JP2752329B2 - リンパ節症及び後天性免疫不全症候群のウイルスのエンベロープ抗原の製造方法 - Google Patents

リンパ節症及び後天性免疫不全症候群のウイルスのエンベロープ抗原の製造方法

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Description

【発明の詳細な説明】 【０００１】本発明は、リンパ節症（リンパ節障害、以
下略称LAS と称する）及び後天性免疫不全症候群（以下
略称AIDSと称する）のウイルスのエンベロープ抗原の製
造方法、及び免疫原組成物の調製用又は該ウイルスに対
する抗体の存在の検出用としての該抗原の使用に係る。
本発明のポリペプチドは、DNA 配列によりコードされ、
グリコシル化されているか又はいないポリペプチドであ
る。 【０００２】LAS 又はAIDSの作用因子であるレトロウイ
ルスは、F. BARRE-SINOUSSI 他, Science, 220, 868(19
83) により同定されている。その特徴は以下の通りであ
る。このレトロウイルスはT-リンパ向性であり、その好
適な標的はLeu3細胞（又はT4リンパ球）により構成され
ており、Mg+ の存在を必要とする逆転写酵素活性を有し
ており、ポリ（アデニル酸−オリゴデオキシ−チミジル
酸）（ポリ（Ａ）−オリゴ (dT)12-18）に対して強い親
和性を示す。ショ糖勾配中の密度は1.16〜1.17、平均直
径が139 ナノメートル、核の平均直径は41ナノメートル
である。該ウイルスの抗原、特にタンパク質P25 はLAS
又はAIDS患者から採取した血清中に含まれる抗体により
免疫学的に認識される。コアタンパク質であるタンパク
質P25 はHTLVI 型及びII型ウイルスのタンパク質p24 に
より免疫学的に認識されない。このウイルスは更に、HT
LVI 及びHTLVIIのタンパク質p19 に対して免疫的に交差
反応性のタンパク質p19 を含んでいない。 【０００３】この型のレトロウイルス（場合によっては
一般略称LAV と称される）はパリ、パスツール研究所の
National Collection of Micro-organism Cultures(CNC
M)に寄託番号I-232,I-240 及びI-241 で寄託されてい
る。形態学的及び免疫学的な全観点から見てLAV に類似
のウイルス株は他の研究室で単離されている。例えば夫
々R.C. GALLO他，Science 224,500(1984) 及びM.G.SARN
-GADHARAN 他，Science224,506(1984) により単離されH
TLV-IIIと命名されたレトロウイルス株、更にM.JAY LEV
Y他，Science, 225,840-842(1984)により単離されARV
と称されたレトロウイルスが挙げられる。呼称を簡略に
するために、これらのウイルス及び同等の形態学的及び
免疫学的特性を有する他のウイルスを以下、一般呼称
“LAV ”と称する。LAV レトロウイルス等及びこれらの
ウイルスの抽出物の使用に関するより詳細な記載につい
ては、1983年9 月15日付英国特許出願第83 24800号を優
先権出願とする1984年9 月14日付ヨーロッパ特許出願を
参照されたい。 【０００４】まずコア抗原は、この時使用した試験系に
おいてAIDS又はLAS 感染患者の血清により認識されたウ
イルス溶解物又は抽出物の主要抗原であった。エンベロ
ープタンパク質から構成されると見なされるタンパク質
p42 も検出した。同様にしてGALLO 他は、同じくウイル
スエンベロープの予想し得る成分と見なされるタンパク
質p41 を検出した。 【０００５】LAV ウイルスの産生方法も記載されてい
る。特に前出のBARRE-SINOUSSI他の論文には、健康な成
人供与者の血液又は臍帯又は骨髄細胞から得られたT リ
ンパ球培養株中でウイルスを産生する方法が記載されて
いる。この方法は特に以下の主要な段階、即ち： −レクチンマイトジェンによる活性化後、（初めにAIDS
又はLAS 感染患者から得られた）ウイルス産生リンパ球
の生の上清液から得たウイルス懸濁液により、供与者の
T リンパ球にウイルスを感染させる段階と、 −抗αインターフェロンヒツジ血清の存在下にTCGF感染
細胞を培養する段階と、 −産生されたウイルスを精製（産生は一般に感染後 9日
〜15日の間に開始し、10〜15日間持続する）する段階と
から成り、前記精製段階は、第１の濃度のウイルスを産
生するべくポリエチレングリコール中にウイルスを沈降
させ、得られた試料を次に20〜60％のショ糖勾配又は
（オスロNYEGAARD社から商標名NYCODENZで市販されてい
る）メトリザナイド(metrizanide) の等張勾配中で遠心
分離し、密度がショ糖勾配中で1.16〜1.17又はNYCODENZ
勾配中で1.10〜1.11のバンドによってウイルスを回収す
ることから成る。 【０００６】CEM 系のようなT 型の永久細胞系から、又
は例えば1984年5 月9 日付仏国特許出願第84 07151号に
開示されているようにエプスタイン−バールウイルスで
健康な供与者から得たリンパ球を形質転換（トランスフ
ォーメーション）して得られるようなB リンパ芽球様細
胞系からLAV ウイルスを産生することもできる。得られ
た永久細胞系は、LAV ウイルスの本質的抗原及び形態学
的特徴を有するウイルス（B リンパ芽球様細胞系の場合
LAV-B で示される）を連続的に産生する（但し前記の場
合よりやや高いショ糖中の密度のバンド（特に1.18）で
収集される）。ウイルスの最終的精製はNYCODENZ勾配中
で実施してもよい。 【０００７】LAS のゲノムRNA とハイブリダイズ可能な
DNA 配列をクローニングする方法は、1984年9 月19日付
英国特許出願第84 23659号中に既に開示されている。以
下、本文中に開示される本発明の新たな改良点と共通の
内容についてはこの英国出願を参考にする。 【０００８】本発明の目的は、精製された未変容(unalt
ered) ウイルス形態（又は使用される精製処理により多
少変容したウイルス）及び該未変容精製ウイルスの取得
方法を提供することにある。 【０００９】本発明の別の目的は、LAV 又は関連するウ
イルス（以下より一般的に「LAV ウイルス群」と称す
る）の検出にも有用であるばかりでなく融通性のより大
きい、特に免疫学的方法により必ずしも直接検出し得な
い生成物を発現する該ウイルス群のゲノムDNA の特異部
分の検出に有効な付加的新規手段を提供することにあ
る。本発明の更に別の目的は、天然に存在するLAV ゲノ
ムによりコードされかつ発現されるタンパク質中に含ま
れる抗原決定基を含むポリペプチドと共通の配列を含有
するポリペプチドを提供することにある。本発明の更に
別の目的は、LAV ウイルスに関連するタンパク質を検出
するための手段、特にAIDS又はAIDS前症(pre-AIDS)の診
断用の手段、又は逆に特にAIDS又はAIDS前症感染患者あ
るいはより一般的には無症候性保菌者又は血液関連生成
物中でLAV ウイルス又はこれに関連するタンパク質に対
する抗体を検出するための手段を提供することにある。
最後に本発明の別の目的は、免疫原性ポリペプチド、よ
り特定的にはAIDS又は関連症候群に対するワクチン組成
物の調製に使用される感染防御用ポリペプチドを提供す
ることにある。 【００１０】本発明は、以下に記載するようなLAV のゲ
ノムRNA 及びLAV ウイルス群のゲノム全体に対応する付
加的cDNA変種とハイブリダイズ可能な付加的DNA フラグ
メント（断片）に関する。更に本発明は、該DNA 又はcD
NAフラグメントを含む組換DNA に関する。 【００１１】未変容精製LAV レトロウイルスは、ウイル
スが非標識システインを含まない培地1 ml当たり200 マ
イクロキュリーの割合の35S-システインにより標識され
た場合に視覚化されるに十分な量の1 個又は数個のエン
ベロープ抗原を含んでいるという点において従来のレト
ロウイルスと区別される。これらの抗原、特にグリコプ
ロテイン（糖タンパク質）は、AIDS又はLAS 感染患者の
血清又はウイルスの無症候性保菌者の血清により生体外
で選択的に認識される。 【００１２】このウイルスの溶解物から（又はウイルス
のエンベロープの軽い洗浄により）得られる前記特定に
従う好適な抗原は、既知の分子量を有する標準タンパク
質の同一の泳動(migration) 系における泳動距離と比較
した泳動距離により決定される110000ドルトン程度の分
