DE3588248T2

DE3588248T2 - LAV-Antigene und -Peptide

Info

Publication number: DE3588248T2
Application number: DE3588248T
Authority: DE
Inventors: Luc Montagnier; Bernard Krust; Solange Chamaret; François Clavel; Jean-Claude Chermann; Françoise Barre-Sinoussi; Marc Alizon; Pierre Sonigo; Cole Stewart; Olivier Danos; Simon Wain-Hobson
Original assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Institut Pasteur de Lille
Current assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Institut Pasteur de Lille
Priority date: 1984-10-18
Filing date: 1985-10-18
Publication date: 2004-07-01
Anticipated expiration: 2005-10-19
Also published as: ES8801319A1; DE3587512D1; DK284986D0; PT81338A; DK35593D0; DK284986A; ATE373010T1; HK1053662A1; AU603543B2; DE3583293D1; EP0201540A1; DE3588251T2; DK172814B1; ES557358A0; ES8801318A1; ATE64601T1; DE3587181D1; NZ230372A; EP0201540B2; DE122005000039I1

Description

LAV-Antigene und -Peptide
Die vorliegende Erfindung betrifft Antigene des Lymphadenopathie-Virus (nachstehend abkürzend als LAS bezeichnet) und des erworbenen Immunschwäche-Syndrom (nachstehend abkürzend als AIDS bezeichnet) verursachenden Virus, insbesondere in gereinigter Form und ein Verfahren zur Herstellung dieser Antigene, insbesondere der Hüll-Antigene dieser Viren. Die Erfindung betrifft auch glycosylierte und nicht-glycosylierte Polypeptide, die durch diese DNA-Sequenzen codiert sind.
Der Erreger von LAS oder AIDS, ein Retrovirus, ist von Barre-Sinoussi, F. et al., Science 220 (1983), 868, identifiziert worden. Es weist die nachstehend beschriebenen Eigenschaften auf. Es ist T-lymphotrop, und es befällt bevorzugt Leu 3-Zellen (oder T4-Lymphocyten). Es weist eine Reverse-Transkriptase-Aktivität auf, für die die Gegenwart von Mg²⁺ erforderlich ist, und eine starke Affinität für Poly(Adenylat-oligodesoxy-Thymidylat)(poly(A)-oligo(dT) 12–18). Es weist eine Dichte von 1,16 bis 1,17 in einem Sucrose-Gradienten auf, einen durchschnittlichen Durchmesser von 139 Nanometer und einen Kern mit einem durchschnittlichen Durchmesser von 41 Nanometern. Virus-Antigene, besonders ein p25-Protein werden immunologisch von Antikörpern erkannt, die in Seren enthalten sind, die von an LAS oder AIDS leidenden Patienten stammen. Das p25-Protein, das ein Kern-Protein ist, wird vom p24-Protein der HTLVI- und -II-Viren immunologisch nicht erkannt. Ferner fehlt dem Virus ein p19-Protein, das mit den HTLVI- und HTLVII-p19-Proteinen eine immunologische Kreuzreaktion zeigt.
Retroviren diesen Typs (gelegentlich wird abkürzend die übergeordnete Bezeichnung LAV verwendet) sind bei der "National Collection of Micro-organism Cultures" des INSTITUT PASTEUR in Paris unter den Nummern I-232, I-240 und I-241 hinterlegt worden. Virusstämme, die unter dem morphologischen und immunologischen Gesichtspunkt dem LAV in jeder Hinsicht gleichen, sind in anderen Laboratorien isoliert worden. Es wird auf die Retrovirusstämme, die als HTLV-III bezeichnet werden und von Gallo, R. C. et al., Science 224 (1984), 500, bzw. Sarngadharan, M. G. et al., Science 224 (1984), 506, isoliert wurden, und. auf das als ARV bezeichnete Retrovirus, das von M. Jay Levy et al., Science 225 (1984), 840–842, isoliert wurde, beispielhaft Bezug genommen. Zur sprachlichen Vereinfachung erhalten die zuletzt erwähnten Viren neben anderen mit entsprechenden morphologischen und immunologischen Eigenschaften hier nachstehend die übergeordnete Bezeichnung "LAV". Es wird hinsichtlich der genaueren Beschreibung der LAV- oder ähnlicher Retroviren und der Verwendungen der Extrakte dieser Viren auf die am 14. September 1984 eingereichte europäische Patentanmeldung hingewiesen, die die Priorität der am 15. September 1983 eingereichten britischen Patentanmeldung mit der Nummer 83 24800 in Anspruch nimmt.
Anfänglich waren die Kern-Antigene in den damals verwendeten Testsystemen die Haupt-Antigene der Virus-Lysate oder Extrakte, die durch Seren von mit AIDS oder LAS infizierten Patienten erkannt wurden. Ein p42-Protein, das als aus einem Hüll-Protein bestehend dargestellt wurde, ist ebenfalls nachgewiesen worden. In derselben Weise beschrieben Gallo et al. ein p41-Protein, von dem auch angenommen wurde, eventuell ein Bestandteil der Virus-Hülle zu sein.
Es sind auch Verfahren zum Erhalt eines LAV-Virus beschrieben worden. Es kann im Hinblick auf die Herstellung des Virus in T-Lymphocyten-Kulturen, die entweder von Blut, der Nabelschnur oder auch den Knochenmarkszellen von erwachsenen Spendern in gutem Gesundheitszustand abstammen, besonders auf den schon erwähnten Artikel von F. Barre-Sinoussi et al. Bezug genommen werden. Dieses Verfahren um faßt besonders die nachstehend beschriebenen wesentlichen Schritte:

– Herstellung einer viralen Infektion dieser T-Lymphocyten nach der Aktivierung durch ein Lectin-Mitogen mit einer Virus-Suspension, die von einer unbehandelten Überstandsflüssigkeit von Lymphocyten stammt, die das Virus produzieren (ursprünglich von einem mit AIDS oder LAS infizierten Patienten erhalten)
– Züchtung von mit TCGF infizierten Zellen in Gegenwart von anti-α-Interferon-Schafserum,
– Durchführung einer Reinigung des erzeugten Virus (die Produktion beginnt üblicherweise zwischen dem 9. und dem 15. Tag nach der Infektion und dauert zwischen 10 und 15 Tagen), wobei die Reinigung zum Erhalt einer ersten Konzentrierung des Virus die Ausfällung des Virus in Polyethylenglycol umfaßt, im Anschluß daran eine Zentrifugation des erhaltenen Präparats in einem 20–60% Sucrose-Gradienten oder einem isotonischen Metrizanid-Gradienten (unter dem Warenzeichen Nycodenz von Nyegaard, Oslo, im Handel erhältlich) und die Gewinnung des Virus mit der Bande, die eine Dichte von 1,16 bis 1,17 im Sucrose-Gradienten oder von 1,10 bis 1,11 im Nycoden^® Gradienten aufweist.

Das LAV-Virus kann auch von permanenten Zellinien des
Typs T, zum Beispiel der CEM-Zellinie oder von B-Lymphoblastoid-Zellinien produziert werden, die zum Beispiel durch Transformation der von einem gesunden Spender stammenden Lymphocyten mit dem Epstein-Barr-Virus erhalten werden, wie dies beispielsweise in der am 9. Mai 1984 eingereichten französischen Patentanmeldung Nr. 84 07151 offengelegt ist. Die erhaltenen permanenten Zellinien produzieren kontinuierlich ein Virus (bei B-Lymphoblastoid-Zellinien als LAV-B bezeichnet), das die wichtigsten antigenen und morphologischen Merkmale der LAV-Viren besitzt (abgesehen davon, daß es gelegentlich in einer Bande mit etwas höherer Dichte als im vorstehenden Fall (genauer 1,18) in Sucrose erhalten wird). Die Endreinigung des Virus kann auch in einem Nycodenz^®-Gradienten durchgeführt werden.
Es wird auf den Artikel von Schüpbach et al., Science 224 (4. Mai 1984), 503–505, hingewiesen. Dieser Artikel beschreibt eine Untersuchung im Hinblick auf verschiedene Antigene des HTLV-III-Retrovirus.
Es werden Ergebnisse vorgestellt, die einen Hinweis auf ein Antigen enthalten, das auf einem Elektrophoresegel eine Laufstrecke zurücklegte, die einem Molekulargewicht von etwa 110000 entsprach.
Schupbach et al. erwähnten, daß dieses Antigen in einer Virus-Präparation nachgewiesen wurde, in den Zellen jedoch unterhalb der Nachweisgrenze lag.
Ein Verfahren zur Clonierung von DNA-Sequenzen, die mit der genomischen LAV-RNA hybridisierbar sind, ist bereits in der am 19. September 1984 eingereichten britischen Patentanmeldung 84 23659 offengelegt worden. Nachstehend wird hinin EP-A-0 178 978 beschrieben worden. Nachstehend wird hinsichtlich des gemeinsamen Gegenstands mit den weiteren Verbesserungen in der hier beschriebenen Erfindung auf diese Anmeldung Bezug genommen.
Die Erfindung zielt ab auf die Bereitstellung gereinigter, unveränderter Virusformen (der Viren, die durch die verwendeten Reinigungsverfahren weniger verändert wurden) und Verfahren zum Erhalt der unveränderten, gereinigten Viren.
Die vorliegende Erfindung zielt darüber hinaus auf die Bereitstellung weiterer neuer Verfahren, die neben ihrer Nützlichkeit zum Nachweis von LAV oder verwandten Viren (hier nachstehend allgemeiner als "LAV-Viren" bezeichnet), auch eine größere Vielseitigkeit, insbesondere beim Nachweis bestimmter Teile der genomischen DNA der Viren, deren Expressionsprodukte durch immunologische Verfahren nicht immer direkt nachweisbar sind. Die vorliegende Erfindung zielt darüber hinaus auf die Bereitstellung von Polypeptiden, die Sequenzen enthalten, die mit antigene Determinanten umfassenden Polypeptiden übereinstimmen, die in den durch das natürlich vorkommende LAV-Genom codierten und exprimierten Proteinen enthalten sind. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ferner die Bereitstellung von Verfahren. zum Nachweis von mit LAV-Viren verwandten Proteinen, besonders zur Diagnose von AIDS oder Prä-AIDS oder, im Gegensatz dazu, zum Nachweis von Antikörpern gegen das LAV-Virus oder mit ihm verwandten Proteinen, besonders in Patienten, die an AIDS oder Prä-AIDS leiden, oder allgemeiner in asymptomatischen Trägern und in blutverwandten Produkten. Schließlich betrifft die Erfindung auch die Bereitstellung immunogener Polypeptide, und insbesondere schützender Polypeptide zur Verwendung in der Herstellung von Impfstoff-Zusammensetzungen gegen AIDS oder verwandte Syndrome.
Die vorliegende Erfindung betrifft weitere, mit der genomischen LAV-RNA hybridisierbare DNA-Fragmente, wie hier nachstehend beschrieben, ebenso wie weitere cDNA-Varianten, die den gesamten LAV-Virus-Genomen entsprechen. Sie betrifft weiter rekombinante DNAs, die die DNAs oder cDNA-Fragmente enthalten.
Ein unverändertes, gereinigtes LAV-Retrovirus unterscheidet sich von den vorstehend definierten durch einen Gehalt an einem oder mehreren Hüll-Antigenen, der zur Sichtbarmachung ausreicht, wenn das Virus mit ³⁵S-Cystein, ohne nicht-markiertes Cystein, in einem Verhältnis von 200 Microcurie pro ml Medium markiert wird. Von diesen Antigenen werden in vitro durch Seren von Patienten, die an AIDS oder SLAs leiden, oder durch Seren von asymptomatischen Trägern des Virus besonders Glycoproteine selektiv erkannt.
Ein bevorzugtes Antigen gemäß der vorstehenden Definition, das aus einem Lysat dieses Virus erhältlich ist (oder durch vorsichtiges Reinigen der 'Virus-Hüllen), ist ein Glycoprotein, das ein Molekulargewicht in der Größenordnung von 110000 Dalton aufweist, wie durch einen Vergleich seiner Laufstrecke mit den Laufstrecken von Standardproteinen, die bekannte Molekulargewichte aufwiesen, im selben Laufsystem festgestellt wurde. Insbesondere wurden vergleichende Messungen 18 Stunden bei einer Spannung von 18 V auf einem 12,5% Polyacrylamidgel durchgeführt, wobei die nachstehend aufgeführten Standardproteine (Vertrieb durch Amersham) verwendet wurden:

– Lysozym-(¹⁴C)-Methyl (MG: 14300),
– Kohlendioxid-(¹⁴C)-Methyl (MG: 30000),
– Ovalbumin- (¹⁴ C)-Methyl (MG: 46000),
– Rinderserumalbumin-(¹⁴C)-Methyl (MG: 69000),
– Phosphorylase b-(¹⁴C)-Methyl (MG: 92500),
– Myosin- (¹⁴C)-Methyl (MG: 200000).

Die Erfindung betrifft auch die Antigene selber, besonders das mit einem Molekulargewicht von etwa 110000-120000, das auch die Eigenschaft aufweist, durch Seren von Patienten, die an AIDS oder LAS leiden, oder durch Seren von Personen erkannt zu werden, die den LAV-Viren oder ihren Analoga ausgesetzt worden waren. Diese Antigene weisen weiter die Eigenschaft auf, mit Concanavalin A Komplexe zu bilden, wobei der Komplex in Gegenwart von O-Methyl-α-D-mannopyranosid dissoziierbar ist. Die erfindungsgemäßen Antigene können auch andere, zum Beispiel unter dem Namen "Linsen-Lectin" bekannte Lectine binden. Das bevorzugte erfindungsgemäße Antigen mit einem Molekulargewicht von 110000 ist auch empfindlich gegen die Wirkung von Endoglycosidasen. Diese Wirkung wird durch das aus dem Antigen mit einem Molekulargewicht von 110000 hergestellte Protein deutlich, das ein Molekulargewicht in der Größenordnung von 90000 aufweist, wobei letzteres beispielsweise durch Immunpräzipitation oder Trennung unter Verwendung der Unterschiede in den Molekulargewichten (unterschiedliche Laufstrecken auf einem Gel) abtrennbar ist.
Bevorzugte erfindungsgemäße Antigene werden von Glycoproteinen gebildet.
Die Erfindung betrifft auch das Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Viren. Dieses Verfahren unterscheidet sich wesentlich von den vorstehend beschriebenen auf der Stufe des abschließenden Reinigungsschrittes. Der Reinigungsschritt des erfindungsgemäßen Verfahrens wird insbesondere nicht weiter in Gradienten durchgeführt, sondern schließt die Durchführung von Differential-Zentrifuga- tionen ein, die direkt mit den Überständen der Kulturmedien der produzierenden Zellen durchgeführt werden. Diese Zentrifugations-Verfahren umfassen besonders eine erste Zentrifugation bei einer Winkelgeschwindigkeit der Zentrifugation, besonders bei 10000 UpM, die die Entfernung von nicht-viralen Bestandteilen, insbesondere von zellulären Bestandteilen ermöglicht, und anschließend eine zweite Zentrifugation bei einer höheren Winkelgeschwindigkeit, besonders bei 45000 UpM, um den eigentlichen Virus-Niederschlag zu erhalten. In bevorzugten Ausführungsformen wird in der ersten Zentrifugation 10 Minuten mit 10000 UpM und in der zweiten 20 Minuten mit 45000 UpM zentrifugiert. Dies sind natürlich nur Orientierungswerte, wobei es sich versteht, daß es der Fähigkeit des Spezialisten überlassen bleibt, zur Trennung der zellulären und der viralen Bestandteile die Zentrifugations-Bedingungen zu modifizieren.
Diese Modifikation des Reinigungsverfahrens hat die Herstellung von viralen Präparationen zur Folge, aus denen das erwähnte Antigen leichter als aus Virus-Präparationen gewonnen werden kann, die durch die früher verwendeten Verfahren gereinigt wurden. Auf jeden Fall werden die schließlich durch das erfindungsgemäße Verfahren erhaltenen Viren durch Seren von Patienten oder Personen, die dem LAV-Virus oder morphologisch und hinsichtlich der Antigenität ähnlichen Stämmen ausgesetzt worden sind, leichter erkannt.
Die erfindungsgemäßen Antigene selber können aus den vorstehend beschriebenen Viren durch deren Lyse (oder andere geeignete Verfahren) in Gegenwart eines geeigneten Detergens und durch Gewinnung und Trennung der freigesetzten Antigene erhalten werden. Die Lyse des Virus wird vorzugsweise in Gegenwart von Aprotinin oder einem anderen zur Hemmung der Protease-Wirkung geeigneten Wirkstoff durchgeführt. Die Trennung der erfindungsgemäßen Antigene kann anschließend durch irgendein bekanntes Verfahren durchgeführt werden; beispielsweise ist es möglich, eine Trennung der Proteine aufgrund ihrer jeweiligen unterschiedlichen Laufstrecken in meinem vorgegebenen Gel durchzuführen, worauf das gesuchte Protein aus der Zone des Gels isoliert wird, in der es bei streng festgelegten Bedingungen unter Berücksichtigung seines Molekulargewichts nach der Durchführung einer Elektrophorese üblicherweise gefunden wird. Die erfindungsgemäßen Antigene können jedoch aufgrund ihrer Affinität für Lectine, insbesondere Concanavalin A oder Linsen-Lectin, vom Lysat der vorstehend beschriebenen Viren abgetrennt werden. Das verwendete Lectin wird vorzugsweise auf einem festen Träger, zum Beispiel dem quervernetzten, aus Agarose stammenden und unter dem Warenzeichen Sepharose vertriebenen Polymer immobilisiert. Nach dem Waschen der gebundenen Antigene mit einem geeigneten Puffer können die Antigene in einer geeigneten Weise, besonders durch Verwendung von gelöstem O-Methyl-α-D-mannopyranosid eluiert werden.
Eine sorgfältigere Reinigung dieser Antigene kann durch Immunpräzipitation mit Seren von Patienten durchgeführt werden, von denen bekannt ist, daß sie gegen dieses Protein wirksame Antikörper aufweisen, mit konzentrierten Antikörper-Präparationen (polyclonalen Antikörpern) oder erneut mit insbesondere gegen das erfindungsgemäße Antigen gerichteten monoclonalen Antikörpern, insbesondere gegen das mit dem Molekulargewicht von 110000, das nachstehend durch die Abkürzung gp110 bezeichnet wird.
Weitere Eigenschaften der Erfindung werden auch bei der nachstehenden Beschreibung der Isolierung eines erfindungsgemäßen Virus und von Antigenen beschrieben, insbesondere eines Kapsel-Antigens des Virus. Es wird auf die Figuren Bezug genommen, wobei:
1 eine Kopie einer photographischen Reproduktion von Gelspuren darstellt, die zur Durchführung von Elektrophoresen von Lysatextrakten von T-Lymphocyten verwendet wurden, die durch eine LAV-Suspension infiziert bzw. nicht-infiziert (Kontrollen) worden waren;
2 die Restriktionskarte eines vollständigen LAV-Genoms (Clon λJ19)darstellt;
3a bis 3e die vollständige Sequenz eines viralen LAV-Genoms darstellen;
4 und 5 Teile der drei möglichen Lesephasen der genomischen LAV-RNA als Diagramm darstellen, einschließlich der offenen, in jedem der Lesephasen erscheinenden Leseraster (ORF);
6 eine schematische Darstellung der langen LAV-terminalen Wiederholung (LTR) ist.
I – Herstellung des Virus und der Antigene
T-Lymphocyten, die von einem gesunden Spender stammten und mit LAV1 unter den von F. Barre-Sinoussi et al. beschriebenen Bedingungen auf CEM-Zellen infiziert worden waren, die von einem an Leukämie leidenden Patienten stammten und auch in vitro mit LAV1 infiziert worden waren, wurden in einem Medium gezüchtet, das 200 Microcurie ³⁵S-Cystein enthielt und dem nicht-markiertes Cystein fehlte. Die infizierten Lymphocyten wurden in einem nicht-denaturierenden Medium gezüchtet, um den Abbau des gesuchten Antigens zu verhindern. Im Anschluß daran wurde mit der Überstandsflüssigkeit des Kulturmediums zur Entfernung der nichtviralen Bestandteile eine erste Zentrifugation von 10 Minuten bei 10000 UpM und danach zur Sedimentierung des Virus eine zweite Zentrifugation von 20 Minuten bei 45000 UpM durchgeführt. Das Virus-Pellet wurde anschließend in Gegenwart von Aprotinin (5%), insbesondere unter den im Artikel von F. Barre-Sinoussi et. al. beschriebenen Bedingungen durch Detergens lysiert.
Dasselbe Verfahren wurde an Lymphocyten wiederholt, die als Kontrolle aus einem gesunden Spender gewonnen worden waren.
Die verschiedenen Lysate wurden anschließend durch Seren von Patienten, die an AIDS oder LAS litten, immunpräzipitiert. Seren, die von gesunden Spendern oder von mit anderen Krankheiten infizierten Spendern stammten, wurden ebenfalls immunopräzipitiert. Mit den Medien wurde anschließend in einem SDS-Polyacrylamidgel eine Elektrophorese durchgeführt.
Die Ergebnisse sind in 1 dargestellt. Die von 1 bis 6 numerierten Gelspuren wurden von Präparationen erhalten, die mit ³⁵S-Cystein markiert worden waren. Die Spuren mit den Nummern 7 bis 10 zeigen Ergebnisse, die an infizierten und nicht-infizierten, mit ³⁵S-markierten Lymphocyten-Präparationen. beobachtet wurden Die Spur M entspricht schließlich den Laufstrecken der vorstehend identifizierten Standardproteine, deren Molekulargewichte im rechten Teil der Figur angegeben sind.
Die Bezeichnung der markierten viralen Proteine erscheint im linken Teil der Figur.
Es ist zu beobachten, daß die Spuren 7 und 9 das spezifische, mit ³⁵S-Methionin markierte LAV-Protein p25 zeigen. Die Abwesenheit des gleichen Proteins auf den Spuren 8 und 1.0 entspricht den Ergebnissen, die an einer von gesunden Lymphocyten stammenden Präparation erhalten wurden.
Die Spuren 3 und 5 entsprechen den Ergebnissen, die an Präparationen von infizierten und mit ³⁵S-Cystein markierten Lymphocyten erhalten wurden. Die Proteine p25 und p18, die charakteristischen Kernproteine von LAV, und das auch für LAV spezifische Glycoprotein gp110 waren ebenfalls vorhanden. Abbildungen, die einem Protein p41 entsprechen (Molekulargewicht der Größenordnung 41000) erschienen, obgleich weniger deutlich, in den verschiedenen Präparationen.
Das erfindungsgemäße Virus und das erfindungsgemäße Antigen können entweder durch Lectine, besonders Concanavalin A ausgefällt oder an eine Sepharose-Concanavalin A-Säule gebunden werden. Insbesondere die Reinigung der Hüll-Glycoproteine kann wie nachstehend beschrieben durchgeführt werden. Diese Bindung kann insbesondere durch Inkontaktbringen eines in einem geeigneten Puffer gelösten Lysats des LAV-Virus mit an Sepharose^® gebundenem Concanavalin A durchgeführt werden. Ein geeigneter Puffer weist die nachstehend beschriebene Zusammensetzung auf:

Tris 10 mM

NaCl 0,15 M

CaCl₂ 1 mM

MgCl₂ 1 mM

Triton 1%

(Warenzeichen des Dertergens im Handel)

pH-Wert 7,4
Nach der Durchführung der Bindung wird das Sepharose®-Concanavalin A, abgesehen von der auf 0,1% verminderten Triton^® Konzentration, mit einem Puffer der gleichen Zusammensetzung gewaschen. Die Elution wird anschließend mit einer 0,2 M O-Methyl-α-D-mannopyranosidlösung im Waschpuffer durchgeführt.
Das Protein kann durch Immunpräzipitation mit Antikörpern weiter konzentriert werden, die in Seren von mit dem AIDS-Virus infizierten Patienten enthalten. sind, oder mit polyclonalen Antikörpern, die aus einem Serum erhalten werden, das von einem zuvor gegen das "unveränderte" erfindungsgemäße Virus oder das vorstehend beschriebene Glycoprotein immunisierten Tier stammt. Das Protein kann anschließend durch Dissoziation des Komplexes mittels einer Lösung, die einen geeigneten ionischen Salzgehalt aufweist, gewonnen werden. Vorzugsweise wird die Antikörper-Präparation selbst in einer bekannten Weise auf einem unlöslichen Träger, beispielsweise vom Sepharose^® B-Typ immobilisiert.
Es ist auch möglich, monoclonale Antikörper zu verwenden, die von zuvor gegen gp110 hergestellten Hybridomen sekretiert werden. Diese monoclonalen Antikörper bilden neben den sie produzierenden Hybridomen auch einen Teil der Erfindung.
Ein Verfahren zur Herstellung und Selektion von monoclonalen Antikörpern, die gegen das gp110 Glycoprotein gerichtet sind, ist nachstehend beschrieben.
Immunisierung der Mäuse
Es wurden Gruppen von 6 bis 8 Wochen alten BALB/c-Mäusen verwendet. Eine Gruppe erhält das Virus, das das vorstehend beschriebene Glycoprotein trägt, und eine andere ein gereinigtes Glycoprotein gp110. Das bei allen Mäusen identische Immunisierungsverfahren umfaßt die Injektion von 10 mg der antigenen Präparation in Gegenwart von komplettem Freunds Adjuvans am Tag 0, anschließend erneut, jedoch in Gegenwart von inkomplettem Freunds Adjuvans am Tag 14 und ohne Adjuvans an den Tagen 28 und 42. Die ersten drei Injektionen werden intraperitoneal, die vierte intravenös verabreicht.
Fusion und Züchtung der Hybride
Die nicht-sekretierende Myelom-Variante 5.53 P3 × 63 Ag8, die Azaguanin-resistent ist und von der MOPC-21-Zellinie stammt, wird verwendet. In Gegenwart von Polyethylenglycol 4000 wird am 45. Tag durch das Verfahren von Fazekas de St-Groth und Scheidegger die Fusion mit immunisierten Maus-Splenocyten durchgeführt. Die Selektion der Hybride in RPMI 1640 "HAT"-Medium wird unter Verwendung derselben Züchtungstechniken auf Platten durchgeführt, die 24 Vertiefungen aufweisen (bekannt unter der Bezeichnung Costar).
Die Hybridome, die Antikörper von geeigneter Spezifität produzieren, werden anschließend in Gegenwart einer "ernährenden" Schicht von syngenen Thymocyten in Platten, die 96 Vertiefungen aufweisen, cloniert. Die so selektierten, produzierenden Clone werden anschließend immer noch in Gegenwart von Thymocyten in Platten mit 24 Vertiefungen vermehrt. Sobald in einer der Vertiefungen die Konfluenz auftritt, wird der Clon intraperitoneal in eine BALB/c-Maus, injiziert, die 8 Tage zuvor eine Pristan-Injektion erhalten hatte, und/oder in Flüssigkultur gehalten.
Darstellung der anti-LAV-Antikörper
Fünf verschiedene Verfahren ermöglichen die Charakterisierung der Clone, die Antikörper von geeigneter Spezifität produzieren. In einer ersten Stufe werden die Hybride, die Antikörper produzieren, durch einen ELISA-Test ermittelt, der Maus-Immunglobuline .in den Überstandsflüssig keiten zeigt. In dieser ersten Selektion werden durch Verwendung eines ELISA-Tests, der anti-LAV-Antikörper zeigt, oder durch Immunfluoreszenz an Virus produzierenden menschlichen Zellen Überstände gesucht, die gegen virale Bestandteile gerichtete Antikörper aufweisen. Schließlich werden die Überstandsflüssigkeiten durch Radio-Immunpräzipitation des mit Cystein markierten Virus und durch das Western-Blot-Verfahren an einer viralen Präparation, die die Bestimmung der Spezifitäten dieser anti-LAV-Antikörper ermöglichen, analysiert.
Ergebnisse
Die von den verschiedenen Fusionen erhaltenen Zellen werden in 648 Vertiefungen gezüchtet. Ihre mikroskopische Untersuchung zeigt, daß die Mehrzahl dieser Vertiefungen einen einzelnen Hybridclon enthält, der fähig ist, in einem selektiven "HAT"-Medium zu wachsen. Mehr als 50% von ihnen produzieren Antikörper, die bei einer ELISA-anti-Virus-Untersuchung eine positive Antwort bewirken. Die repräsentativsten Fusionen werden durch das Western-Blot-Verfahren getestet und einige von ihnen subcloniert, wobei ihre jeweiligen Spezifitäten und Reaktivitäten im anti-Virus-ELISA und ihre Verhaltensweisen unter den Züchtungsbedingungen berücksichtigt werden. Es werden insbesondere die Hybride selektiert, die Antikörper produzieren, die selektiv das virale Glycoprotein gp110 erkennen, das ein Molekulargewicht von etwa 110 kD aufweist. Sämtliche Subclonierungen ergeben Antikörper produzierende Clone, die nach der Expression in syngene Mäuse. injiziert werden. Eine Analyse der Spezifitäten der in den unterschiedlichen Ascites-Flüssigkeiten vorhandenden Antikörper bestätigt die Spezifität der Ascites-Antikörper hinsichtlich des gp110.
Die erhaltenen monoclonalen Antikörper können selbst zur Reinigung von Proteinen verwendet werden, die eine auch in gp110 vorhandene antigene Stelle enthalten. Die Erfindung betrifft daher auch diese Reinigungsverfahren als solche.
Dieses Verfahren wird vorteilhaft an Virus-Lysaten, Lysaten von T-Lymphocyten oder weiteren, LAV oder Entsprechendes 'produzierenden Zellen angewandt, wenn die unkontrollierte Abtrennung von gp110 während des Reinigungsverfahrens des Virus vor seiner Lysis sorgfältig vermieden worden ist. Es ist unnötig zu sagen, daß das Verfahren auch an jeder Lösung verwendet werden kann, die gp110 oder ein Protein, Polypeptid oder Glycoprotein enthält, das eine antigene Stelle umfaßt, die üblicherweise vom Hüll-Protein getragen und durch den monoclonalen Antikörper erkannt wird. Zur Durchführung dieses Verfahrens ist es vorteilhaft, die monoclonalen Antikörper auf einem festen Träger zu immobilisieren, der bevorzugt für Affinitätschromatographie-Verfahren verwendbar ist. Diese monoclonalen Antikörper werden beispielsweise an ein dreidimensional vernetztes Agarosegitter, unter dem Warenzeichen Sepharose von der schwedischen Firma Pharmacia A. G. vertrieben, beispielsweise durch das Bromcyan-Verfahren gebunden.
Die Erfindung betrifft daher auch ein Verfahren zur Trennung der betreffenden Antigene, wobei das Verfahren das Inkontaktbringen eines Antigen-Gemisches, das die Antigene von Interesse einschließt (zum Beispiel ein Virus-Lysat oder -Extrakt), mit einer Affinitätssäule umfaßt, die die vorstehend beschriebenen monoclonalen Antikörper trägt, um die durch die monoclonalen Antikörper selektiv erkannten Polypeptide, Proteine oder Glycoproteine selektiv zu binden, die Gewinnung der letzteren durch Dissoziation des Antigen-Antikörper-Komplexes unter Verwendung eines geeigneten Puffers, insbesondere einer Lösung von geeigneter Innenstärke, beispielsweise eines Salzes, vorzugsweise Ammoniumacetat (das bei der Gefriertrocknung der Präparation keinen Rückstand bildet), einer auf einen pH-Wert von 2 bis 4 angesäuerten Lösung oder eines Glycin-Puffers beim gleichen pH-Wert, und die Gewinnung der eluierten Polypeptide, Proteine oder Glycoproteine.
Es versteht sich von selbst, daß die Erfindung auch Polypeptid-Fragmente betrifft, die niedrigere Molekular- Gewichte aufweisen und antigene Stellen tragen, die durch die gleichen monoclonalen Antikörper erkannt werden. Es ist für den Fachmann klar, daß die Verfügbarkeit von monoclonalen Antikörpern, die das gp110-Glycoprotein erkennen auch den Zugriff auf kleinere Peptidsequenzen oder Fragmente ermöglicht, die eine gemeinsame antigene Stelle oder ein gemeinsames Epitop enthalten. Fragmente von kleinerer Größe können unter Verwendung von bekannten Verfahren erhalten werden. Ein derartiges Verfahren umfaßt beispielsweise die Spaltung des ursprünglich größeren Polypeptids durch Enzyme, die zur Spaltung an spezifischen Stellen fähig sind. Zur beispielhaften Darstellung solcher Proteine kann das Enzym von Staphylococcus aureus V8, α-Chymotrypsin, Maus-Unterkiefer-Drüsen-Protease, die von der Firma Boehringer vertrieben wird, Vibrio alginolyticus chemovar iophagus-Collagenase, die unter anderem die Peptide Gly-Pro und Gly-Ala spezifisch erkennt, erwähnt werden.
Es ist auch möglich, durch Clonierung von Fragmenten, die einer aus Genomen von LAV-Varianten konstruierten cDNA entnommen worden sind, Polypeptide oder Fragmente von Hüll-Antigenen des Virus zu erhalten.
Die 2 und 3 sind Restriktionskarten einer solchen cDNA, die insgesamt 9,1 bis 9,2 kB umfaßt. Die, von cDNA-Fragmenten codierten Polypeptide befinden sich in der Region, die sich von der KpnI-Stelle (Position 6100) bis zur Bg1II-Stelle (Position 9150) der Restriktionskarte von 2 erstreckt. Das Vorhandensein einer charakteristischen Stelle eines Hüll-Antigens des LAV-Virus oder eines ähnlichen Virus in einem exprimierten Polypeptid (in einer geeigneten Wirtszelle, die zuvor durch ein entsprechendes Fragment oder durch einen das Fragment enthaltenden Vektor transformiert worden ist) kann durch jedes geeignete immunologische Verfahren nachgewiesen werden.
Die Erfindung betrifft insbesondere Polypeptide, die von hier nachstehend definierten cDNA-Fragmenten codiert werden. Sie betrifft auch die Nucleinsäure-Fragmente selber, die eine cDNA-Variante einschließen, die einem vollständigen retroviralen LAV-Genom entspricht, das durch eine Reihe von Restriktionsstellen in der hier nachstehend beschriebenen Reihenfolge (vom 5'-Ende zum 3'-Ende) charakterisiert ist.

