５．６．ＴＧ１．７株、Ｓ
Ｐ−１株等がある。

【００２２】本発明においては、ヒトリンパ球とマウス
ミエローマ細胞融合に先立って、ヒトリンパ球を補体と
ヒトＴリンパ球に対するマウスＭＣＡ〔例えば、オルト
・ダイアグノスティク社（ＯｒｔｈｏＤｉａｇｎｏｓ
ｔｉｃ社）のＯＫＴ３〕とで処理し、あるいはＡＥＴで
処理した羊赤血球とＦｉｃｏｌｌとで処理し、Ｔリンパ
球を除去しておくことが望ましい。本発明の実施におい
ては、例えばヒト固型リンパ組織を抗体陽性患者から手
術によって摘出し、摘出組織をハサミとメスによってお
だやかにほぐし、細胞分散液を得る。細胞分散液からＴ
リンパ球を除去するために次の２つの方法を用いる。

【００２３】（１）細胞分散液をＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑ
ｕｅ層に重層し、遠心することによってリンパ球を分離
する。さらに、補体１／２容と抗ヒトＴリンパ球・マウ
スＭＣＡで処理し、あらかじめＴリンパ球を破壊し、残
ったＢリンパ球を遠心分離する。（２）細胞分散液を、
ＡＥＴ処理した羊赤血球と混合し、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａ
ｑｕｅ遠心法によりＢ細胞を分離する。これらの方法を
用いると、未処理のリンパ球を用いる場合よりもハイブ
リドーマの生成率が上昇する。

【００２４】かくして得られたヒトリンパ球とマウス・
ミエローマ細胞とを融合する。細胞融合やハイブリドー
マ培養の一般的な条件は既知であるが、本発明者らがハ
イブリドーマの生成率と増殖が至適となるような組合せ
を鋭意研究した結果、本発明においては、リンパ球１０
⁴個に１つの割合でハイブリドーマが生成するようにな
った。

【００２５】その条件は次に述べるとおりである。例え
ば、リンパ球とミエローマ細胞を１０：１〜１：１０
０、好ましくは１：１〜１：１０の比率で混合し、適当
な細胞融合溶液、例えば約３５％ポリエチレングリコー
ル（分子量１，０００〜６，０００程度）及び約７．５
％ジメチルスルホキシドを含むＲＰＭＩ１６４０を加
えて、室温〜３７℃で１〜数分間攪拌し、その後１０％
ウシ胎児血清アルブミン（ＦＣＳ）加ＲＰＭＩ１６４
０で徐々に希釈し、洗浄の後、ＨＡＴ（ヒポキサンチン
−アミノプテリン−チミジン）選択培養液にて細胞濃度
が１〜５×１０⁵個／mlとなるように調製する。

【００２６】これを０．２mlずつ、例えば９６穴プレー
トに分注し、５％ＣＯ₂を含む空気中で３５〜３８℃で
２〜３週間培養する。９６穴プレートにはフィーダー相
としてマウス腹腔滲出細胞を入れて置き、融合したを入
れる直前にその培養液を除去する。ＨＡＴ培養液中では
ハイブリドーマのみが生存し、８−アザグアニン耐性の
ミエローマ細胞及びミエローマ同士の融合細胞は生存し
得ない（未融合の抗体産生細胞は数日で死滅する）。

【００２７】培養後、培養液の抗体価を酵素抗体法（Ｅ
ＬＩＳＡ）によってチェックし、目的とする抗体を産生
しているハイブリドーマのみを選び出す。そして、その
ハイブリドーマを取り出し、限界希釈法によってクロー
ニングし、ＭＣＡを安定に産生するサブクローンを樹立
する。さらにそれらのハイブリドーマの中から、ウエス
タンブロット分析又は免疫沈降法による抗原の解析、及
び感染細胞表面への結合能を検討し、ｇｐ１２０に結合
するＭＣＡ又は感染細胞表面に結合するＭＣＡを選び出
す。

【００２８】このようにして得られた本発明の抗ＨＩＶ
・ヒトＭＣＡを産生するマウス−ヒトハイブリドーマ
は、凍結して保存することができる。かかるハイブリド
ーマのセルライン（細胞株）及び／又はそれに由来する
細胞株を適当な方法で大量に培養すると、培養上清から
本発明の目的とするヒトＭＣＡを得ることができる。ま
た、このハイブリドーマを動物に移植して腫瘍化し、そ
の腹水や血清からヒトＭＣＡを得ることもできる。