子量を有するグリコプロテインである。特に比較用の測
定は、以下の標準タンパク質（AMERSHAMにより市販）： −リゾチーム-(14C)- メチル(MW: 14300) 、 −二酸化炭素-(14C)- メチル(MW: 30000）、 −オブアルブミン-(14C)- メチル(MW: 46000) 、 −ウシ血清アルブミン (14C)- メチル(MW: 69000) 、 −ホスホリラーゼ b-(14C)- メチル(MW: 92500) 、 −ミオシン-(14C)- メチル(MW: 200000) を使用し、18V の電圧下で18時間12.5％ポリアクリルア
ミドゲル上で実施した。 【００１３】本発明は更に、AIDSもしくはLAS 感染患者
の血清又はLAV ウイル群もしく又はその類似物にさらさ
れたヒトの血清により認識される能力を有する抗原自
体、特に分子量が約110000〜120000の抗原に関する。こ
れらの抗原は更に、コンカナバリンA との複合体を形成
するという特徴を有しており、該複合体はO-メチル- α
-D- マンノピラノシドの存在下で解離可能である。本発
明の抗原は更に例えば「レンチル- レクチン」として知
られている他のレクチンとも結合できる。分子量110000
の本発明の好適な抗原は更にエンドグリコシダーゼの作
用に対しても感受性である。この作用によって、分子量
110000の抗原から分子量約90000 のタンパク質が産生さ
れることになり、該タンパク質は例えば免疫沈降法によ
り又は分子量の差（ゲル上における泳動差）を使用する
分離法により分離可能である。 【００１４】本発明の好適な抗原はグリコプロテインか
ら構成される。 【００１５】本発明は更に、本発明のウイルスの産生方
法に係る。この方法は、最終精製工程において上記の従
来方法と本質的に異なる。特に本発明方法の精製工程は
勾配中で実施せずに、産生細胞の培地の上清に対して直
接分画遠心を行う。この遠心分離工程は、特に非ウイル
ス成分、より特定的には細胞成分を除去するべく特に10
000rpmの遠心分離角速度で実施する第１の遠心分離段階
と、ウイルス自体を沈降させるべく特に45000rpmのより
高い角速度で実施する第２の遠心分離段階とを含んでい
る。好適具体例において、10000rpmの第１の遠心分離段
階は10分間持続し、45000rpmの第２の遠心分離段階は20
分間持続する。当然のことながらこれらの値は単なる例
示であって、細胞成分とウイルス成分とを分離するため
に遠心分離条件を変更することは当業者の能力の範囲内
であると理解されるべきである。 【００１６】精製工程をこのように変更すると、従来の
方法により精製されるウイルス製剤に比較して前記抗原
を容易に単離できるようなウイルス製剤が製造される。
いずれにせよ本発明方法により最終的に得られるウイル
スは、患者又はLAV ウイルスもしくは形態学的又は抗原
的に同様の株にさらされたヒトの血清により容易に認識
される。 【００１７】本発明の抗原は任意の好適なデタージェン
トの存在下で上記ウイルスを溶解（又は他の好適な処
理）し、遊離した抗原を回収及び分離することにより上
記ウイルスから得られる。ウイルスの溶解はアプロチニ
ン又はプロテアーゼの作用を抑制するために好適な任意
の他の剤の存在下に実施することが有利である。こうし
てそれ自体既知の任意の方法により本発明の抗原を分離
することができ、例えば所定のゲル中で夫々異なる泳動
を使用することによりタンパク質を分離することが可能
であり、こうして所望のタンパク質は、分子量に関して
十分に設定された条件下の電気泳動工程でこのタンパク
質が通常見出だされるゲルの領域から単離される。一
方、レクチン、特にコンカナバリンA 又はレンチル- レ
クチンに対する親和性を利用して前記ウイルスの溶解物
（ライセート）から本発明の抗原を分離することもでき
る。使用されるレクチンは好ましくは、例えばアガロー
スに由来し商標名SEPHAROSE で市販されている架橋ポリ
マーのような固体担体に固定化される。固定された抗原
を好適な緩衝液で洗浄後、特にO-メチル- α-D- マンノ
ピラノシド溶液により任意の好適な方法で抗原を溶離さ
せることができる。 【００１８】これらの抗原のより充分な精製方法とし
て、前記タンパク質に対して有効な抗体を有することが
わかっている患者の血清、濃縮抗体製剤（ポリクローナ
ル抗体）又はより特定的には以下略称gp110 と称する分
子量110000の本発明の抗原に対するモノクローナル抗体
を使用して免疫沈降法を実施してもよい。 【００１９】本発明のその他の特徴は、添付図面を参考
に本発明のウイルス及び抗原、特に該ウイルスのエンベ
ロープ抗原の単離に関する以下の記載中で明らかとな
る。尚、図１は夫々LAV 懸濁液により感染されたT リン
パ球及び感染されない（対照）T リンパ球の溶解抽出物
の電気泳動を実施するために使用したゲルストリップの
写真複製から得られた図、第２図は完全LAV ゲノム（ク
ローンλJ19 ）の制限地図、図３はLAV ウイルスゲノム
の完全配列図、図４及び図５はLAV ゲノムRNA の3 個の
可能な読み取り相の一部及び該読み取り相の各々に現れ
る読み取り枠(ORF) を示す概略説明図、第６図はLAV の
末端長反復配列(LTR) の概略説明図である。 【００２０】Ｉ−ウイルス及び抗原の産生 健康な供与者から得、F. BARRE-SINOUSSI 他に記載の条
件下でLAV1を感染させたT リンパ球、又は白血病患者か
ら得、同様に生体外でLAVIを感染させたCEM 細胞を、20
0 マイクロキュリーの35S-システインを含んでおり且つ
非標識システインを含まない培地中で培養維持した。所
望の抗原が分解しないように、感染リンパ球は非変性培
地中で培養した。その後、非ウイルス成分を除去するべ
く培地の上清液に対して10000rpmの第１の遠心分離を10
分間実施し、次にウイルスを沈降させるべく 45000rpm
の第２の遠心分離を20分間実施した。次に、特にF. BAR
RE- SINOUSSI他の論文中に記載の条件下でアプロチニン
(5％) の存在下にウイルスペレットをデタージェントに
より溶解した。 【００２１】対照として、健康な供与者から採取したリ
ンパ球で同一の処理を行った。 【００２２】次にAIDS又はLAS の感染患者の血清により
各溶解物を免疫沈降させた。健康な供与者又は他の疾患
の感染患者からの血清についても同様の免疫沈降を実施
した。次にSDS-ポリアクリルアミドゲル中で培地を電気
泳動させた。 【００２３】結果を図１に示す。 1〜6 の番号のゲルス
トリップは、35S-システインで標識した試料から得たも
のである。 7〜10の番号のストリップは、35S-メスチオ
ニンで標識した感染又は非感染リンパ球試料で観察され
た結果を示す。更にストリップM は上記標準タンパク質
の泳動距離に対応し、この標準タンパク質の分子量は図
面の右側の部分に示してある。 【００２４】標識したウイルスタンパク質については図
面の左側に示してある。 【００２５】7〜10列は、35S-メチオニンで標識されたL
AV の特異的タンパク質p25 を示している。このタンパ
ク質は、健常リンパ球からの試料で得られた結果に対応
するストリップ 8〜10には現れていない。 【００２６】3 列及び5 列は、35S-システインで標識さ
れた感染リンパ球から得られた試料で観察された結果に
対応する。LAV の特徴的コアタンパク質であるタンパク
質p25 及びp18 並びに同様にLAV に特異的なグリコプロ
テインgp110 も現れている。余り顕著でないが、タンパ
ク質 p41（分子量が約 41000）に対応する像も各試料中
に現れている。 【００２７】本発明のウイルス及び本発明の抗原は、レ
クチン特にコンカナバリンA により沈降させるか又はセ
ファロース−コンカナバリンA カラムに固定させること
ができる。特にエンベロープグリコプロテインの精製は
次のように実施することができる。この固定は、特に好
適な緩衝液に溶解したLAV ウイルスの溶解物をセファロ
ースに結合されたコンカナバリンA と接触させることに
より実施することができる。好適な緩衝液の組成を以下
に示す。 【００２８】Tris 10mM、NaCl 0.15M、CaCl2 1m
M、MgCl2 1mM。 【００２９】商標名TRITONで市販されているデタージェ
ント1 ％ pH 7.4 固定が得られたら、同一の組成を有する緩衝液でセファ
ロース−コンカナバリンA を洗浄する。但しTRITON濃度
は0.1 ％に低下させる。次に洗浄用緩衝液に溶解した0.
