JPH0748276A - Ｈｉｖ感染症予防ワクチンおよびその製造法 - Google Patents
Ｈｉｖ感染症予防ワクチンおよびその製造法Info
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- JPH0748276A JPH0748276A JP5054239A JP5423993A JPH0748276A JP H0748276 A JPH0748276 A JP H0748276A JP 5054239 A JP5054239 A JP 5054239A JP 5423993 A JP5423993 A JP 5423993A JP H0748276 A JPH0748276 A JP H0748276A
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 Ｖ３ループペプチドを３本、更に不変部位の
ペプチド２本、更に細胞性免疫能を活性化させるヘルパ
ーペプチドを１本、それぞれ免疫原性が高まる方法を使
用してワクチンとした。 【効果】 多くのＨＩＶの抗原性の変異に対応出来るワ
クチンが得られる。例えばタイ、日本、その他、その地
域のＶ３ペプチドをＰＣＲ法で決定して、ワクチンを作
成することができる。上記ワクチンを用いれば、Ｖ３部
位に対する抗体、ｅｎｖ定常部位に対する抗体、ｇａｇ
領域に対する抗体等が多方面よりＨＩＶの増殖を抑制で
きる。
ペプチド２本、更に細胞性免疫能を活性化させるヘルパ
ーペプチドを１本、それぞれ免疫原性が高まる方法を使
用してワクチンとした。 【効果】 多くのＨＩＶの抗原性の変異に対応出来るワ
クチンが得られる。例えばタイ、日本、その他、その地
域のＶ３ペプチドをＰＣＲ法で決定して、ワクチンを作
成することができる。上記ワクチンを用いれば、Ｖ３部
位に対する抗体、ｅｎｖ定常部位に対する抗体、ｇａｇ
領域に対する抗体等が多方面よりＨＩＶの増殖を抑制で
きる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ヒト免疫不全ウイルス
（Human Immunodeficiency Virus、以下「ＨＩＶ」とい
う）感染症予防ワクチンに関し、より詳しくは、複数種
のペプチドを免疫原として含むＨＩＶ感染症予防ワクチ
ンに関する。
（Human Immunodeficiency Virus、以下「ＨＩＶ」とい
う）感染症予防ワクチンに関し、より詳しくは、複数種
のペプチドを免疫原として含むＨＩＶ感染症予防ワクチ
ンに関する。
【０００２】
【従来の技術】ＨＩＶ感染症、いわゆるエイズ（ＡＩＤ
Ｓ：Acquired Immunodeficiency Syndrome、後天的免疫
不全症候群）のまん延は社会的にも極めて重大な問題と
なって来ており、その予防ないし治療薬の開発が切望さ
れている。
Ｓ：Acquired Immunodeficiency Syndrome、後天的免疫
不全症候群）のまん延は社会的にも極めて重大な問題と
なって来ており、その予防ないし治療薬の開発が切望さ
れている。
【０００３】従来、ＨＩＶ感染症予防ワクチンとしては
いくつかの提案がされており、また、そのうち数種のワ
クチン（例えばｇａｇの１部に対応した合成ペプチドＨ
ＧＰ−３０を用いたワクチン）については、臨床試験が
開始されており、また、ヘルパーペプチド、ＨＧＰ−３
０，ＣＥ２１又はＶ３ペプチドをそれぞれ別々に免疫す
ることにより、感染防御能を得るか又はそれを補助する
ことに関しては、それぞれの報告がある。しかしなが
ら、ＨＩＶ感染症予防ワクチンとして安全性が高く、し
かも予防効果の高い決定的なワクチンは未だ報告されて
いない。
いくつかの提案がされており、また、そのうち数種のワ
クチン（例えばｇａｇの１部に対応した合成ペプチドＨ
ＧＰ−３０を用いたワクチン）については、臨床試験が
開始されており、また、ヘルパーペプチド、ＨＧＰ−３
０，ＣＥ２１又はＶ３ペプチドをそれぞれ別々に免疫す
ることにより、感染防御能を得るか又はそれを補助する
ことに関しては、それぞれの報告がある。しかしなが
ら、ＨＩＶ感染症予防ワクチンとして安全性が高く、し
かも予防効果の高い決定的なワクチンは未だ報告されて
いない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、安全
性が高く、しかも予防効果及び治療効果が高いＨＩＶ感
染症予防ワクチンを提供することにある。
性が高く、しかも予防効果及び治療効果が高いＨＩＶ感
染症予防ワクチンを提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者は鋭意研究の結
果、従来の合成ペプチドを用いたワクチンと異なり、Ｈ
ＩＶエンベロープ（ｅｎｖ）タンパク質ｇｐ１２０の特
定の領域に対応するペプチドと、ｇｐ１２０又は内部構
造タンパクｇａｇの不変部位ペプチドとを少くとも含む
複数種のペプチドをワクチン用免疫原として用いること
が、複雑な遺伝子操作を必要とせずに効率よく抗体を産
生させることを可能とし、安全性が高く、しかも産生さ
れた抗体がお互いに影響し合う相乗効果の高いＨＩＶ感
染症予防ワクチンとして極めて有効性が強いことを見出
した。
果、従来の合成ペプチドを用いたワクチンと異なり、Ｈ
ＩＶエンベロープ（ｅｎｖ）タンパク質ｇｐ１２０の特
定の領域に対応するペプチドと、ｇｐ１２０又は内部構
造タンパクｇａｇの不変部位ペプチドとを少くとも含む
複数種のペプチドをワクチン用免疫原として用いること
が、複雑な遺伝子操作を必要とせずに効率よく抗体を産
生させることを可能とし、安全性が高く、しかも産生さ
れた抗体がお互いに影響し合う相乗効果の高いＨＩＶ感
染症予防ワクチンとして極めて有効性が強いことを見出
した。
【０００６】本発明のＨＩＶ感染症予防ワクチンは、上
記知見に基くものであり、より詳しくは、ＨＩＶ（ヒト
免疫不全ウイルス）エンベロープｇｐ１２０のＶ３領域
ペプチド（エンベロープタンパク質内のアミノ酸位置３
０３〜３２２）と、ｇｐ１２０の不変部位ペプチド又は
内部構造タンパク質ｇａｇの不変部位ペプチドとからな
る複数のペプチドとを免疫原として含むことを特徴とす
るものである。
記知見に基くものであり、より詳しくは、ＨＩＶ（ヒト
免疫不全ウイルス）エンベロープｇｐ１２０のＶ３領域
ペプチド（エンベロープタンパク質内のアミノ酸位置３
０３〜３２２）と、ｇｐ１２０の不変部位ペプチド又は
内部構造タンパク質ｇａｇの不変部位ペプチドとからな
る複数のペプチドとを免疫原として含むことを特徴とす
るものである。
【０００７】更に、本発明によれば、ＨＩＶエンベロー
プｇｐ１２０のＶ３領域ペプチド（エンベロープタンパ
ク質内のアミノ酸位置３０３〜３２２）と、ｇｐ１２０
の不変部位ペプチド又は内部構造タンパク質ｇａｇの不
変部位ペプチドとからなる複数のペプチドと、担体タン
パク質とを含む複合体からなることを特徴とするＨＩＶ
感染症予防ワクチンが提供される。
プｇｐ１２０のＶ３領域ペプチド（エンベロープタンパ
ク質内のアミノ酸位置３０３〜３２２）と、ｇｐ１２０
の不変部位ペプチド又は内部構造タンパク質ｇａｇの不
変部位ペプチドとからなる複数のペプチドと、担体タン
パク質とを含む複合体からなることを特徴とするＨＩＶ
感染症予防ワクチンが提供される。
【０００８】更に、本発明によれば、ＨＩＶエンベロー
プｇｐ１２０のＶ３領域ペプチド（エンベロープタンパ
ク質内のアミノ酸位置３０３〜３２２）と、ｇｐ１２０
の不変部位ペプチド又は内部構造タンパク質ｇａｇの不
変部位ペプチドとからなる複数のペプチドを含む免疫原
と、アジュバントとを混合する段階を含むことを特徴と
するＨＩＶ感染症予防ワクチンの製造法が提供される。
プｇｐ１２０のＶ３領域ペプチド（エンベロープタンパ
ク質内のアミノ酸位置３０３〜３２２）と、ｇｐ１２０
の不変部位ペプチド又は内部構造タンパク質ｇａｇの不
変部位ペプチドとからなる複数のペプチドを含む免疫原
と、アジュバントとを混合する段階を含むことを特徴と
するＨＩＶ感染症予防ワクチンの製造法が提供される。
【０００９】更に、本発明によれば、ＨＩＶエンベロー
プｇｐ１２０のＶ３領域ペプチド（エンベロープタンパ
ク質内のアミノ酸位置３０３〜３２２）と、ｇｐ１２０
の不変部位ペプチド又は内部構造タンパク質ｇａｇの不
変部位ペプチドとからなる複数のペプチドと、担体タン
パク質とを結合させる段階を含むことを特徴とするＨＩ
Ｖ感染症予防ワクチンの製造法が提供される。
プｇｐ１２０のＶ３領域ペプチド（エンベロープタンパ
ク質内のアミノ酸位置３０３〜３２２）と、ｇｐ１２０
の不変部位ペプチド又は内部構造タンパク質ｇａｇの不
変部位ペプチドとからなる複数のペプチドと、担体タン
パク質とを結合させる段階を含むことを特徴とするＨＩ
Ｖ感染症予防ワクチンの製造法が提供される。
【００１０】以下、本発明のＨＩＶ感染症予防ワクチン
を、必要に応じて図面を参照しつつ詳細に説明する。
を、必要に応じて図面を参照しつつ詳細に説明する。
【００１１】なお、本明細書におけるアミノ酸配列の表
記においては、Ｎ末端（左側）からＣ末端（右側）へ記
載するものとする（例えば、以下のアミノ酸配列（１）
においては、ＡｓｎがＮ末端、ＣｙｓがＣ末端であ
る）。
記においては、Ｎ末端（左側）からＣ末端（右側）へ記
載するものとする（例えば、以下のアミノ酸配列（１）
においては、ＡｓｎがＮ末端、ＣｙｓがＣ末端であ
る）。
【００１２】（Ｖ３領域ペプチド）本発明において、
「Ｖ３領域ペプチド」とは、ＨＩＶのエンベロープタン
パク質（ｅｎｖ）を構成する分子量１２万の糖タンパク
質ｇｐ１２０のアミノ酸位置３０３〜３２２の配列（の
全部又は１部）に対応するペプチドをいう（各種株によ
り、そのアミノ酸番号は異なる場合がある）。このＶ３
領域ペプチドに関しては、文献（Parkerら、Proc. Nat.