【００２９】以上の如くして得られた抗ＨＩＶ・ヒトＭ
ＣＡは、次のような特性を有する。（１）ＨＩＶ感染細胞より得られたウイルス抗原を固定
したＥＬＩＳＡでは、結合陽性であるが、ウイルス抗原
を得る場合と同様の方法で非感染細胞から得た物質を固
定したＥＬＩＳＡでは、結合陰性である。（２）ＨＩＶ
は多くの抗原物質から構成されているので、本発明のヒ
トＭＣＡがどのような構成成分に結合するのか、ウエス
タンブロット分析及び免疫沈降法によって検討した。１
つのヒトＭＣＡは、分子量１２０キロダルトン（１２０
Ｋ）と１６０Ｋに結合した（１６０Ｋは１２０Ｋと４１
Ｋの前駆体である）。

【００３０】もう１つのヒトＭＣＡは、分子量４１Ｋ，
１２０Ｋ及び１６０Ｋに結合することが判った。（３）
ＨＩＶ感染細胞の表面に結合するか否かを検討した。未
固定のＨＩＶ感染細胞にヒトＭＣＡを反応させた後、ヒ
トＩｇＧに対するフルオレッセイン標識抗体を反応させ
たところ、感染細胞表面に強い蛍光が観察された。従っ
て、感染細胞の表面にヒトＭＣＡは結合することが判っ
た。（４）ヒトのＩｇＧにはＩｇＧ１，ＩｇＧ２，Ｉｇ
Ｇ３とＩｇＧ４の４つのサブクラスがあり、それぞれ異
る生物活性を持っている。それぞれのサブクラスに特異
的な動物抗血清を用いてチェックしたところ、本発明の
ヒトＭＣＡはＩｇＧ１であることが判明した。

【００３１】実施例１（１）細胞融合（ａ）リンパ球の調製ＡＲＣ患者から手術によって摘出されたリンパ膜をハサ
ミとメスによって細かくほぐし、培地Ａ（ＲＰＭＩ１
６４０−１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）−２mMグルタミ
ン、１mMピルビン酸ナトリウム−２０μｇ／ml Ｌ−セ
リン−０．０５ｕ／mlヒトインシュリン−８０μｇ／ml
ゲンタマイシン硫酸塩）に細胞を懸濁した。このｃｅｌ
ｌ細胞懸濁液をＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ液に重層し、
１５００rpm で２０分間遠心した。Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａ
ｑｕｅの上に集積した細胞を取り出し、リン酸緩衝液
（ＰＢＳ）で１回、ＲＰＭＩ１６４０で２回遠心洗浄
し、最終的にＲＰＭＩ１６４０中に１×１０⁷ｃｅｌ
ｌｓ／mlに懸濁させた。

【００３２】（ｂ）リンパ球の処理Ｔリンパ球との細胞融合を減少させるために、次のいず
れかの方法によってＴリンパ球の除去を行なった。即
ち、（１）上記細胞懸濁液にＯＫＴ３〔オルソ・ダイア
グノスチック社（ＯｒｔｈｏＤｉａｇｎｏｓｔｉｃ
社）〕を最終的に２００倍希釈になるように加えて、４
℃で６０分間反応させた後、細胞を遠心沈澱（１５００
rpm 、５分間）させた。この細胞ペレットに、体ラビッ
ト補体の３倍希釈液（ＲＰＭＩ１６４０で希釈した）
を加えて、３７℃で６０min 反応させた。そして、この
細胞懸濁液を２回遠心洗浄した。

【００３３】（２）上記細胞懸濁液に１×１０⁸のＡＥ
Ｔ処理羊赤血球を加え、室温で５分間反応させた後、細
胞を遠心沈澱（１０００rpm 、５分間）させた。この細
胞ペレットを室温で２０分間反応させた後Ｆｉｃｏｌｌ
−Ｐａｑｕｅ液に重層し、１５００rpm で２０分間遠心
し、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅの上に集積した細胞（Ｂ
リンパ球）を取り出してＲＰＭＩ１６４０で洗浄し
た。

【００３４】（ｃ）細胞融合ＯＫＴ３処理リンパ球あるいは無処理リンパ球それぞれ
３×１０⁷細胞と、マウス・ミエローマＰ３Ｕ１ｃｅ
ｌｌｓ（３×１０⁷細胞）とをＲＰＭＩ１６４０培地
で混合し、細胞を遠心沈澱（１６００rpm 、５分間）さ
せた。上清を除去し、その細胞ペレットをタッピングに
よってほぐし、１mlのポリエチレングリコール溶液（３
５％Ｖ／Ｖポリエチレングリコール＃１０００−７．
５％Ｖ／Ｖジメチルスルホキシド−ＲＰＭＩ１６４
０中）をゆっくり加え、室温で１分間放置した。