2MのO-メチル- α-D- マンノピラノシド溶液により溶離
させる。 【００３０】AIDS感染患者の血清中に含まれている抗体
又は本発明の「未変容」ウイルスもしくは上記グリコプ
ロテインを予め感作された動物由来の血清から得られる
ポリクローナル抗体を使用して免疫沈降を実施すること
によりタンパク質を更に濃縮してもよい。次に十分なイ
オン性塩含有量を有する溶液により複合体を解離させ、
タンパク質を回収することができる。好ましくは、例え
ばセファロースB 型の不溶性担体にそれ自体既知の方法
で抗体製剤を固定化する。 【００３１】予めgp110 に対して用意されたハイブリド
ーマにより産生されるモノクローナル抗体を使用するこ
ともできる。これらのモノクローナル抗体及び該モノク
ローナル抗体を産生するハイブリドーマも本発明の一部
を構成するものである。 【００３２】以下、gp110 グリコプロテインに対するモ
ノクローナル抗体の産生及び選択方法について記載す
る。 【００３３】マウスの免疫感作 6〜8 週齢のBalb/cマウス群を使用した。ある群には上
記グリコプロテインを含むウイルスを感作し、別の群に
は精製したグリコプロテインgp110 を感作した。感作手
順は全マウスに共通とし、0 日目にはフロイント完全ア
ジュバントの存在下、14日目にはフロイント不完全アジ
ュバントの存在下、28日及び42日目にはアジュバントの
不在下で10mgの抗原製剤を注射した。初めの3 回の注射
は腹膜組織内、4 回目は静脈内とした。 【００３４】融合及びハイブリッドの培養 それ自体MOPC-21 細胞系に由来するアザグアニン耐性の
非分泌性ミエローマ変異細胞 5.53 P3×63 Ag8を使用す
る。45日目にFAZEKAS de st-GROTH 及びSCHEIDEGGER の
方法を用い、ポリエチレン−グリコール4000の存在中で
免疫マウス脾細胞と融合させる。同じ培養方法を用い24
カップのプレート（COSTARなる指称で公知）に入れたRP
MI 16-40「HAT 」培地中でハイブリッドを選択する。 【００３５】同質遺伝子型胸腺細胞の「支持細胞」層の
存在中で96カップのプレート中で適当な特異性をもつ抗
体産生ハイブリドーマをクローニングする。このように
して産生クローンを選択し、次に同じく胸腺細胞の存在
中で24カップのプレートで膨張させる。カップの1 つで
コンフルエンス（集密状態）が出現すると、8 日前にPR
ISTANEを注射しておいたBalb/cマウスの腹膜組織内に注
射するか及び／又は液体培地中に維持する。 【００３６】抗LAV 抗体の証明 5 種類の異なる方法の使用によって適当な特異性をもつ
抗体産生クローンの特性決定ができる。第1 段階では、
抗体産生ハイブリッドをELISA テストで測定し上清中の
マウス免疫グロブリンの存在を証明する。この第1 選択
からウイルス成分に対する抗体をもつ上清を抗LAV 抗体
の存在を証明するELISA テストを用いるか又はウイルス
産生ヒト細胞に対する免疫蛍光法によって探す。最後
に、システインでラベルしたウイルスのラジオイムノ沈
澱及びウイルス調製物に対するWestern-Blot法によって
上清を分析する。これらの方法によって抗LAV 抗体の特
異性を決定し得る。 【００３７】結 果 種々の融合から得られた細胞を648 カップで培養する。
これらの顕微鏡観察によればこれらのカップの大部分が
「HAT 」選択培地中で増殖し得る単個ハイブリッドクロ
ーンを含む。これらの50％以上がELISA 抗ウイルス検査
で陽性反応を生じる抗体を産生する。最も代表的な融合
物をWestern-Blot法でテストし抗ウイルスELISA での夫
々の特異反応性と培養条件下での夫々の挙動とを考慮に
いれながら幾つかの融合物をサブクローニングする。特
に選択されたハイブリッドは、分子量約110KD をもつウ
イルス性グリコプロテインgp110 を選択的に認識する抗
体を産生する。サブクローニングした融合物全部が抗体
産生クローンを生じる。発現後にこのクローンを同質遺
伝子型マウスに注射する。異なる腹腔液中に存在する抗
体の特異性の分析によってgp110 に対する前記腹水の抗
体の特異性が確認される。 【００３８】得られたモノクローナル抗体は、同じくgp
110 に含まれる抗原部位を含むタンパク質を精製すべく
使用され得る。従って本発明はまた、このような精製方
法に係る。この方法は、溶解以前のウイルスの精製処理
中にコントロールできないgp110 の分離が生じないよう
に配慮すれば、ウイルス溶解物又はT リンパ球溶解物又
はその他のLAV 産生細胞等にも有利に使用される。言う
までもなくこの方法はまた、gp110 又は通常エンベロー
プタンパク質に含まれておりモノクローナル抗体によっ
て認識される抗原部位を含むタンパク質もしくはポリペ
プチドもしくはグリコプロテインを含む任意の溶液に使
用できる。この方法を実施するには、モノクローナル抗
体を好ましくはアフィニティクロマトグラフィー処理に
適応させた固体担体に固定するのが有利である。例え
ば、これらモノクローナル抗体を、スエーデンの会社PH
ARMACIA A.G.により商品名SEPHAROSE で市販されている
三次元網目状のアガロース格子に例えば臭化シアン法で
固定する。 【００３９】従って本発明は更に、該当抗原の分離方法
に係る。該方法では、該当抗原を含む抗原混合物（例え
ばウイルス溶解物又は抽出物）と前記モノクローナル抗
体を担持するアフィニティカラムとを接触させ、前記モ
ノクローナル抗体によって選択的に認識されたポリペプ
チド、タンパク質又はグリコプロテインを選択的に固定
し、適当なバッファ特に適当なイオン強度の溶液例えば
塩溶液好ましくは酢酸アンモニウム溶液（これは pH2〜
4 もしくは同じpHでグリシンバッファに酸性化した調製
物又は溶液の凍結乾燥のときに残渣を生じない）を用い
て抗原抗体複合体を解離してモノクローナル抗体を回収
し、溶出したポリペプチド、タンパク質又はグリコプロ
テインを回収する。 【００４０】本発明が更に、より低い分子量をもち同じ
モノクローナル抗体によって認識され得る抗原部位を含
むポリペプチド断片（フラグメント）に係ることも自明
であろう。gp110 グリコプロテインを認識するモノクロ
ーナル抗体が入手できると、共通の抗原部位又はエピト
ープを含むより小さいペプチド配列又は断片にも本発明
方法を適用できることも当業者には明らかである。より
小さいサイズの断片を得るためには公知の方法を利用す
るとよい。例えばかかる方法では、より大きいポリペプ
チドを特異的部位で開裂し得る酵素によって原ポリペプ
チドを開裂する。このようなタンパク質として例えば、
黄色ブドウ球菌Staphylo‐coccus aureus V8 の酵素、
α−キモトリプシン、BOEHRINGER社によって市販されて
いる「マウス顎下腺プロテアーゼ」、ビブリオ菌Vibrio
alginolyticus chemovar iophagusコラゲナーゼ等
があり、これは前記ペプチドGly-Pro 及びGly-Ala 等を
特異的に認識する。 【００４１】また、LAV 変異種のゲノムから構成された
cDNAから切除された断片をクローニングすることによっ
て、ウイルスのエンベロープ抗原のポリペプチド又は断
片を得ることも可能である。 【００４２】図２及び図３は、全部で 9.1〜9.2kb から
なるかかるcDNAの制限マップである。cDNA断片でコード
されるポリペプチドは図２の制限マップのKpn Ｉ部位
（6100位置）からBgl II部位（9150位置）までの領域に
存在していた。（対応断片又は前記断片を含むベクター
で予め形質転換された適当な宿主細胞中で）発現された
任意のポリペプチド中のLAV ウイルス等のエンベロープ
抗原の特徴的部位の存在は任意の適当な免疫化学的手段
によって検出され得る。 【００４３】本発明はより特定的には、後述するcDNA断
片によってコードされるポリペプチドに係る。本発明は
更に、全LAV レトロウイルスゲノムに対応するcDNA変異
体を含み、（5'端から3'端まで）後述する順序で一連の
制限部位を含むことによって特徴付けられる核酸断片自
体に係る。 【００４４】また、全LAV ゲノムの連続部位（図１のλ
J19 の制限マップ参照）を、R 領域のHind III部位（座
標1 として選択）に対する座標として以下に示す。座標
は±200bp の正確度で推定されている。 【００４５】 【表１】 【００４６】本発明による別のDNA 変異体は任意に、座
標ほぼ5550に付加的Hind IIIを含む。 【００４７】図１は前記完全DNA(λJ19)のより詳細な制
限マップを示す。 【００４８】図4a〜図4eは本発明の好ましいDNA のより
詳細なヌクレオチド配列を示す。 【００４９】本発明は更に、後述する如き別の好ましい
DNA 断片及びポリペプチド配列（グリコシル化したもの
又はグリコシル化しないもの）に係る。 【００５０】LAV の配列決定 配列決定と特に重要な部位の決定を前出英国特許第8423
659 号に開示されたλJ19 に対応するファージ組換体に
