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LAV-Antigene und -Peptide
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Die vorliegende Erfindung betrifft
Antigene des Lymphadenopathie-Virus (nachstehend abkürzend als LAS
bezeichnet) und des erworbenen Immunschwäche-Syndrom (nachstehend abkürzend als
AIDS bezeichnet) verursachenden Virus, insbesondere in gereinigter
Form und ein Verfahren zur Herstellung dieser Antigene, insbesondere
der Hüll-Antigene dieser Viren.
Die Erfindung betrifft auch glycosylierte und nicht-glycosylierte
Polypeptide, die durch diese DNA-Sequenzen codiert sind.
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Der Erreger von LAS oder AIDS, ein
Retrovirus, ist von Barre-Sinoussi, F. et al., Science 220 (1983), 868,
identifiziert worden. Es weist die nachstehend beschriebenen Eigenschaften
auf. Es ist T-lymphotrop, und es befällt bevorzugt Leu 3-Zellen
(oder T4-Lymphocyten). Es weist eine Reverse-Transkriptase-Aktivität auf, für die die
Gegenwart von Mg2+ erforderlich ist, und
eine starke Affinität
für Poly(Adenylat-oligodesoxy-Thymidylat)(poly(A)-oligo(dT)
12–18).
Es weist eine Dichte von 1,16 bis 1,17 in einem Sucrose-Gradienten
auf, einen durchschnittlichen Durchmesser von 139 Nanometer und
einen Kern mit einem durchschnittlichen Durchmesser von 41 Nanometern.
Virus-Antigene, besonders ein p25-Protein werden immunologisch von
Antikörpern erkannt,
die in Seren enthalten sind, die von an LAS oder AIDS leidenden
Patienten stammen. Das p25-Protein, das ein Kern-Protein ist, wird
vom p24-Protein der HTLVI- und -II-Viren immunologisch nicht erkannt.
Ferner fehlt dem Virus ein p19-Protein, das mit den HTLVI- und HTLVII-p19-Proteinen
eine immunologische Kreuzreaktion zeigt.
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Retroviren diesen Typs (gelegentlich
wird abkürzend die übergeordnete
Bezeichnung LAV verwendet) sind bei der "National Collection of Micro-organism
Cultures" des INSTITUT
PASTEUR in Paris unter den Nummern I-232, I-240 und I-241 hinterlegt
worden. Virusstämme,
die unter dem morphologischen und immunologischen Gesichtspunkt
dem LAV in jeder Hinsicht gleichen, sind in anderen Laboratorien
isoliert worden. Es wird auf die Retrovirusstämme, die als HTLV-III bezeichnet
werden und von Gallo, R. C. et al., Science 224 (1984), 500, bzw.
Sarngadharan, M. G. et al., Science 224 (1984), 506, isoliert wurden,
und. auf das als ARV bezeichnete Retrovirus, das von M. Jay Levy
et al., Science 225 (1984), 840–842,
isoliert wurde, beispielhaft Bezug genommen. Zur sprachlichen Vereinfachung
erhalten die zuletzt erwähnten
Viren neben anderen mit entsprechenden morphologischen und immunologischen
Eigenschaften hier nachstehend die übergeordnete Bezeichnung "LAV". Es wird hinsichtlich
der genaueren Beschreibung der LAV- oder ähnlicher Retroviren und der
Verwendungen der Extrakte dieser Viren auf die am 14. September
1984 eingereichte europäische
Patentanmeldung hingewiesen, die die Priorität der am 15. September 1983
eingereichten britischen Patentanmeldung mit der Nummer
83
24800 in Anspruch nimmt.
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Anfänglich waren die Kern-Antigene
in den damals verwendeten Testsystemen die Haupt-Antigene der Virus-Lysate
oder Extrakte, die durch Seren von mit AIDS oder LAS infizierten
Patienten erkannt wurden. Ein p42-Protein, das als aus einem Hüll-Protein
bestehend dargestellt wurde, ist ebenfalls nachgewiesen worden.
In derselben Weise beschrieben Gallo et al. ein p41-Protein, von
dem auch angenommen wurde, eventuell ein Bestandteil der Virus-Hülle zu sein.
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Es sind auch Verfahren zum Erhalt
eines LAV-Virus beschrieben worden. Es kann im Hinblick auf die Herstellung
des Virus in T-Lymphocyten-Kulturen, die entweder von Blut, der
Nabelschnur oder auch den Knochenmarkszellen von erwachsenen Spendern
in gutem Gesundheitszustand abstammen, besonders auf den schon erwähnten Artikel
von F. Barre-Sinoussi
et al. Bezug genommen werden. Dieses Verfahren um faßt besonders
die nachstehend beschriebenen wesentlichen Schritte:
- – Herstellung
einer viralen Infektion dieser T-Lymphocyten
nach der Aktivierung durch ein Lectin-Mitogen mit einer Virus-Suspension,
die von einer unbehandelten Überstandsflüssigkeit
von Lymphocyten stammt, die das Virus produzieren (ursprünglich von
einem mit AIDS oder LAS infizierten Patienten erhalten)
- – Züchtung von
mit TCGF infizierten Zellen in Gegenwart von anti-α-Interferon-Schafserum,
- – Durchführung einer
Reinigung des erzeugten Virus (die Produktion beginnt üblicherweise
zwischen dem 9. und dem 15. Tag nach der Infektion und dauert zwischen
10 und 15 Tagen), wobei die Reinigung zum Erhalt einer ersten Konzentrierung
des Virus die Ausfällung
des Virus in Polyethylenglycol umfaßt, im Anschluß daran
eine Zentrifugation des erhaltenen Präparats in einem 20–60% Sucrose-Gradienten
oder einem isotonischen Metrizanid-Gradienten (unter dem Warenzeichen
Nycodenz von Nyegaard, Oslo, im Handel erhältlich) und die Gewinnung des
Virus mit der Bande, die eine Dichte von 1,16 bis 1,17 im Sucrose-Gradienten
oder von 1,10 bis 1,11 im Nycoden® Gradienten
aufweist.
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Das LAV-Virus kann auch von permanenten
Zellinien des
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Typs T, zum Beispiel der CEM-Zellinie
oder von B-Lymphoblastoid-Zellinien produziert werden, die zum Beispiel
durch Transformation der von einem gesunden Spender stammenden Lymphocyten
mit dem Epstein-Barr-Virus erhalten werden, wie dies beispielsweise
in der am 9. Mai 1984 eingereichten französischen Patentanmeldung Nr.
84 07151 offengelegt ist. Die erhaltenen permanenten Zellinien produzieren
kontinuierlich ein Virus (bei B-Lymphoblastoid-Zellinien als LAV-B bezeichnet), das
die wichtigsten antigenen und morphologischen Merkmale der LAV-Viren
besitzt (abgesehen davon, daß es
gelegentlich in einer Bande mit etwas höherer Dichte als im vorstehenden
Fall (genauer 1,18) in Sucrose erhalten wird). Die Endreinigung
des Virus kann auch in einem Nycodenz®-Gradienten
durchgeführt
werden.
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Es wird auf den Artikel von Schüpbach et
al., Science 224 (4. Mai 1984), 503–505, hingewiesen. Dieser Artikel
beschreibt eine Untersuchung im Hinblick auf verschiedene Antigene
des HTLV-III-Retrovirus.
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Es werden Ergebnisse vorgestellt,
die einen Hinweis auf ein Antigen enthalten, das auf einem Elektrophoresegel
eine Laufstrecke zurücklegte,
die einem Molekulargewicht von etwa 110000 entsprach.
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Schupbach et al. erwähnten, daß dieses
Antigen in einer Virus-Präparation
nachgewiesen wurde, in den Zellen jedoch unterhalb der Nachweisgrenze
lag.
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Ein Verfahren zur Clonierung von
DNA-Sequenzen, die mit der genomischen LAV-RNA hybridisierbar sind,
ist bereits in der am 19. September 1984 eingereichten britischen
Patentanmeldung
84 23659 offengelegt worden. Nachstehend
wird hinin
EP-A-0 178 978 beschrieben worden. Nachstehend
wird hinsichtlich des gemeinsamen Gegenstands mit den weiteren Verbesserungen
in der hier beschriebenen Erfindung auf diese Anmeldung Bezug genommen.
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Die Erfindung zielt ab auf die Bereitstellung
gereinigter, unveränderter
Virusformen (der Viren, die durch die verwendeten Reinigungsverfahren
weniger verändert
wurden) und Verfahren zum Erhalt der unveränderten, gereinigten Viren.
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Die vorliegende Erfindung zielt darüber hinaus
auf die Bereitstellung weiterer neuer Verfahren, die neben ihrer
Nützlichkeit
zum Nachweis von LAV oder verwandten Viren (hier nachstehend allgemeiner
als "LAV-Viren" bezeichnet), auch
eine größere Vielseitigkeit,
insbesondere beim Nachweis bestimmter Teile der genomischen DNA
der Viren, deren Expressionsprodukte durch immunologische Verfahren
nicht immer direkt nachweisbar sind. Die vorliegende Erfindung zielt
darüber
hinaus auf die Bereitstellung von Polypeptiden, die Sequenzen enthalten,
die mit antigene Determinanten umfassenden Polypeptiden übereinstimmen,
die in den durch das natürlich
vorkommende LAV-Genom codierten und exprimierten Proteinen enthalten
sind. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ferner die Bereitstellung
von Verfahren. zum Nachweis von mit LAV-Viren verwandten Proteinen,
besonders zur Diagnose von AIDS oder Prä-AIDS oder, im Gegensatz dazu,
zum Nachweis von Antikörpern
gegen das LAV-Virus oder mit ihm verwandten Proteinen, besonders
in Patienten, die an AIDS oder Prä-AIDS leiden, oder allgemeiner
in asymptomatischen Trägern
und in blutverwandten Produkten. Schließlich betrifft die Erfindung
auch die Bereitstellung immunogener Polypeptide, und insbesondere
schützender
Polypeptide zur Verwendung in der Herstellung von Impfstoff-Zusammensetzungen
gegen AIDS oder verwandte Syndrome.