【００３５】次に、これに２mlのＲＰＭＩ１６４０を
加えて、１分間放置し、さらに２mlのＲＰＭＩ１６４
０を加えて２分間放置し、次に４mlのＨＡＴ培地（培地
Ａ中９５μＭヒポキサンチン−０．４μＭアミノプテリ
ン−１６μＭチミジン）を加えて２分間放置し、次いで
８mlのＨＡＴ培地を加えて２分間放置し、そして２４ml
のＨＡＴ培地を加えて、３７℃で３０分間放置した。最
終的にＨＡＴ培地で７５ないし１５０mlとした。これを
約２００mlずつ９６−ウエルの平らな培養プレートに接
種した。

【００３６】なお、この培養プレートには前もってＩＣ
Ｒマウス（雄性）の腹腔滲出細胞を２×１０⁴細胞ウエ
ルずつ接種し、融合した細胞を接種する直前に培養液を
除去し、融合蛋白質を入れた。この培養プレートを３７
℃でＣＯ₂−インキュベーター中で培養した。培地は１
週間毎に、半量ずつＨＴ培地（ＨＡＴからアミノプテリ
ンを省いたもの）で置換して、ハイブリドーマ・クロー
ンが出現するまで培養を続けた。

【００３７】（ｄ）クローニングハイブリドーマコロニーが出現した時点において、ＨＩ
Ｖに対する抗体活性を培地毎に測定し、ＨＩＶ−特異的
産生コロニーのハイブリドーマをクローニングした。ま
ず、９６−ウエル平プレートに、マウス腹腔滲出細胞２
×１０⁴／ウエルだけを接種しておいた。そして、１時
間〜１日後に培地を除去し、ハイブリドーマに、１０細
胞／ウエルで９６ウエルに接種した。第一クローニング
にはＨＴ培地を用い、第二クローニングには培地Ａを用
いた。培養２〜３週間後に抗体活性を測定し、陽性クロ
ーンを拾った。

【００３８】（２）酵素抗体法（Ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎ
ｋｅｄｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔａｓｓａｙ；ＥＬ
ＩＳＡ）（ａ）ウイルス抗原（ｉ）ＨＴＬＶ−III ｂ（ヒトＴリンパ球指向性ウイル
スタイプIII ｂ）抗原バイオティックスラボラトリー・
プロダクト社（ＢｉｏｎｅｔｉｃｓＬａｂｏｒａｔｏ
ｒｙＰｒｏｄｕｃｔｓ社）（ii）ＣＲ１０／Ｎ１Ｔ抗原

【００３９】ＣＲ１０／Ｎ１Ｔは、ＣＥＭ細胞にＨＩＶ
のＮ１Ｔ様を持続感染させた細胞である。このＣＲ１０
からウイルス抗原を部分精製した。即ち、ＣＲ１０／Ｎ
１Ｔ細胞をＰＢＳで３回洗浄し、−７０℃で凍結してお
いた。使用時にこれを融解し、１０⁸細胞を９mlの蒸留
水に懸濁し、この細胞懸濁液をボルテックスブレンダー
で１分間激しく振った。これを２８００rpm で１０分間
遠心し、その懸濁液を取った。

【００４０】これに１０倍濃度のＰＢＳを１ml加えて、
１５０００×ｇで３０分間遠心し、ペレットを取った。
このペレットを５mlのＰＢＳで中に再懸濁し、氷冷下１
５秒間、４回超音波処理し、さらに氷冷下３０分間放置
し、その上清を取った。これに１００，０００×ｇで１
時間超遠心分離し、その上清をウイルス抗原として用い
た。陰性対照として、ＣＥＭ細胞（ＨＩＶ非感染）を同
様に処理した抗原を作製した。

【００４１】（ｂ）抗原でコートしたプレートＨＴＬＶ−III 抗原（１μｇ／ml）、ＣＲ１０／Ｎ１Ｔ
抗原（２０〜５０μｇ／ml）、ＣＥＭ抗原（２０〜５０
μｇ／ml）、を、それぞれマイクロタイタープレート
（Ｃｏｓｔｅｒ，＃３９１２）の各ウエルに５０mlずつ
入れ、３７℃で６０分間放置した。これをＨＢＳＳ・Ｂ
ＳＡ（０．１％ＮａＮ₃及び０．５％ウシ血清アルブミ
ンを含むＨａｎｋの平衡塩溶液）で２回洗浄し、３％Ｂ
ＳＡを含むＰＢＳ（ＣＡ⁺⁺，Ｍｇ⁺⁺）を１２５μｌ／ｗ
ｅｌｌ入れ、３７℃で６０分間、さらに４℃で一夜放置
し、ブロックを行なった。