対して実施した。この組換体の調製方法は該出願に開示
されている。 【００５１】（前記出願で開示されている）クローンλ
J19 の全組換体ファージDNA をDEININGER(1983) 、Anal
ytical Biochem.129、216 のプロトコルで超音波処理し
た。Klenow反応を16℃で12時間維持してDNA を修復し
た。DNA を 0.8％アガロースゲルで電気泳動にかけ、 3
00〜600bp のサイズのDNA を切除し電気溶出して沈澱さ
せた。(10mM Tris、pH8 、0.1mM EDTA中に)DNAを再懸濁
させ、 T4DNA−及びRNA−リガーゼ(Maniatis T 等(198
2)、分子クローニング (Molecular Cloning)、Cold Spr
ing Harbor Laboratory)を用い、（制限酵素Sma Ｉで切
断しアルカリ性燐酸塩化（ホスファターゼ処理）した）
M13mp8 RF DNA に結合した。大腸菌TGI 株を用いて更に
研究した。この菌株は以下の遺伝子型をもつ。 【００５２】Δlac pro 、supE、thi.F'traD36、proAB
、lacIq 、 ZΔM15 、 r- この大腸菌TGI 株は組換体の認識を容易にするという特
性を有する。LAV DNAの断片と組換えられていないプラ
スミドでトランスフェクトされた細胞の青色は変化しな
い。これに反して、LAV DNA 断片を含む組換体プラスミ
ドでトランスフェクトされた細胞は白色コロニーを形成
する。使用した方法はGene(1983)、26、101 に開示され
ている。 【００５３】この菌株をHanahan 法(Hanahan D(1983)、
J.Mol.Biol.166、557)を用い結合ミックスで形質転換し
た。細胞をソフトアガロース中にIPTGとX-gal とを含む
トリプトン- アガロースプレートにプレートアウトし
た。白色プラークを採取してスクリーニングするか又は
ニトロセルロースフィルターを使用しその場で(in sit
u) 直接スクリーニングした。これらDNA は、λJ19 のp
UC18Hind III サブクローンのニックトランスレートし
たDNA インサートとハイブリダイズした。これにより、
以下の表で同定されるλのプラスミド又はサブクローン
が単離できた。この表でまた注目すべきは、各プラスミ
ドの名称に添えて、パスツール研究所、パリ、フランス
の「Collection Nationale des Cultures deMicro-orga
nismes(C.N.C.M.)」に寄託した対応するプラスミドを含
む大腸菌TGI 株の細胞培養物の受託番号が付けられてい
ることである。形質転換しなかったTGI 細胞系も受託番
号I-364 でC.N.C.M.に寄託された。これら全部の寄託日
は1984年11月15日である。LAVゲノムに由来の対応する
インサートのサイズも示されている。 【００５４】 【表２】【００５５】陽性のハイブリダイズM13 ファージプレー
トを5 時間増殖させ単鎖DNA を抽出した。 【００５６】ジデオキシ法及びSanger等（Sanger等（19
77）、Proc.Natl.Acad.Sci. 、USA、74、5463及びM13
クローニング及び配列決定ハンドブック、AMERSHAM(198
3)）の方法でλJ19DNAのM13mp8サブクローンを配列決定
した。17-merオリゴヌクレオチドプライマーα−35SdAT
P （400Ci/mmol、AMERSHAM）と0.5X-5X バッファ勾配ゲ
ル(Biggen M.D.等(1983)、Proc.Natl.Acad.Sci. 、USA
、50、3963) とを使用した。Stadenのプログラム(Stad
en R.(1982)、Nucl. Acids Res.10、4731) 下でゲルを
読み取ってコンピュータに入れた。適当な参考文献及び
方法は全てAMERSHAMのM13 クローニング及び配列決定ハ
ンドブックに記載されている。 【００５７】（LAV-Iaとも指称される）λJ19 の完全DN
A 配列は図４〜図4eに示されている。 【００５８】配列はファージλJ19 インサートの配列か
ら再構成された。番号付けは（後述のごとく）、実験的
に位置決定した頭部(capsite) から始まる。重要な遺伝
要素、主要な読取枠及びその予想産生物がHind IIIクロ
ーニング部位と共に示されている。env 遺伝子中の潜在
グリコシル化部位は上部に線を引いて示されている。タ
ンパク質のマイクロ配列決定によって決定されるp25 ga
g のNH2 −末端配列は枠で囲まれている。 【００５９】各ヌクレオチドを平均5.3 回配列決定し
た。85％の配列について双方の鎖（ストランド）を決定
し残りに関しては独立のクローンから少なくとも2 回配
列決定した。塩基組成はT 22.2％、C 17.8％、A 35.8
％、 G 244.2％、及び G＋C42 ％である。ジヌクレオチ
ドGCは真核細胞配列（Bird、1980）での通例として極め
て不十分にしか示されなかった(0.9％) 。 【００６０】図５及び図６は（図５の左側の番号1,2,3
で示す）連続読取りフェーズ（相）に対応する連続読取
枠の長さを示す概略図である。LAV ゲノムのヌクレオチ
ド構造に対するこれら読取枠(ORF) の相対位置は、DNA
配列中の対応するヌクレオチドの各々の位置を示す番号
によって示される。縦の線は対応する読み終わりコドン
の位置に対応する。 【００６１】以下の遺伝子及びDNA 断片は、図示の種々
の読取枠中で識別できる。次に前記遺伝子及び断片によ
ってコードされるタンパク質又はグリコプロテインにつ
いて説明する。 【００６２】1)「gag 遺伝子」（又はORF −gag) 「gag 遺伝子」はコアタンパク質をコードする。 【００６３】gag ：gag orf の5'末端の近傍には、gago
rf中及び頭部（cap site）から最初の「典型的」開始コ
ドン(Kozak、1984)(336 位置) がある。前駆物質となる
タンパク質は500 個のアミノ酸から成る。計算分子量55
841 は55kdのgag 前駆物質たるポリペプチドと一致す
る。主要コアタンパク質p25 の N−末端アミノ酸配列は
732 位置から始まるヌクレオチド配列によってコードさ
れる（図5a参照）。これは明らかに、クローニングされ
たLAV ゲノムと免疫的に特性決定されたLAV p25 タンパ
ク質との間にリンクを形成する。p25 をコードする配列
の5'でコードされたタンパク質はむしろ親水性である。
その計算分子量14866 はgag タンパク質p18の分子量と
一致する。gag 領域の3'部は恐らくレトロウイルス核酸
結合タンパク質(NBP) をコードする。実際、HTLV-1(Sei
ki等、1983) 及びRSV(Schwartz等、1983) と同様に、全
部のNBP (Orozlan等、1984) に共通の基本単位Cys- X2
-Cys-X8-9 -Cysの重複が観察される（LAV 配列のヌクレ
オチド1509及び1572）。その機能と一致して、推定され
るNBP は極めて塩基性(17 ％、Arg ＋Lys)である。 【００６４】特にp25 、p18 及びp13 を含むコア抗原を
コードすると思われるゲノム断片(ORF−gag)は、ヌクレ
オチド位置 312(5' CTA GCG GAG 3'から始まる）とヌク
レオチド位置1835(CTCG TCA CAA 3'で終わる）との間に
位置すると思われる。前記ORF の部分でコードされるペ
プチド又はタンパク質の構造はフェーズ2 に対応する構
造であると考えられる。 【００６５】336−338 位置のATG によってコードされ
るメチオニンアミノ酸「M 」は、gag タンパク質前駆物
質の開始メチオニンである可能性が大きい。ORF-gag の
終端従ってgag タンパク質の終端は1835位置に存在する
と思われる。 【００６６】アミノ酸配列Pro-Ile-Val-Gln-Asn-Ile-Gl
n-Gly-Gln-Met-Val-His-から始まると考えられるp25 タ
ンパク質の初端は、732 位置に始まるヌクレオチド配列
CCTATA…，によってコードされると思われる。 【００６７】従って本発明はより特定的には以下のDNA
配列に係る。 【００６８】−LAV ウイルスのコアタンパク質p18 及び
p25 のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を含むと考
えられるタンパク質p55 をコードすると思われるヌクレ
オチド336 からヌクレオチド約1650までのDNA 配列 −タンパク質p25 をコードすると思われるヌクレオチド
732 からヌクレオチド約1300までのDNA 配列 −タンパク質p13 をコードすると思われるヌクレオチド
約1371からヌクレオチド約1650までのDNA 配列 −タンパク質p18 をコードすると思われるヌクレオチド
336 からヌクレオチド約611 までのDNA 配列。 【００６９】本発明は更に、前記に特定的に定義したDN