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Die vorliegende Erfindung betrifft
weitere, mit der genomischen LAV-RNA hybridisierbare DNA-Fragmente,
wie hier nachstehend beschrieben, ebenso wie weitere cDNA-Varianten,
die den gesamten LAV-Virus-Genomen entsprechen. Sie betrifft weiter
rekombinante DNAs, die die DNAs oder cDNA-Fragmente enthalten.
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Ein unverändertes, gereinigtes LAV-Retrovirus
unterscheidet sich von den vorstehend definierten durch einen Gehalt
an einem oder mehreren Hüll-Antigenen,
der zur Sichtbarmachung ausreicht, wenn das Virus mit 35S-Cystein,
ohne nicht-markiertes Cystein, in einem Verhältnis von 200 Microcurie pro
ml Medium markiert wird. Von diesen Antigenen werden in vitro durch
Seren von Patienten, die an AIDS oder SLAs leiden, oder durch Seren
von asymptomatischen Trägern
des Virus besonders Glycoproteine selektiv erkannt.
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Ein bevorzugtes Antigen gemäß der vorstehenden
Definition, das aus einem Lysat dieses Virus erhältlich ist (oder durch vorsichtiges
Reinigen der 'Virus-Hüllen), ist
ein Glycoprotein, das ein Molekulargewicht in der Größenordnung
von 110000 Dalton aufweist, wie durch einen Vergleich seiner Laufstrecke
mit den Laufstrecken von Standardproteinen, die bekannte Molekulargewichte
aufwiesen, im selben Laufsystem festgestellt wurde. Insbesondere
wurden vergleichende Messungen 18 Stunden bei einer Spannung von
18 V auf einem 12,5% Polyacrylamidgel durchgeführt, wobei die nachstehend
aufgeführten
Standardproteine (Vertrieb durch Amersham) verwendet wurden:
- – Lysozym-(14C)-Methyl (MG: 14300),
- – Kohlendioxid-(14C)-Methyl (MG: 30000),
- – Ovalbumin-
(14 C)-Methyl (MG: 46000),
- – Rinderserumalbumin-(14C)-Methyl (MG: 69000),
- – Phosphorylase
b-(14C)-Methyl (MG: 92500),
- – Myosin-
(14C)-Methyl (MG: 200000).
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Die Erfindung betrifft auch die Antigene
selber, besonders das mit einem Molekulargewicht von etwa 110000-120000, das auch
die Eigenschaft aufweist, durch Seren von Patienten, die an AIDS
oder LAS leiden, oder durch Seren von Personen erkannt zu werden,
die den LAV-Viren oder ihren Analoga ausgesetzt worden waren. Diese
Antigene weisen weiter die Eigenschaft auf, mit Concanavalin A Komplexe
zu bilden, wobei der Komplex in Gegenwart von O-Methyl-α-D-mannopyranosid
dissoziierbar ist. Die erfindungsgemäßen Antigene können auch
andere, zum Beispiel unter dem Namen "Linsen-Lectin" bekannte Lectine binden. Das bevorzugte
erfindungsgemäße Antigen
mit einem Molekulargewicht von 110000 ist auch empfindlich gegen
die Wirkung von Endoglycosidasen. Diese Wirkung wird durch das aus
dem Antigen mit einem Molekulargewicht von 110000 hergestellte Protein
deutlich, das ein Molekulargewicht in der Größenordnung von 90000 aufweist,
wobei letzteres beispielsweise durch Immunpräzipitation oder Trennung unter
Verwendung der Unterschiede in den Molekulargewichten (unterschiedliche
Laufstrecken auf einem Gel) abtrennbar ist.
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Bevorzugte erfindungsgemäße Antigene
werden von Glycoproteinen gebildet.
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Die Erfindung betrifft auch das Verfahren
zur Herstellung der erfindungsgemäßen Viren. Dieses Verfahren
unterscheidet sich wesentlich von den vorstehend beschriebenen auf
der Stufe des abschließenden Reinigungsschrittes.
Der Reinigungsschritt des erfindungsgemäßen Verfahrens wird insbesondere
nicht weiter in Gradienten durchgeführt, sondern schließt die Durchführung von
Differential-Zentrifuga- tionen ein, die direkt mit den Überständen der
Kulturmedien der produzierenden Zellen durchgeführt werden. Diese Zentrifugations-Verfahren
umfassen besonders eine erste Zentrifugation bei einer Winkelgeschwindigkeit
der Zentrifugation, besonders bei 10000 UpM, die die Entfernung
von nicht-viralen Bestandteilen, insbesondere von zellulären Bestandteilen
ermöglicht,
und anschließend
eine zweite Zentrifugation bei einer höheren Winkelgeschwindigkeit,
besonders bei 45000 UpM, um den eigentlichen Virus-Niederschlag zu erhalten.
In bevorzugten Ausführungsformen
wird in der ersten Zentrifugation 10 Minuten mit 10000 UpM und in
der zweiten 20 Minuten mit 45000 UpM zentrifugiert. Dies sind natürlich nur
Orientierungswerte, wobei es sich versteht, daß es der Fähigkeit des Spezialisten überlassen
bleibt, zur Trennung der zellulären
und der viralen Bestandteile die Zentrifugations-Bedingungen zu
modifizieren.
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Diese Modifikation des Reinigungsverfahrens
hat die Herstellung von viralen Präparationen zur Folge, aus denen
das erwähnte
Antigen leichter als aus Virus-Präparationen gewonnen werden
kann, die durch die früher
verwendeten Verfahren gereinigt wurden. Auf jeden Fall werden die
schließlich
durch das erfindungsgemäße Verfahren
erhaltenen Viren durch Seren von Patienten oder Personen, die dem
LAV-Virus oder morphologisch
und hinsichtlich der Antigenität ähnlichen
Stämmen
ausgesetzt worden sind, leichter erkannt.
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Die erfindungsgemäßen Antigene selber können aus
den vorstehend beschriebenen Viren durch deren Lyse (oder andere
geeignete Verfahren) in Gegenwart eines geeigneten Detergens und
durch Gewinnung und Trennung der freigesetzten Antigene erhalten
werden. Die Lyse des Virus wird vorzugsweise in Gegenwart von Aprotinin
oder einem anderen zur Hemmung der Protease-Wirkung geeigneten Wirkstoff
durchgeführt.
Die Trennung der erfindungsgemäßen Antigene
kann anschließend
durch irgendein bekanntes Verfahren durchgeführt werden; beispielsweise
ist es möglich,
eine Trennung der Proteine aufgrund ihrer jeweiligen unterschiedlichen
Laufstrecken in meinem vorgegebenen Gel durchzuführen, worauf das gesuchte Protein
aus der Zone des Gels isoliert wird, in der es bei streng festgelegten
Bedingungen unter Berücksichtigung
seines Molekulargewichts nach der Durchführung einer Elektrophorese üblicherweise
gefunden wird. Die erfindungsgemäßen Antigene
können
jedoch aufgrund ihrer Affinität
für Lectine,
insbesondere Concanavalin A oder Linsen-Lectin, vom Lysat der vorstehend
beschriebenen Viren abgetrennt werden. Das verwendete Lectin wird vorzugsweise
auf einem festen Träger,
zum Beispiel dem quervernetzten, aus Agarose stammenden und unter dem
Warenzeichen Sepharose vertriebenen Polymer immobilisiert. Nach
dem Waschen der gebundenen Antigene mit einem geeigneten Puffer
können
die Antigene in einer geeigneten Weise, besonders durch Verwendung
von gelöstem
O-Methyl-α-D-mannopyranosid
eluiert werden.
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Eine sorgfältigere Reinigung dieser Antigene
kann durch Immunpräzipitation
mit Seren von Patienten durchgeführt
werden, von denen bekannt ist, daß sie gegen dieses Protein
wirksame Antikörper
aufweisen, mit konzentrierten Antikörper-Präparationen (polyclonalen Antikörpern) oder
erneut mit insbesondere gegen das erfindungsgemäße Antigen gerichteten monoclonalen
Antikörpern,
insbesondere gegen das mit dem Molekulargewicht von 110000, das
nachstehend durch die Abkürzung
gp110 bezeichnet wird.
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Weitere Eigenschaften der Erfindung
werden auch bei der nachstehenden Beschreibung der Isolierung eines
erfindungsgemäßen Virus
und von Antigenen beschrieben, insbesondere eines Kapsel-Antigens des
Virus. Es wird auf die Figuren Bezug genommen, wobei:
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1 eine
Kopie einer photographischen Reproduktion von Gelspuren darstellt,
die zur Durchführung von
Elektrophoresen von Lysatextrakten von T-Lymphocyten verwendet wurden,
die durch eine LAV-Suspension infiziert bzw. nicht-infiziert (Kontrollen)
worden waren;
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2 die
Restriktionskarte eines vollständigen
LAV-Genoms (Clon λJ19)darstellt;
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3a bis 3e die vollständige Sequenz
eines viralen LAV-Genoms darstellen;
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4 und 5 Teile der drei möglichen
Lesephasen der genomischen LAV-RNA als Diagramm darstellen, einschließlich der
offenen, in jedem der Lesephasen erscheinenden Leseraster (ORF);
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6 eine
schematische Darstellung der langen LAV-terminalen Wiederholung
(LTR) ist.
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I – Herstellung
des Virus und der Antigene
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T-Lymphocyten, die von einem gesunden
Spender stammten und mit LAV1 unter den von F. Barre-Sinoussi et
al. beschriebenen Bedingungen auf CEM-Zellen infiziert worden waren,
die von einem an Leukämie leidenden
Patienten stammten und auch in vitro mit LAV1 infiziert worden waren,
wurden in einem Medium gezüchtet,
das 200 Microcurie 35S-Cystein enthielt
und dem nicht-markiertes Cystein fehlte. Die infizierten Lymphocyten
wurden in einem nicht-denaturierenden Medium gezüchtet, um den Abbau des gesuchten
Antigens zu verhindern. Im Anschluß daran wurde mit der Überstandsflüssigkeit
des Kulturmediums zur Entfernung der nichtviralen Bestandteile eine
erste Zentrifugation von 10 Minuten bei 10000 UpM und danach zur
Sedimentierung des Virus eine zweite Zentrifugation von 20 Minuten
bei 45000 UpM durchgeführt.