【００４２】（ｃ）ＥＬＩＳＡ抗原によりコートされたプレートをＨＢＳＳ・ＢＳＡで
２回洗浄し、これに５０μｌの加熱された（５６℃、６
０分間）ハイブリドーマ培養液を加えた。室温で６０分
間反応させたのち、これをＨＢＳＳ・ＢＳＡで２回洗浄
した。その後５０μｌのヒトＩｇＧに対するヤギ抗体に
アルカリホスファターゼが抗合したもの（１０００×希
釈、ＴａｃｏＩｎｃ．）を加え、再び室温で６０分間
反応させたのち、ＨＢＳＳ・ＢＳＡで４回洗浄した。
０．０５Ｍ炭酸塩緩衝液−１mM ＭｇＣｌ₂（pH９．
５）中１mg／mlのｐ−ニトロフェニルホスフェート１０
μｌを加え、室温で６０分間ないし一夜反応させたの
ち、４９５mmにおける吸光度をＥＬＩＳＡリーダー（Ｔ
ｉｔｅｒｔｅｃｈＩｎｃ．）によって測定した。（３）実験結果（ａ）患者Ａのリンパ腺細胞をＯＫＴ３処理、無処理で
比較した。

【００４３】

【表１】

【００４４】（ｂ）上記のように、ＡＲＣを有する患者
からのＯＫＴ３処理リンパ球とマウス・ミエローマ細胞
との融合からハイブリドーマを得、それらのクローニン
グによって、ＭＣＡを安定に産生するハイブリドーマN
o．８６とNo．１を樹立することに成功した。一方、Ａ
ＲＣ患者の脾臓より得たリンパ球をＡＥＴロゼット処理
したリンパ球とマウスミエローマ細胞との融合からハイ
ブリドーマを得、それらのクローニングによってＭＣＡ
を安定産生するハイブリドーマＳ１−１を樹立すること
に成功した。No．８６，No．１、及びＳ１−１の産生す
るＭＣＡは、ＥＬＩＳＡでＨＴＬＶ−III 抗原及びＣＲ
１０／Ｎ１Ｔ抗原に反応し、ＣＥＭ抗原には反応しなか
った。ＭＣＡの産生量は、No．８６では１０μｇ／１０
⁶細胞／日、No．１では２０μｇ／１０⁶細胞／日、そ
してＳ１−１では５μｇ／１０⁶細胞／日であった。

【００４５】実施例２（１）ＭＣＡの精製ハイブリドーマNo．８６，No．１、及びＳ１−１の培養
液（１．５〜２ｌ）を出発材料として用いた。この培養
液に硫酸アンモニウムを加えて５０％飽和にし、そして
生じた沈澱を１０，０００rpm での２０分間の遠心によ
り集めた。その沈澱物を適当量のＰＢＳに溶かし、ＰＢ
Ｓで透析した。この溶液をプロティンＡ−セファロース
カラム（ベッドボリウム６ml、ファルマシアＡＢ）に適
用した。食塩水で洗浄したのち、食塩中にＨＣｌ（pH
２．５）で溶出した。こうして溶出されたＩｇＧは、ド
デシル硫酸ナトリウム、−ポリアクリルアミドゲル電気
泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で純粋なＩｇＧであることが
確認された。（２）ＩｇＧのサブクラス

【００４６】（ａ）Ｈ鎖精製されたＭＣＡの溶液をヒトＩｇＧ１，ＩｇＧ２，Ｉ
ｇＧ３，ａｎｄＩｇＧ４に対するヒツジ抗血清（Ｓｅ
ｒｏｔｅｃＩｎｃ．）と反応させ、免疫沈降リングが
できるか否かによって、そのサブクラスを決定した。そ
の結果、No．８６，No．１、及びＳ１−１ともに抗−Ｉ
ｇＧ１にのみ反応し、他の抗血清には反応しなかった。
従って、いずれのＭＣＡもＩｇＧ１であることが判っ
た。

【００４７】（ｂ）Ｌ鎖ヒトＩｇＧに対するヤギ血清をマイクロタイタープレー
トにコートした。この抗−ヒトＩｇＧ−コートプレート
に、精製ＭＣＡを反応させ、実施例１の（２）項に記し
たＥＬＩＳＡ法により、ヒトλ鎖に対するヤギ抗体にア
ルカリホスファターゼが接合したもの及びヒトκ鎖に対
するヤギ抗体にアルカリホスファターゼが接合したもの
（ＴａｇｏＩｎｃ．）を用いて、そのタイプを決定し
た。その結果、No．８６はκ鎖を有し、No．１はλ鎖を
有し、そしてＳ１−１はλ鎖を有することが判った。