A 配列又は断片の直接翻訳によって得られた構造に対応
する構造をもつ前記断片特にタンパク質p13 、p18 、p2
5 及びp55 又はポリペプチドによってコードされるアミ
ノ酸構造をもつ精製ポリペプチドに係る。これらペプチ
ド配列は第4a図から明らかである。より特定的には本発
明は、以下のヌクレオチド位置から伸びるDNA 配列によ
ってコードされるものと等しいペプチド配列又は等価の
ペプチド配列をもつ精製ポリペプチドに係る。 【００７０】 【表３】 【００７１】p13 、p18 及びp25 はいずれも同じ前駆物
質即ちp55 に由来すると考えられることを指摘してお
く。 【００７２】本発明は更に、gag 読取枠の対応するDNA
断片によってコードされるポリペプチド断片に係る。ga
g 読取枠中の特に親水性のペプチドは後述するごとく同
定される。該ペプチドはLAV DNA 配列中の 336−338 か
ら始まるATG によってコードされたアミノ酸 1＝Met を
始めとするように定義されgag 配列中の順序にしたがっ
て番号付けされている（第3a図）。各ペプチドに関する
一番目及び二番目の数字は夫々 N−末端及び C−末端の
アミノ酸を示す。 【００７３】これら親水性ペプチドは以下のアミノ酸を
含む。 【００７４】アミノ酸12−32即ちGlu-Leu-Asp-Arg-Trp-
Glu-Lys-Ile-Arg-Leu-Arg-Pro-Gly-Gly-Lys-Lys-Lys-Ty
r-Lys-Leu-Lys 、アミノ酸37−46即ちAla-Ser-Arg-Glu-
Leu-Glu-Arg-Phe-Ala-Val-、アミノ酸49−79即ちGly-Le
u-Leu-Glu-Thr-Ser-Glu-Gly-Cys-Arg-Gln-Ile-Leu-Gly-
Gln-Leu-Gln-Pro-Ser-Leu-Gln-Thr-Gly-Ser-Glu-Glu-Le
u-Arg-Ser-Leu-Tyr-、アミノ酸88−153 即ちVal-His-Gl
n-Arg-Ile-Glu-Ile-Lys-Asp-Thr-Lys-Glu-Ala-Leu-Asp-
Lys-Ile-Glu-Glu-Glu-Gln-Asn-Lys-Ser-Lys-Lys-Lys-Al
a-Gln-Gln-Ala-Ala-Ala-Asp-Thr-Gly-His-Ser-Ser-Gln-
Val-Ser-Gln-Asn-Tyr-Pro-Ile-Val-Gln-Asn-Ile-Gln-Gl
y-Gln-Met-Val-His-Gln-Ala-Ile-Ser-Pro-Arg-Thr-Leu-
Asn-、アミノ酸 158−165 即ちVal-Val-Glu-Glu-Lys-Al
a-Phe-Ser-アミノ酸 178−188即ちGly-Ala-Thr-Pro-Gln
-Asp-Leu-Asn-Thr-Met-Leu-、アミノ酸 200−220 即ちM
et-Leu-Lys-Glu-Thr-Ile-Asn-Glu-Glu-Ala-Ala-Glu-Trp
-Asp-Arg-Val-His-Pro-Val-His-Ala-、アミノ酸 226−2
34 即ちGly-Gln-Met-Arg-Glu-Pro-Arg-Gly-Ser-、アミ
ノ酸 239−264 即ちThr-Thr-Ser-Thr-Leu-Gln-Glu-Gln-
Ile-Gly-Trp-Met-Thr-Asn-Asn-Pro-Pro-Ile-Pro-Val-Gl
y-Glu-Ile-Tyr-Lys-Arg-、アミノ酸 288−331 即ちGly-
Pro-Lys-Glu-Pro-Phe-Arg-Asp-Tyr-Val-Asp-Arg-Phe-Ty
r-Lys-Thr-Leu-Arg-Ala-Glu-Gln-Ala-Ser-Gln-Glu-Val-
Lys-Asn-Trp-Met-Thr-Glu-Thr-Leu-Leu-Val-Gln-Asn-Al
a-Asn-Pro-Asp-Cys-Lys-、アミノ酸 352−361 即ちGly-
Val-Gly-Gly-Pro-Gly-His-Lys-Ala-Arg-、アミノ酸 377
−390 即ちMet-Met-Gln-Arg-Gly-Asn-Phe-Arg-Asn-Gln-
Arg-Lys-Ile-Val-、アミノ酸 399−432 即ちGly-His-Il
e-Ala-Arg-Asn-Cys-Arg-Ala-Pro-Arg-Lys-Lys-Gly-Cys-
Trp-Lys-Cys-Gly-Lys-Glu-Gly-His-Gln-Met-Lys-Asp-Cy
s-Thr-Glu-Arg-GLn-Ala-Asn-、アミノ酸 437−484 即ち
Ile-Trp-Pro-Ser-Tyr-Lys-Gly-Arg-Pro-Gly-Asn-Phe-Le
u-Gln-Ser-Arg-Pro-Glu-Pro-Thr-Ala-Pro-Pro-Glu-Glu-
Ser-Phe-Arg-Ser-Gly-Val-Glu-Thr-Thr-Thr-Pro-Ser-Gl
n-Lys-Gln-Glu-Pro-Ile-Asp-Lys-Glu-Leu-Tyr-、アミノ
酸 492−498 即ちLeu-Phe-Gly-Asn-Asp-Pro-Ser-。 【００７５】本発明は更にこれらペプチドの任意の組み
合わせに係る。 【００７６】2)「pol 遺伝子」（すなわちＯＲＦ−pol) pol ：この逆転写酵素遺伝子は 1,003個までのアミノ酸
を有するタンパク質をコードし得る（算出ＭＷ＝11362
9）。第１メチオニンコドンは読取り枠のオリジン（開
始点）から92個目のトリプレットであるため、このタン
パク質はスプライスされたメッセンジャーＲＮＡから翻
訳される可能性があり、従ってgag-pol ポリタンパク質
前駆体が形成される可能性がある。 【００７７】pol コーディング領域は他のレトロウィル
スタンパク質配列とかなりのホモロジーが（相同）発見
された唯一の領域である。現在３つのホモロジー領域
（ドメイン）が明らかにされており、その第１は17個の
アミノ酸を含む極めて短い領域からなる（1856から開
始）。ホモロジー領域はp15gagRSV プロテアーゼ内に位
置し（Ｄittmar及びＭoelling 1978年）、読取り枠によ
ってコードされたポリペプチドはＨＴＬＶ−１のgag と
pol との間に位置する（図５）（Ｓchwartz 他、1983
年，Ｓeiki他、1983年）。従ってこの第１領域はウィル
スのプロテアーゼ内の保存配列に対応し得る。３つのゲ
ノム内における該領域の別の位置は重要ではないと思わ
れる。何故ならレトロウィルスはスプライシング又は他
のメカニズムによってgag-pol ポリタンパク質前駆体を
発現するからである（Ｓchwartz 他、1983年，Ｓeiki
他、1983年）。第２の、そして最長のホモロジー領域
（2048から開始）は恐らく逆転酵素のコア配列を表わ
す。アミノ酸 250個分の領域では、最小限の挿入又は欠
失のみを伴って、ＬＡＶのアミノ酸同一性はＲＳＶに対
して38％、ＨＴＬＶ−Ｉに対して25％、Ｍo Ｍu ＬＶに
対して21％を示し（Ｓchinnick他、1981年）、ＨＴＬＶ
−Ｉ及びＲＳＶは同一領域内で38％の同一性を示す。第
３のホモロジー領域はpol 読取り枠の３′端に位置し、
エキソヌクレアーゼ活性を持つＲＳＶのpp32ペプチドの
一部分に対応する（Ｍisra他、1982年）。この場合もＨ
ＴＬＶ−１に対するより対応ＲＳＶ配列に対するホモロ
ジーの方が大きい。 【００７８】図４ａから図４ｃは、pol 遺伝子に対応す
ると考えられるヌクレオチド位置1631（５′ＴＴＴ Ｔ
ＴＴ……３′から出発）からヌクレオチド位置5162に亘
って延びるＤＮＡフラグメントも示している。対応ポリ
ペプチドのポリペプチド構造は相（phase)1 に対応する
構造であると見なされる。これは位置4639で停止する
（５′Ｇ ＧＡＴ ＧＡＧ ＧＡＴ３′で終止。）。 【００７９】これらの遺伝子はウィルスポリメラーゼ即
ち逆転写酵素をコードすると考えられる。 【００８０】3)エンベロープ遺伝子（即ちＯＲＦ−env) env ：env 読取り枠は始めにかなり近い部分（８番目の
トリプレット）に可能なイニシエーターメチオニンコド
ンを有する。もしそうであれば、env 前駆体と考えられ
るタンパク質(861個のアミノ酸、算出ＭＷ＝97376)の分
子量はＬＡＶグリコプロテインの大きさと一致する（グ
リコシダーゼ処理後110Kd 及び90Kd）。潜在的Ｎ−グリ
コシル化部位（Ａsn−Ｘ−Ｓer／Ｔhr）は32箇所あり、
これらは第４ｄ図及び第４ｅ図にオーバーラインで示さ
れている。env の興味をひく特徴の１つはタンパク質の
両端に存在するＴrp残基の数が極めて多いことにある。 【００８１】エンベロープタンパク質をコードすると考
えられるＤＮＡ配列は、ヌクレオチド位置5746（５′Ａ
ＡＡ ＧＡＧ ＧＡＧＡ ……３′から開始）からヌク
レオチド位置8908（…Ａ ＡＣＴ ＡＡＡ ＧＡＡ
３′で終了）まで延在すると考えられる。エンベロープ
タンパク質の配列のポリペプチド構造は「相３」読取り