Das Virus-Pellet wurde anschließend
in Gegenwart von Aprotinin (5%), insbesondere unter den im Artikel
von F. Barre-Sinoussi et. al. beschriebenen Bedingungen durch Detergens
lysiert.
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Dasselbe Verfahren wurde an Lymphocyten
wiederholt, die als Kontrolle aus einem gesunden Spender gewonnen
worden waren.
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Die verschiedenen Lysate wurden anschließend durch
Seren von Patienten, die an AIDS oder LAS litten, immunpräzipitiert.
Seren, die von gesunden Spendern oder von mit anderen Krankheiten
infizierten Spendern stammten, wurden ebenfalls immunopräzipitiert.
Mit den Medien wurde anschließend
in einem SDS-Polyacrylamidgel eine Elektrophorese durchgeführt.
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Die Ergebnisse sind in 1 dargestellt. Die von 1
bis 6 numerierten Gelspuren wurden von Präparationen erhalten, die mit 35S-Cystein markiert worden waren. Die Spuren
mit den Nummern 7 bis 10 zeigen Ergebnisse, die an infizierten und
nicht-infizierten, mit 35S-markierten Lymphocyten-Präparationen.
beobachtet wurden Die Spur M entspricht schließlich den Laufstrecken der
vorstehend identifizierten Standardproteine, deren Molekulargewichte
im rechten Teil der Figur angegeben sind.
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Die Bezeichnung der markierten viralen
Proteine erscheint im linken Teil der Figur.
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Es ist zu beobachten, daß die Spuren
7 und 9 das spezifische, mit 35S-Methionin
markierte LAV-Protein p25 zeigen. Die Abwesenheit des gleichen Proteins
auf den Spuren 8 und 1.0 entspricht den Ergebnissen, die an einer
von gesunden Lymphocyten stammenden Präparation erhalten wurden.
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Die Spuren 3 und 5 entsprechen den
Ergebnissen, die an Präparationen
von infizierten und mit 35S-Cystein markierten
Lymphocyten erhalten wurden. Die Proteine p25 und p18, die charakteristischen
Kernproteine von LAV, und das auch für LAV spezifische Glycoprotein
gp110 waren ebenfalls vorhanden. Abbildungen, die einem Protein
p41 entsprechen (Molekulargewicht der Größenordnung 41000) erschienen,
obgleich weniger deutlich, in den verschiedenen Präparationen.
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Das erfindungsgemäße Virus und das erfindungsgemäße Antigen
können
entweder durch Lectine, besonders Concanavalin A ausgefällt oder
an eine Sepharose-Concanavalin A-Säule gebunden
werden. Insbesondere die Reinigung der Hüll-Glycoproteine kann wie nachstehend beschrieben
durchgeführt
werden. Diese Bindung kann insbesondere durch Inkontaktbringen eines
in einem geeigneten Puffer gelösten
Lysats des LAV-Virus mit an Sepharose
® gebundenem
Concanavalin A durchgeführt
werden. Ein geeigneter Puffer weist die nachstehend beschriebene
Zusammensetzung auf:
Tris | 10
mM |
NaCl | 0,15
M |
CaCl2 | 1
mM |
MgCl2 | 1
mM |
Triton | 1% |
(Warenzeichen
des Dertergens im Handel) | |
pH-Wert | 7,4 |
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Nach der Durchführung der Bindung wird das
Sepharose®-Concanavalin
A, abgesehen von der auf 0,1% verminderten Triton® Konzentration,
mit einem Puffer der gleichen Zusammensetzung gewaschen. Die Elution
wird anschließend
mit einer 0,2 M O-Methyl-α-D-mannopyranosidlösung im
Waschpuffer durchgeführt.
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Das Protein kann durch Immunpräzipitation
mit Antikörpern
weiter konzentriert werden, die in Seren von mit dem AIDS-Virus
infizierten Patienten enthalten. sind, oder mit polyclonalen Antikörpern, die
aus einem Serum erhalten werden, das von einem zuvor gegen das "unveränderte" erfindungsgemäße Virus
oder das vorstehend beschriebene Glycoprotein immunisierten Tier
stammt. Das Protein kann anschließend durch Dissoziation des
Komplexes mittels einer Lösung,
die einen geeigneten ionischen Salzgehalt aufweist, gewonnen werden.
Vorzugsweise wird die Antikörper-Präparation
selbst in einer bekannten Weise auf einem unlöslichen Träger, beispielsweise vom Sepharose® B-Typ
immobilisiert.
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Es ist auch möglich, monoclonale Antikörper zu
verwenden, die von zuvor gegen gp110 hergestellten Hybridomen sekretiert
werden. Diese monoclonalen Antikörper
bilden neben den sie produzierenden Hybridomen auch einen Teil der
Erfindung.
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Ein Verfahren zur Herstellung und
Selektion von monoclonalen Antikörpern,
die gegen das gp110 Glycoprotein gerichtet sind, ist nachstehend
beschrieben.
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Immunisierung
der Mäuse
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Es wurden Gruppen von 6 bis 8 Wochen
alten BALB/c-Mäusen verwendet.
Eine Gruppe erhält
das Virus, das das vorstehend beschriebene Glycoprotein trägt, und
eine andere ein gereinigtes Glycoprotein gp110. Das bei allen Mäusen identische
Immunisierungsverfahren umfaßt
die Injektion von 10 mg der antigenen Präparation in Gegenwart von komplettem Freunds
Adjuvans am Tag 0, anschließend
erneut, jedoch in Gegenwart von inkomplettem Freunds Adjuvans am
Tag 14 und ohne Adjuvans an den Tagen 28 und 42. Die ersten drei
Injektionen werden intraperitoneal, die vierte intravenös verabreicht.
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Fusion und
Züchtung
der Hybride
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Die nicht-sekretierende Myelom-Variante
5.53 P3 × 63
Ag8, die Azaguanin-resistent ist und von der MOPC-21-Zellinie stammt,
wird verwendet. In Gegenwart von Polyethylenglycol 4000 wird am
45. Tag durch das Verfahren von Fazekas de St-Groth und Scheidegger
die Fusion mit immunisierten Maus-Splenocyten durchgeführt. Die
Selektion der Hybride in RPMI 1640 "HAT"-Medium
wird unter Verwendung derselben Züchtungstechniken auf Platten
durchgeführt,
die 24 Vertiefungen aufweisen (bekannt unter der Bezeichnung Costar).
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Die Hybridome, die Antikörper von
geeigneter Spezifität
produzieren, werden anschließend
in Gegenwart einer "ernährenden" Schicht von syngenen
Thymocyten in Platten, die 96 Vertiefungen aufweisen, cloniert.
Die so selektierten, produzierenden Clone werden anschließend immer
noch in Gegenwart von Thymocyten in Platten mit 24 Vertiefungen
vermehrt. Sobald in einer der Vertiefungen die Konfluenz auftritt,
wird der Clon intraperitoneal in eine BALB/c-Maus, injiziert, die
8 Tage zuvor eine Pristan-Injektion
erhalten hatte, und/oder in Flüssigkultur
gehalten.
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Darstellung
der anti-LAV-Antikörper
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Fünf
verschiedene Verfahren ermöglichen
die Charakterisierung der Clone, die Antikörper von geeigneter Spezifität produzieren.
In einer ersten Stufe werden die Hybride, die Antikörper produzieren,
durch einen ELISA-Test ermittelt, der Maus-Immunglobuline .in den Überstandsflüssig keiten
zeigt. In dieser ersten Selektion werden durch Verwendung eines
ELISA-Tests, der anti-LAV-Antikörper
zeigt, oder durch Immunfluoreszenz an Virus produzierenden menschlichen
Zellen Überstände gesucht,
die gegen virale Bestandteile gerichtete Antikörper aufweisen. Schließlich werden
die Überstandsflüssigkeiten
durch Radio-Immunpräzipitation des
mit Cystein markierten Virus und durch das Western-Blot-Verfahren an einer
viralen Präparation,
die die Bestimmung der Spezifitäten
dieser anti-LAV-Antikörper
ermöglichen,
analysiert.
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Ergebnisse
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Die von den verschiedenen Fusionen
erhaltenen Zellen werden in 648 Vertiefungen gezüchtet. Ihre mikroskopische
Untersuchung zeigt, daß die
Mehrzahl dieser Vertiefungen einen einzelnen Hybridclon enthält, der
fähig ist,
in einem selektiven "HAT"-Medium zu wachsen.
Mehr als 50% von ihnen produzieren Antikörper, die bei einer ELISA-anti-Virus-Untersuchung eine
positive Antwort bewirken. Die repräsentativsten Fusionen werden
durch das Western-Blot-Verfahren getestet und einige von ihnen subcloniert,
wobei ihre jeweiligen Spezifitäten
und Reaktivitäten
im anti-Virus-ELISA und ihre Verhaltensweisen unter den Züchtungsbedingungen
berücksichtigt
werden. Es werden insbesondere die Hybride selektiert, die Antikörper produzieren,
die selektiv das virale Glycoprotein gp110 erkennen, das ein Molekulargewicht
von etwa 110 kD aufweist. Sämtliche Subclonierungen
ergeben Antikörper
produzierende Clone, die nach der Expression in syngene Mäuse. injiziert
werden. Eine Analyse der Spezifitäten der in den unterschiedlichen
Ascites-Flüssigkeiten
vorhandenden Antikörper
bestätigt
die Spezifität
der Ascites-Antikörper
hinsichtlich des gp110.