Acad. Sci. USA,８５，１９３２−１３３６（１９８
８）；Ruscheら、Proc. Nat. Acad. Sci. USA,８５，３
１９８−３２０２（１９８８））を参照することができ
る。
「Ｖ３領域ペプチド」とは、ＨＩＶのエンベロープタン
パク質（ｅｎｖ）を構成する分子量１２万の糖タンパク
質ｇｐ１２０のアミノ酸位置３０３〜３２２の配列（の
全部又は１部）に対応するペプチドをいう（各種株によ
り、そのアミノ酸番号は異なる場合がある）。このＶ３
領域ペプチドに関しては、文献（Parkerら、Proc. Nat.
Acad. Sci. USA,８５，１９３２−１３３６（１９８
８）；Ruscheら、Proc. Nat. Acad. Sci. USA,８５，３
１９８−３２０２（１９８８））を参照することができ
る。
【００１３】より具体的には例えば、本発明において
は、以下に示すようなアミノ酸配列を有するペプチド
（アミノ酸数２４個程度）が好ましく用いられる。
は、以下に示すようなアミノ酸配列を有するペプチド
（アミノ酸数２４個程度）が好ましく用いられる。
【００１４】 Ａｓｎ- Ａｓｎ- Ｔｈｒ- Ａｒｇ- Ｌｙｓ- Ｓｅｒ- Ｉｌｅ- Ａｒｇ- Ｉｌｅ - Ｇｌｎ- Ａｒｇ- Ｇｌｙ- Ｐｒｏ- Ｇｌｙ- Ａｒｇ- Ａｌａ- Ｐｈｅ- Ｖａｌ - Ｔｈｒ- Ｉｌｅ- Ｇｌｙ- Ｌｙｓ- Ｉｌｅ- Ｇｌｙ- Ｃｙｓ…………（１）（一文字表記：ＮＮＴＲＫＳ ＩＲＩＱＲＧＰＧＲＡＦＶ
ＴＩＧＫＩＧＣ） （ＨＩＶ− IIIB ないしＬＡＩの配列に基く）
ＴＩＧＫＩＧＣ） （ＨＩＶ− IIIB ないしＬＡＩの配列に基く）
【００１５】 Ａｓｎ- Ａｓｎ- Ｔｈｒ- Ａｒｇ- Ｌｙｓ- Ｓｅｒ- Ｉｌｅ- Ｔｈｒ- Ｌｙｓ - Ｇｌｙ- Ｐｒｏ- Ｇｌｙ- Ａｒｇ- Ｖａｌ- Ｉｌｅ- Ｔｙｒ- Ａｌａ- Ｔｈｒ - Ｇｌｙ- Ｇｌｎ- Ｉｌｅ- Ｉｌｅ- Ｇｌｙ- Ｃｙｓ ……………（２）（一文字表記：ＮＮＴＲＫＳ ＩＴＫＧＰＧＲＶＩＹＡＴ
ＧＱＩＩＧＣ ） （ＨＩＶ− IIIRFの配列に基く）
ＧＱＩＩＧＣ ） （ＨＩＶ− IIIRFの配列に基く）
【００１６】 Ｔｙｒ- Ａｓｎ- Ｌｙｓ- Ａｒｇ- Ｌｙｓ- Ａｒｇ- Ｉｌｅ- Ｈｉｓ- Ｉｌｅ - Ｇｌｙ- Ｐｒｏ- Ｇｌｙ- Ａｒｇ- Ａｌａ- Ｐｈｅ- Ｔｙｒ- Ｔｈｒ- Ｔｈｒ - Ｌｙｓ- Ａｓｎ- Ｉｌｅ- Ｉｌｅ- Ｇｌｙ- Ｃｙｓ ……………（３）（一文字表記：ＹＮＫＲＫＲ ＩＨＩＧＰＧＲＡＦＹＴＴ
ＫＮＩＩＧＣ （ＨＩＶ− IIIMNの配列に基く）
ＫＮＩＩＧＣ （ＨＩＶ− IIIMNの配列に基く）
【００１７】 （「ＨＩＶ日本型」の配列に基くアミノ酸配列） ……………（４）
【００１８】 Ｃｙｓ- Ｔｈｒ- Ａｒｇ- Ｐｒｏ- Ｓｅｒ- Ａｓｎ- Ａｓｎ- Ｔｈｒ- Ａｒｇ- Ｔｈｒ- Ｓｅｒ- Ｉｌｅ- Ｔｈｒ- Ｉｌｅ- Ｇｌｙ- Ｐｒｏ- Ｇｌｙ- Ｇｌｎ- Ｖａｌ- Ｐｈｅ- Ｔｙｒ- Ａｒｇ- Ｔｈｒ- Ｇｌｙ- Ａｓｐ- Ｉｌｅ- Ｉｌｅ- Ｇｌｙ- Ａｓｐ- Ｉｌｅ- Ａｒｇ- Ｌｙｓ- Ａｌａ- Ｔｙｒ- Ｃｙｓ・・・・・・（５ ）（一文字表記：ＣＴＲＰＳＮ ＮＴＲＴＳＩＴＩＧＰＧＱ
ＶＦＹＲＴＧＤＩＩＧＤＩＲＫＡＹＣ ） （「ＨＩＶタイＡ型」の配列に基くアミノ酸配列）
ＶＦＹＲＴＧＤＩＩＧＤＩＲＫＡＹＣ ） （「ＨＩＶタイＡ型」の配列に基くアミノ酸配列）
【００１９】 Ｃｙｓ- Ｔｈｒ- Ａｒｇ- Ｐｒｏ- Ａｓｎ- Ａｓｎ- Ａｓｎ- Ｔｈｒ- Ａｒｇ- Ｌｙｓ- Ｓｅｒ- Ｉｌｅ- Ｈｉｓ- Ｌｅｕ- Ｇｌｙ- Ｐｒｏ- Ｇｌｙ- Ｇｌｎ- Ａｌａ- Ｔｒｐ- Ｔｙｒ- Ｔｈｒ- Ｔｈｒ- Ｇｌｙ- Ｇｌｎ- Ｉｌｅ- Ｉｌｅ- Gly- Ａｓｐ- Ｉｌｅ- Ａｒｇ- Ｇｌｎ- Ａｌａ- Ｈｉｓ- Ｃｙｓ・・・ （６）（一文字表記：ＣＴＲＰＮＮ ＮＴＲＫＳＩＨＬＧＰＧＱ
ＡＷＹＴＴＧＱＩＩＧ ＤＩＲＱＡＨＣ） （「ＨＩＶタイＢ型」の配列に基くアミノ酸配列）
ＡＷＹＴＴＧＱＩＩＧ ＤＩＲＱＡＨＣ） （「ＨＩＶタイＢ型」の配列に基くアミノ酸配列）
【００２０】上記したような（１）〜（６）のペプチド
はそれぞれ単独でＶ３領域ペプチドとして用いることも
可能であるが、本発明者の知見によれば、複数種類のＶ
３領域ペプチドを混合して用いることが、ＨＩＶの数々
の変異に対して防御効果が認められ、複数種のＨＩＶに
対する予防効果を高める点（及びＨＩＶの高度異性に対
応する点）から好ましい。このような好ましい組合せと
しては、例えば以下に示すような２ないし３種の組合せ
が挙げられる。
はそれぞれ単独でＶ３領域ペプチドとして用いることも
可能であるが、本発明者の知見によれば、複数種類のＶ
３領域ペプチドを混合して用いることが、ＨＩＶの数々
の変異に対して防御効果が認められ、複数種のＨＩＶに
対する予防効果を高める点（及びＨＩＶの高度異性に対
応する点）から好ましい。このような好ましい組合せと
しては、例えば以下に示すような２ないし３種の組合せ
が挙げられる。
【００２１】 （１）と（２）と（３）（ IIIB ＋ IIIRF＋ IIIMN） （１）と（３）と（４） （ IIIB ＋ IIIMN＋日本型） （４）と（５） （日本型＋タイＡ型） （１）と（５）と（６） （III B ＋タイＡ型＋タイＢ
型） 上記したようなＶ３領域ペプチドを複数種組合せて用い
る場合、これらのうちで最もモル数の多いペプチドのモ
ル数を１とした際に、最もモル数の小さいペプチドのモ
ル数は１／３以上であることが好ましく、１／２以上
（特に４／５以上）であることが更に好ましい。本発明
においては、通常、各ペプチドをほぼ等モル（例えばほ
ぼ１：１、又はほぼ１：１：１）のモル数で用いること
が好ましい。
型） 上記したようなＶ３領域ペプチドを複数種組合せて用い
る場合、これらのうちで最もモル数の多いペプチドのモ
ル数を１とした際に、最もモル数の小さいペプチドのモ
ル数は１／３以上であることが好ましく、１／２以上
（特に４／５以上）であることが更に好ましい。本発明
においては、通常、各ペプチドをほぼ等モル（例えばほ
ぼ１：１、又はほぼ１：１：１）のモル数で用いること
が好ましい。
【００２２】（不変部位ペプチド）本発明において、
「不変部位ペプチド」としては、ＨＩＶのエンベロープ
タンパク質（ｅｎｖ）を構成する上記ｇｐ１２０のアミ
ノ酸位置２５２〜２７４の配列（の全部又は１部）に対
応するペプチド（Ｈｏら、Science, 239, 1021-1023,19
85）；および／又はＨＩＶの内部構造タンパク質ｇａｇ
を構成する分子量１万７千のタンパク質（ｐ１７）の一
部と類似の配列を有する不変部位ペプチド（アミノ酸３
０個程度）が用いられる（Achourら、Proc. Nat. Acad.