相に従って読取られる構造に相当する。 【００８２】env 転写は位置 5767-5769のＡＴＧコドン
のレベルで開始されると考えられる。 【００８３】シグナルペプチド（ヌクレオチド5815-585
0bp によってコード）と、第２領域（7315-7350bp ）
と、トランスメンブランセグメント（7831-7890bp ）と
に対応してレトロウィルスエンベロープタンパク質に特
有の疎水領域が３つ存在する（Ｓeiki他、1983年）。第
２疎水領域（7315-7350bp)の前にはＡrg＋Lys に富んだ
区間が存在する。これはタンパク質加水分解切断の部位
を表わしている可能性があり、これにより、他のレトロ
ウィルスタンパク質との類似性から類推して、外側エン
ベロープポリペプチドとメンブラン結合タンパク質とを
形成すると思われる（Ｓeiki他、1983年，Ｋiyokawa
他、1984年）。ＬＡＶエンベロープタンパク質配列の注
目すべき特徴は、トランスメンブランタンパク質をコー
ドするセグメントが異常な長さ(150残基）を有すること
にある。このenv タンパク質はタンパク質データバンク
のどの配列に対してもホモロジーを示さない。あらゆる
白血病誘発性レトロウィルスのトランスメンブランタン
パク質に共通の小アミノ酸パターン（Ｃianciolo他、19
84年）はＬＡＶenv には存在しない。 【００８４】本発明はより特定的には、ヌクレオチド約
の辺りで始まるgp110 （約 110,000ダルトンの分子量
を持つＬＡＶウィルスのエンベロープグリコタンパク
質）をコードすると見なされるヌクレオチド5767からヌ
クレオチド7314まで伸びるＤＮＡ配列と、最初は約90,0
00ダルトンと信じられ、後に55,000であることが判った
概略分子量を有するグリコタンパク質配列に相当するグ
リコタンパク質配列のポリペプチド骨格（バックボー
ン）とに係る。gp110 の糖残基を完全に除去した結果の
ポリペプチドは、前記gp110 の適当なグリコシダーゼ処
理によって得られる。 【００８５】本発明は更に、前記により明確に特定した
ＤＮＡ配列及びフラグメント（図４ｄ及び図４ｅ）の直
接翻訳に対応し、夫々gp110 及びgp90のアミノ酸構造
（又はポリペプチドバックボーン）を有する精製ポリペ
プチドにも係わる。 【００８６】本発明は中和エピトープを含むポリペプチ
ドにも係わる。 【００８７】中和エピトープの位置は図４ｄで更に明ら
かである。より特定的にはエンベロープタンパク質のア
ミノ酸配列（読取り相３）に含まれるオーバーラインで
示した３文字グループを参照されたい。これらは一般的
には式Ａsn−Ｘ−Ｓer又はＡsn−Ｘ−Ｔhrで示される。
Ｘは他の任意のアミノ酸である。従って前記env グリコ
プロテインの最初のタンパク産物又はポリペプチドバッ
クボーンの分子量は91,000を越える。これらのグループ
は通常グリコシル化された残基を担持すると思われる。
これら付加されたグリコシル化残基をもつＡsn−Ｘ−Ｓ
er及びＡsn−Ｘ−Ｔhr残基は前記タンパク質の親水領域
を構成し、且つ該タンパク質の正常のコンホーメーショ
ン（立体配置）の周辺部に位置してこのコンホーメーシ
ョンに対し外側に露出されていると思われる。従ってこ
れらはワクチン組成物において効果的に使用し得るエピ
トープであると考えられる。 【００８８】このように本発明はより特定的には、env
タンパク質に含まれ、このタンパク質から切り出され得
る（又は同一のアミノ酸構造を有する）ペプチド配列に
係る。これらペプチド配列は200 個のアミノ酸を越えな
いような大きさを有する。 【００８９】本発明の好ましいペプチド（以後ａ，ｂ，
ｃ，ｄ，ｅ，ｆと称する）は、夫々下記の位置にまたが
るヌクレオチド配列によってコードされるペプチドに相
当すると見なされる。 【００９０】ａ） ほぼ6171〜ほぼ6276まで、 ｂ） ほぼ6336〜ほぼ6386まで、 ｃ） ほぼ6466〜ほぼ6516まで、 ｄ） ほぼ6561〜ほぼ6696まで、 ｅ） ほぼ6936〜ほぼ7006まで、 ｆ） ほぼ7611〜ほぼ7746まで、 env 読取り枠内の他の親水性ペプチドとしては後記のも
のが挙げられる。これらのペプチドはＬＡＶ ＤＮＡ配
列（第４ｄ図及び第４ｅ図）中の位置 5746-5748でＡＡ
Ａによりコードされるアミノ酸１＝リシンから始まると
定義され、以後末端配列に対する順序に従って番号付け
される。各ペプチドに関する第１及び第２の数字は、そ
のペプチドのＮ末端アミノ酸及びＣ末端アミノ酸を示
す。 【００９１】これらの親水性ペプチドとしては下記のも
のが挙げられる。 【００９２】アミノ酸8-23、即ちMet-Arg-Val-Lys-Glu-
Lys-Tyr-Gln-His-Leu-Trp-Arg-Trp-Gly-Trp-Lys-、アミ
ノ酸 63-78、即ちSer-Asp-Ala-Lys-Ala-Tyr-Asp-Thr-Gl
u-Val-His-Asn-Val-Trp-Ala-Thr-、アミノ酸 82-90、即
ちVal-Pro-Thr-Asp-Pro-Asn-Pro-Gln-Glu-、アミノ酸97
-123、即ちThr-Glu-Asn-Phe-Asn-Met-Trp-Lys-Asn-Asp-
Met-Val-Glu-Gln-Met-His-Glu-Asp-Ile-Ile-Ser-Leu-Tr
p-Asp-Gln-Ser-Leu-、アミノ酸 127-183、即ちVal-Lys-
Leu-Thr-Pro-Leu-Cys-Val-Ser-Leu-Lys-Cys-Thr-Asp-Le
u-Gly-Asn-Ala-Thr-Asn-Thr-Asn-Ser-Ser-Asn-Thr-Asn-
Ser-Ser-Ser-Gly-Glu-Met-Met-Met-Glu-Lys-Gly-Glu-Il
e-Lys-Asn-Cys-Ser-Phe-Asn-Ile-Ser-Thr-Ser-Ile-Arg-
Gly-Lys-Val-Gln-Lys-、アミノ酸 197-201、即ちLeu-As
p-Ile-Ile-Pro-Ile-Asp-Asn-Asp-Thr-Thr-、アミノ酸 2
39-294、即ちLys-Cys-Asn-Asn-Lys-Thr-Phe-Asn-Gly-Th
r-Gly-Pro-Cys-Thr-Asn-Val-Ser-Thr-Val-Gln-Cys-Thr-
His-Gly-Ile-Arg-Pro-Val-Val-Ser-Thr-Gln-Leu-Leu-Le
u-Asn-Gly-Ser-Leu-Ala-Glu-Glu-Glu-Val-Val-Ile-Arg-
Ser-Ala-Asn-Phe-Thr-Asp-Asn-Ala-Lys-、アミノ酸 300
-327、即ちLeu-Asn-Gln-Ser-Val-Glu-Ile-Asn-Cys-Thr-
Arg-Pro-Asn-Asn-Asn-Thr-Arg-Lys-Ser-Ile-Arg-Ile-Gl
n-Arg-Gly-Pro-Gly-Arg-、アミノ酸 334-381、即ちLys-
Ile-Gly-Asn-Met-Arg-Gln-Ala-His-Cys-Asn-Ile-Ser-Ar
g-Ala-Lys-Trp-Asn-Ala-Thr-Leu-Lys-Gln-Ile-Ala-Ser-
Lys-Leu-Arg-Glu-Gln-Phe-Gly-Asn-Asn-Lys-Thr-Ile-Il
e-Phe-Lys-Gln-Ser-Ser-Gly-Gly-Asp-Pro-、アミノ酸 3
97-424、即ちCys-Asn-Ser-Thr-Gln-Leu-Phe-Asn-Ser-Th
r-Trp-Phe-Asn-Ser-Thr-Trp-Ser-Thr-Glu-Gly-Ser-Asn-
Asn-Thr-Glu-Gly-Ser-Asp-、アミノ酸 466-500、即ちLe
u-Thr-Arg-Asp-Gly-Gly-Asn-Asn-Asn-Asn-Gly-Ser-Glu-
Ile-Phe-Arg-Pro-Gly-Gly-Gly-Asp-Met-Arg-Asp-Asn-Tr
p-Arg-Ser-Glu-Leu-Tyr-Lys-Tyr-Lys-Val-、アミノ酸 5
10-523、即ちPro-Thr-Lys-Ala-Lys-Arg-Arg-Val-Val-Gl
n-Arg-Glu-Lys-Arg-、アミノ酸 551-577、即ちVal-Gln-
Ala-Arg-Gln-Leu-Leu-Ser-Gly-Ile-Val-Gln-Gln-Gln-As
n-Asn-Leu-Leu-Arg-Ala-Ile-Glu-Ala-Gln-Gln-His-Leu
-、アミノ酸 594-603、即ちAla-Val-Glu-Arg-Tyr-Leu-L
ys-Asp-Gln-Gln-、アミノ酸 621-630、即ちPro-Trp-Asn
-Ala-Ser-Trp-Ser-Asn-Lys-Ser-、アミノ酸 657-679、
即ちLeu-Ile-Glu-Glu-Ser-Gln-Asn-Gln-Gln-Glu-Lys-As
n-Glu-Gln-Glu-Leu-Leu-Glu-Leu-Asp-Lys-Trp-Ala-、ア