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Die erhaltenen monoclonalen Antikörper können selbst
zur Reinigung von Proteinen verwendet werden, die eine auch in gp110
vorhandene antigene Stelle enthalten. Die Erfindung betrifft daher
auch diese Reinigungsverfahren als solche.
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Dieses Verfahren wird vorteilhaft
an Virus-Lysaten, Lysaten von T-Lymphocyten oder weiteren, LAV oder
Entsprechendes 'produzierenden
Zellen angewandt, wenn die unkontrollierte Abtrennung von gp110
während
des Reinigungsverfahrens des Virus vor seiner Lysis sorgfältig vermieden
worden ist. Es ist unnötig
zu sagen, daß das
Verfahren auch an jeder Lösung
verwendet werden kann, die gp110 oder ein Protein, Polypeptid oder
Glycoprotein enthält,
das eine antigene Stelle umfaßt,
die üblicherweise
vom Hüll-Protein
getragen und durch den monoclonalen Antikörper erkannt wird. Zur Durchführung dieses
Verfahrens ist es vorteilhaft, die monoclonalen Antikörper auf
einem festen Träger
zu immobilisieren, der bevorzugt für Affinitätschromatographie-Verfahren
verwendbar ist. Diese monoclonalen Antikörper werden beispielsweise
an ein dreidimensional vernetztes Agarosegitter, unter dem Warenzeichen
Sepharose von der schwedischen Firma Pharmacia A. G. vertrieben,
beispielsweise durch das Bromcyan-Verfahren gebunden.
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Die Erfindung betrifft daher auch
ein Verfahren zur Trennung der betreffenden Antigene, wobei das Verfahren
das Inkontaktbringen eines Antigen-Gemisches, das die Antigene von
Interesse einschließt
(zum Beispiel ein Virus-Lysat oder -Extrakt), mit einer Affinitätssäule umfaßt, die
die vorstehend beschriebenen monoclonalen Antikörper trägt, um die durch die monoclonalen
Antikörper
selektiv erkannten Polypeptide, Proteine oder Glycoproteine selektiv
zu binden, die Gewinnung der letzteren durch Dissoziation des Antigen-Antikörper-Komplexes
unter Verwendung eines geeigneten Puffers, insbesondere einer Lösung von
geeigneter Innenstärke,
beispielsweise eines Salzes, vorzugsweise Ammoniumacetat (das bei
der Gefriertrocknung der Präparation
keinen Rückstand
bildet), einer auf einen pH-Wert von 2 bis 4 angesäuerten Lösung oder
eines Glycin-Puffers beim gleichen pH-Wert, und die Gewinnung der
eluierten Polypeptide, Proteine oder Glycoproteine.
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Es versteht sich von selbst, daß die Erfindung
auch Polypeptid-Fragmente betrifft, die niedrigere Molekular- Gewichte aufweisen
und antigene Stellen tragen, die durch die gleichen monoclonalen
Antikörper
erkannt werden. Es ist für
den Fachmann klar, daß die
Verfügbarkeit
von monoclonalen Antikörpern,
die das gp110-Glycoprotein erkennen auch den Zugriff auf kleinere
Peptidsequenzen oder Fragmente ermöglicht, die eine gemeinsame
antigene Stelle oder ein gemeinsames Epitop enthalten. Fragmente
von kleinerer Größe können unter
Verwendung von bekannten Verfahren erhalten werden. Ein derartiges
Verfahren umfaßt
beispielsweise die Spaltung des ursprünglich größeren Polypeptids durch Enzyme,
die zur Spaltung an spezifischen Stellen fähig sind. Zur beispielhaften
Darstellung solcher Proteine kann das Enzym von Staphylococcus aureus
V8, α-Chymotrypsin,
Maus-Unterkiefer-Drüsen-Protease,
die von der Firma Boehringer vertrieben wird, Vibrio alginolyticus
chemovar iophagus-Collagenase, die unter anderem die Peptide Gly-Pro
und Gly-Ala spezifisch erkennt, erwähnt werden.
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Es ist auch möglich, durch Clonierung von
Fragmenten, die einer aus Genomen von LAV-Varianten konstruierten
cDNA entnommen worden sind, Polypeptide oder Fragmente von Hüll-Antigenen des Virus
zu erhalten.
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Die 2 und 3 sind Restriktionskarten
einer solchen cDNA, die insgesamt 9,1 bis 9,2 kB umfaßt. Die, von
cDNA-Fragmenten codierten Polypeptide befinden sich in der Region,
die sich von der KpnI-Stelle (Position 6100) bis zur Bg1II-Stelle
(Position 9150) der Restriktionskarte von 2 erstreckt. Das Vorhandensein einer
charakteristischen Stelle eines Hüll-Antigens des LAV-Virus oder
eines ähnlichen
Virus in einem exprimierten Polypeptid (in einer geeigneten Wirtszelle,
die zuvor durch ein entsprechendes Fragment oder durch einen das
Fragment enthaltenden Vektor transformiert worden ist) kann durch
jedes geeignete immunologische Verfahren nachgewiesen werden.
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Die Erfindung betrifft insbesondere
Polypeptide, die von hier nachstehend definierten cDNA-Fragmenten
codiert werden. Sie betrifft auch die Nucleinsäure-Fragmente selber, die eine
cDNA-Variante einschließen, die
einem vollständigen retroviralen
LAV-Genom entspricht, das durch eine Reihe von Restriktionsstellen
in der hier nachstehend beschriebenen Reihenfolge (vom 5'-Ende zum 3'-Ende) charakterisiert
ist.
-
Die Koordinaten der aufeinanderfolgenden
Stellen des gesamten LAV-Genoms (vgl. auch die Restriktionskarte
von λJ19
in
1) werden hier nachstehend
unter Bezug auf die HindIII-Stelle (gewählt als Koordinate 1), die
in der R-Region
liegt, auch angegeben. Die Koordinaten werden mit einer Genauigkeit
von ± 200 Bp
geschätzt:
HindIII | 0 |
SacI | 50 |
HindIII | 520 |
PstI | 800 |
HindIII | 1100 |
BglII | 1500 |
KpnI | 3500 |
KpnI | 3900 |
EcoRI | 4100 |
EcoRI | 5300 |
SalI | 5500 |
KpnI | 6100 |
BglII | 6500 |
BglII | 7600 |
HindIII | 7850 |
BamHI | 8150 |
XhoI | 8600 |
KpnI | 8700 |
BglII | 8750 |
BglII | 9150 |
SacI | 9200 |
HindIII | 9250 |
-
Eine weitere erfindungsgemäße DNA-Variante
enthält
gegebenenfalls eine weitere HindIII-Stelle etwa an der Koordinate
5550.
-
Es wird auch auf 1 Bezug genommen, die eine ge nauere Restriktionskarte
der Gesamt-DNA (λJ19)
darstellt.
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Eine noch detailliertere Nucleotidsequenz
einer bevorzugten erfindungsgemäßen DNA
ist hier nachstehend in den 4a–4e dargestellt.
-
Die Erfindung betrifft ferner weitere
bevorzugte DNA-Fragmente
und Polypeptidsequenzen (glycosyliert oder nicht glycosyliert),
auf die hier nachstehend Bezug genommen wird.
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Sequenzierung von LAV
-
Die Sequenzierung und Bestimmung
der Stellen von besonderem Interesse wurden an einem rekombinanten
Phagen durchgeführt,
der dem in der vorstehend genannten britischen Patentanmeldung Nr.
84 23659 beschriebenen λJ19 entspricht.
Ein Verfahren zu seiner Herstellung wird in der Anmeldung beschrieben.
-
Die gesamte rekombinante Phagen-DNA
vom Clon λJ19
(in der früheren
Anmeldung beschrieben) wurde gemäß der Vorschrift
von Deininger, Analytical Biochem. 129 (1983), 216, mit Ultraschall
behandelt. An der DNA wurde 12 Stunden bei 16°C durch eine Klenow-Reaktion
eine Reparatur durchgeführt.
Mit der DNA wurde in einem 0,8% Agarosegel eine Elektrophorese durchgeführt, und
die DNA im Größenbereich
von 300–600
Bp wurde ausgeschnitten, elektroeluiert und ausgefällt. Die
resuspendierte DNA (in 10 mM Tris, pH-Wert 8; 0,1 mM EDTA) wurde
in M13mp8-RF-DNA (durch das Restriktionsenzym SmaI gespalten und
anschließend
mit alkalischer Phosphatase behandelt) unter Verwendung von T4-DNAund
RNA-Ligasen ligiert (Maniatis, T. et al. (1982), Molecular Cloning – Cold Spring
Harbor Laboratory). Ein E. coli-Stamm
mit der Bezeichnung TGl wurde für
die weitere Untersuchung verwendet. Dieser Stamm weist den nachstehend
beschriebenen Genotyp auf:
Δ lac
pro, supE, thi.F'traD36,
proAB, lacIq, ZΔM15, r
-
Dieser E. coli-TGI-Stamm weist die
Besonderheit auf, daß Rekombinante
leicht erkannt werden können.
Die blaue Farbe der Zellen, die mit Plasmiden transfiziert sind,
die nicht mit einem LAV-DNA-Fragment rekombiniert haben, wird nicht
modifiziert. Die Zellen, die mit einem rekombinanten Plasmid transfiziert
sind, das ein LAV-DNA-Fragment enthält, ergeben dagegen weiße Kolonien.
Das verwendete Verfahren ist in Gene 26 (1983), 101, beschrieben.