【００４８】（３）ＭＣＡにより認識されるウイルス抗
原ウエスタンブロット法（ＢｉｏＲａｄイムノブロット
アッセイ、ＢｉｏＲａｄＩｎｃ．）によってNo．８
６とNo．１ＭＣＡが認識するウイルス抗原を同定し
た。方法の概略を述べる。ＨＩＶのＨＴＬＶ様をＳＤＳ
−ＰＡＧＥにかけて、分離されたウイルス抗原をブロッ
トしたニトロセルロース膜にＭＣＡを反応させ、次にヒ
トＩｇＧに対する抗体にパーオキシダーゼが結合したも
のを反応させた。最後に酵素基質を反応させ、発色させ
た。その結果を第１図に示した。第１図において、Ａは
ＡＩＤＳ患者血清、Ｂは健常人血清、ＣはNo．８６のク
ローン、ＤはNo．８６サブクローン１、ＥはNo．８６サ
ブクローン２、ＦはNo．８６サブクローン３、ＧはNo．
８６サブクローン４、ＨはNo．１のクローン、そしてＩ
はＳ１−１のクローンである。

【００４９】No．８６は、ｇｐ４１に強く反応し、ｇｐ
１２０には弱く反応した。ｇｐ４１とｇｐ１２０との両
方に反応するのは、ｇｐ１２０に対するＭＣＡとｇｐ４
１に対するＭＣＡの混合物である可能がある。そこで、
No．８６のハイブリドーマを再びｃｌｏｎｉｎｇして、
そのサブクローン１，２，３，４を得、それぞれのＭＣ
Ａについてウエスタンブロット法を行なったが、第１図
中のレーンＤ，Ｅ，Ｆ及びＧに示す如く、やはり４サブ
クローンのＭＣＡとも同様に、ｇｐ４１とｇｐ１２０の
両方に反応した。

【００５０】従って、このＭＣＡはｇｐ１２０とｇｐ４
１との両方に抗原エピトープをもつか、ｇｐ１２０とｇ
ｐ４１の両断点に対するＭＣＡと考えられる。ｇｐ１６
０に反応するのは、この抗原ｇｐ４１とｇｐ１２０から
構成されたグリコプロティンであるからである。他方、
No．１は、ｇｐ１２０に反応した。勿論、その前駆体で
あるｇｐ１６０にも反応している。Ｓ１−１の認識する
抗原はウエスタンブロット法では検出できなかった。

【００５１】（４）免疫沈降法（ＲＩＰＡ）モノクローナル抗体の認識するある種の抗原決定部位は
ウエスタンブロット法では検出できないことがある。こ
れは抗体を反応させる前に抗原を強力な界面活性剤と共
に熱処理及びメタノール処理を行なうため抗原の立体構
造を崩してしまい、モノクローナル抗体が結合できなく
なるためである。Ｓ１−１はウエスタンブロット法では
認識抗原を検出できなかったので免疫沈降電気泳動ラジ
オグラフィーによって認識抗原を決定した。

【００５２】ＲＩＰＡに用いる³⁵Ｓ標識抗原は次のよう
に調製した。ＭＯＴ細胞あるいは、ＨＴＬＶ IIIｂ感染
細胞（感染４日目、５×１０⁶のＭＯＴ細胞当り１０³
ＴＣＩＤ₅₀の感染価で感染させた）を³⁵Ｓ−システイン
と³⁵Ｓ−メチオニン（５０μＣｉ／ml）で標識した。標
識に用いる培地は１／１０容のメチオニンを含むＲＰＭ
Ｉ１６４０培地−１０％透析牛胎児血清−他の必須ア
ミノ酸−³⁵Ｓ標識アミノ酸を用いた。非感染及び感染Ｍ
ＯＴ細胞を標識培地で１４時間培養し、ＰＢＳ（−）で
洗浄した。

【００５３】洗浄した細胞をＰＲＰＡ緩衝液（２０mM
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌpH７．４、１％デオキシコレート（Ｄ
ＯＣ）、１％Ｔｒｉｔｏｎ×−１００、０．１％ドデシ
ル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１mM（ｐ−アミジオフェ
ニル）メタンスルホニルフルオリド（ＰＡＰＭＳＦ）で
可溶化した。これを高速遠心（１８，０００rpm 、６０
分）した上清を可溶化画分として得た。可溶化画分を分
割し、一方を２０〜１００mMのジチオスレイトール（Ｄ
ＴＴ）で３７℃、３０ないし６０分インキュベーション
し、他方をＤＴＴ非存在下で３７℃、３０ないしは６０
分インキュベーションした。以上のように調製した抗原
をＭＣＡＳ１−１あるいはＨＩＶ抗体陽性ヒト血清と
混合して免疫複合体を作り、これをＲＩＰＡ緩衝液中で
プロティンＡ−セファロースビーズに結合させた。