Sci, USA,87,7045-704,1990）。
「不変部位ペプチド」としては、ＨＩＶのエンベロープ
タンパク質（ｅｎｖ）を構成する上記ｇｐ１２０のアミ
ノ酸位置２５２〜２７４の配列（の全部又は１部）に対
応するペプチド（Ｈｏら、Science, 239, 1021-1023,19
85）；および／又はＨＩＶの内部構造タンパク質ｇａｇ
を構成する分子量１万７千のタンパク質（ｐ１７）の一
部と類似の配列を有する不変部位ペプチド（アミノ酸３
０個程度）が用いられる（Achourら、Proc. Nat. Acad.
Sci, USA,87,7045-704,1990）。
【００２３】後者のｇａｇのｐ１７と類似の配列を有す
るペプチドとしては、下記式（７）に示す構造を有する
ペプチド（ＨＧＰ−３０類似のペプチド）が好ましく用
いられる。
るペプチドとしては、下記式（７）に示す構造を有する
ペプチド（ＨＧＰ−３０類似のペプチド）が好ましく用
いられる。
【００２４】 一方、上記ｇｐ１２０の配列に対応する不変部位ペプチ
ドとしては、より具体的には例えば、以下に示すような
アミノ酸配列を有するペプチド（アミノ酸数２４個程
度）のペプチドが好ましく用いられる。
ドとしては、より具体的には例えば、以下に示すような
アミノ酸配列を有するペプチド（アミノ酸数２４個程
度）のペプチドが好ましく用いられる。
【００２５】 Ｖａｌ- Ｇｌｎ- Ｃｙｓ- Ｔｈｒ- Ｈｉｓ- Ｇｌｙ- Ｉｌｅ- Ａｒｇ- Ｐｒｏ - Ｖａｌ- Ｖａｌ- Ｓｅｒ- Ｔｈｒ- Ｇｌｎ- Ｌｅｕ- Ｌｅｕ- Ｌｅｕ- Ａｓｎ - Ｇｌｙ- Ｓｅｒ- Ｌｅｕ- Ａｌａ- Ｇｌｕ- Ｇｌｕ- Ｇｌｕ- （Ｃｙｓ）（Ｃ ２１Ｅ） ……（８）（一文字表記：ＶＱＣＴＨＧ ＩＲＰＶＶＳＴＱＬＬＬＮ
ＧＳＬＡＥＥＥ（Ｃ）） （ヘルパーＴ細胞活性化部位ペプチド）本発明におい
て、「ヘルパーＴ細胞活性化部位ペプチド」とは、ＨＩ
Ｖのエンベロープタンパク質（ｅｎｖ）を構成するｇｐ
１２０のアミノ酸位置４３０〜４４５の配列（の全部又
は１部）に対応するペプチドをいう（Cease ら、Proc.
Nat. Acad. Sci, USA,84, 424-4253, 1987）。より具体
的には例えば、本発明においては、以下に示すようなア
ミノ酸配列を有するペプチド（アミノ酸数１５個ないし
１６個程度）が好ましく用いられる。
ＧＳＬＡＥＥＥ（Ｃ）） （ヘルパーＴ細胞活性化部位ペプチド）本発明におい
て、「ヘルパーＴ細胞活性化部位ペプチド」とは、ＨＩ
Ｖのエンベロープタンパク質（ｅｎｖ）を構成するｇｐ
１２０のアミノ酸位置４３０〜４４５の配列（の全部又
は１部）に対応するペプチドをいう（Cease ら、Proc.
Nat. Acad. Sci, USA,84, 424-4253, 1987）。より具体
的には例えば、本発明においては、以下に示すようなア
ミノ酸配列を有するペプチド（アミノ酸数１５個ないし
１６個程度）が好ましく用いられる。
【００２６】 Ｃｙｓ）- Ｉｌｅ- Ａｓｎ- Ｍｅｔ- Ｔｒｐ- Ｇｌｎ- Ｇｌｕ- Ｌｅｕ- Ｇｌｙ - Ｌｙｓ- Ａｌａ- Ｍｅｔ- Ｔｙｒ- Ａｌａ- Ｐｒｏ- Ｐｒｏ- （Ｃｙｓ） …………（９）（一文字表記：（Ｃ）ＩＮＭ ＷＱＥＬＧＫＡＭＹＡＰＰ
（Ｃ）） 上記式（７）ないし（１３）において、かっこ内のシス
テイン（Ｃｙｓ）は、ＫＬＨ又はＨＳＡ以外のシステイ
ン含量が比較的少ないペプチド又はキャリア（担体）タ
ンパク質との結合用に好適な配列を示す。
（Ｃ）） 上記式（７）ないし（１３）において、かっこ内のシス
テイン（Ｃｙｓ）は、ＫＬＨ又はＨＳＡ以外のシステイ
ン含量が比較的少ないペプチド又はキャリア（担体）タ
ンパク質との結合用に好適な配列を示す。
【００２７】上記した各種ペプチドはＨＩＶウイルス自
身から得てもよいが、安全性および純度の点からは、合
成法（特に自動ペプチド合成機による合成法）を用いる
ことが好ましい。
身から得てもよいが、安全性および純度の点からは、合
成法（特に自動ペプチド合成機による合成法）を用いる
ことが好ましい。
【００２８】（担体タンパク質）本発明においては、上
記した複数種のペプチドは、通常はこの担体タンパク質
とともに用いられるが、この担体タンパク質を用いずに
（通常アジュバントとともに用いて）ワクチンとするこ
とも可能である（J. Immunol.,148 ,914-920(1992)参
照）。このような場合、本発明においては、ＭＡＰ（マ
ルチプル アンティゲン ペプチド）法又はＢＬＤ（ブ
ランチト リジン オリゴマー）法を用いることが好ま
しい。
記した複数種のペプチドは、通常はこの担体タンパク質
とともに用いられるが、この担体タンパク質を用いずに
（通常アジュバントとともに用いて）ワクチンとするこ
とも可能である（J. Immunol.,148 ,914-920(1992)参
照）。このような場合、本発明においては、ＭＡＰ（マ
ルチプル アンティゲン ペプチド）法又はＢＬＤ（ブ
ランチト リジン オリゴマー）法を用いることが好ま
しい。
【００２９】本発明においては、一般にハプテンとの結
合に用いられる担体タンパク質を特に制限なく用いるこ
とが可能であるが、なかでも、特にシステイン基含有タ
ンパク質が好ましく用いられる。このようなシステイン
含有タンパク質は、その１分子中に（平均値で）システ
イン基を１０個以上、好ましくは２０個以上（更には３
０個以上）含むタンパク質が好ましい。このようなタン
パク質の分子量は１０万〜５００万程度（更には３０万
〜４００万程度）であることが好ましい。
合に用いられる担体タンパク質を特に制限なく用いるこ
とが可能であるが、なかでも、特にシステイン基含有タ
ンパク質が好ましく用いられる。このようなシステイン
含有タンパク質は、その１分子中に（平均値で）システ
イン基を１０個以上、好ましくは２０個以上（更には３
０個以上）含むタンパク質が好ましい。このようなタン
パク質の分子量は１０万〜５００万程度（更には３０万
〜４００万程度）であることが好ましい。
【００３０】このようなタンパク質としては、具体的に
は例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）等のアルブミ
ン、カブトガニヘモシアニン（ＫＬＨ；分子量約３６０
万）、などが好ましく用いられる。
は例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）等のアルブミ
ン、カブトガニヘモシアニン（ＫＬＨ；分子量約３６０
万）、などが好ましく用いられる。
【００３１】本発明において、上記担体タンパク質を複
数種のペプチドと結合させて複合体を調製する方法は特
に限定されないが、Ｎ−ヒドロキシサクシイミドエステ
ル等の適当なアシル化剤を用いて結合することが可能で
ある。本発明においてＫＬＨを担体タンパク質として用
いる際には、上記アシル化剤としてｍ−マレイミドベン
ゾイル−Ｎ−ヒドロキシサクシイミドエステル（ＭＢ
Ｓ）等のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルが好ま
しく用いられる。
数種のペプチドと結合させて複合体を調製する方法は特
に限定されないが、Ｎ−ヒドロキシサクシイミドエステ
ル等の適当なアシル化剤を用いて結合することが可能で
ある。本発明においてＫＬＨを担体タンパク質として用
いる際には、上記アシル化剤としてｍ−マレイミドベン
ゾイル−Ｎ−ヒドロキシサクシイミドエステル（ＭＢ
Ｓ）等のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルが好ま
しく用いられる。
【００３２】担体タンパク質とペプチドとを結合させる
際には、担体タンパク質（例えばＫＬＨ又はＨＳＡ）１
モルに対して、ペプチドを５モル以上程度、更には１０
〜４０モル程度（特に１０〜３０モル程度）用いること
が好ましい。担体タンパク質と複数種のペプチドとを結
合させる場合、複数種のペプチドをあらかじめ混合物と
してから担体タンパク質と結合させてもよく、またそれ
ぞれ担体タンパク質を結合させた後にそれぞれのペプチ
ド−担体タンパク質複合体を混合してもよく、またこれ
ら２通りの方法を適宜組合せて用いてもよい。