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Dieser Stamm wurde unter Verwendung
des Hanahan- Verfahrens
(Hanahan D., J. Mol. Biol. 166 (1983), 557) mit dem Ligierungsgemisch
transformiert. Die Zellen wurden auf einer Trypton-Agarose-Platte
mit IPTG und X-Gal in weicher Agarose ausplattiert. weiße Plaques
wurden entweder entnommen und abgesucht oder unter Verwendung eines
Nitrozellulose-Filters direkt in situ abgesucht. Ihre DNA-Moleküle wurden
mit nick-translatierten DNA-Insertionen von pUC18- HindIII-Subclonen
von λJ19
hybridisiert. Dies ermöglichte
die Isolierung der Plasmide oder Subclone von λ, die in der nachstehend beschriebenen
Tabelle identifiziert sind. Im Bezug auf diese Tabelle sollte auch
darauf hingewiesen werden, daß auf
die Bezeichnung eines jeden Plasmids die Hinterlegungsnummer einer
Zellkultur von E. coli TGI, die das entsprechende Plasmid enthält, bei
der "Collection
Nationale des Cultures de Micro-organismes" (C.N.C.M.) des Pasteur Instituts in
Paris, Frankreich, folgt. Auch eine nicht transformierte TGI-Zellinie
wurde bei der C.N.C.M. unter der Nr. I-364 hinterlegt. Sämtliche
Hinterlegungen fanden am 15. November 1984 statt. Die Größen der
entsprechenden vom LAV-Genom stammenden Insertionen sind auch angegeben
worden.
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Tabelle
Haupt-Merkmale
der rekombinanten Plasmide
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Positiv hybridisierende M13-Phagen-Platten
wurden 5 Stunden gezüchtet,
und die einzelsträngigen DNAs
extrahiert.
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Die M13mp8 Subclone von λJ19- DNAs
wurden nach dem Didesoxy-Verfahren und der Technologie, die von
Sanger et al. entwickelt wurden (Sanger et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 74 (1977), 5463) und dem M13-Clonierungs- und Sequenzierungs-Handbuch
(Amersham (1983)) sequenziert. Es wurden der 17-mer Oligonucleotid-Primer α-35SdATP (400Ci/mmol, Amersham) und die 0,5×-5× Puffer-Gradienten-Gele (Biggen, M.
D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 50 (1983), 3963) verwendet.
Die Gele wurden gelesen und über
die Programme von Staden (Staden, R., Nucl. Acids Res. 10 (1982),
4731) in den Computer eingegeben. Sämtliche einschlägigen Literaturhinweise
und geeigneten Verfahren können
dem M13-Clonierungs- und Sequenzierungs-Handbuch von Amersham entnommen
werden.
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Die vollständige DNA-Sequenz von λJ19 (auch
als LAV-Ia bezeichnet)
ist in den 4 bis 4e dargestellt.
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Die Sequenz wurde aus der Sequenz
der Insertion des Phagen λJ19
rekonstruiert. Die Numerierung beginnt an der Cap-Stelle, die experimentell
lokalisiert wurde (s. u.). Wichtige genetische Elemente, größere offene
Leserahmen und ihre erwarteten Produkte sind zusammen mit den HindIII-Clonierungsstellen
angegeben. Die potentiellen Glycosylierungs-Stellen im env-Gen sind
oben mit einem Strich versehen. Die NH2-terminale
Sequenz von p25gag, die durch Protein-Micro-Sequenzierung bestimmt
wurde, ist eingerahmt.
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Jedes Nucleotid wurde im Durchschnitt
5,3 Mal sequenziert: 85% der Sequenz wurde an beiden Strängen bestimmt
und der Rest mindestens zweimal in unabhängigen Clonen sequenziert.
Die Basenzusammensetzung ist T, 22,2%; C, 17,8 %; A, 35,8%; G, 244,2%;
G + C, 42% . Das Dinucleotid GC ist stark unterrepräsentiert
(0,9%), wie dies bei eukaryoti- schen Sequenzen üblich ist (Bird 1980).
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Die 5 und 6 liefern eine graphische
Darstellung der Längen
der aufeinander folgenden offenen Leserahmen, die den aufeinander
folgenden Lesephasen entsprechen (auch mit den Zahlen "1", "2" und "3" bezeichnet, die auf der linken Seite
von 5 erscheinen). Die
relati ven Positionen dieser offenen Leserahmen (ORF) in bezug auf
die Nucleotid-Struktur des LAV-Genoms werden durch die Reihe von
Zahlen angegeben, die die jeweiligen Positionen der entsprechenden
Nucleotide in der DNA-Sequenz wiedergeben. Die vertikalen Striche
entsprechen den Positionen der jeweiligen Stoppcodons.
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Die nachstehend beschriebenen Gene
und DNA-Fragmente können
auf den verschiedenen dargestellten Leserahmen unterschieden werden.
Es wird anschließend
auch auf die von die- sen Genen und Fragmenten codierten Proteine
oder Glycoproteine Bezug genommen, insbesondere auf ORF-Sequenzen,
beispielsweise ORF-Q und ORF-F.
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Die Erfindung betrifft ferner offene
Leserahmen liefernde DNA-Sequenzen, die als ORF-Q, ORF-F und als "1", "2", "3", "4" und "5" definiert werden, deren relative Positionen
genauer in den 2 und 3 erscheinen.
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Diese ORFs weisen die nachstehend
dargestellten Positionen auf:
-
ORF-Q und –F
-
Man stellte am viralen (+)-Strang
des LAV-Genoms fest, daß er
obligatorische retrovirale Gene enthielt, die die Kernstrukturproteine
(gag), die Reverse Transkriptase (pol) und das Hüll-Protein (env) codieren, und
zwei weitere offene Leserahmen (ORF), die als Q und F bezeichnet
werden (Tabelle 1). Die genetische Organisation von LAV, 5'-LTRgag-pol-Q-env-F-3'LTR, ist einmalig.
Während
in sämtlichen
Replikations-kompetenten Retroviren die pol- und env-Gene überlappen,
sind sie in LAV durch den ORF-Q (192 Aminosäuren), worauf vier kleine (< 100 Triplets)
ORFs folgen, getrennt. Der ORF-F. (206 Aminosäuren) überlappt leicht das 3'-Ende von env und
ist deswegen bemerkenswert, daß er
zur Hälfte
durch die U3-Region des LTR codiert wird.
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Eine derartige Struktur unterscheidet
LAV klar von zuvor sequenzierten Retroviren (2). Der (–)-Strang ist. anscheinend
nicht-codierend. Die weitere HindIII-Stelle des LAV-Clons λJ81 (bezüglich λJ19) läßt sich
der anscheinend nicht-codierenden Region zwischen Q und env (Positionen
5166–5745)
kartieren. In der Position 5501 beginnt eine Sequenz (AAGCCT), die
sich durch eine einzelne Base (unterstrichen) von der HindIII-Erkennungssequenz
unterscheidet. Es muß erwartet
werden, daß viele
der Restriktionsstellen-Polymorphismen zwischen verschiedenen Isolaten
in dieser Region kartiert werden können. Der Clon λJ81 ist auch in
der am 15. September 1984 eingereichten britischen Anmeldung mit
der Nr. 84 23659 beschrieben worden.
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Q und F
-
Die Nucleotid-Positionen ihrer jeweiligen
Enden sind hier nachstehend in Tabelle 1 dargestellt.
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Die Lage von ORF-Q ist in der Struktur
von Retroviren ohne Vorbild. ORF-F ist dadurch einmalig, daß es zur
Hälfte
durch das U3-Element des LTR codiert wird. Beide ORFs weisen in
der Nähe
ihrer 5'-Enden "starke" Initiator-Codons
auf (Kozak 1984) und können
Proteine von 192 Aminosäuren
(berechnetes MG = 22487) bzw. 206 Aminosäuren (berechnetes MG = 23316)
codieren. Beide mutmaßlichen
Proteine sind hydrophil (pQ 49% polar, 15,1% Arg + Lys; pF 46% polar,
11 Arg + Lys), und daher ist es unwahrscheinlich, daß sie direkt
mit der Membran verbunden sind. Die Funktion der mutmaßlichen
Proteine pQ und pF kann nicht vorhergesagt werden, da durch Absuchen
von Proteinsequenz-Datenbanken keine Homologie festgestellt wurde.
Zwischen ORF-F und dem pX Protein von HTLV-1 besteht keine nachweisbare
Homologie. Ferner weichen ihre Hydrophobie/Hydrophilie-Profile stark
voneinander ab. Es ist bekannt, daß Retroviren zelluläre Gene,
besonders Proto-Oncogene (Weinberg 1982) transduzieren können. Es
wird angenommen, daß ORF-Q
und –F
exogenes genetisches Material und nicht Überbleibsel von zellulärer DNA
darstellen, da (I) LAV-DNA unter stringenten Bedingungen nicht an
das menschliche Genom hybridisiert (Alizon et al., 1984), (II) ihre
Codon-Verwendung mit der von gag-, pol- und env-Genen vergleichbar
ist (Daten nicht dargestellt).
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Die Organisation eines rekonstruierten
LTR und f1ankierender viraler Elemente ist in 6 schematisch dargestellt. Der LTR ist
638 Bp lang und zeigt die üblichen
Merkmale (Chen und Barker 1984): (I) Er wird durch einen invertierten
Repeat "inverted
repeat" (5'ACTG) gebunden, der
die konservierten TG-Dinucleotide (Temin 1981) enthält, (II)
zum 5'LTR benachbart
ist die tRNA-Primer-Bindungsstelle (PBS), die zu tRNA lys / 3 komplementär ist (Raba
et al., 1979), (III) ein perfekter 15 Bp Polypurin-Bereich ist dem
3'LTR benachbart.
Den übrigen
drei, zwischen den Nucleotiden 8200–8800 beobachteten Polypurin-Bereichen
schließt
sich keine Sequenz an, die zu der der PBS vorangehenden Sequenz
komplementär
ist. Die Grenzen der U5-, R- und U3-Elemente wurden, wie nachstehend
beschrieben, bestimmt. US liegt zwischen PBS und der Polyadenylierungsstelle,
was durch die Sequenz des 3'-Endes der Oligo(dT)-geprimeten
LAV-cDNA (Alizon et al., 1984) nachgewiesen wurde. Daher ist U5
84 Bp lang. Die Länge
von R + U5 wurde durch Synthese der tRNA-geprimeten LAV-cDNA bestimmt.