Die Koordinaten der aufeinanderfolgenden Stellen des gesamten LAV-Genoms (vgl. auch die Restriktionskarte von λJ19 in 1) werden hier nachstehend unter Bezug auf die HindIII-Stelle (gewählt als Koordinate 1), die in der R-Region liegt, auch angegeben. Die Koordinaten werden mit einer Genauigkeit von ± 200 Bp geschätzt:

HindIII	0
SacI	50
HindIII	520
PstI	800
HindIII	1100
BglII	1500
KpnI	3500
KpnI	3900
EcoRI	4100
EcoRI	5300
SalI	5500
KpnI	6100
BglII	6500
BglII	7600
HindIII	7850
BamHI	8150
XhoI	8600
KpnI	8700
BglII	8750
BglII	9150
SacI	9200
HindIII	9250

Eine weitere erfindungsgemäße DNA-Variante enthält gegebenenfalls eine weitere HindIII-Stelle etwa an der Koordinate 5550.
Es wird auch auf 1 Bezug genommen, die eine ge nauere Restriktionskarte der Gesamt-DNA (λJ19) darstellt.
Eine noch detailliertere Nucleotidsequenz einer bevorzugten erfindungsgemäßen DNA ist hier nachstehend in den 4a–4e dargestellt.
Die Erfindung betrifft ferner weitere bevorzugte DNA-Fragmente und Polypeptidsequenzen (glycosyliert oder nicht glycosyliert), auf die hier nachstehend Bezug genommen wird.
Sequenzierung von LAV
Die Sequenzierung und Bestimmung der Stellen von besonderem Interesse wurden an einem rekombinanten Phagen durchgeführt, der dem in der vorstehend genannten britischen Patentanmeldung Nr. 84 23659 beschriebenen λJ19 entspricht. Ein Verfahren zu seiner Herstellung wird in der Anmeldung beschrieben.
Die gesamte rekombinante Phagen-DNA vom Clon λJ19 (in der früheren Anmeldung beschrieben) wurde gemäß der Vorschrift von Deininger, Analytical Biochem. 129 (1983), 216, mit Ultraschall behandelt. An der DNA wurde 12 Stunden bei 16°C durch eine Klenow-Reaktion eine Reparatur durchgeführt. Mit der DNA wurde in einem 0,8% Agarosegel eine Elektrophorese durchgeführt, und die DNA im Größenbereich von 300–600 Bp wurde ausgeschnitten, elektroeluiert und ausgefällt. Die resuspendierte DNA (in 10 mM Tris, pH-Wert 8; 0,1 mM EDTA) wurde in M13mp8-RF-DNA (durch das Restriktionsenzym SmaI gespalten und anschließend mit alkalischer Phosphatase behandelt) unter Verwendung von T4-DNAund RNA-Ligasen ligiert (Maniatis, T. et al. (1982), Molecular Cloning – Cold Spring Harbor Laboratory). Ein E. coli-Stamm mit der Bezeichnung TGl wurde für die weitere Untersuchung verwendet. Dieser Stamm weist den nachstehend beschriebenen Genotyp auf:
Δ lac pro, supE, thi.F'traD36, proAB, lacI^q, ZΔM15, r
Dieser E. coli-TGI-Stamm weist die Besonderheit auf, daß Rekombinante leicht erkannt werden können. Die blaue Farbe der Zellen, die mit Plasmiden transfiziert sind, die nicht mit einem LAV-DNA-Fragment rekombiniert haben, wird nicht modifiziert. Die Zellen, die mit einem rekombinanten Plasmid transfiziert sind, das ein LAV-DNA-Fragment enthält, ergeben dagegen weiße Kolonien. Das verwendete Verfahren ist in Gene 26 (1983), 101, beschrieben.
Dieser Stamm wurde unter Verwendung des Hanahan- Verfahrens (Hanahan D., J. Mol. Biol. 166 (1983), 557) mit dem Ligierungsgemisch transformiert. Die Zellen wurden auf einer Trypton-Agarose-Platte mit IPTG und X-Gal in weicher Agarose ausplattiert. weiße Plaques wurden entweder entnommen und abgesucht oder unter Verwendung eines Nitrozellulose-Filters direkt in situ abgesucht. Ihre DNA-Moleküle wurden mit nick-translatierten DNA-Insertionen von pUC18- HindIII-Subclonen von λJ19 hybridisiert. Dies ermöglichte die Isolierung der Plasmide oder Subclone von λ, die in der nachstehend beschriebenen Tabelle identifiziert sind. Im Bezug auf diese Tabelle sollte auch darauf hingewiesen werden, daß auf die Bezeichnung eines jeden Plasmids die Hinterlegungsnummer einer Zellkultur von E. coli TGI, die das entsprechende Plasmid enthält, bei der "Collection Nationale des Cultures de Micro-organismes" (C.N.C.M.) des Pasteur Instituts in Paris, Frankreich, folgt. Auch eine nicht transformierte TGI-Zellinie wurde bei der C.N.C.M. unter der Nr. I-364 hinterlegt. Sämtliche Hinterlegungen fanden am 15. November 1984 statt. Die Größen der entsprechenden vom LAV-Genom stammenden Insertionen sind auch angegeben worden.
Tabelle Haupt-Merkmale der rekombinanten Plasmide
Positiv hybridisierende M13-Phagen-Platten wurden 5 Stunden gezüchtet, und die einzelsträngigen DNAs extrahiert.
Die M13mp8 Subclone von λJ19- DNAs wurden nach dem Didesoxy-Verfahren und der Technologie, die von Sanger et al. entwickelt wurden (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 (1977), 5463) und dem M13-Clonierungs- und Sequenzierungs-Handbuch (Amersham (1983)) sequenziert. Es wurden der 17-mer Oligonucleotid-Primer α-³⁵SdATP (400Ci/mmol, Amersham) und die 0,5×-5× Puffer-Gradienten-Gele (Biggen, M. D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 50 (1983), 3963) verwendet. Die Gele wurden gelesen und über die Programme von Staden (Staden, R., Nucl. Acids Res. 10 (1982), 4731) in den Computer eingegeben. Sämtliche einschlägigen Literaturhinweise und geeigneten Verfahren können dem M13-Clonierungs- und Sequenzierungs-Handbuch von Amersham entnommen werden.
Die vollständige DNA-Sequenz von λJ19 (auch als LAV-Ia bezeichnet) ist in den 4 bis 4e dargestellt.
Die Sequenz wurde aus der Sequenz der Insertion des Phagen λJ19 rekonstruiert. Die Numerierung beginnt an der Cap-Stelle, die experimentell lokalisiert wurde (s. u.). Wichtige genetische Elemente, größere offene Leserahmen und ihre erwarteten Produkte sind zusammen mit den HindIII-Clonierungsstellen angegeben. Die potentiellen Glycosylierungs-Stellen im env-Gen sind oben mit einem Strich versehen. Die NH₂-terminale Sequenz von p25gag, die durch Protein-Micro-Sequenzierung bestimmt wurde, ist eingerahmt.
Jedes Nucleotid wurde im Durchschnitt 5,3 Mal sequenziert: 85% der Sequenz wurde an beiden Strängen bestimmt und der Rest mindestens zweimal in unabhängigen Clonen sequenziert. Die Basenzusammensetzung ist T, 22,2%; C, 17,8 %; A, 35,8%; G, 244,2%; G + C, 42% . Das Dinucleotid GC ist stark unterrepräsentiert (0,9%), wie dies bei eukaryoti- schen Sequenzen üblich ist (Bird 1980).
Die 5 und 6 liefern eine graphische Darstellung der Längen der aufeinander folgenden offenen Leserahmen, die den aufeinander folgenden Lesephasen entsprechen (auch mit den Zahlen "1", "2" und "3" bezeichnet, die auf der linken Seite von 5 erscheinen). Die relati ven Positionen dieser offenen Leserahmen (ORF) in bezug auf die Nucleotid-Struktur des LAV-Genoms werden durch die Reihe von Zahlen angegeben, die die jeweiligen Positionen der entsprechenden Nucleotide in der DNA-Sequenz wiedergeben. Die vertikalen Striche entsprechen den Positionen der jeweiligen Stoppcodons.
Die nachstehend beschriebenen Gene und DNA-Fragmente können auf den verschiedenen dargestellten Leserahmen unterschieden werden. Es wird anschließend auch auf die von die- sen Genen und Fragmenten codierten Proteine oder Glycoproteine Bezug genommen, insbesondere auf ORF-Sequenzen, beispielsweise ORF-Q und ORF-F.
Die Erfindung betrifft ferner offene Leserahmen liefernde DNA-Sequenzen, die als ORF-Q, ORF-F und als "1", "2", "3", "4" und "5" definiert werden, deren relative Positionen genauer in den 2 und 3 erscheinen.
Diese ORFs weisen die nachstehend dargestellten Positionen auf:
ORF-Q und –F
Man stellte am viralen (+)-Strang des LAV-Genoms fest, daß er obligatorische retrovirale Gene enthielt, die die Kernstrukturproteine (gag), die Reverse Transkriptase (pol) und das Hüll-Protein (env) codieren, und zwei weitere offene Leserahmen (ORF), die als Q und F bezeichnet werden (Tabelle 1). Die genetische Organisation von LAV, 5'-LTRgag-pol-Q-env-F-3'LTR, ist einmalig. Während in sämtlichen Replikations-kompetenten Retroviren die pol- und env-Gene überlappen, sind sie in LAV durch den ORF-Q (192 Aminosäuren), worauf vier kleine (< 100Triplets) ORFs folgen, getrennt. Der ORF-F. (206 Aminosäuren) überlappt leicht das 3'-Ende von env und ist deswegen bemerkenswert, daß er zur Hälfte durch die U3-Region des LTR codiert wird.