【００５４】プロティンＡ−セファロースビーズに結合
させた標識抗原−抗体複合体をＲＩＰＡ緩衝液で８回、
１０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH６．８）で２回洗浄し、
サンプル緩衝液〔６２．５mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH
６．８）、１％ＳＤＳ、２０％グリセロール、０．２％
ブロムフェノールブルー〕に２％２−メルカプトエタノ
ール存在下あるいは非存在下で懸濁した。懸濁液を１０
０℃、３分間加熱した後、遊離した標識抗原を１０％ア
クリルアミドゲルにて泳動した。泳動後、ゲルを５０％
メタノール−１０％酢酸で固定し、１Ｍサリチル酸−３
％グリセロール液で処理した後、グルドライヤーを用い
て乾燥させた。乾燥したゲルを−８０℃、３〜５日オー
トラジオグラフィーにかけた。第２〜４図から次の結果
を得た。

【００５５】ＭＣＡＳ１−１はｇｐ１２０（ｇｐ
１６０）及びｐ２４を認識している。ｇｐ１２０（ｇｐ１６０）上の抗原決定部位は、−
ＳＨ基試薬により容易に破壊される。一方ｐ２４上の抗
原決定部位は−ＳＨ基試薬によっては破壊されない。

【００５６】（５）ＨＩＶ感染細胞の表面への結合ＭＣＡ No. ８０，No. １、及びＳ１−１がＨＩＶ−感
染細胞の表面に反応するか否かを間接蛍光抗体法によっ
て検討した。ＭＯＴ細胞（ＨＴＬＶ−II形質転換Ｔ細胞
株）５×１０⁶個を２．５×１０⁶ＴＣＩＤ₅₀のＨＴＬ
Ｖ−III ｂと混ぜ、２時間、３７℃で感染させた。これ
を２０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地中で３日
間培養後、０．１％ＮａＮ₃を含むＰＢＳで、４℃、３
回細胞を洗浄した。陰性対照として、ＨＩＶに感染して
いないＣ−３細胞を用意した。

【００５７】これらの未固定細胞を２×１０⁶個／チュ
ーブだけコニカルチューブに分注し、１５００rpm ，５
min 遠心した。上清を除去し、その細胞ペレットに、Ｈ
ＢＳＳ−０．１％ＮａＮ₃で希釈した５０μｇ／mlのモ
ノクローナル抗体１００ulを加えて懸濁した。４℃で６
０分間反応させたのち、０．１ＮａＮ₃−１mM ＥＤＴ
Ａ−ＰＢＳで細胞を３回洗浄した。この細胞ペレット
に、さらに、ヒトＩｇＧに対する抗体にフルオレッセイ
ンイソチオシアネートが接合したもの（５０×希釈、Ｔ
ａｇｏＩｎｃ．）１００μｌを加えて、４℃で６０分
間反応させた。

【００５８】以上のように処理された細胞をフローサイ
トメトリー（ＦＡＣＳｃａｎ，ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋ
ｉｎｓｏｎ，Ｃｏ．）によって解析した。それぞれ、Ｈ
ＴＬＶ−III ｂ−感染ＭＯＴ細胞とＡＩＤＳ患者からの
血清（×１００希釈）、未感染ＭＯＴ細胞とＡＩＤＳ患
者からの血清（×１００希釈）、ＨＴＬＶ−III ｂ−感
染ＭＯＴ細胞とヒト正常成人からの血清（×１００希
釈）、未感染ＭＯＴ細胞と正常成人からの血清（×１０
０希釈）、ＨＴＬＶ−III ｂ−感染ＭＯＴ細胞とＭＣＡ
No. ８６、未感染ＭＯＴ細胞とＭＣＡＳ１−１、Ｈ
ＴＬＶ−III ｂ−感染ＭＯＴ細胞とＭＣＡＶ１、未感
染ＭＯＴ細胞とＭＣＡＶ１、の結合状態を検討した。
なお、Ｖ１は無関係の抗原（ｉｒｒｅｌｅｖａｎｔａ
ｎｔｉｇｅｎ）に対するＩｇＧ１のヒトＭＣＡである。