Nach der alkalischen Hydrolyse des Primers wurde festgestellt, daß R + U5
eine Länge
von 181 ± 1
Bp aufweisen. Daher ist R 97 Bp lang, und die Cap-Stelle an seinem
5'-Ende kann lokalisiert werden.
U3 ist schließlich
456 Bp lang. Das LAV-LTR enthält
auch charakteristische regulatorische Elemente: eine Polyadenylierungs-Signalsequenz
AATAAA 19 Bp von der R-U5-Verbindung entfernt und die Sequenz ATATAAG,
die sehr wahrscheinlich die TATA-Box ist, 22 Bp 5' von der Cap-Stelle
entfernt. Es gibt keine weiteren direkten Repeats innerhalb des
LTR. Interessanterweise zeigt der LAV-LTR einige Ähnlichkeiten zu dem des Maus-Brusttumor-Virus
((MMTV) Donehower et al., 1981). Sie verwenden beide tRNA lys / 3 als Primer
zur (-) -Strangsynthese, während
alle übrigen
zur Zeit bekannten exogenen Säuger-Retroviren
tRNApro verwenden (Chen und Barker 1984).
Sie weisen sehr ähnliche
Polypurin-Bereiche auf (der von LAV ist AAAAGRAAAGGGGGG, während der
von MMTV AAAAAAGAAAAAGGGGG ist). Es ist wahrscheinlich, daß die virale
(+)-Strangsynthese diskontinuierlich ist, da der das U3-Element
vom 3'LTR flankierende
Polypurin-Bereich als exaktes Duplikat am 3'-Ende vom ORF-pol bei 4331–4336 vorliegt.
Ferner sind MMTV und LAV darin ungewöhnlich, daß das U3-Element einen ORF
codieren kann. Bei MMTV enthält
U3 den gesamten ORF, während
in LAV U3 110 Codons der 3'-Hälfte von
ORF F enthält.
-
Der lange endständige Repeat ("long terminal repeat"; LTR) von LAV ist
in 6 graphisch dargestellt. Wie
erwähnt,
wurde der LTR aus der λJ19-Sequenz
durch Nebeneinanderstellen der den HindIII-Clonierungsstellen benachbarten
Sequenzen rekonstruiert.
-
Die Sequenzierung des Oligo(dT)-geprimeten
LAV-DNA-Clons pLAV75
(Alizon et al., 1984) schließt die
Möglichkeit
von gehäuft
auftretenden HindIII-Stellen in der R-Region von LAV aus. Die LTR
werden durch eine "inverted
repeat"-Sequenz
(IR) begrenzt. Beide viralen Elemente, die den LTR flankieren, sind
dargestellt worden, d. i. die tRNA-Primer-Bindungsstelle (PBS) am
5'LTR und der Polypurin-Bereich
(PU) am 3'LTR. Eine mutmaßliche TATA-Box,
die Cap-Stelle, das Po1yadenylierungs-Signal (AATAAA) und die Polyadenylierungs-Stelle (CAA) sind
ebenso angegeben. Die Lage des offenen Leserahmens F (648 Nucleotide)
ist oberhalb des LTR-Schemas dargestellt.
-
Die LTRs ("long terminal repeats") können auch
durch ihre Lage zwischen der Position 8560 und der Position 160
(das Ende erstreckt sich über
die Position 9097/1 hinaus) definiert werden. Das Ende des Genoms
ist in der Tat bei 9097, und aufgrund der LTR-Struktur des Retrovirus
ist es mit dem Sequenz-Anfang:
verbunden.
-
Tabelle 1 faßt die Lagen und Größen der
viralen offenen Leserahmen zusammen. Die Nucleotid-Koordinaten beziehen
sich auf die erste Base des ersten Tripletts (1. Triplett), des
ersten Methionin-Initiationscodons (Met) und des Stop- Codons (Stop).
Die Anzahl Aminosäuren
und die berechneten Molekulargewichte sind diejenigen, abgesehen
vom pol, bei denen sich die Größe und das
MG auf die des gesamten ORF beziehen, die für unmodifizierte Vorläuferprodukte,
vom ersten Methionin beginnend bis zum Ende, ermittelt worden sind.
Tabelle
1
Lage und Größen von
viralen offenen Leserahmen
-
Die Erfindung betrifft insbesondere
alle DNA-Fragmente,
auf die hier vorstehend genauer Bezug genommen worden ist und die
offenen Leserastern entsprechen. Es versteht sich von selbst, daß ein Fachmann fähig ist,
sämtliche
von ihnen zu erhalten, beispielsweise durch Spaltung einer vollständigen DNA,
die dem gesamten Genom einer LAV-Art ent spricht, zum Beispiel durch
deren partielle oder vollständige
Spaltung mit einem geeigneten Restriktionsenzym und durch anschließende Gewinnung
der betreffenden Fragmente. Die unterschiedlichen, vorstehend beschriebenen
DNAs können
auch als eine Quelle von geeigneten Fragmenten verwendet werden.
Es können
die Verfahren verwendet werden, die hier nachstehend zur Isolierung
der Fragmente beschrieben werden, die zuvor in den hier vorstehend
beschriebenen Plasmiden eingeschlossen waren und nachfolgend zur
DNA-Sequenzierung
verwendet wurden.
-
Selbstverständlich können auch andere Verfahren
verwendet werden. Einige davon sind in der am 19. September 1984
angemeldeten britischen Patentanmeldung Nr. 8423659 beispielhaft
dargestellt worden. Es wird beispielsweise auf die nachstehend beschriebenen
Verfahren Bezug genommen:
- a) DNA kann mit geeigneten
Selektionsmarkern durch mehrere Verfahren in Säugerzellen transfiziert werden:
z. B. Calciumphosphat-Präzipitation,
Polyethylenglycol oder Protoplastfusion.
- b) DNA-Fragmente, die Genen entsprechen, können in Expressionsvektoren
für E.
coli, Hefe- oder Säugerzellen
cloniert und die erhaltenen Proteine gereinigt werden.
- c) Die provirale DNA kann zur Erzeugung von fusio ierten Polypeptiden
mit dem "shot-gun"-Verfahren (Fragmentierung)
in prokaryotische Expressionsvektoren eingeführt werden. Rekombinant hergestellte,
als Antigen kompetente Fusionsproteine können durch einfaches Absuchen
der Rekombinanten mit anti-LAV-Antigen-Antikörpern identifiziert werden.
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Die Erfindung betrifft ferner insbesondere
DNA-Rekombinante,
besonders modifizierte Vektoren, die eine der vorstehend beschriebenen
DNA-Sequenzen einschließen,
die zur Transformation entsprechender Mikroorganismen oder Zellen,
insbesondere eukaryotischer Zellen, beispielsweise Hefen, zum Beispiel
Saccharomyces cerevisiae, oder höherer
eukaryotischer Zellen, insbesondere Säugerzellen, und zur Ermöglichung der
Expression dieser DNA-Sequenzen in den entsprechenden Mikroorganismen
oder Zellen angepaßt
sind.
-
Insbesondere betrifft die Erfindung
solche modifizierten rekombinanten DNA-Vektoren, die durch die vorstehend
beschriebenen DNA-Sequenzen modifiziert wurden und die fähig sind,
höhere
eukaryotische Zellen, insbesondere Säugerzellen zu transformieren.
Vorzugsweise wird eine der vorstehend beschriebenen Sequenzen unter
die direkte Kontrolle eines Promotors gestellt, der in den Vektoren
enthalten ist und der durch die Polymerasen der Zellen erkannt wird,
so daß die
ersten exprimierten Nucleotid-Codons den. ersten Tripletts. der
vorstehend definierten DNA-Sequenzen entsprechen. Daher betrifft
diese Erfindung auch die entsprechenden DNA-Fragmente, die durch
ein geeignetes Verfahren aus LAV-Genomen oder entsprechenden cDNAs
erhalten werden können.
Ein derartiges Verfahren umfaßt
beispielsweise die Spaltung der LAV-Genome oder cDNAs durch Restriktionsenzyme,
vorzugsweise auf der Stufe der Restriktionsstellen, die die Fragmente
umgeben und nahe an. ihren jeweiligen entgegengesetzten Enden liegen,
die Gewinnung und Identifizierung der gesuchten Fragmente nach der
Größe, falls
erforderlich, eine Überprüfung ihrer
Restriktionskarten oder Nucleotidsequenzen (oder durch eine Reaktion
mit monoclonalen Antikörpern,
die spezifisch gegen Epitope gerichtet sind, die von diesen von
den DNA-Fragmenten
codierten Polypeptiden getragen werden) und ferner, falls erforderlich,
die Verkürzung
der Enden der Fragmente, beispielsweise durch ein exonucleolytisches
Enzym, zum Beispiel Bal31, zum Zweck der Kontrolle der gewünschten
Nucleotidsequenzen der DNA-Fragment-Enden oder, umgekehrt, die Reparatur
der Enden mit dem Klenow-Enzym und gegebenenfalls die Ligierung
der letzteren an synthetische Polynucleotid-Fragmente, um die Rekonstitution
der Nucleotid-Enden der Fragmente zu ermöglichen. Diese Fragmente können anschließend in
einen der Vektoren inseriert werden, um die Expression des entsprechenden
Polypeptids durch die damit transformierte Zelle zu bewirken. Das
entsprechende Polypeptid kann anschließend aus den transformierten
Zellen gewonnen werden, falls nach deren Lyse erforderlich, und durch
Verfahren, beispielsweise die Elektrophorese, gereinigt werden.
Es ist unnötig
zu sagen, daß alle üblichen
Verfahren zur Durchführung
dieser Arbeitsschritte verwendet werden können.
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Die Erfindung betrifft insbesondere
auch clonierte Sonden, die ausgehend von jedem erfindungsgemäßen DNA-Fragment hergestellt
werden können
und somit rekombinante DNA-Moleküle,
die solche Fragmente enthalten, insbesondere alle Plasmide, die
in prokaryotischen oder eukaryotischen Zellen amplifizierbar sind
und die Fragmente tragen.