Eine derartige Struktur unterscheidet LAV klar von zuvor sequenzierten Retroviren (2). Der (–)-Strang ist. anscheinend nicht-codierend. Die weitere HindIII-Stelle des LAV-Clons λJ81 (bezüglich λJ19) läßt sich der anscheinend nicht-codierenden Region zwischen Q und env (Positionen 5166–5745) kartieren. In der Position 5501 beginnt eine Sequenz (AAGCCT), die sich durch eine einzelne Base (unterstrichen) von der HindIII-Erkennungssequenz unterscheidet. Es muß erwartet werden, daß viele der Restriktionsstellen-Polymorphismen zwischen verschiedenen Isolaten in dieser Region kartiert werden können. Der Clon λJ81 ist auch in der am 15. September 1984 eingereichten britischen Anmeldung mit der Nr. 84 23659 beschrieben worden.
Q und F
Die Nucleotid-Positionen ihrer jeweiligen Enden sind hier nachstehend in Tabelle 1 dargestellt.
Die Lage von ORF-Q ist in der Struktur von Retroviren ohne Vorbild. ORF-F ist dadurch einmalig, daß es zur Hälfte durch das U3-Element des LTR codiert wird. Beide ORFs weisen in der Nähe ihrer 5'-Enden "starke" Initiator-Codons auf (Kozak 1984) und können Proteine von 192 Aminosäuren (berechnetes MG = 22487) bzw. 206 Aminosäuren (berechnetes MG = 23316) codieren. Beide mutmaßlichen Proteine sind hydrophil (pQ 49% polar, 15,1% Arg + Lys; pF 46% polar, 11 Arg + Lys), und daher ist es unwahrscheinlich, daß sie direkt mit der Membran verbunden sind. Die Funktion der mutmaßlichen Proteine pQ und pF kann nicht vorhergesagt werden, da durch Absuchen von Proteinsequenz-Datenbanken keine Homologie festgestellt wurde. Zwischen ORF-F und dem pX Protein von HTLV-1 besteht keine nachweisbare Homologie. Ferner weichen ihre Hydrophobie/Hydrophilie-Profile stark voneinander ab. Es ist bekannt, daß Retroviren zelluläre Gene, besonders Proto-Oncogene (Weinberg 1982) transduzieren können. Es wird angenommen, daß ORF-Q und –F exogenes genetisches Material und nicht Überbleibsel von zellulärer DNA darstellen, da (I) LAV-DNA unter stringenten Bedingungen nicht an das menschliche Genom hybridisiert (Alizon et al., 1984), (II) ihre Codon-Verwendung mit der von gag-, pol- und env-Genen vergleichbar ist (Daten nicht dargestellt).
Die Organisation eines rekonstruierten LTR und f1ankierender viraler Elemente ist in 6 schematisch dargestellt. Der LTR ist 638 Bp lang und zeigt die üblichen Merkmale (Chen und Barker 1984): (I) Er wird durch einen invertierten Repeat "inverted repeat" (5'ACTG) gebunden, der die konservierten TG-Dinucleotide (Temin 1981) enthält, (II) zum 5'LTR benachbart ist die tRNA-Primer-Bindungsstelle (PBS), die zu tRNA lys / 3 komplementär ist (Raba et al., 1979), (III) ein perfekter 15 Bp Polypurin-Bereich ist dem 3'LTR benachbart. Den übrigen drei, zwischen den Nucleotiden 8200–8800 beobachteten Polypurin-Bereichen schließt sich keine Sequenz an, die zu der der PBS vorangehenden Sequenz komplementär ist. Die Grenzen der U5-, R- und U3-Elemente wurden, wie nachstehend beschrieben, bestimmt. US liegt zwischen PBS und der Polyadenylierungsstelle, was durch die Sequenz des 3'-Endes der Oligo(dT)-geprimeten LAV-cDNA (Alizon et al., 1984) nachgewiesen wurde. Daher ist U5 84 Bp lang. Die Länge von R + U5 wurde durch Synthese der tRNA-geprimeten LAV-cDNA bestimmt. Nach der alkalischen Hydrolyse des Primers wurde festgestellt, daß R + U5 eine Länge von 181 ± 1 Bp aufweisen. Daher ist R 97 Bp lang, und die Cap-Stelle an seinem 5'-Ende kann lokalisiert werden. U3 ist schließlich 456 Bp lang. Das LAV-LTR enthält auch charakteristische regulatorische Elemente: eine Polyadenylierungs-Signalsequenz AATAAA 19 Bp von der R-U5-Verbindung entfernt und die Sequenz ATATAAG, die sehr wahrscheinlich die TATA-Box ist, 22 Bp 5' von der Cap-Stelle entfernt. Es gibt keine weiteren direkten Repeats innerhalb des LTR. Interessanterweise zeigt der LAV-LTR einige Ähnlichkeiten zu dem des Maus-Brusttumor-Virus ((MMTV) Donehower et al., 1981). Sie verwenden beide tRNA lys / 3 als Primer zur (-) -Strangsynthese, während alle übrigen zur Zeit bekannten exogenen Säuger-Retroviren tRNA^pro verwenden (Chen und Barker 1984). Sie weisen sehr ähnliche Polypurin-Bereiche auf (der von LAV ist AAAAGRAAAGGGGGG, während der von MMTV AAAAAAGAAAAAGGGGG ist). Es ist wahrscheinlich, daß die virale (+)-Strangsynthese diskontinuierlich ist, da der das U3-Element vom 3'LTR flankierende Polypurin-Bereich als exaktes Duplikat am 3'-Ende vom ORF-pol bei 4331–4336 vorliegt. Ferner sind MMTV und LAV darin ungewöhnlich, daß das U3-Element einen ORF codieren kann. Bei MMTV enthält U3 den gesamten ORF, während in LAV U3 110 Codons der 3'-Hälfte von ORF F enthält.
Der lange endständige Repeat ("long terminal repeat"; LTR) von LAV ist in 6 graphisch dargestellt. Wie erwähnt, wurde der LTR aus der λJ19-Sequenz durch Nebeneinanderstellen der den HindIII-Clonierungsstellen benachbarten Sequenzen rekonstruiert.
Die Sequenzierung des Oligo(dT)-geprimeten LAV-DNA-Clons pLAV75 (Alizon et al., 1984) schließt die Möglichkeit von gehäuft auftretenden HindIII-Stellen in der R-Region von LAV aus. Die LTR werden durch eine "inverted repeat"-Sequenz (IR) begrenzt. Beide viralen Elemente, die den LTR flankieren, sind dargestellt worden, d. i. die tRNA-Primer-Bindungsstelle (PBS) am 5'LTR und der Polypurin-Bereich (PU) am 3'LTR. Eine mutmaßliche TATA-Box, die Cap-Stelle, das Po1yadenylierungs-Signal (AATAAA) und die Polyadenylierungs-Stelle (CAA) sind ebenso angegeben. Die Lage des offenen Leserahmens F (648 Nucleotide) ist oberhalb des LTR-Schemas dargestellt.
Die LTRs ("long terminal repeats") können auch durch ihre Lage zwischen der Position 8560 und der Position 160 (das Ende erstreckt sich über die Position 9097/1 hinaus) definiert werden. Das Ende des Genoms ist in der Tat bei 9097, und aufgrund der LTR-Struktur des Retrovirus ist es mit dem Sequenz-Anfang:
verbunden.
Tabelle 1 faßt die Lagen und Größen der viralen offenen Leserahmen zusammen. Die Nucleotid-Koordinaten beziehen sich auf die erste Base des ersten Tripletts (1. Triplett), des ersten Methionin-Initiationscodons (Met) und des Stop- Codons (Stop). Die Anzahl Aminosäuren und die berechneten Molekulargewichte sind diejenigen, abgesehen vom pol, bei denen sich die Größe und das MG auf die des gesamten ORF beziehen, die für unmodifizierte Vorläuferprodukte, vom ersten Methionin beginnend bis zum Ende, ermittelt worden sind.
Tabelle 1 Lage und Größen von viralen offenen Leserahmen
Die Erfindung betrifft insbesondere alle DNA-Fragmente, auf die hier vorstehend genauer Bezug genommen worden ist und die offenen Leserastern entsprechen. Es versteht sich von selbst, daß ein Fachmann fähig ist, sämtliche von ihnen zu erhalten, beispielsweise durch Spaltung einer vollständigen DNA, die dem gesamten Genom einer LAV-Art ent spricht, zum Beispiel durch deren partielle oder vollständige Spaltung mit einem geeigneten Restriktionsenzym und durch anschließende Gewinnung der betreffenden Fragmente. Die unterschiedlichen, vorstehend beschriebenen DNAs können auch als eine Quelle von geeigneten Fragmenten verwendet werden. Es können die Verfahren verwendet werden, die hier nachstehend zur Isolierung der Fragmente beschrieben werden, die zuvor in den hier vorstehend beschriebenen Plasmiden eingeschlossen waren und nachfolgend zur DNA-Sequenzierung verwendet wurden.
Selbstverständlich können auch andere Verfahren verwendet werden. Einige davon sind in der am 19. September 1984 angemeldeten britischen Patentanmeldung Nr. 8423659 beispielhaft dargestellt worden. Es wird beispielsweise auf die nachstehend beschriebenen Verfahren Bezug genommen:

a) DNA kann mit geeigneten Selektionsmarkern durch mehrere Verfahren in Säugerzellen transfiziert werden: z. B. Calciumphosphat-Präzipitation, Polyethylenglycol oder Protoplastfusion.
b) DNA-Fragmente, die Genen entsprechen, können in Expressionsvektoren für E. coli, Hefe- oder Säugerzellen cloniert und die erhaltenen Proteine gereinigt werden.
c) Die provirale DNA kann zur Erzeugung von fusio ierten Polypeptiden mit dem "shot-gun"-Verfahren (Fragmentierung) in prokaryotische Expressionsvektoren eingeführt werden. Rekombinant hergestellte, als Antigen kompetente Fusionsproteine können durch einfaches Absuchen der Rekombinanten mit anti-LAV-Antigen-Antikörpern identifiziert werden.

Die Erfindung betrifft ferner insbesondere DNA-Rekombinante, besonders modifizierte Vektoren, die eine der vorstehend beschriebenen DNA-Sequenzen einschließen, die zur Transformation entsprechender Mikroorganismen oder Zellen, insbesondere eukaryotischer Zellen, beispielsweise Hefen, zum Beispiel Saccharomyces cerevisiae, oder höherer eukaryotischer Zellen, insbesondere Säugerzellen, und zur Ermöglichung der Expression dieser DNA-Sequenzen in den entsprechenden Mikroorganismen oder Zellen angepaßt sind.
Insbesondere betrifft die Erfindung solche modifizierten rekombinanten DNA-Vektoren, die durch die vorstehend beschriebenen DNA-Sequenzen modifiziert wurden und die fähig sind, höhere eukaryotische Zellen, insbesondere Säugerzellen zu transformieren. Vorzugsweise wird eine der vorstehend beschriebenen Sequenzen unter die direkte Kontrolle eines Promotors gestellt, der in den Vektoren enthalten ist und der durch die Polymerasen der Zellen erkannt wird, so daß die ersten exprimierten Nucleotid-Codons den. ersten Tripletts. der vorstehend definierten DNA-Sequenzen entsprechen. Daher betrifft diese Erfindung auch die entsprechenden DNA-Fragmente, die durch ein geeignetes Verfahren aus LAV-Genomen oder entsprechenden cDNAs erhalten werden können. Ein derartiges Verfahren umfaßt beispielsweise die Spaltung der LAV-Genome oder cDNAs durch Restriktionsenzyme, vorzugsweise auf der Stufe der Restriktionsstellen, die die Fragmente umgeben und nahe an. ihren jeweiligen entgegengesetzten Enden liegen, die Gewinnung und Identifizierung der gesuchten Fragmente nach der Größe, falls erforderlich, eine Überprüfung ihrer Restriktionskarten oder Nucleotidsequenzen (oder durch eine Reaktion mit monoclonalen Antikörpern, die spezifisch gegen Epitope gerichtet sind, die von diesen von den DNA-Fragmenten codierten Polypeptiden getragen werden) und ferner, falls erforderlich, die Verkürzung der Enden der Fragmente, beispielsweise durch ein exonucleolytisches Enzym, zum Beispiel Bal31, zum Zweck der Kontrolle der gewünschten Nucleotidsequenzen der DNA-Fragment-Enden oder, umgekehrt, die Reparatur der Enden mit dem Klenow-Enzym und gegebenenfalls die Ligierung der letzteren an synthetische Polynucleotid-Fragmente, um die Rekonstitution der Nucleotid-Enden der Fragmente zu ermöglichen. Diese Fragmente können anschließend in einen der Vektoren inseriert werden, um die Expression des entsprechenden Polypeptids durch die damit transformierte Zelle zu bewirken. Das entsprechende Polypeptid kann anschließend aus den transformierten Zellen gewonnen werden, falls nach deren Lyse erforderlich, und durch Verfahren, beispielsweise die Elektrophorese, gereinigt werden. Es ist unnötig zu sagen, daß alle üblichen Verfahren zur Durchführung dieser Arbeitsschritte verwendet werden können.
Die Erfindung betrifft insbesondere auch clonierte Sonden, die ausgehend von jedem erfindungsgemäßen DNA-Fragment hergestellt werden können und somit rekombinante DNA-Moleküle, die solche Fragmente enthalten, insbesondere alle Plasmide, die in prokaryotischen oder eukaryotischen Zellen amplifizierbar sind und die Fragmente tragen.
Unter Verwendung der clonierten DNA-Fragmente als eine molekulare Hybridisierungs-Sonde – entweder durch Markierung mit Radionucleotiden oder mit fluoreszierenden Reagenzien – kann LAV-Virion-RNA im Blut; in Körperflüssigkeiten und Blutprodukten (z. B. von anti-hämophilen Faktoren wie Faktor VIII-Konzentraten) und in Impfstoffen, z. B. im Hepatis B-Impfstoff direkt nachgewiesen werden. Es ist schon dargestellt worden, daß das gesamte Virus in Kulturüberständen von LAV-produzierenden Zellen nachgewiesen werden kann. Ein geeignetes Verfahren, um diesen Nachweis zu erreichen, umfaßt die Immobilisierung des Virus auf einem Träger, z. B. unter anderem auf Nitrozellulose-Filtern, das Aufbrechen des Virions und die Hybridisierung mit markierten (radioaktiv-markierten oder "kalten" Fluoreszenz- oder Enzym-markierten) Sonden. Eine derartige Vorgehensweise ist bereits für das Hepatitis B-Virus im peripheren Blut entwickelt worden (gemäß Scotto, J. et al., Hepatology 3 (1983) , 379-384).
Erfindungsgemäße Sonden können auch zum schnellen Absuchen von genomischer DNA verwendet werden, die aus Gewebe von Patienten mit LAV-verwandten Symptomen stammt, um festzustellen, ob die provirale DNA oder RNA in Wirtsgeweben und weiteren Geweben vorhanden ist.
Ein für derartiges Absuchen verwendbares Verfahren umfaßt die nachstehend beschriebenen Schritte: Extraktion von DNA aus dem Gewebe, Restriktionsenzym-Spaltung der DNA, Elektrophorese der Fragmente und Southern-Blotting von geno mischer DNA aus Geweben, und anschließende Hybridisierung mit markierter, clonierter proviraler LAV-DNA. Eine Hybridisierung in situ kann auch verwendet werden.
Lymphatische Flüssigkeiten und Gewebe und weitere nicht-lymphatische Gewebe von Menschen, Primaten und anderen Säugerarten können auch abgesucht werden, um festzustellen, ob weitere evolutionär verwandte Retroviren existieren. Die vorstehend beschriebenen Verfahren können verwendet werden, obwohl Hybridisierung und Waschen unter nicht-stringenten Bedingungen durchgeführt werden würden.
Die erfindungsgemäßen DNAs oder DNA-Fragmente können auch zur Durchführung der Expression von viralen LAV-Antigenen zu diagnostischen Zwecken verwendet werden.
Die Erfindung betrifft allgemein die Polypeptide als solche, ohne zu unterscheiden, ob sie chemisch synthetisiert, aus viralen Präparationen isoliert oder durch die unterschiedlichen erfindungsgemäßen DNAs exprimiert werden, insbesondere durch die ORFs oder Fragmente davon, und zwar nach der Transformation mit einem geeigneten Vektor, der zuvor durch die entsprechenden DNA-Moleküle modifiziert worden ist in geeigneten Wirten, insbesondere in prokaryotischen oder eukaryotischen Wirten.
Die Erfindung betrifft generell auch jedes der Polypeptid-Fragmente (oder Moleküle, besonders Glycoproteine, die dasselbe Polypeptid-Rückrat, wie die hier vorstehend beschriebenen Polypeptide aufweisen), die ein für ein LAV-Protein oder Glycoprotein charakteristisches Epitop tragen, wobei das Polypeptid oder Molekül dann N-terminale bzw. C-terminale Enden aufweist, die frei oder unabhängig voneinander kovalent an Aminosäuren gebunden sind, die andere als die sind, die normalerweise in den größeren Polypeptiden oder Glycoproteinen der LAV-Viren mit ihnen verbunden sind, wobei die zuletzt beschriebenen Aminosäuren dann frei sind oder zu einer anderen Polypeptidsequenz gehören. Insbesondere betrifft die Erfindung Hybrid-Polypeptide, die hier vorstehend genauer beschriebenen Epitop-tragenden Polypeptide, rekombiniert mit anderen, normalerweise in den LAV-Proteinen fremden Polypeptid-Fragmenten enthalten, die Größen aufweisen, welche ausreichen, um eine erhöhte Immunogenität der Epitop-tragenden Polypeptide zu liefern, wobei die fremden Polypeptid-Fragmente entweder als Immunogen inert sind oder die immunogenen Eigenschaften der Epitop-tragenden Polypeptide nicht stören.
Derartige Hybrid-Polypeptide, die bis zu 150, und sogar 250 Aminosäuren enthalten, bestehen üblicherweise aus den Expressions-Produkten eines Vektors, der ab initio eine Nucleinsäure-Sequenz enthielt, die unter der Kontrolle eines geeigneten Promotors oder Replikons in einem geeigneten Wirt exprimierbar ist, wobei die Nucleinsäure-Sequenz jedoch zuvor durch Insertion einer DNA-Sequenz modifiziert worden war, die das Epitop-tragende Polypeptid codiert.
Die Epitop-tragenden Polypeptide, insbesondere die, deren N-terminale und C-terminale Aminosäuren frei sind, sind auch. durch chemische Synthese zugänglich, und zwar gemäß Verfahren, die in der Proteinchemie gut bekannt sind.