際には、担体タンパク質（例えばＫＬＨ又はＨＳＡ）１
モルに対して、ペプチドを５モル以上程度、更には１０
〜４０モル程度（特に１０〜３０モル程度）用いること
が好ましい。担体タンパク質と複数種のペプチドとを結
合させる場合、複数種のペプチドをあらかじめ混合物と
してから担体タンパク質と結合させてもよく、またそれ
ぞれ担体タンパク質を結合させた後にそれぞれのペプチ
ド−担体タンパク質複合体を混合してもよく、またこれ
ら２通りの方法を適宜組合せて用いてもよい。
【００３３】（ワクチン）上述したように、ｇｐ１２０
及び／又はｇａｇの不変部位ペプチドと、Ｖ３領域ペプ
チドとを少くとも含む複数種のペプチド（必要に応じて
担体タンパク質）とからなる本発明のワクチンにおいて
は、Ｖ３領域ペプチドと不変部位ペプチドとのモル比
（又はＶ３領域ペプチド−担体タンパク質結合物と、不
変部位ペプチド−担体タンパク質結合物とのモル比）
は、１：３〜３：１程度、更には２：１〜１：２程度、
特にはおよそ１：１程度（すなわち、一方を１とした際
に、他方が０．９〜１．１程度）であることが好まし
い。
及び／又はｇａｇの不変部位ペプチドと、Ｖ３領域ペプ
チドとを少くとも含む複数種のペプチド（必要に応じて
担体タンパク質）とからなる本発明のワクチンにおいて
は、Ｖ３領域ペプチドと不変部位ペプチドとのモル比
（又はＶ３領域ペプチド−担体タンパク質結合物と、不
変部位ペプチド−担体タンパク質結合物とのモル比）
は、１：３〜３：１程度、更には２：１〜１：２程度、
特にはおよそ１：１程度（すなわち、一方を１とした際
に、他方が０．９〜１．１程度）であることが好まし
い。
【００３４】本発明のワクチンがヘルパーＴ細胞活性化
部位ペプチドを含む場合（すなわち、３種ないし４種の
ペプチドを含む場合）においても、最もモル数の小さい
ペプチド１モルに対して、最もモル数の大きいペプチド
は３モル以下、更には２モル以下（特に１．１〜１．０
モル程度）であることが好ましい。
部位ペプチドを含む場合（すなわち、３種ないし４種の
ペプチドを含む場合）においても、最もモル数の小さい
ペプチド１モルに対して、最もモル数の大きいペプチド
は３モル以下、更には２モル以下（特に１．１〜１．０
モル程度）であることが好ましい。
【００３５】（アジュバント）上記した複数種のペプチ
ド（必要に応じて、更に担体タンパク質）を含む本発明
のワクチンは、通常、適当なアジュバントとともに用い
られる。
ド（必要に応じて、更に担体タンパク質）を含む本発明
のワクチンは、通常、適当なアジュバントとともに用い
られる。
【００３６】本発明のワクチンとともに用いられるアジ
ュバントとしては、公知のものを特に制限なく使用する
ことが可能である。このようなアジュバントの例として
はアラム（水酸化アルミニウムないしアルミニウム・ア
ジュバント）、イスコム（ＩＳＣＯＭ）、ＭＤＰ−ＰＥ
（合成親油性ムラミルトリペプチド）、リポゾーム等を
用いることが可能であるが、日本国内においてヒトに対
して投与する場合には、法規制等との関連からアラムを
用いることが好ましい。
ュバントとしては、公知のものを特に制限なく使用する
ことが可能である。このようなアジュバントの例として
はアラム（水酸化アルミニウムないしアルミニウム・ア
ジュバント）、イスコム（ＩＳＣＯＭ）、ＭＤＰ−ＰＥ
（合成親油性ムラミルトリペプチド）、リポゾーム等を
用いることが可能であるが、日本国内においてヒトに対
して投与する場合には、法規制等との関連からアラムを
用いることが好ましい。
【００３７】上記アジュバントは、通常、本発明のワク
チンに対して１．５〜５倍量程度（更には１．５〜２倍
量程度）用いることが好ましい。本発明のワクチンにお
いては、例えば、上記アラムは３００μｇ／ｍｌ程度の
割合で混入していることが好ましい。
チンに対して１．５〜５倍量程度（更には１．５〜２倍
量程度）用いることが好ましい。本発明のワクチンにお
いては、例えば、上記アラムは３００μｇ／ｍｌ程度の
割合で混入していることが好ましい。
【００３８】（投与量および投与方法）本発明のワクチ
ンをヒトに投与する場合（実験等でウサギ等の動物に投
与する場合もほぼ同様）、体重１ｋｇに対して該ワクチ
ンの投与量は５μｇ／ｋｇ程度であることが好ましい。
ンをヒトに投与する場合（実験等でウサギ等の動物に投
与する場合もほぼ同様）、体重１ｋｇに対して該ワクチ
ンの投与量は５μｇ／ｋｇ程度であることが好ましい。
【００３９】本発明のワクチンを用いる免疫法として
は、４回以上日をおいてワクチンを投与することが好ま
しい。この投与の日の間隔は特に制限されないが、例え
ば、０日、３０日、６０日、１２０日のように投与する
ことが好ましい。なお、上述した投与量は、１回目の投
与量であり、２回日目以降の投与量は１／３程度まで減
量してもよい。更に、例えば、１回目には複数のペプチ
ドと担体タンパク質との複合体からなる本発明のワクチ
ンを（必要に応じてアジュバントとともに）投与し、２
回目以降は、複数種のペプチドからなる本発明のワクチ
ンを（必要に応じてアジュバントとともに）投与しても
よい。
は、４回以上日をおいてワクチンを投与することが好ま
しい。この投与の日の間隔は特に制限されないが、例え
ば、０日、３０日、６０日、１２０日のように投与する
ことが好ましい。なお、上述した投与量は、１回目の投
与量であり、２回日目以降の投与量は１／３程度まで減
量してもよい。更に、例えば、１回目には複数のペプチ
ドと担体タンパク質との複合体からなる本発明のワクチ
ンを（必要に応じてアジュバントとともに）投与し、２
回目以降は、複数種のペプチドからなる本発明のワクチ
ンを（必要に応じてアジュバントとともに）投与しても
よい。
【００４０】
【実施例】以下、実施例により、本発明を更に具体的に
説明する。
説明する。
【００４１】実施例１ （ペプチド合成およびペプチド複合体の調製）中和抗体
産生Ｖ３領域ペプチドとして、下記３種のペプチドを用
いた。
産生Ｖ３領域ペプチドとして、下記３種のペプチドを用
いた。
【００４２】 Ａｓｎ- Ａｓｎ- Ｔｈｒ- Ａｒｇ- Ｌｙｓ- Ｓｅｒ- Ｉｌｅ- Ａｒｇ- Ｉｌｅ- Ｇｌｎ- Ａｒｇ- Ｇｌｙ- Ｐｒｏ- Ｇｌｙ- Ａｒｇ- Ａｌａ- Ｐｈｅ- Ｖａｌ- Ｔｈｒ- Ｉｌｅ- Ｇｌｙ- Ｌｙｓ- Ｉｌｅ- Ｇｌｙ- Ｃｙｓ…（１）、（一文字表記：ＮＮＴＲＫＳ ＩＲＩＱＲＧＰＧＲＡＦＶ
ＴＩＧＫＩＧＣ） Ａｓｎ- Ａｓｎ- Ｔｈｒ- Ａｒｇ- Ｌｙｓ- Ｓｅｒ- Ｉｌｅ- Ｔｈｒ- Ｌｙｓ- Ｇｌｙ- Ｐｒｏ- Ｇｌｙ- Ａｒｇ- Ｖａｌ- Ｉｌｅ- Ｔｙｒ- Ａｌａ- Ｔｈｒ- Ｇｌｙ- Ｇｌｎ- Ｉｌｅ- Ｉｌｅ- Ｇｌｙ- Ｃｙｓ…（２）（一文字表記：ＮＮＴＲＫＳ ＩＴＫＧＰＧＲＶＩＹＡＴ
ＧＱＩＩＧＣ） および、 Ｔｙｒ- Ａｓｎ- Ｌｙｓ- Ａｒｇ- Ｌｙｓ- Ａｒｇ- Ｉｌｅ- Ｈｉｓ- Ｉｌｅ- Ｇｌｙ- Ｐｒｏ- Ｇｌｙ- Ａｒｇ- Ａｌａ- Ｐｈｅ- Ｔｙｒ- Ｔｈｒ- Ｔｈｒ- Ｌｙｓ- Ａｓｎ- Ｉｌｅ- Ｉｌｅ- Ｇｌｙ- Ｃｙｓ…（３）（一文字表記：ＹＮＫＲＫＲ ＩＨＩＧＰＧＲＡＦＹＴＴ
ＫＮＩＩＧＣ） 上記した３種のペプチドは自動ペプチド合成機（米国Ap
plied Biosystems社製４３０Ａ）で合成した。これら３
種のペプチドは、まず、モル比、１０：１０：１０：１
でＭＢＳ（ｍ−マレイミド ベンゾイル−Ｎ−ヒドロキ
シサクシニイミドエステル）を用いてＫＬＨ（スカシガ
イヘモシアニン）又はＨＳＡ（ヒト血清アルブミン）と
結合(conjugate) させた後、セファデックスＧ２５カラ
ムを用いて精製した。上記個々のペプチド（１）〜
（３）をＫＬＨと結合させる場合には、モル比は３０：
１とした。
ＴＩＧＫＩＧＣ） Ａｓｎ- Ａｓｎ- Ｔｈｒ- Ａｒｇ- Ｌｙｓ- Ｓｅｒ- Ｉｌｅ- Ｔｈｒ- Ｌｙｓ- Ｇｌｙ- Ｐｒｏ- Ｇｌｙ- Ａｒｇ- Ｖａｌ- Ｉｌｅ- Ｔｙｒ- Ａｌａ- Ｔｈｒ- Ｇｌｙ- Ｇｌｎ- Ｉｌｅ- Ｉｌｅ- Ｇｌｙ- Ｃｙｓ…（２）（一文字表記：ＮＮＴＲＫＳ ＩＴＫＧＰＧＲＶＩＹＡＴ