ミノ酸 719-758、即ちArg-Val-Arg-Gln-Gly-Tyr-Ser-Pr
o-Leu-Ser-Phe-Gln-Thr-His-Leu-Pro-Thr-Pro-Arg-Gly-
Pro-Asp-Arg-Pro-Glu-Gly-Ile-Glu-Glu-Glu-Gly-Gly-Gl
u-Arg-Asp-Arg-Asp-Arg-Ser-Ile-、アミノ酸 780-803、
即ちTyr-His-Arg-Leu-Arg-Asp-Leu-Leu-Leu-Ile-Val-Th
r-Arg-Ile-Val-Glu-Leu-Leu-Gly-Arg-Arg-Gly-Trp-Glu
-。 【００９３】本発明はこれらのペプチドを任意に組合わ
せたものにも係る。 【００９４】4)他のＯＲＦ 本発明は更に、ＯＲＦ−Ｑ，ＯＲＦ−Ｒ及び 1,2,3,4,5
として規定されている読取り枠を与えるＤＮＡ配列にも
係る。これらの枠の相対位置は特に図２及び図３に示さ
れている。 【００９５】これらのＯＲＦは下記の位置を有する。 【００９６】 【表４】 【００９７】ＯＲＦ Ｑ及びＦ ＬＡＶゲノムのウィルス（＋）ストランド（鎖）は、コ
ア構造タンパク質(gag) 、逆転写酵素(pol) 及びエンベ
ロープタンパク質(env) をコードする法定レトロウィル
ス遺伝子と、更に別の２つの読取り枠(orf) とを含むこ
とが判明した（表１）。この２つの枠を以後Ｑ及びＦと
称する。ＬＡＶの遺伝子構造５′ＬＴＲ−gag −pol −
Ｑ−env −Ｆ−３′ＬＴＲは他に類を見ない。全ての複
製能のあるレトロウィルスでpol 及びenv の遺伝子は互
いに重なり合うが、ＬＡＶではこれら遺伝子が４つの小
さい（＜100 トリプレット）orf の前のorf Q (192個の
アミノ酸）によって分離される。orf Ｆ（206 個のアミ
ノ酸）はenv の３′端に少しだけ重なり、且つＬＴＲの
Ｕ３領域によって半分コードされるという特徴を有す
る。 【００９８】このような構造によりＬＡＶは、先に配列
決定されたレトロウィルスとは明確に区別される（図
２）。（−）ストランドは明らかに非コード鎖である。
ＬＡＶクローンλＪ81の（λＪ19に対して）余分のＨin
d III 部位はＱ及びenv 間の明らかに非コーディング領
域（位置5166-5745)にある。単一の塩基（アンダーライ
ンを付してある）によってＨind III 認識配列とは異な
る配列（ＡＡＧＣＣＴ）が位置5501から始まっている。
種々の単離体の間の制限部位多型現象の多くがこの領域
にマップされることが予想される。クローンλＪ81は19
84年 9月15日出願の英国特許出願第84 23659号にも記載
されている。 【００９９】Ｑ及びＦ 表１にこれらの枠の末端におけるヌクレオチド位置を示
した。 【０１００】orf Ｑの位置はレトロウィルス構造におい
ては先例のないものであり、orf ＦはＬＴＲのＵ３エレ
メント（要素）によってその半分がコードされるという
点で独特である。どちらのorf も「強い」イニシエータ
ーコドン（Ｋozak 1984 年）をその５′端近傍に有し、
夫々 192個のアミノ酸からなるタンパク質（算出ＭＷ＝
22487)及び 206個のアミノ酸からなるタンパク質（算出
ＭＷ＝23316)をコードし得る。これらの推定タンパク質
は双方共親水性であり(pＱ49％極性、15.1％Ａrg＋Ｌy
s;pＦ46％極性、11％Ａrg＋Ｌys）、従って膜に直接結
合することはないと思われる。これら推定タンパク質 p
Ｑ及び pＦの機能は、タンパク質配列データバンクをス
クリーニングしてもホモロジーが全く発見されないため
予知し得ない。orf ＦとＨＴＬＶ−１の pＸタンパク質
との間には検出し得るホモロジーはない。加えて、これ
ら両者の疎水性／親水性プロフィルは完全に異なってい
る。レトロウィルスが細胞遺伝子、特に始原腫瘍遺伝子
（proto-oncogene）を導入し得ることは既に知られてい
る（Ｗeinberg 1982年）。我々はorf Ｑ及びＦが外因性
遺伝子物質を表わすのであって、細胞ＤＮＡの何らかの
痕跡を表わすのではないと考える。何故なら（Ｉ）ＬＡ
Ｖ ＤＮＡはストリンジェントな（緊縮）条件ではヒト
ゲノムとハイブリダイズしないし（Ａlizon 他、1984
年）、（II）orfＱ及びＦのコドン使用頻度はgag ，pol
及びenv 遺伝子に比肩する（データ示さず）からであ
る。 【０１０１】第６図に再構築ＬＴＲの構造とウィルスの
フランキングエレメントとを概略的に示した。このＬＴ
Ｒは638bp の長さを有し、通常の特徴を示す（Ｃhen 及
びＢarker 、1984年）：（Ｉ）保存ＴＧジヌクレオチド
を含む逆方向反復（５′ＡＣＴＧ）によってその境界が
限定される（Ｔemin、1981年）；（II）５′ＬＴＲに隣
接してｔＲＮＡ3 lys と相補的なｔＲＮＡプライマー結
合部位（ＰＢＳ）がある（Ｒaba 他、1979年）；（III
）３′ＬＴＲに隣接して完全な15bpポリプリントラク
トがある。ヌクレオチド 8200-8800の間に見られる他の
３つのポリプリントラクトの後には前記ＰＢＳの直前の
配列と相補的な配列は続かない。Ｕ５，Ｒ及びＵ３エレ
メントの境界は次のように決定された。Ｕ５はＰＢＳ
と、オリゴ（ｄｔ）でプライムしたＬＡＶc ＤＮＡの
３′端の配列から確立されたポリアデニル化部位との間
に位置する（Ａlizon 他、1984年）。従ってＵ５の長さ
は84bpである。Ｒ＋Ｕ５の長さはｔＲＮＡでプライムし
たＬＡＶｃＤＮＡを合成することによって決定した。プ
ライマーのアルカリ性加水分解の後ではＲ＋Ｕ５の長さ
は181±1bp であった。従ってＲの長さは97bpであり、
その５′端でのキャッピング部位の位置が決定され得
る。またＵ３は456bp の長さを有する。ＬＡＶ ＬＴＲ
は特徴的な調節エレメント、即ちＲ−Ｕ５接合部から19
bpのポリアデニル化シグナル配列ＡＡＴＡＡＡと、キャ
ップ部位の５′の22bpのＴＡＴＡボックスと思われるＡ
ＴＡＴＡＡＧ配列とをも含む。ＬＴＲ内にはこれ以外の
直接反復は存在しない。興味深いことに、このＬＡＶ
ＬＴＲはマウス乳腺腫瘍ウィルス（ＭＭＴＶ）のＬＴＲ
と類似した点を幾つか有する（Ｄonehower他、1981
年）。例えばこれら両者のＬＴＲはいずれも（−）スト
ランド合成のプライマーとしてｔＲＮＡ3 lys を使用す
る。これに対し現時点で知られている他の総ての外因性
哺乳動物レトロウィルスはｔＲＮＡpro を使用する（Ｃ
hen 及びＢarker 、1984年）。また、これらのＬＴＲは
極めて類似したポリプリントラクトを有する（ＬＡＶの
場合ＡＡＡＡＧＡＡＡＡＧＧＧＧＧＧ、ＭＭＴＶの場合
ＡＡＡＡＡＡＧＡＡＡＡＡＧＧＧＧＧ）。ウィルス
（＋）ストランド合成は断続的である可能性がある。何
故なら３′ＬＴＲのＵ３エレメントの両側のポリプリン
トラクトはorf pol の３′端において 4331-4336で正確
に重複するからである。更に、ＭＭＴＶ及びＬＡＶはＵ
３エレメントがorf をコードし得るという点で他とは異
なる。ＭＭＴＶの場合はＵ３がorf 全体を含むが、ＬＡ
Ｖの場合はＵ３はorf Ｆの３′側半分のコドン 110個を
含む。 【０１０２】ＬＡＶの末端の長い繰返し配列（ＬＴＲ）
を第６図に示した。前述の如くこのＬＴＲはＨind III
クローニング部位に隣接する配列を併置することによっ
てλＪ19の配列から再構築したものである。 【０１０３】オリゴ（ｄＴ）でプライムしたＬＡＶ Ｄ
ＮＡクローン pＬＡＶ75 （Ａlizon 他、1984年）の配
列決定によるとＬＡＶのＲ領域におけるＨind III 部位
のクラスターの可能性は除外される。ＬＴＲは逆方向反
復配列（ＩＲ）によってその境界が限定される。ＬＴＲ
の両側のウィルスエレメントは双方とも５′ＬＴＲのｔ
ＲＮＡプライマー結合部位（ＰＢＳ）及び３′ＬＴＲの
ポリプリントラック（ＰＵ）として表わされてきた。推
定されるのＴＡＴＡボックス、キャップ部位、ポリデニ
ル化シグナル（ＡＡＴＡＡＡ）及びポリアデニル化部位
（ＣＡＡ）も示されている。読取り枠Ｆ（ 648個のヌク
レオチド）の位置はＬＴＲ説明図の上方に示されてい
る。 【０１０４】ＬＴＲ（末端の長い反復配列）は位置8560
と位置 160との間に延在するものとして規定することも
できる（先端は位置9097/1にわたって延びる）。実際、
ゲノムの終端は9097に位置し、レトロウィルスのＬＴＲ
構造に起因して下記の配列の冒頭につながる。 【０１０５】 【表５】 【０１０６】ウィルス読取り枠の位置及び大きさを表１
にまとめた。ヌクレオチドの座標は第１トリプレットと
第１メチオニン開始コドン（Ｍet）と、終止コドン（ス
トップ）との第１塩基を指示する。アミノ酸の数及び算
出分子量（ＭＷ）はpol を除いて第１メチオニンから終
端までの非修飾前駆体生成物に関して計算したものであ
る。pol の大きさ及びＭＷはorf 全体の大きさ及びＭＷ
を示す。 【０１０７】 【表６】 【０１０８】本発明はより特定的には、読取り枠に対応