Die Synthese von Peptiden in homogener Lösung und in fester Phase ist gut bekannt.
Diesbezüglich kann auf das Syntheseverfahren in homogener Lösung zurückgegriffen werden, das von Houbenweyl in dem Werk mit dem Titel "Methoden der Organischen Chemie" Hrsg. E. Wunsch, Bd. 15-I und II, Thieme, Stuttgart 1974, beschrieben wurde.
Dieses Syntheseverfahren besteht aus einer schrittweisen Kondensierung von jeweils zwei einzelnen aufeinander folgenden Aminosäuren in der geeigneten Reihenfolge oder von zuvor verfügbaren oder hergestellten, aufeinander folgenden Peptidfragmenten, die schon mehrere Aminoacyl-Reste in der jeweilig richtigen Reihenfolge enthalten. Abgesehen von den Carboxyl- und Aminogruppen, die an der Bildung der Peptidbindungen beteiligt sind, muß Sorge dafür getragen werden, daß alle anderen reaktionsfähigen Gruppen, die von diesen Aminoacyl-Gruppen oder Fragmenten getragen werden, zuvor geschützt werden. Vor der Bildung der Peptidbindungen ist es jedoch vorteilhaft, die Carboxylgruppen gemäß den in der Peptidsynthese vertrauten Verfahren zu aktivieren. In einer anderen Ausführungsform kann auf Kupplungsreaktionen zurückgegriffen werden, die übliche Kupplungsreagenzien ins Spiel bringen, beispielsweise vom Carbodiimid-Typ, wie 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid. Wenn die verwendete Aminosäuregruppe eine weitere Aminogruppe (z. B. Lysin) oder eine weitere Säurefunktion (z. B. Glutaminsäure) trägt, können diese Gruppen durch Carbobenzoxy- oder t-Butyloxycarbonyl-Gruppen, bezüglich der Aminogruppen, oder durch t-Butylester-Gruppen, hinsichtlich der Carboxyl-Gruppen, geschützt werden. Ähnliche Verfahren sind zum Schutz von weiteren reaktiven Gruppen verfügbar. Es können beispielsweise SH-Gruppen (z. B. im Cystein) durch eine Acetamidomethyl- oder Paramethoxybenzyl-Gruppe geschützt werden.
Bei fortschreitender Synthese, Aminosäure für Aminosäure, beginnt die Synthese vorzugsweise durch die Kondensation der C-terminalen Aminosäure mit der Aminosäure, die der benachbarten Aminoacyl-Gruppe in der gewünschten Sequenz entspricht u.s.w., Schritt für Schritt, bis zur Nterminalen Aminosäure. Ein weiteres verläßliches, bevorzugtes Verfahren ist das von R. D. Merrifield in "Solid phase peptide synthesis" (J. Am. Chem. Soc., 45, 2149–2154) beschriebene.
Im Merrifield-Verfahren wird die erste C-terminale Aminosäure der Kette mit Hilfe ihrer Carboxylgruppe an ein geeignetes poröses, polymeres Harz fixiert, worauf die Aminogruppe der Aminosäure, beispielsweise durch eine t-Butyloxycarbonyl-Gruppe geschützt wird.
Wenn die erste C-terminale Aminosäure so an das Harz gebunden worden ist, wird die Schutzgruppe der Aminogruppe durch Waschen des Harzes mit einer Säure, d. h. Trifluoressigsäure, entfernt, falls die Schutzgruppe der Aminogruppe eine t-Butyloxycarbonyl-Gruppe ist.
Anschließend wird die Carboxylgruppe der zweiten Aminosäure, die die zweite Aminoacyl-Gruppe der gewünschten Peptidsequenz liefern soll, an die ungeschützte Aminogruppe der an das Harz gebunden, C-terminalen Aminosäure gekoppelt. Es ist vorzugsweise die Carboxylgruppe dieser zweiten Aminosäure aktiviert worden, beispielsweise durch Dicyclohexylcarbodiimid, während seine Aminogruppe geschützt worden ist, zum Beispiel durch eine t-Butyloxycarbonyl-Gruppe. Der erste Teil der gewünschten Peptidkette, der die ersten beiden Aminosäuren umfaßt, wird so erhalten. Wie vorstehend beschrieben, wird die Schutzgruppe der Aminogruppe anschließend entfernt, und es kann mit der Bindung der nächsten Aminoacyl-Gruppe und so weiter fortgefahren werden, bis das gesamte gewünschte Peptid erhalten wird.
Die Schutzgruppen der unterschiedlichen Seitengruppen (falls vorhanden) der so gebildeten Peptidkette können anschließend entfernt werden. Das gesuchte Peptid kann anschließend vom Harz gelöst werden, beispielsweise durch Fluorwasserstoffsäure, und schließlich nach üblichen Verfahren in reiner Form aus der Säurelösung gewonnen werden.
Hinsichtlich der Peptidsequenzen von kleinster Größe, die ein Epitop oder eine immunogene Determinante tragen, und insbesondere derjenigen, die durch chemische Synthese leicht zugänglich sind, kann es zur Erhöhung ihrer immunogenen in vivo Eigenschaften erforderlich sein, sie kovalent an ein physiologisch verträgliches und nicht-toxisches Träger-Molekül zu kuppeln oder zu konjugieren.
Als Beispiele von Träger-Molekülen oder macromoleku-laren Trägern, die zur Herstellung der erfindungsgemäßen Konjugate verwendet werden können, werden natürliche Proteine erwähnt, beispielsweise Tetanus-Toxoid, Ovalbumin, Serumalbumine und Hämocyanine. Synthetische macromolekulare Träger, beispielsweise Polylysine oder Poly(D-L-Alanin)poly(L-Lysin)-Moleküle können auch verwendet werden.
Weitere Arten von verwendbaren macromolekularen Trägern, die üblicherweise Molekulargewichte von mehr als 20000 aufweisen, sind aus der Literatur bekannt.
Die Konjugate können durch bekannte Verfahren synthetisiert werden, die beispielsweise von Frantz und Robertson in "Infect. and Immunity" 33.(1981), 193–198, oder von P. E. Kauffman in Applied and Environmental Microbiology, Oktober 1981, Bd. 42, Nr. 4, 611–614, beschrieben werden.
Es können beispielsweise die nachstehend genannten Kupplungs-Wirkstoffe verwendet werden: Glutaraldehyd, Ethylchlorkohlensäureester, wasserlösliche Carbodiimide (N-Ethyl-N'(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid, HCl), Diisocyanate, bis-Diazobenzidin, Di- und Trichlor-s-triazine, Bromcyane, Benzoquinon, genauso wie Kupplungs-Wirkstoffe, die in "Scand. J. Immunol." 8 (1978), 7–23, (Avrameas, Ternynck, Guesdon) erwähnt werden.
Es kann jedes Kupplungsverfahren zur Bindung einer oder mehrerer reaktiver Gruppen des Peptids auf der einen Seite, und einer oder mehrerer reaktiver Gruppen des Trägers auf der anderen Seite verwendet werden. Es ist erneut vorteilhaft, die Kupplung in Gegenwart eines in der Proteinsynthese verwendeten Kupplungs-Wirkstoffs, d. h. z. B. 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid oder N-Hydroxybenzotriazol, zwischen den Carboxyl- und Aminogruppen durchzuführen, die im Peptid und im Träger, oder umgekehrt, enthalten sind. Die Kupplung zwischen Aminogruppen, die jeweils im Peptid und im Träger enthalten sind, kann, wenn der Träger Hämocyanin ist, auch mit Glutaraldehyd, beispielsweise gemäß dem von Boquet, P. et al. Molec. Immunol. 19 (1982), 1441–1549, beschriebenen Verfahren erreicht werden.
Die Immunogenität von Epitop-tragenden Peptiden kann auch durch ihre Oligomerisierung, beispielsweise in Gegenwart von Glutaraldehyd oder eines anderen geeigneten Kupplungs-Wirkstoffs verstärkt werden. Insbesondere betrifft die Erfindung so erhaltene wasserlösliche immunogene Oligomere, die besonders 2 bis 10 monomere Einheiten umfassen.
Die Glycoproteine, Proteine und Polypeptide (üblicherweise hier nachstehend als erfindungsgemäße "Antigene" bezeichnet, unabhängig davon, ob sie in einem gereinigten Zustand aus LAV-Virus-Präparationen oder durch die rekombinante DNA-Technologie erhalten werden) sind in Verfahren zum Nachweis der Gegenwart von anti-LAV-Antikörpern in biologischen Medien nützlich, insbesondere biologischen Flüssigkeiten, beispielsweise Seren vom Menschen oder von Tieren, insbesondere mit Blick auf die mögliche Diagnose von LAS oder AIDS.
Insbesondere betrifft die Erfindung ein in vitro-Verfahren zur Diagnose unter Verwendung eines Hüll-Glycoproteins (oder eines Polypeptids, das ein Epitop dieses Glycoproteins trägt) zum Nachweis von anti-LAV-Antikörpern in Seren von Personen, die sie tragen. Andere Polypeptide – insbesondere die, die ein Epitop eines Kernproteins tragen – können auch verwendet werden.
Eine bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens umfaßt:

– Deponierung einer bekannten Menge eines oder mehrerer Antigene in den Vertiefungen einer Microtiterplatte;
– Einführung von ansteigenden Verdünnungen der biologischen Flüssigkeit, d. h. Serum zur Diagnose in diesen Vertiefungen;
– Inkubation der Microtiterplatte;
– Sorgfältiges Waschen der Microtiterplatte mit einem geeigneten Puffer;
– Zugabe von spezifischen, markierten Antikörpern gegen Immunglobuline des Blutes in die Vertiefungen; und
– Nachweis des gebildeten Antigen-Antikörper-Komplexes, der dann die Gegenwart von LAV-Antikörpern in der biologischen Flüssigkeit anzeigt.