ＧＱＩＩＧＣ） および、 Ｔｙｒ- Ａｓｎ- Ｌｙｓ- Ａｒｇ- Ｌｙｓ- Ａｒｇ- Ｉｌｅ- Ｈｉｓ- Ｉｌｅ- Ｇｌｙ- Ｐｒｏ- Ｇｌｙ- Ａｒｇ- Ａｌａ- Ｐｈｅ- Ｔｙｒ- Ｔｈｒ- Ｔｈｒ- Ｌｙｓ- Ａｓｎ- Ｉｌｅ- Ｉｌｅ- Ｇｌｙ- Ｃｙｓ…（３）（一文字表記：ＹＮＫＲＫＲ ＩＨＩＧＰＧＲＡＦＹＴＴ
ＫＮＩＩＧＣ） 上記した３種のペプチドは自動ペプチド合成機（米国Ap
plied Biosystems社製４３０Ａ）で合成した。これら３
種のペプチドは、まず、モル比、１０：１０：１０：１
でＭＢＳ（ｍ−マレイミド ベンゾイル−Ｎ−ヒドロキ
シサクシニイミドエステル）を用いてＫＬＨ（スカシガ
イヘモシアニン）又はＨＳＡ（ヒト血清アルブミン）と
結合(conjugate) させた後、セファデックスＧ２５カラ
ムを用いて精製した。上記個々のペプチド（１）〜
（３）をＫＬＨと結合させる場合には、モル比は３０：
１とした。
【００４３】中和抗体産生用ｇｐ１２０不変部位ペプチ
ドとしては、下記のペプチドを用いた。
ドとしては、下記のペプチドを用いた。
【００４４】 Ｖａｌ- Ｇｌｎ- Ｃｙｓ- Ｔｈｒ- Ｈｉｓ- Ｇｌｙ- Ｉｌｅ- Ａｒｇ- Ｐｒｏ - Ｖａｌ- Ｖａｌ- Ｓｅｒ- Ｔｈｒ- Ｇｌｎ- Ｌｅｕ- Ｌｅｕ- Ｌｅｕ- Ａｓｎ - Ｇｌｙ- Ｓｅｒ- Ｌｅｕ- Ａｌａ- Ｇｌｕ- Ｇｌｕ- Ｇｌｕ- （Ｃｙｓ）（Ｃ ２１Ｅ） …（８）（一文字表記：ＶＱＣＴＨＧ ＩＲＰＶＶＳＴＱＬＬＬＮ
ＧＳＬＡＥＥＥ（Ｃ））
ＧＳＬＡＥＥＥ（Ｃ））
【００４５】またヘルパーＴ細胞誘導用ペプチドとして
は、、下記のペプチドを用いた。 Ｉｌｅ- Ａｓｎ- Ｍｅｔ- Ｔｒｐ- Ｇｌｎ- Ｇｌｕ- Ｌｅｕ- Ｇｌｙ- Ｌｙｓ- Ａｌａ- Ｍｅｔ- Ｔｙｒ- Ａｌａ- Ｐｒｏ- Ｐｒｏ- （Ｃｙｓ）…（９）（一文字表記：ＩＮＭＷＱＥ ＬＧＫＡＭＹＡＰＰ
（Ｃ）） 上記ペプチドをそれぞれ前記と同様に自動ペプチド合成
機を用いて合成して、ＫＬＨ又はＨＳＡと２０：２０：
１のモル比で同様に結合させた。Ｃ２１ＥペプチドをＫ
ＬＡ又はＨＳＡと結合させる際には、モル比は３０：１
とした。これら２種のペプチドは、ＨＩＶ− IIIB 、Ｈ
ＩＶ− IIIRFおよびＨＩＶ− IIIMN株(strain)に共通の
ものである。
は、、下記のペプチドを用いた。 Ｉｌｅ- Ａｓｎ- Ｍｅｔ- Ｔｒｐ- Ｇｌｎ- Ｇｌｕ- Ｌｅｕ- Ｇｌｙ- Ｌｙｓ- Ａｌａ- Ｍｅｔ- Ｔｙｒ- Ａｌａ- Ｐｒｏ- Ｐｒｏ- （Ｃｙｓ）…（９）（一文字表記：ＩＮＭＷＱＥ ＬＧＫＡＭＹＡＰＰ
（Ｃ）） 上記ペプチドをそれぞれ前記と同様に自動ペプチド合成
機を用いて合成して、ＫＬＨ又はＨＳＡと２０：２０：
１のモル比で同様に結合させた。Ｃ２１ＥペプチドをＫ
ＬＡ又はＨＳＡと結合させる際には、モル比は３０：１
とした。これら２種のペプチドは、ＨＩＶ− IIIB 、Ｈ
ＩＶ− IIIRFおよびＨＩＶ− IIIMN株(strain)に共通の
ものである。
【００４６】（上記式（８）ないし（９）において、カ
ッコ内のシステインは、他のペプチド又はキャリア担体
タンパク質との結合用に合成した際の配列を示す）。
ッコ内のシステインは、他のペプチド又はキャリア担体
タンパク質との結合用に合成した際の配列を示す）。
【００４７】上記により得た２種の成分（すなわち、Ｖ
３ペプチドキャリア結合物、および不変部位ペプチド／
ヘルパーＴ細胞誘導ペプチド−キャリア結合物）の等量
（等重量）を混合し、ワクチンとした。
３ペプチドキャリア結合物、および不変部位ペプチド／
ヘルパーＴ細胞誘導ペプチド−キャリア結合物）の等量
（等重量）を混合し、ワクチンとした。
【００４８】上記結合の後、残ったＭＢＳはセファデッ
クスＧ−１０カラムを用いて除去した。
クスＧ−１０カラムを用いて除去した。
【００４９】実施例２ （ワクチンによる免疫化）ウサギにキャリア結合ワクチ
ン２０μｇ／ｋｇを投与して免疫し、これを１週間の間
をおいて合計４回行った。
ン２０μｇ／ｋｇを投与して免疫し、これを１週間の間
をおいて合計４回行った。
【００５０】更にボランティア（健常人）には、ＫＬＨ
結合ペプチドワクチンの合計量５μｇ／ｋｇをアジュバ
ントたるアラム（５μｇ／ｋｇ；ワクチン＋アラム＝１
０μｇ）とともに投与して０日および３０日に免疫し
た。更に、６０日後および１２０日後には、ＨＳＡ含有
ワクチン２０μｇ／ｋｇおよびポリマー化ペプチド（キ
ャリア非結合キラーペプチド）１０μｇ／ｋｇを投与し
た。
結合ペプチドワクチンの合計量５μｇ／ｋｇをアジュバ
ントたるアラム（５μｇ／ｋｇ；ワクチン＋アラム＝１
０μｇ）とともに投与して０日および３０日に免疫し
た。更に、６０日後および１２０日後には、ＨＳＡ含有
ワクチン２０μｇ／ｋｇおよびポリマー化ペプチド（キ
ャリア非結合キラーペプチド）１０μｇ／ｋｇを投与し
た。
【００５１】実施例３ （エンザイム−リンクト・イムノソルベントアッセイ、
ＥＬＩＳＡ）ＥＬＩＳＡ法による測定は、報文（ＡＩＤ
Ｓ，３，７６５〜７６６（１９８９）およびＡＩＤＳ，
５，１１４０〜１１４１（１９９１）に記載された方法
により行った。
ＥＬＩＳＡ）ＥＬＩＳＡ法による測定は、報文（ＡＩＤ
Ｓ，３，７６５〜７６６（１９８９）およびＡＩＤＳ，
５，１１４０〜１１４１（１９９１）に記載された方法
により行った。
【００５２】すなわち、ペプチド又はキャリア結合ペプ
チドのそれを９６穴のマイクロプレート上にコーティン
グした。ここでは、異なる部位由来の３種のペプチドの
混合物を使用した。他の抗原は、それぞれのペプチドと
ともに使用した。（Ｃ２１Ｅペプチドは、ｇｐ１２０の
不変部位に対応し、ＨＧＰ−３０ペプチドはウィルス中
部ｇａｇ部位の蛋白に対応する）。
チドのそれを９６穴のマイクロプレート上にコーティン
グした。ここでは、異なる部位由来の３種のペプチドの
混合物を使用した。他の抗原は、それぞれのペプチドと
ともに使用した。（Ｃ２１Ｅペプチドは、ｇｐ１２０の
不変部位に対応し、ＨＧＰ−３０ペプチドはウィルス中
部ｇａｇ部位の蛋白に対応する）。
【００５３】１時間の後、ウェルを洗浄し、それぞれの
希釈した抗血清を反応させた。次にペルオキシダーゼ標
識した抗マウス、抗ウサギ又は抗ヒトＩｇＧを反応させ
た。タイター法により、最終的に検出可能な希釈度の逆
数（逆タイター値）を決定した。以下に示す実施例４以
降は、上記した報文に準じて行った。
希釈した抗血清を反応させた。次にペルオキシダーゼ標
識した抗マウス、抗ウサギ又は抗ヒトＩｇＧを反応させ
た。タイター法により、最終的に検出可能な希釈度の逆
数（逆タイター値）を決定した。以下に示す実施例４以
降は、上記した報文に準じて行った。
【００５４】実施例４ （細胞融合の抑制）ウイルス成長の阻害は、文献(Scien
ce, ２３９，１０２１〜１０２３（１９８８）；Natur
e，３３２，４６９〜４７０（１９８８）；J. Virol．
６２，２６２２〜２６２８（１９８８）；Proc. Natl.
Acad. Sci. USA，８５，３１９８〜３２０２（１９８
８））記載の方法に準じて行った。
ce, ２３９，１０２１〜１０２３（１９８８）；Natur
e，３３２，４６９〜４７０（１９８８）；J. Virol．
６２，２６２２〜２６２８（１９８８）；Proc. Natl.
Acad. Sci. USA，８５，３１９８〜３２０２（１９８
８））記載の方法に準じて行った。
【００５５】すなわち、ＨＩＶ（ IIIB 、 IIIRFおよび
IIIMN株）と希釈した血清とを３７℃で３０分間反応さ
せた後、ＣＤ４+ 末しょう血Ｔ細胞（２×１０5 Cell／
ウェル）とともに２４穴のプレート中で、被検血清の存
在下に３７℃で５日間観察し、融合細胞の出現を観察し
た。
IIIMN株）と希釈した血清とを３７℃で３０分間反応さ
せた後、ＣＤ４+ 末しょう血Ｔ細胞（２×１０5 Cell／
ウェル）とともに２４穴のプレート中で、被検血清の存
在下に３７℃で５日間観察し、融合細胞の出現を観察し
た。
【００５６】融合活性(fused activity)数は、 Ｖｎ／Ｖｏ＝（被検血清中で融合した細胞の数）／ （コントロール血清中で融合した細胞の数） で表示した。中和活性(neutmalizeing activity)は、該
中和活性に対応するレシプロカル希釈の回数で評価し
た。この結果、７０％以上の融合阻害が見られた。この