【００５９】その結果、次のことが判った。ＭＣＡ N
o. ８６は、ＨＩＶ感染細胞の表面に反応し、非感染細
胞には反応しない。ＭＣＡ No. １及びＳ１−１でも同
様の結果が得られた。ＨＩＶに特異的でないＭＣＡＶ
１は、ＨＩＶ感染細胞にも反応しない（第５図）。感染
細胞の表面に反応したＭＣＡは、補体と共に、あるいは
リンパ球やマクロファージと共に感染細胞を破壊し、ウ
イルスの産生をストップさせることによって、感染の拡
大を抑制することが考えられる。

【００６０】（６）中和測定法ＭＣＡの中和測定法は２つの方法：ニュートラルレッド
色素とり込み法とｐ２４抗原捕捉法によった。ニュート
ラルレッド色素取り込み法は次の原理に基いている。Ｈ
ＩＶが感染許容細胞に感染すると、細胞はしばらくして
崩壊する。ニュートラルレッド色素は生きた細胞の細胞
質にとり込まれる。ニュートラルレッド色素とり込み法
において、ＭＣＡがＨＩＶに結合しＨＩＶの感染許容細
胞への進入を抑制すると、細胞は生き残ってニュートラ
ルレッド色素をとり込むことになる。従って、細胞にと
り込まれた色素量を測定することよって、ＭＣＡのＨＩ
Ｖ中和価を定量化できる。

【００６１】ＨＴＬＶ IIIｂ感染Ｈ９細胞の上清を中和
測定法のウイルス源とした。感染価（ＭＯＩ）２０〜２
５のウイルスを系列希釈した抗ＨＩＶ抗体と混合し、３
７℃で１時間反応させた。この場合、抗ＨＩＶと無関係
なヒトＭＣＡとＨＩＶの混合液を陰性コントロール、抗
ＨＩＶ抗体陽性血清とＨＩＶの混合液を陽性コントロー
ルとして用いた。反応終了後、ＣＤ４陽性細胞（ＭＯＴ
細胞）を３×１０⁴コ／穴の割合で加えた。ＨＩＶ、抗
体、ＭＯＴ細胞を含むこれらのプレートを５日ないしは
６日培養した。

【００６２】５日ないしは６日目に、９６−穴マイクロ
タイタープレート中の細胞をマイクロピペットで均一に
混合し、そのうち１００μｌを１００μｌの０．０１４
％ニュートラルレッド色素を含む培養液の入ったｐｏｌ
ｙ−Ｌリジン処理プレートのそれぞれの穴に移した。こ
のプレートを３７℃、１時間反応させた。この操作によ
って、生細胞、死細胞共にｐｏｌｙ−Ｌリジンに結合す
る。この間、生細胞あるいは傷害をうけていない細胞の
みが色素をとり込む。１時間後、プレートを洗浄して余
分な色素をとり除き、１００μｌの１％酢酸−７０％エ
タノール液を加える。色素をとり込んだ細胞は溶解さ
れ、上清中に色素が放出される。生きのこった細胞から
放出された色素量はＴｉｔｅｒｔｃｋＥＬＩＳＡリー
ダーで５４０nmの吸収によって測定される。

【００６３】１００μｇ／mlのヒトＭＣＡＳ１−１は
ニュートラルレッド取り込み法（細胞生存測定法）によ
って９０％以上の感染性ＨＩＶを中和することがわかっ
た（第６図）。健常人血清はＨＩＶの感染性を全く中和
しなかった。もう一つのＨＩＶ中和測定は抗原捕捉ＥＬ
ＩＳＡによるＨＩＶのコアタンパクｐ２４を検出する方
法で行なわれた。ＨＩＶが感染許容細胞に感染するとＨ
ＩＶはその細胞内で増殖し、ＨＩＶ粒子が培養上清中に
放出される。もしＭＣＡがＨＩＶに結合し、細胞への侵
入を阻害するなら、ＨＩＶは増殖できず、ＨＩＶ粒子が
培養上清中に放出されることはない。

【００６４】ＭＯＩ２０−２５に相当するＨＩＬＶ I
IIｂ感染Ｈ９細胞から得られた無細胞ＨＩＬＶ IIIｂウ
イルスを段階希釈した抗−ＨＩＶ抗体と９６穴マイクロ
タイタープレート中で混合し１時３７℃で反応させる。
重要なことはこの抗原捕捉法でＨＩＶ接種源の量が検出
され得ないように注意することである。ＨＩＶ感染細胞
から産生されるウイルス粒子のみが検出される。抗ＨＩ
Ｖと無関係なヒトＭＣＡとＨＩＶ陽性血清が対象コント
ロールとして用いられた。