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Unter Verwendung der clonierten DNA-Fragmente
als eine molekulare Hybridisierungs-Sonde – entweder durch Markierung
mit Radionucleotiden oder mit fluoreszierenden Reagenzien – kann LAV-Virion-RNA im
Blut; in Körperflüssigkeiten
und Blutprodukten (z. B. von anti-hämophilen Faktoren wie Faktor
VIII-Konzentraten) und in Impfstoffen, z. B. im Hepatis B-Impfstoff
direkt nachgewiesen werden. Es ist schon dargestellt worden, daß das gesamte
Virus in Kulturüberständen von
LAV-produzierenden Zellen nachgewiesen werden kann. Ein geeignetes
Verfahren, um diesen Nachweis zu erreichen, umfaßt die Immobilisierung des
Virus auf einem Träger,
z. B. unter anderem auf Nitrozellulose-Filtern, das Aufbrechen des
Virions und die Hybridisierung mit markierten (radioaktiv-markierten
oder "kalten" Fluoreszenz- oder
Enzym-markierten) Sonden. Eine derartige Vorgehensweise ist bereits
für das
Hepatitis B-Virus im peripheren Blut entwickelt worden (gemäß Scotto,
J. et al., Hepatology 3 (1983) , 379-384).
-
Erfindungsgemäße Sonden können auch zum schnellen Absuchen
von genomischer DNA verwendet werden, die aus Gewebe von Patienten
mit LAV-verwandten Symptomen stammt, um festzustellen, ob die provirale
DNA oder RNA in Wirtsgeweben und weiteren Geweben vorhanden ist.
-
Ein für derartiges Absuchen verwendbares
Verfahren umfaßt
die nachstehend beschriebenen Schritte: Extraktion von DNA aus dem
Gewebe, Restriktionsenzym-Spaltung der DNA, Elektrophorese der Fragmente und
Southern-Blotting von geno mischer DNA aus Geweben, und anschließende Hybridisierung
mit markierter, clonierter proviraler LAV-DNA. Eine Hybridisierung
in situ kann auch verwendet werden.
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Lymphatische Flüssigkeiten und Gewebe und weitere
nicht-lymphatische Gewebe von Menschen, Primaten und anderen Säugerarten
können
auch abgesucht werden, um festzustellen, ob weitere evolutionär verwandte
Retroviren existieren. Die vorstehend beschriebenen Verfahren können verwendet
werden, obwohl Hybridisierung und Waschen unter nicht-stringenten
Bedingungen durchgeführt
werden würden.
-
Die erfindungsgemäßen DNAs oder DNA-Fragmente
können
auch zur Durchführung
der Expression von viralen LAV-Antigenen
zu diagnostischen Zwecken verwendet werden.
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Die Erfindung betrifft allgemein
die Polypeptide als solche, ohne zu unterscheiden, ob sie chemisch synthetisiert,
aus viralen Präparationen
isoliert oder durch die unterschiedlichen erfindungsgemäßen DNAs
exprimiert werden, insbesondere durch die ORFs oder Fragmente davon,
und zwar nach der Transformation mit einem geeigneten Vektor, der
zuvor durch die entsprechenden DNA-Moleküle modifiziert worden ist in
geeigneten Wirten, insbesondere in prokaryotischen oder eukaryotischen
Wirten.
-
Die Erfindung betrifft generell auch
jedes der Polypeptid-Fragmente (oder Moleküle, besonders Glycoproteine,
die dasselbe Polypeptid-Rückrat,
wie die hier vorstehend beschriebenen Polypeptide aufweisen), die
ein für
ein LAV-Protein oder Glycoprotein charakteristisches Epitop tragen,
wobei das Polypeptid oder Molekül
dann N-terminale bzw. C-terminale Enden aufweist, die frei oder
unabhängig
voneinander kovalent an Aminosäuren
gebunden sind, die andere als die sind, die normalerweise in den
größeren Polypeptiden
oder Glycoproteinen der LAV-Viren mit ihnen verbunden sind, wobei
die zuletzt beschriebenen Aminosäuren
dann frei sind oder zu einer anderen Polypeptidsequenz gehören. Insbesondere
betrifft die Erfindung Hybrid-Polypeptide, die hier vorstehend genauer
beschriebenen Epitop-tragenden Polypeptide, rekombiniert mit anderen, normalerweise
in den LAV-Proteinen fremden Polypeptid-Fragmenten enthalten, die
Größen aufweisen,
welche ausreichen, um eine erhöhte
Immunogenität
der Epitop-tragenden Polypeptide zu liefern, wobei die fremden Polypeptid-Fragmente
entweder als Immunogen inert sind oder die immunogenen Eigenschaften
der Epitop-tragenden Polypeptide nicht stören.
-
Derartige Hybrid-Polypeptide, die
bis zu 150, und sogar 250 Aminosäuren
enthalten, bestehen üblicherweise
aus den Expressions-Produkten eines Vektors, der ab initio eine
Nucleinsäure-Sequenz
enthielt, die unter der Kontrolle eines geeigneten Promotors oder
Replikons in einem geeigneten Wirt exprimierbar ist, wobei die Nucleinsäure-Sequenz
jedoch zuvor durch Insertion einer DNA-Sequenz modifiziert worden
war, die das Epitop-tragende Polypeptid codiert.
-
Die Epitop-tragenden Polypeptide,
insbesondere die, deren N-terminale und C-terminale Aminosäuren frei
sind, sind auch. durch chemische Synthese zugänglich, und zwar gemäß Verfahren,
die in der Proteinchemie gut bekannt sind.
-
Die Synthese von Peptiden in homogener
Lösung
und in fester Phase ist gut bekannt.
-
Diesbezüglich kann auf das Syntheseverfahren
in homogener Lösung
zurückgegriffen
werden, das von Houbenweyl in dem Werk mit dem Titel "Methoden der Organischen
Chemie" Hrsg. E.
Wunsch, Bd. 15-I und II, Thieme, Stuttgart 1974, beschrieben wurde.
-
Dieses Syntheseverfahren besteht
aus einer schrittweisen Kondensierung von jeweils zwei einzelnen aufeinander
folgenden Aminosäuren
in der geeigneten Reihenfolge oder von zuvor verfügbaren oder
hergestellten, aufeinander folgenden Peptidfragmenten, die schon
mehrere Aminoacyl-Reste in der jeweilig richtigen Reihenfolge enthalten.
Abgesehen von den Carboxyl- und Aminogruppen, die an der Bildung
der Peptidbindungen beteiligt sind, muß Sorge dafür getragen werden, daß alle anderen
reaktionsfähigen
Gruppen, die von diesen Aminoacyl-Gruppen oder Fragmenten getragen
werden, zuvor geschützt
werden. Vor der Bildung der Peptidbindungen ist es jedoch vorteilhaft,
die Carboxylgruppen gemäß den in
der Peptidsynthese vertrauten Verfahren zu aktivieren. In einer
anderen Ausführungsform
kann auf Kupplungsreaktionen zurückgegriffen werden,
die übliche
Kupplungsreagenzien ins Spiel bringen, beispielsweise vom Carbodiimid-Typ,
wie 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid.
Wenn die verwendete Aminosäuregruppe
eine weitere Aminogruppe (z. B. Lysin) oder eine weitere Säurefunktion
(z. B. Glutaminsäure)
trägt,
können
diese Gruppen durch Carbobenzoxy- oder t-Butyloxycarbonyl-Gruppen, bezüglich der
Aminogruppen, oder durch t-Butylester-Gruppen, hinsichtlich der
Carboxyl-Gruppen,
geschützt
werden. Ähnliche
Verfahren sind zum Schutz von weiteren reaktiven Gruppen verfügbar. Es
können
beispielsweise SH-Gruppen (z. B. im Cystein) durch eine Acetamidomethyl-
oder Paramethoxybenzyl-Gruppe geschützt werden.
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Bei fortschreitender Synthese, Aminosäure für Aminosäure, beginnt
die Synthese vorzugsweise durch die Kondensation der C-terminalen
Aminosäure
mit der Aminosäure,
die der benachbarten Aminoacyl-Gruppe in der gewünschten Sequenz entspricht
u.s.w., Schritt für
Schritt, bis zur Nterminalen Aminosäure. Ein weiteres verläßliches,
bevorzugtes Verfahren ist das von R. D. Merrifield in "Solid phase peptide
synthesis" (J. Am. Chem.
Soc., 45, 2149–2154)
beschriebene.
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Im Merrifield-Verfahren wird die
erste C-terminale Aminosäure
der Kette mit Hilfe ihrer Carboxylgruppe an ein geeignetes poröses, polymeres
Harz fixiert, worauf die Aminogruppe der Aminosäure, beispielsweise durch eine
t-Butyloxycarbonyl-Gruppe
geschützt
wird.
-
Wenn die erste C-terminale Aminosäure so an
das Harz gebunden worden ist, wird die Schutzgruppe der Aminogruppe
durch Waschen des Harzes mit einer Säure, d. h. Trifluoressigsäure, entfernt,
falls die Schutzgruppe der Aminogruppe eine t-Butyloxycarbonyl-Gruppe
ist.
-
Anschließend wird die Carboxylgruppe
der zweiten Aminosäure,
die die zweite Aminoacyl-Gruppe der gewünschten Peptidsequenz liefern
soll, an die ungeschützte
Aminogruppe der an das Harz gebunden, C-terminalen Aminosäure gekoppelt.
Es ist vorzugsweise die Carboxylgruppe dieser zweiten Aminosäure aktiviert worden,
beispielsweise durch Dicyclohexylcarbodiimid, während seine Aminogruppe geschützt worden
ist, zum Beispiel durch eine t-Butyloxycarbonyl-Gruppe. Der erste
Teil der gewünschten
Peptidkette, der die ersten beiden Aminosäuren umfaßt, wird so erhalten. Wie vorstehend
beschrieben, wird die Schutzgruppe der Aminogruppe anschließend entfernt,
und es kann mit der Bindung der nächsten Aminoacyl-Gruppe und
so weiter fortgefahren werden, bis das gesamte gewünschte Peptid
erhalten wird.