際、血清希釈数を用いて抗体能の検討を行った。
中和活性に対応するレシプロカル希釈の回数で評価し
た。この結果、７０％以上の融合阻害が見られた。この
際、血清希釈数を用いて抗体能の検討を行った。
【００５７】実施例５ （ｐ２４産生の阻害）抗血清によるＨＩＶ複製の阻害
は、もう一つの方法、すなわちウィルスの蛋白の合成能
の阻害活性で検討した。この検討は、文献（J. Virol,
６２，２６２２〜２６２８（１９８８），Proc. Natl A
cad. Sic. USA ，８８，２２４９〜２２５３（１９９
１））記載の方法に準じて行った。
は、もう一つの方法、すなわちウィルスの蛋白の合成能
の阻害活性で検討した。この検討は、文献（J. Virol,
６２，２６２２〜２６２８（１９８８），Proc. Natl A
cad. Sic. USA ，８８，２２４９〜２２５３（１９９
１））記載の方法に準じて行った。
【００５８】すなわち、ＣＥＭ細胞をＨＩＶ−１ウイル
スとともに３７℃で４時間インキュベートし、よく洗浄
した後、感染ＣＥＭ細胞を、最終濃度２．５％の抗血清
を含有するメディウム中で培養した。５日間インキュベ
ーションの後、培地の細胞を含んでいない上清を採取
し、０．４５μｍフィルターで濾過した。ウイルス濃度
は市販のｐ２４捕かく測定試薬（Coulter Co. ）を用い
て行った。
スとともに３７℃で４時間インキュベートし、よく洗浄
した後、感染ＣＥＭ細胞を、最終濃度２．５％の抗血清
を含有するメディウム中で培養した。５日間インキュベ
ーションの後、培地の細胞を含んでいない上清を採取
し、０．４５μｍフィルターで濾過した。ウイルス濃度
は市販のｐ２４捕かく測定試薬（Coulter Co. ）を用い
て行った。
【００５９】実施例６ （抗原特異ＩＬ−２産生）ＩＬ−２（インターロイキン
−２）産生のアッセイは、文献(Immunology,６４，１１
３〜１１９（１９８８））記載の方法に準じて行った。
−２）産生のアッセイは、文献(Immunology,６４，１１
３〜１１９（１９８８））記載の方法に準じて行った。
【００６０】すなわち、２．５×１０4 個の末しょう血
リンパ細胞を最終濃度２〜１０μｇ／ｍｌのそれぞれ抗
原とともに９６穴マイクロプレートのウェル中で培養し
た（ウイルス（ IIIB ）および IIIB ウイルス遺伝子か
ら得られた組換えｇｐ１２０（ｒｇｐ１２０、横浜市の
三井化成（株）から供与されたものを用いた）は、加熱
殺菌された精製ＨＩＶ−１タンパク質および組換えによ
り調製されたＨＩＶエンベロープを代表している） ４８時間後、それぞれの培地の上清１００μｌをＩＬ−
２依存性のＴ−細胞ラインＣＴＬＬを用いて評価した。
後述する表の数値は、４ないし６試料の平均ｃｐｍ±Ｓ
Ｄ（標準偏差）を示す。
リンパ細胞を最終濃度２〜１０μｇ／ｍｌのそれぞれ抗
原とともに９６穴マイクロプレートのウェル中で培養し
た（ウイルス（ IIIB ）および IIIB ウイルス遺伝子か
ら得られた組換えｇｐ１２０（ｒｇｐ１２０、横浜市の
三井化成（株）から供与されたものを用いた）は、加熱
殺菌された精製ＨＩＶ−１タンパク質および組換えによ
り調製されたＨＩＶエンベロープを代表している） ４８時間後、それぞれの培地の上清１００μｌをＩＬ−
２依存性のＴ−細胞ラインＣＴＬＬを用いて評価した。
後述する表の数値は、４ないし６試料の平均ｃｐｍ±Ｓ
Ｄ（標準偏差）を示す。
【００６１】実施例７ （ウエスタン・ブロッティング）免疫した血清とＨＩＶ
感染細胞への抗体の結合は、文献(Proc.Natl. Acad. Sc
i. USA，８５，３１９８−３２０２（１９８８））記載
の方法に準じたウエスタン・ブロッティング法にて行っ
た。
感染細胞への抗体の結合は、文献(Proc.Natl. Acad. Sc
i. USA，８５，３１９８−３２０２（１９８８））記載
の方法に準じたウエスタン・ブロッティング法にて行っ
た。
【００６２】すなわち、ＨＩＶ感染Ｍｏｌｔ−４細胞
を、ソディウム ドデシルサルフェート（ＳＤＳ）によ
り可溶化し、それぞれの可溶化サンプルを電気泳動にか
けてニトロセルロース濾紙中に転移させた。次いで、そ
れぞれの濾紙をペルオキシターゼ標識抗ウサギ（又は抗
ヒト）ＩｇＧ抗体を用いて染色した。
を、ソディウム ドデシルサルフェート（ＳＤＳ）によ
り可溶化し、それぞれの可溶化サンプルを電気泳動にか
けてニトロセルロース濾紙中に転移させた。次いで、そ
れぞれの濾紙をペルオキシターゼ標識抗ウサギ（又は抗
ヒト）ＩｇＧ抗体を用いて染色した。
【００６３】結果 （ヒト血清の抗体価）まず、それぞれの免疫抗原に対す
る抗体価（力価）を調べた。ＥＬＩＳＡによるアッセイ
においては、免疫された個体からの血清は４００〜５
１，２００の抗体価を示した（下記表１および表２参
照）。
る抗体価（力価）を調べた。ＥＬＩＳＡによるアッセイ
においては、免疫された個体からの血清は４００〜５
１，２００の抗体価を示した（下記表１および表２参
照）。
【００６４】
【表１】
【００６５】上記表１は、ウサギから得たワクチン免疫
血清のそれぞれの合成ペプチドに対する抗体価を示して
いる。上記表１中、「ＫＬＨ−mixed 」は、本発明の多
価ワクチンを示し、他の免疫抗原は、ＫＬＨとそれぞれ
のＶ３領域ペプチド（又はＣ２１Ｅ及びＨＧＰ−３０の
ペプチド）との結合物を示している。「ＮＴ」は、試験
していない（not tested）の意味である。
血清のそれぞれの合成ペプチドに対する抗体価を示して
いる。上記表１中、「ＫＬＨ−mixed 」は、本発明の多
価ワクチンを示し、他の免疫抗原は、ＫＬＨとそれぞれ
のＶ３領域ペプチド（又はＣ２１Ｅ及びＨＧＰ−３０の
ペプチド）との結合物を示している。「ＮＴ」は、試験
していない（not tested）の意味である。
【００６６】
【表２】
【００６７】上記表２は、ワクチン免疫したヒト（各個
人）からの免疫血清の抗体価を示している。表２に示さ
れているように、本発明のワクチンを用いて免疫すれ
ば、ＥＬＩＳＡで高い抗体価を得ることができる。
人）からの免疫血清の抗体価を示している。表２に示さ
れているように、本発明のワクチンを用いて免疫すれ
ば、ＥＬＩＳＡで高い抗体価を得ることができる。
【００６８】それぞれの１価ワクチンにおいては、多価
ワクチンの場合と比較して、多少高いレベルの抗ペプチ
ド抗体が見られた。オクタロニー法においては、主な抗
体のクラスはＩｇＧであることが見い出された。ウサギ
抗血清のタイターは、ヒト抗血清のそれよりも高かっ
た。これのデータから、ヒトにおいても、本発明のワク
チンを用いた免疫法は抗体レベルを良好に上昇させるこ
とが確認された。
ワクチンの場合と比較して、多少高いレベルの抗ペプチ
ド抗体が見られた。オクタロニー法においては、主な抗
体のクラスはＩｇＧであることが見い出された。ウサギ
抗血清のタイターは、ヒト抗血清のそれよりも高かっ
た。これのデータから、ヒトにおいても、本発明のワク
チンを用いた免疫法は抗体レベルを良好に上昇させるこ
とが確認された。
【００６９】（抗血清の中和活性）ＨＩＶ感染ＣＤ４＋
Ｔ細胞およびＢ細胞の融合に対する阻害活性の測定結果
を下記表３および表４に示す。
Ｔ細胞およびＢ細胞の融合に対する阻害活性の測定結果
を下記表３および表４に示す。
【００７０】
【表３】
【００７１】上記表３は、ウサギ抗血清を用いたＨＩＶ
中和抗体価を示している。ウサギから得た抗血清は、表
１に示したものと同じである。
中和抗体価を示している。ウサギから得た抗血清は、表
１に示したものと同じである。
【００７２】
【表４】
【００７３】上記表４は、ヒト抗血清を用いたＨＩＶ中
和抗体価を示している。ヒトから得た抗血清は、表２に
示したものと同じである。
和抗体価を示している。ヒトから得た抗血清は、表２に
示したものと同じである。
【００７４】ウサギからの免疫血清は、顕著な巨細胞形
成阻害効果を誘起した。しかしながら、１価ワクチンで
免疫された血清は、強い阻害タイターを示さなかった。
ウサギ抗血清においては本発明の多価ワクチン（すなわ
ち、３種のＶ３領域ペプチドおよび不変部位ペプチドを
含むワクチン）で免疫した血清においては、抗融合活性
の強い相乗効果が見られた（表３）。このような強い相