【００６５】ウイルス−抗体反応の後、ＣＤ₄陽性細胞
株（ＭＯＴ）を３×１０⁴細胞／穴で各穴へ加えた。Ｈ
ＩＶ、抗体、ＭＯＴ細胞を入れたこれらのプレートを７
日間培養する。各穴の上清の試料を３，５，７日目に採
取するこれらの試料は１時間５６℃で熱不活化し、５μ
ｇ／mlのＨＩＶ陽性血清をコートした、９６穴ＥＬＩＳ
Ａプレートへ加える。室温で１時間反応後、ＥＬＩＳＡ
プレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むリン酸緩
衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄する。次に２μｇ／mlの
ビオチン化抗ｐ２４ヒトモノクローナル抗体を加え反応
させる。

【００６６】次に１μｇ／mlのストレプトアヒジン結合
アルカリフォスファテースを加え１時間反応後未結合の
試薬を洗い流す。カーボネイト緩衝液pH９．５に溶かし
た／mg／mlのパラニトトロフェニルのフォスフェイトを
プレートに加え、各穴の４０５nmの吸光度をＴｉｔｅｒ
ｔｅｋＭｕｌｔｉｓｋａｎＥＬＩＳＡリーダーでよ
みとる。吸光度の増加分がすなわち基の培養上清中に存
在するｐ２４の増加を示している。Ｓ１−１の２５〜１
００μｇ／mlの濃度においては明らかに、ｐ２４ＨＩ
Ｖコアタンパクの低下を示すことから、ヒトＭＣＡＳ
１−１はＨＩＶの感染を阻止した（図７）。以上の結果
をまとめて表２に示す。

【００６７】

【表２】

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、各ＭＣＡのウエスタンブロット法によ
る認識抗原の解析を示す。

【図２】図２は、ＭＣＡＳ１−１の免疫沈降法による
認識抗原の解析を示す。

【図３】図３は、ＭＣＡＳ１−１の免疫沈降法による
認識抗原の解析を示す。

【図４】図４は、ＭＣＡＳ１−１の免疫沈降法による
認識抗原の解析を示す。

【図５】図５は、間接蛍光抗体法（ＦＡＣＳ）によるＭ
ＣＡＳ１−１の感染細胞膜への反応性を示す。

【図６】図６はニュートラルレッド色素とり込み法によ
るＭＣＡＳ１−１の中和曲線を示す。

【図７】図７は、ｐ２４抗原捕捉法によるＭＣＡＳ１
−１の中和曲線を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所 // Ｃ０７Ｋ 14/155 Ｃ１２Ｎ 15/02 Ｇ０１Ｎ 33/569 Ｈ 33/577 Ｂ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者増保安彦東京都日野市旭が丘４丁目３番２号帝人株式会社生物医学研究所内 (72)発明者菅野徹東京都日野市旭が丘４丁目３番２号帝人株式会社生物医学研究所内 (72)発明者松本洋一東京都日野市旭が丘４丁目３番２号帝人株式会社生物医学研究所内 (72)発明者エバンエム．ハーシュアメリカ合衆国，アリゾナ 85718，タクソン，カミノラゾレッラ 2321 (72)発明者エスキルドエー．ピーターソンアメリカ合衆国，アリゾナ 85718，タクソン，ビアセレステ 3160 (72)発明者ダクラスレイクアメリカ合衆国，アリゾナ 85724，タソソン（番地なし）アリゾナヘルスサイエンスィズセンター，デパートメントオブインターナルメディシン

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ＨＩＶのエンベロープの構造成分である
分子量１２０，０００ダルトンの糖蛋白質（ｇｐ１２
０）に結合するが、ＳＨ試薬で処理したｇｐ１２０には
結合しないことを特徴とするヒト・モノクローナル抗
体。
【請求項２】ＨＩＶがその感染許容細胞に感染するの
を抑制する能力を有する請求項１に記載のヒト・モノク
ローナル抗体。
【請求項３】ヒト・リンパ球とマウス・ミエローマ細
胞とを融合することにより形成される、請求項１又は２
に記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ
セルライン。
【請求項４】請求項１又は２に記載のモノクローナル
抗体の製造方法において、請求項３に記載のハイブリド
ーマセルラインを培養し、次に生産されたモノクローナ
ル抗体又はその含有物を採取することを特徴とする方
法。
【請求項５】請求項１又は２に記載のヒト・モノクロ
ーナル抗体を産生するハイブリドーマセルラインの製造
方法において、ＨＩＶ血清陽性患者のヒト・リンパ球を
採取し、該リンパ球とマウス・ミエローマ細胞とを融合
せしめ、そして請求項１又は２に記載のモノクローナル
抗体を産生するハイブリドーマを選択することを含んで
成る方法。