Es ist vorteilhaft, die anti-Immunglobulin-Antikörper mit einem Enzym zu markieren, das aus denen ausgewählt wird, die zur Hydrolyse eines Substrat fähig sind, wobei das Substrat, wenigstens innerhalb eines bekannten Wellenlängenbereichs, eine Veränderung seiner Strahlungsabsorption erfährt. Der Nachweis des Substrats, vorzugsweise im Vergleich mit einer Kontrolle, liefert anschließend einen Meßwert der potentiellen Risiken oder des tatsächlichen Vorhandenseins der Krankheit.
Derartige bevorzugte Verfahren sind immunenzymatische- oder auch Immunfluoreszenz-Nachweise, insbesondere gemäß dem ELISA-Verfahren. Titrationen können durch Immunfluoreszenz oder direkte oder indirekte immunenzymatische Bestimmungen nachgewiesen werden. Quantitative Titrationen von Antikörpern in den untersuchten Seren können durchgeführt werden.
Die Erfindung betrifft auch Diagnose-Kits als solche zum in vitro Nachweis von anti-LAV-Virus-Antikörper, wobei die Kits neben irgendeinem der hier genannten Polypeptide und sämtlichen biologischen und chemischen Reagenzien auch die notwendige Ausstattung zur Durchführung diagnostischer Tests umfassen. Bevorzugte Kits umfassen sämtliche Reagenzien, die zur Durchführung der ELISA-Testserforderlich sind. Derart bevorzugte Kits werden neben einem der Polypeptide, auch geeignete Puffer und anti-Mensch Immunglobuline einschließen, wobei die anti-Mensch Immunglobuline entweder mit einem immunfluoreszenten Molekül oder einem Enzym markiert werden. Im letzten Fall umfassen bevorzugte Kits dann auch ein Substrat, das durch das Enzym hydrolisierbar ist und ein Signal liefert, insbesondere eine veränderte Absorption einer Strahlung, mindestens in einer bekannten Wellenlänge, wobei das Signal anschließend das Vorhandensein eines Antikörpers in der mit diesem Kit zu untersuchenden biologischen Flüssigkeit anzeigt.
Die unterschiedlichen erfindungsgemäßen Peptide können selber auch zur Produktion von Antikörpern, vorzugsweise monoclonalen Antikörpern, die für die jeweils unterschiedlichen Peptide spezifisch sind, verwendet werden. Zur Herstellung von Hybridomen, die die monoclonalen Antikörper sekretieren, werden übliche Herstellungs- und Absuchverfahren verwendet. Diese monoclonalen Antikörper, die selbst Teil der Erfindung sind, liefern dann sehr nützliche Werkzeuge zur Identifizierung und selbst zur Bestimmung der relativen Verhältnisse der unterschiedlichen Polypeptide oder Proteine in biologischen Proben, insbesondere Proben vom Menschen, die LAV oder verwandte Viren enthalten.
Die Erfindung betrifft ferner Wirte (prokaryotische oder eukaryotische Zellen), die durch die vorstehend bebeschriebenen Rekombinanten transformiert sind und die fähig sind, die DNA-Fragmente zu exprimieren.
Schließlich betrifft die Erfindung auch Vektoren zur Transformation von eukaryotischen Zellen menschlichen Ur- sprungs, insbesondere von Lymphocyten, deren Polymerasen fähig sind, die LTRs von LAV zu erkennen. Insbesondere sind die Vektoren durch die Gegenwart eines darin enthaltenden LAV-LTR gekennzeichnet, wobei der LTR dann als ein Promotor aktiv ist, der unter seiner Steuerung in einem geeigneten Wirt die wirksame Transkription und Translation einer ein bestimmtes Protein codierenden DNA-Insertion ermöglicht.
Literaturhinweise

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Claims

Gereinigtes pol-Antigen mit dem Gerüst des Polypeptids, das von der nucleotidischen Sequenz codiert wird, die sich von Nucleotidposition 1631 bis Nucleotid 4639 des in 4 dargestellten LAV-Virusgenoms erstreckt, oder ein Antigen mit dem gleichen Polypeptid-Gerüst und dessen Aminosäuresequenz in der Sequenz in 4 enthalten ist, die sich von Nucleotidposition 1631 bis 4639 erstreckt, oder ein Polypeptid, das gemeinsame Sequenzen mit dem Antigen enthält, das von der nucleotidischen Sequenz codiert wird, die sich von Nucleotidposition 1631 bis 4639 erstreckt, mit der Maßgabe, dass das Polypeptid ein Epitop aufweist, das im Wesentlichen die gleichen immunologischen Eigenschaften wie das LAV-pol-Antigen hat.
Gereinigte DNA, die das pol-Antigen nach Anspruch 1 codieren kann, wobei sich die gereinigte DNA von dem Fragment unterscheidet, das zwischen der KpnI-Stelle (3500) und der Bg/II-Stelle (6500) liegt, wie in der Restriktionskarte in 3 gezeigt.
Gereinigte DNA mit einer nucleotidischen Sequenz, die sich von Nucleotid 1631 bis Nucleotid 4639 der nucleotidischen Sequenz des in 4 dargestellten LAV-Genoms erstreckt.
DNA-Fragment, das in einer DNA-Sequenz nach Anspruch 3 enthalten ist, dadurch gekennzeichnet, dass es ein Polypeptid codiert, das ein Epitop enthält, welches spezifisch von monoclonalen Antikörpern erkannt wird, die gegen das entsprechende Antigen nach Anspruch 1 gerichtet sind, und wobei das DNA-Fragment nicht das Fragment ist, das wie in der in 3 gezeigten Restriktionskarte zwischen der KpnI-Stelle (3500) und der Bg/II-Stelle (6500) liegt.
DNA-Sequenz, dadurch gekennzeichnet, dass sie unter stringenten Bedingungen mit einer DNA-Sequenz nach Anspruch 3 hybridisiert und das vollständige pol-Antigen codiert.
Polypeptidfragment, das ein Epitop trägt, das charakteristisch für ein Antigen nach Anspruch 1 ist.
Polypeptidfragment nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass es eine immunogene Determinante trägt.
Polypeptidfragment nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass es mit einem physiologisch verträglichen und nicht-toxischen Trägermolekül kovalent verknüpft ist, um seine immunogene Eigenschaft in vivo zu steigern.
Polypeptidfragment nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass es in oligomerisierter Form vorliegt.
DNA-Hybridisierungssonde, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine DNA-Sequenz nach Anspruch 4 umfasst, wobei die Sequenz markiert ist.
Rekombinanter Vektor, dadurch gekennzeichnet, dass er eine DNA-Sequenz nach Anspruch 2 umfasst.
Mikroorganismus oder Zelle, bevorzugt eukaryontische Zelle, die mit einem Vektor nach Anspruch 11 unter Bedingungen transformiert ist, welche die Expression der DNA-Sequenz in dem Mikroorganismus erlauben, die in dem Vektor enthalten ist.
Mikroorganismus nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass er aus eukaryontischen Zellen, bevorzugt Säugerzellen oder Hefen, ausgewählt ist.
Antikörper, dadurch gekennzeichnet, dass er spezifisch ein Antigen nach Anspruch 1 erkennt.
Antikörper nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass er ein monoclonaler Antikörper ist.
Verfahren zur chemischen Synthese eines Peptids oder eines Polypeptids nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch: – schrittweises Kondensieren der aufeinanderfolgenden Aminosäuren in Zweiergruppen in der richtigen Reihenfolge bereits vorhandener bzw. gebildeter Peptidfragmente an aufeinanderfolgende Peptidfragmente, die bereits verschiedene Aminoacylreste in der jeweils richtigen Reihenfolge enthalten, wobei alle reaktiven Gruppen außer den an der Bildung der Peptidbindung beteiligten Carboxyl- und Amino-Gruppen geschützt sind, – möglicherweise Aktivieren der Carboxylgruppen vor der Bildung der Peptidbindung, – Gewinnen des gebildeten Peptids oder Polypeptids.
Verfahren zur Herstellung des Antigens nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch: – Transformieren eines prokaryontischen oder eukaryontischen Wirts mit einem geeigneten Vektor nach Anspruch 11, der zuvor durch eine DNA unter Bedingungen modifiziert wurde, welche die Herstellung des gewünschten Peptids erlauben, – Gewinnen und Reinigen des so erhaltenen Antigens, z. B. durch Elektrophorese.
Verfahren zum Nachweis der Anwesenheit von anti-LAV-Antikörpern in einem biologischen Medium, umfassend Inkontaktbringen des biologischen Mediums mit dem Polypeptid nach Anspruch 1 unter Bedingungen, die geeignet sind, eine Komplexbildung zwischen den Antikörpern und dem herzustellenden Polypeptid zu ermöglichen, und Nachweisen des Komplexes als Hinweis auf die Anwesenheit von Antikörpern in der biologischen Flüssigkeit.
Verfahren zum Nachweis von LAV-proviraler DNA in einer biologischen Probe, umfassend: - Extrahieren von DNA aus der Probe, - Spalten der extrahierten DNA durch Restriktionsenzym-Spaltung, – Elektrophorese der durch die obige Spaltung erhaltenen Fragmente und Durchführen eines Southern-Blots mit der genomischen DNA, – Hybridisieren der Fragmente nach der Elektrophorese und dem Southern-Blot mit einer markierten Sonde, die eine DNA nach einem der Ansprüche 2 bis 5 umfasst; - Erhalt der hybridisierten Fragmente.
Verwendung der Antikörper nach Anspruch 14 oder 15 zum Nachweis eines Antigens nach Anspruch 1 oder auch zur Bestimmung des relativen Anteils des Antigens in einer biologischen Probe, die LAV oder einen verwandten Virus enthält.
Verfahren zur Herstellung von monoclonalen Antikörpern gegen ein nach Anspruch 1 bestimmtes Antigen, umfassend die Schritte: – Fusionieren von Myelomzellen mit Splenocyten eines zuvor mit diesem Antigen immunisierten Tiers, um Hybridome zu erhalten, – Auswählen der Hybridome, welche Antiköper mit Spezifität für das bei der Immunisierung verwendete Antigen haben, – Gewinnen der Antikörper gegen das bestimmte Antigen.
Verfahren zum Nachweis einer Nucleinsäure, die mit einer Nucleotidsequenz nach einem der Ansprüche 2 bis 5 hybridisiert, wobei die DNA nach einem der Ansprüche 2 bis 5 als Hybridisierungssonde verwendet wird.