乗効果は、従来のワクチンを用いた場合には見出だされ
ていなかったものである。良好なレベルの阻害は、免疫
したヒトからの血清においても確認された（表４）。ヒ
トに関し、このような相乗効果は現在まで報告されてい
なかったものである。
成阻害効果を誘起した。しかしながら、１価ワクチンで
免疫された血清は、強い阻害タイターを示さなかった。
ウサギ抗血清においては本発明の多価ワクチン（すなわ
ち、３種のＶ３領域ペプチドおよび不変部位ペプチドを
含むワクチン）で免疫した血清においては、抗融合活性
の強い相乗効果が見られた（表３）。このような強い相
乗効果は、従来のワクチンを用いた場合には見出だされ
ていなかったものである。良好なレベルの阻害は、免疫
したヒトからの血清においても確認された（表４）。ヒ
トに関し、このような相乗効果は現在まで報告されてい
なかったものである。
【００７５】（ｐ２４タンパク質産生に対する抗血清に
よる阻害）ウイルス成長阻害は、培地上清中の遊離ｐ２
４タンパク質を検出することにより行った。この場合に
も本発明のワクチン（複数種ペプチドの組合せ）により
誘起された相乗効果が見られた（下記表５参照）。
よる阻害）ウイルス成長阻害は、培地上清中の遊離ｐ２
４タンパク質を検出することにより行った。この場合に
も本発明のワクチン（複数種ペプチドの組合せ）により
誘起された相乗効果が見られた（下記表５参照）。
【００７６】
【表５】
【００７７】上記表５は、ウサギ血清によるＨＩＶ−１
ｐ２４タンパク質産生阻害活性を示している。ウサギ
からの血清は、前記表１と同じである。「ＮＴ」は、試
験していない（not tested）の意味である。
ｐ２４タンパク質産生阻害活性を示している。ウサギ
からの血清は、前記表１と同じである。「ＮＴ」は、試
験していない（not tested）の意味である。
【００７８】
【表６】
【００７９】上記表６は、ヒト血清によるＨＩＶ−１
ｐ２４タンパク質産生阻害活性を示している。ヒトから
の血清は、前記表２と同じである。「ＮＴ」は、試験し
ていない（not tested）の意味である。表６に示すよう
に、ヒトに本発明のワクチンを免疫して得られた血清
は、強いウィルス産生抑制能があることが判明した。
ｐ２４タンパク質産生阻害活性を示している。ヒトから
の血清は、前記表２と同じである。「ＮＴ」は、試験し
ていない（not tested）の意味である。表６に示すよう
に、ヒトに本発明のワクチンを免疫して得られた血清
は、強いウィルス産生抑制能があることが判明した。
【００８０】以上の結果から、本発明のワクチンを用い
て得られた抗血清が、ウイルスの増殖を確実に阻害する
ことが判明した。
て得られた抗血清が、ウイルスの増殖を確実に阻害する
ことが判明した。
【００８１】（細胞性免疫の活性化）本発明のワクチン
による細胞性免疫の活性化も、抗原特異的なＩＬ−２が
本発明の多価ワクチンにより誘起されるか否かにより評
価した。結果を下記表７に示す。
による細胞性免疫の活性化も、抗原特異的なＩＬ−２が
本発明の多価ワクチンにより誘起されるか否かにより評
価した。結果を下記表７に示す。
【００８２】
【表７】
【００８３】上記表７は、ワクチンを投与したヒト（各
個人）からの末梢白血球による抗原特異的ＩＬ−２の産
生を示している。表中の数値は、４ないし６サンプルの
平均±標準偏差（ＳＤ）である。
個人）からの末梢白血球による抗原特異的ＩＬ−２の産
生を示している。表中の数値は、４ないし６サンプルの
平均±標準偏差（ＳＤ）である。
【００８４】上記表７に示したように、ＨＩＶ全体又は
組換えｇｐ１２０タンパク質を培養系に添化した場合、
ＩＬ−２産生の実質的なレベルが観察された。この結果
は、本発明のワクチンがＨＩＶ抗原に特異的なＩＬ−２
を産生するＴ細胞を誘起可能なこと、すなわち細胞性免
疫能が活性化されていることを示している。
組換えｇｐ１２０タンパク質を培養系に添化した場合、
ＩＬ−２産生の実質的なレベルが観察された。この結果
は、本発明のワクチンがＨＩＶ抗原に特異的なＩＬ−２
を産生するＴ細胞を誘起可能なこと、すなわち細胞性免
疫能が活性化されていることを示している。
【００８５】（ウエスタン・ブロッティング）図２にウ
エスタン・ブロッティングの結果（写真のコピー）を示
す。上記図２は、抗血清を用いたＨＩＶ感染細胞のウエ
スタン・ブロッティングである。図２中、（Ａ）は、ウ
サギ中に産生された抗体であり、各レーンの意味は、以
下の通りである。
エスタン・ブロッティングの結果（写真のコピー）を示
す。上記図２は、抗血清を用いたＨＩＶ感染細胞のウエ
スタン・ブロッティングである。図２中、（Ａ）は、ウ
サギ中に産生された抗体であり、各レーンの意味は、以
下の通りである。
【００８６】１・・・可溶化したＭｏｌｔ−４細胞 ２・・・III B 株によって感染したＭｏｌｔ細胞の可溶
化物 ３・・・III MN株によって感染したＭｏｌｔ細胞の可溶
化物 ４・・・III RF株によって感染したＭｏｌｔ細胞の可溶
化物 また、図２中（Ｂ）は、ヒト中に産生された抗体であ
り、ここで用いた各サンプル（各レーン）の意味は、上
記（Ａ）におけると同様である。
化物 ３・・・III MN株によって感染したＭｏｌｔ細胞の可溶
化物 ４・・・III RF株によって感染したＭｏｌｔ細胞の可溶
化物 また、図２中（Ｂ）は、ヒト中に産生された抗体であ
り、ここで用いた各サンプル（各レーン）の意味は、上
記（Ａ）におけると同様である。
【００８７】このウエスタン・ブロッティングの結果
は、ｇｐ１２０不変部位ペプチドに対する抗体が、分子
量１２０Ｋダルトンサイズの分子からなる抗原と結合し
たことを示している。すなわち、本発明のワクチンによ
り産生された抗体が、ＨＩＶエンベロープのタンパク質
と反応することが確認された。
は、ｇｐ１２０不変部位ペプチドに対する抗体が、分子
量１２０Ｋダルトンサイズの分子からなる抗原と結合し
たことを示している。すなわち、本発明のワクチンによ
り産生された抗体が、ＨＩＶエンベロープのタンパク質
と反応することが確認された。
【００８８】また上記した各実施例においては、いかな
る副作用も観察されなかった。
る副作用も観察されなかった。
【００８９】
【発明の効果】上述したように本発明によれば、動物の
みならずヒトにも効果的なワクチンであって、ＨＩＶウ
イルス自体を使用していないために安全性が高く、予防
効率が高く、しかも体液性免疫とともに細胞性免疫を活
性化させることが可能な多価ワクチンが提供される。
みならずヒトにも効果的なワクチンであって、ＨＩＶウ
イルス自体を使用していないために安全性が高く、予防
効率が高く、しかも体液性免疫とともに細胞性免疫を活
性化させることが可能な多価ワクチンが提供される。
【図１】抗血清を用いたＨＩＶ感染細胞のウエスタン・
ブロッティング結果を示す写真のコピーである。
ブロッティング結果を示す写真のコピーである。
Claims (10)
- 【請求項１】 ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス）エンベ
ロープｇｐ１２０のＶ３領域ペプチド（エンベロープタ
ンパク質内のアミノ酸位置３０３〜３２２）と、ｇｐ１
２０又は内部構造タンパク質ｇａｇの不変部位ペプチド
とからなる複数のペプチドとを免疫原として含むことを
特徴とするＨＩＶ感染症予防ワクチン。 - 【請求項２】 ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス）エンベ
ロープｇｐ１２０のＶ３領域ペプチド（エンベロープタ
ンパク質内のアミノ酸位置３０３〜３２２）と、ｇｐ１
２０の不変部位ペプチド又は内部構造タンパク質ｇａｇ
の不変部位ペプチドとからなる複数のペプチドと、担体
タンパク質とを少なくとも含む複合体からなることを特
徴とするＨＩＶ感染症予防ワクチン。 - 【請求項３】 アジュバントを更に含む請求項１又は２
記載のＨＩＶ感染症予防ワクチン。 - 【請求項４】 前記複数のペプチドとしてヘルパーＴ細
胞活性化部位ペプチドを更に含む請求項１又は２記載の
ＨＩＶ感染症予防ワクチン。 - 【請求項５】 前記担体タンパク質がシステイン基含有
タンパク質からなる請求項２記載のＨＩＶ感染症予防ワ