-
Die Schutzgruppen der unterschiedlichen
Seitengruppen (falls vorhanden) der so gebildeten Peptidkette können anschließend entfernt
werden. Das gesuchte Peptid kann anschließend vom Harz gelöst werden, beispielsweise
durch Fluorwasserstoffsäure,
und schließlich
nach üblichen
Verfahren in reiner Form aus der Säurelösung gewonnen werden.
-
Hinsichtlich der Peptidsequenzen
von kleinster Größe, die
ein Epitop oder eine immunogene Determinante tragen, und insbesondere
derjenigen, die durch chemische Synthese leicht zugänglich sind,
kann es zur Erhöhung
ihrer immunogenen in vivo Eigenschaften erforderlich sein, sie kovalent
an ein physiologisch verträgliches
und nicht-toxisches Träger-Molekül zu kuppeln
oder zu konjugieren.
-
Als Beispiele von Träger-Molekülen oder
macromoleku-laren
Trägern,
die zur Herstellung der erfindungsgemäßen Konjugate verwendet werden
können,
werden natürliche
Proteine erwähnt,
beispielsweise Tetanus-Toxoid, Ovalbumin, Serumalbumine und Hämocyanine.
Synthetische macromolekulare Träger,
beispielsweise Polylysine oder Poly(D-L-Alanin)poly(L-Lysin)-Moleküle können auch
verwendet werden.
-
Weitere Arten von verwendbaren macromolekularen
Trägern,
die üblicherweise
Molekulargewichte von mehr als 20000 aufweisen, sind aus der Literatur
bekannt.
-
Die Konjugate können durch bekannte Verfahren
synthetisiert werden, die beispielsweise von Frantz und Robertson
in "Infect. and
Immunity" 33.(1981),
193–198,
oder von P. E. Kauffman in Applied and Environmental Microbiology,
Oktober 1981, Bd. 42, Nr. 4, 611–614, beschrieben werden.
-
Es können beispielsweise die nachstehend
genannten Kupplungs-Wirkstoffe verwendet werden: Glutaraldehyd,
Ethylchlorkohlensäureester,
wasserlösliche
Carbodiimide (N-Ethyl-N'(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid,
HCl), Diisocyanate, bis-Diazobenzidin, Di- und Trichlor-s-triazine,
Bromcyane, Benzoquinon, genauso wie Kupplungs-Wirkstoffe, die in "Scand. J. Immunol." 8 (1978), 7–23, (Avrameas,
Ternynck, Guesdon) erwähnt
werden.
-
Es kann jedes Kupplungsverfahren
zur Bindung einer oder mehrerer reaktiver Gruppen des Peptids auf
der einen Seite, und einer oder mehrerer reaktiver Gruppen des Trägers auf
der anderen Seite verwendet werden. Es ist erneut vorteilhaft, die
Kupplung in Gegenwart eines in der Proteinsynthese verwendeten Kupplungs-Wirkstoffs,
d. h. z. B. 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid
oder N-Hydroxybenzotriazol, zwischen den Carboxyl- und Aminogruppen
durchzuführen,
die im Peptid und im Träger,
oder umgekehrt, enthalten sind. Die Kupplung zwischen Aminogruppen,
die jeweils im Peptid und im Träger
enthalten sind, kann, wenn der Träger Hämocyanin ist, auch mit Glutaraldehyd,
beispielsweise gemäß dem von
Boquet, P. et al. Molec. Immunol. 19 (1982), 1441–1549, beschriebenen
Verfahren erreicht werden.
-
Die Immunogenität von Epitop-tragenden Peptiden
kann auch durch ihre Oligomerisierung, beispielsweise in Gegenwart
von Glutaraldehyd oder eines anderen geeigneten Kupplungs-Wirkstoffs
verstärkt
werden. Insbesondere betrifft die Erfindung so erhaltene wasserlösliche immunogene
Oligomere, die besonders 2 bis 10 monomere Einheiten umfassen.
-
Die Glycoproteine, Proteine und Polypeptide
(üblicherweise
hier nachstehend als erfindungsgemäße "Antigene" bezeichnet, unabhängig davon, ob sie in einem
gereinigten Zustand aus LAV-Virus-Präparationen oder durch die rekombinante
DNA-Technologie erhalten werden) sind in Verfahren zum Nachweis
der Gegenwart von anti-LAV-Antikörpern in
biologischen Medien nützlich,
insbesondere biologischen Flüssigkeiten,
beispielsweise Seren vom Menschen oder von Tieren, insbesondere
mit Blick auf die mögliche
Diagnose von LAS oder AIDS.
-
Insbesondere betrifft die Erfindung
ein in vitro-Verfahren
zur Diagnose unter Verwendung eines Hüll-Glycoproteins (oder eines Polypeptids,
das ein Epitop dieses Glycoproteins trägt) zum Nachweis von anti-LAV-Antikörpern in
Seren von Personen, die sie tragen. Andere Polypeptide – insbesondere
die, die ein Epitop eines Kernproteins tragen – können auch verwendet werden.
-
Eine bevorzugte Ausführungsform
des erfindungsgemäßen Verfahrens
umfaßt:
- – Deponierung
einer bekannten Menge eines oder mehrerer Antigene in den Vertiefungen
einer Microtiterplatte;
- – Einführung von
ansteigenden Verdünnungen
der biologischen Flüssigkeit,
d. h. Serum zur Diagnose in diesen Vertiefungen;
- – Inkubation
der Microtiterplatte;
- – Sorgfältiges Waschen
der Microtiterplatte mit einem geeigneten Puffer;
- – Zugabe
von spezifischen, markierten Antikörpern gegen Immunglobuline
des Blutes in die Vertiefungen; und
- – Nachweis
des gebildeten Antigen-Antikörper-Komplexes,
der dann die Gegenwart von LAV-Antikörpern in der biologischen Flüssigkeit
anzeigt.
-
Es ist vorteilhaft, die anti-Immunglobulin-Antikörper mit
einem Enzym zu markieren, das aus denen ausgewählt wird, die zur Hydrolyse
eines Substrat fähig
sind, wobei das Substrat, wenigstens innerhalb eines bekannten Wellenlängenbereichs,
eine Veränderung
seiner Strahlungsabsorption erfährt.
Der Nachweis des Substrats, vorzugsweise im Vergleich mit einer
Kontrolle, liefert anschließend
einen Meßwert
der potentiellen Risiken oder des tatsächlichen Vorhandenseins der
Krankheit.
-
Derartige bevorzugte Verfahren sind
immunenzymatische- oder auch Immunfluoreszenz-Nachweise, insbesondere
gemäß dem ELISA-Verfahren.
Titrationen können
durch Immunfluoreszenz oder direkte oder indirekte immunenzymatische
Bestimmungen nachgewiesen werden. Quantitative Titrationen von Antikörpern in
den untersuchten Seren können
durchgeführt
werden.
-
Die Erfindung betrifft auch Diagnose-Kits
als solche zum in vitro Nachweis von anti-LAV-Virus-Antikörper, wobei
die Kits neben irgendeinem der hier genannten Polypeptide und sämtlichen
biologischen und chemischen Reagenzien auch die notwendige Ausstattung
zur Durchführung
diagnostischer Tests umfassen. Bevorzugte Kits umfassen sämtliche
Reagenzien, die zur Durchführung
der ELISA-Testserforderlich sind. Derart bevorzugte Kits werden
neben einem der Polypeptide, auch geeignete Puffer und anti-Mensch
Immunglobuline einschließen,
wobei die anti-Mensch Immunglobuline entweder mit einem immunfluoreszenten
Molekül oder
einem Enzym markiert werden. Im letzten Fall umfassen bevorzugte
Kits dann auch ein Substrat, das durch das Enzym hydrolisierbar
ist und ein Signal liefert, insbesondere eine veränderte Absorption
einer Strahlung, mindestens in einer bekannten Wellenlänge, wobei
das Signal anschließend
das Vorhandensein eines Antikörpers
in der mit diesem Kit zu untersuchenden biologischen Flüssigkeit
anzeigt.
-
Die unterschiedlichen erfindungsgemäßen Peptide
können
selber auch zur Produktion von Antikörpern, vorzugsweise monoclonalen
Antikörpern,
die für
die jeweils unterschiedlichen Peptide spezifisch sind, verwendet
werden. Zur Herstellung von Hybridomen, die die monoclonalen Antikörper sekretieren,
werden übliche
Herstellungs- und Absuchverfahren verwendet. Diese monoclonalen
Antikörper,
die selbst Teil der Erfindung sind, liefern dann sehr nützliche
Werkzeuge zur Identifizierung und selbst zur Bestimmung der relativen Verhältnisse
der unterschiedlichen Polypeptide oder Proteine in biologischen
Proben, insbesondere Proben vom Menschen, die LAV oder verwandte
Viren enthalten.
-
Die Erfindung betrifft ferner Wirte
(prokaryotische oder eukaryotische Zellen), die durch die vorstehend bebeschriebenen
Rekombinanten transformiert sind und die fähig sind, die DNA-Fragmente
zu exprimieren.
-
Schließlich betrifft die Erfindung
auch Vektoren zur Transformation von eukaryotischen Zellen menschlichen
Ur- sprungs, insbesondere von Lymphocyten, deren Polymerasen fähig sind,
die LTRs von LAV zu erkennen. Insbesondere sind die Vektoren durch
die Gegenwart eines darin enthaltenden LAV-LTR gekennzeichnet, wobei
der LTR dann als ein Promotor aktiv ist, der unter seiner Steuerung
in einem geeigneten Wirt die wirksame Transkription und Translation
einer ein bestimmtes Protein codierenden DNA-Insertion ermöglicht.
-
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