クチン。 - 【請求項６】 前記担体タンパク質がヒト血清アルブミ
ン（ＨＳＡ）、カブトガニヘモシアニン（ＫＬＨ）又は
マルチプル アンティゲン ペプチド（multiple antig
en peptide) からなる請求項１記載のＨＩＶ感染症予防
ワクチン。 - 【請求項７】 前記複数のペプチドが合成ペプチドから
なる請求項１ないし６のいずれかに記載のＨＩＶ感染症
予防ワクチン。 - 【請求項８】 ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス）エンベ
ロープｇｐ１２０のＶ３領域ペプチド（エンベロープタ
ンパク質内のアミノ酸位置３０３〜３２２）と、ｇｐ１
２０の不変部位ペプチド又は内部構造タンパク質ｇａｇ
の不変部位ペプチドとからなる複数のペプチドを含む免
疫原と、アジュバントとを混合する段階を含むことを特
徴とするＨＩＶ感染症予防ワクチンの製造法。 - 【請求項９】 ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス）エンベ
ロープｇｐ１２０のＶ３領域ペプチド（エンベロープタ
ンパク質内のアミノ酸位置３０３〜３２２）と、ｇｐ１
２０の不変部位ペプチド又は内部構造タンパク質ｇａｇ
の不変部位ペプチドとからなる複数のペプチドと、担体
タンパク質とを結合させる段階を含むことを特徴とする
ＨＩＶ感染症予防ワクチンの製造法。 - 【請求項１０】 前記複数のペプチドが合成ペプチドか
らなる請求項８又は９記載のＨＩＶ感染症予防ワクチン
の製造法。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5054239A JPH0748276A (ja) | 1992-03-26 | 1993-03-15 | Ｈｉｖ感染症予防ワクチンおよびその製造法 |
| AU37605/93A AU3760593A (en) | 1992-03-26 | 1993-03-19 | Vaccine for preventing HIV-infected disease and production thereof |
| PCT/JP1993/000327 WO1993018791A1 (en) | 1992-03-26 | 1993-03-19 | Vaccine for preventing hiv-infected disease and production thereof |
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9860292 | 1992-03-26 | ||
| JP4-98602 | 1992-08-14 | ||
| JP23764892 | 1992-08-14 | ||
| JP4-237648 | 1992-08-14 | ||
| JP5054239A JPH0748276A (ja) | 1992-03-26 | 1993-03-15 | Ｈｉｖ感染症予防ワクチンおよびその製造法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0748276A true JPH0748276A (ja) | 1995-02-21 |
Family
ID=27295215
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5054239A Pending JPH0748276A (ja) | 1992-03-26 | 1993-03-15 | Ｈｉｖ感染症予防ワクチンおよびその製造法 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0748276A (ja) |
| AU (1) | AU3760593A (ja) |
| WO (1) | WO1993018791A1 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP3294755B1 (en) * | 2015-05-13 | 2023-08-23 | The United States of America as represented by the Secretary of the Department of Health and Human Services | Methods and compositions for inducing an immune response using conserved element constructs |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0222296A (ja) * | 1988-02-12 | 1990-01-25 | United Biomedical Inc | 合成ペプチドと、これをヒト免疫不全ウイルスｂｐ１２０ エンベロープ蛋白に対する抗体の検出、ａｉｄｓ及び前ａｉｄｓ状態の診断のために使用する方法、並びにこれをワクチンとして使用する方法 |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB8629116D0 (en) * | 1986-12-05 | 1987-01-14 | Hoffmann La Roche | Env/gag polypeptides |
| WO1988005440A1 (fr) * | 1987-01-16 | 1988-07-28 | Institut Pasteur | Peptides ayant des proprietes immunologiques 2-hiv-2 |
| WO1988009181A2 (en) * | 1987-05-29 | 1988-12-01 | Tanox Biosystems, Inc. | Monoclonal antibodies neutralizing hiv-1 |
| JPH01179687A (ja) * | 1987-12-30 | 1989-07-17 | Chemo Sero Therapeut Res Inst | Ｈｉｖ融合蛋白質 |
| EP0339504A3 (en) * | 1988-04-26 | 1990-09-12 | The Du Pont Merck Pharmaceutical Company | Human immunodeficiency virus (hiv) env-coded peptide capable of eliciting hiv-inhibiting antibodies in mammals |
| GB8910145D0 (en) * | 1989-05-03 | 1989-06-21 | Connaught Lab | Synthetic peptides for an hiv-1 vaccine |
-
1993
- 1993-03-15 JP JP5054239A patent/JPH0748276A/ja active Pending
- 1993-03-19 AU AU37605/93A patent/AU3760593A/en not_active Abandoned
- 1993-03-19 WO PCT/JP1993/000327 patent/WO1993018791A1/ja active Application Filing
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0222296A (ja) * | 1988-02-12 | 1990-01-25 | United Biomedical Inc | 合成ペプチドと、これをヒト免疫不全ウイルスｂｐ１２０ エンベロープ蛋白に対する抗体の検出、ａｉｄｓ及び前ａｉｄｓ状態の診断のために使用する方法、並びにこれをワクチンとして使用する方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU3760593A (en) | 1993-10-21 |
| WO1993018791A1 (en) | 1993-09-30 |
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