する前述の総ての特定ＤＮＡフラグメントに係わる。当
業者はこれら全てのＤＮＡフラグメントを得るのに、例
えばＬＡＶ種の完全ゲノムに対応する全ＤＮＡを適切な
制限酵素による部分的又は全体的消化によって切断する
などし、次いで所望のフラグメントを回収することがで
きると理解されたい。前述の種々のＤＮＡはまた、適切
なフラグメントの源として使用することもできる。前述
のプラスミドに含ませ且つＤＮＡ配列決定に使用された
フラグメントを分離するための下記の如き技術が使用可
能である。 【０１０９】勿論他の方法を使用してもよい。その一例
は1984年 9月19日出願の英国特許出願第 8423659号に記
載されている。下に使用し得る方法を数例挙げる。 【０１１０】a) ＤＮＡを、リン酸カルシウム沈澱，ポ
リエチレングリコ―ル，プロトプラスト融合，等々種々
の方法により適切な選択マーカと共に哺乳動物細胞内に
トランフェクトする。 【０１１１】b) 遺伝子に対応するＤＮＡフラグメント
を、大腸菌，イースト（酵母）又は哺乳動物細胞用の発
現ベクター中にクローニングし、得られたタンパク質を
精製する。 【０１１２】c) 融合ポリペプチドを生成させるべくプ
ロウィルスＤＮＡを「ショット−ガン処理」（断片化）
して原核生物発現ベクター中に導入する。抗原として作
用し得る融合タンパク質を産生する組換体はＬＡＶ抗原
に対する抗体を用いてこれら組換体をスクリーニングす
るだけで同定できる。 【０１１３】本発明は更に、前記ＤＮＡ配列のいずれか
を含み且つ対応微生物又は細胞、特にイースト、例えば
サッカロミセスセレビシアエ（saccharomyces cerevisi
ae）の如き真核細胞、又はより高等な真核細胞、特に哺
乳動物細胞を軽質転換させ且つ前記ＤＮＡ配列を対応微
生物又は細胞中で発現させるのに適するようにしたＤＮ
Ａ組換体、特に修飾ベクターにも係わる。この種の一般
的方法は1984年11月16日出願の前出の英国特許出願 842
9099号に記述されている。 【０１１４】本発明はより特定的には前述のＤＮＡ配列
によって修飾され且つより高等な真核細胞特に哺乳動物
細胞を軽質転換させ得るような被修飾ＤＮＡ組換体ベク
ターに係わる。前記配列はいずれも、前記ベクターに含
まれ且つ前記細胞のポリメラーゼによって認識されるプ
ロモーターの直接制御下で、第１発現ヌクレオチドコド
ンが前述の如く規定されたＤＮＡ配列の第１トリプレッ
トに対応するように配置されるのが好ましい。従って本
発明は更に、任意の適切な方法によってＬＡＶゲノム又
は対応ｃＤＮＡから得ることができるような対応ＤＮＡ
フラグメントにも係わる。そのための方法としては、例
えば、制限酵素を用いて好ましくは前記フラグメントを
包囲し且つこれらフラグメントの対向末端に夫々近い制
限部位のレベルで前記ＬＡＶゲノム又はｃＤＮＡを切断
し、大きさに応じて所望のフラグメントの回収及び同定
を行ない、必要であればこれらフラグメントの制限マッ
プ又はヌクレオチド配列をチェックし（又は前記ＤＮＡ
フラグメントによりコードされたポリペプチドに担持さ
れるエピトープに対して特異的に作用するモノクローナ
ル抗体との反応を用いる）、更に必要であれば、前記Ｄ
ＮＡフラグメントの末端の所望のヌクレオチド配列を制
御する目的で、又は逆に前記末端をＫlenow酵素によっ
て修復し場合によっては前記フラグメントを前記フラグ
メントのヌクレオチド末端を再構築すべく設計された合
成ポリヌクレオチドフラグメントに結合する目的で、た
とえばＢａｌ 31 のようなエキソヌクレアーゼによって
フラグメントの末端を処理する方法がある。これらのフ
ラグメントは次いで前記のいずれかのベクターに挿入し
得、このベクターで形質転換された細胞により対応ポリ
ペプチドを発現させ得る。対応ポリペプチドは次いで必
要であれば細胞の溶解後に形質転換細胞から回収でき、
電気泳動の如き方法によって精製し得る。これらの操作
を行なうには勿論、任意の従来技術を使用し得る。 【０１１５】本発明は更に、本発明の任意のＤＮＡフラ
グメントを出発材料とし得るクローニングされたプロー
ブにも係り、従ってこの種のフラグメントを含む組換体
ＤＮＡ特に原核細胞又は真核細胞中で増幅し得且つ前記
フラグメントを担持する任意のプラスミドにも係わる。 【０１１６】クローン化ＤＮＡフラグメントを−放射
性ヌクレオチド又は螢光試薬によって標識することによ
り−分子ハイブリダイゼーションプローブとして使用
すれば、血液中、体液中、血液製剤（例えば第VIII因子
濃縮物の如き抗血友病因子）中及びワクチン、即ちＢ型
肝炎ワクチン中でＬＡＶヴィリオンＲＮＡが直接検出さ
れ得る。ＬＡＶ産生細胞の培養上澄み中に全ウィルスが
検出され得ることは既に判明している。この検出を行な
うための適切な方法の１つは、ウィルスをサポート（担
体）、例えばニトロセルロースフィルタ等の上に固定化
し、ヴィリオンを破砕して（放射性標識又は「コール
ド」な螢光標識、又は酵素標識により）標識されたプロ
ーブとハイブリダイズさせることからなる。この種の方
法は末梢血液中のＢ型肝炎ウィルスに関して既に開発さ
れている（ＳＣＯＴＴＯ Ｊ．他著Ｈepatology （1983
年), 3 , 379-384参照）。 【０１１７】本発明のプローブは更に、プロウィルスＤ
ＮＡ又はＲＮＡが宿主の組織及び他の組織中に存在する
か否かを検出すべく、ＬＡＶに係わる症状を示す患者の
組織から誘導したゲノムＤＮＡの高速スクリーニングを
行なうためにも使用し得る。 【０１１８】このようなスクリーニングに使用できる方
法の１つは下記のステップからなる。ＤＮＡを組織から
抽出し、このＤＮＡを制限酵素によって切断し、フラグ
メントを電気泳動にかけ、組織からのゲノムＤＮＡのサ
ザンブロッティング（Ｓouthern blotting）を行ない、
次いで標識されたクローン化ＬＡＶプロウィルスＤＮＡ
とハイブリダイズさせる。その場でハイブリダイズさせ
る方法をとってもよい。 【０１１９】他の進化的に関連するレトロウィルスの存
在を調べるべく、ヒト，霊長目及び他の哺乳動物種のリ
ンパ液及びリンパ組織ならびに非リンパ組織をスクリー
ニング処理することもできる。この場合も前述の方法を
使用し得る。但し、ハイブリダイゼーション及び洗浄は
非ストリンジェントな条件で実施する。 【０１２０】本発明のＤＮＡ又はＤＮＡフラグメント
は、診断の目的でＬＡＶウィルス抗原を発現させるため
にも使用できる。 【０１２１】本発明は一般的には、化学合成されたも
の、ウィルス試料から分離されたもの、又は本発明の種
々のＤＮＡによって発現されたもの、特に対応ＤＮＡに
より予め修飾された適切なベクターによって形質転換し
た後でこれらＤＮＡのＯＲＦもしくはそのフラグメント
により適当な宿主、特に原核或いは真核宿主中に発現さ
れたものの総てを含めたポリペプチド自体に係わる。 【０１２２】概して本発明は、ＬＡＶタンパク質あるい
は糖タンパク質に特有なエピトープを有するあらゆるポ
リペプチドフラグメント（あるいは分子、特に上述のポ
リペプチドと同じポリペプチドバックボーンを有する糖
タンパク質）にも係わり、前記ポリペプチドあるいは分
子のＮ末端及びＣ末端はそれぞれ遊離しているか、ある
いはまた互いに独立に、通常ＬＡＶウィルスのより大き
いポリペプチドあるいは糖タンパク質のＮ末端やＣ末端
に結合しているアミノ酸以外のアミノ酸と共有結合して
いる。これらアミノ酸はそれ自体遊離しているかまたは
別のポリペプチド配列に属する。本発明は特に、先に特
定したエピトープ保有ポリペプチドであって、通常ＬＡ
Ｖタンパク質にとって異質である他のポリペプチドフラ
グメントと再結合した（組み換えられた）もののいずれ
かを含有するハイブリッドポリペプチドに係わり、上記
異質なポリペプチドフラグメントはエピトープ保有ポリ
ペプチドの免疫原性を増大するに充分な大きさを有する
が、該フラグメント自体は免疫原性的に不活性である
か、あるいはエピトープ保有ポリペプチドの免疫原性を
妨げないものである。 【０１２３】150個まで、場合によっては 250個までの
アミノ酸を含み得る上記のようなハイブリッドポリペプ
チドは普通、適当な宿主中で適当なプロモーターあるい
はレプリコンの制御下に発現され得る核酸配列を初めか
ら含有しているベクターの発現生成物から成るが、前記
核酸配列は、エピトープ保有ポリペプチドをコードする
ＤＮＡ配列を該核酸配列に挿入することによって予め変
更されている。 【０１２４】特にＮ末端及びＣ末端アミノ酸が遊離して
いる上記エピトープ保有ポリペプチドは、タンパク化学
の分野で公知の技術による化学的合成も可能である。 【０１２５】均質な溶液中での、また固相におけるペプ
チド合成が公知である。 【０１２６】この点、Ｅ．ＷＵＮＳＣＨ編集の“Ｍetho
den der organischen Ｃhemie （有機化学の手法）”，
vol.15−Ｉ＆II，ＴＨＩＥＭＥ，Ｓtuttgart, 1974でＨ
oubenweyl が述べている均質な溶液中での合成方法が使
用できる。 【０１２７】この合成方法は、２個ずつ連続するアミノ
酸を適当な順序で連続的に縮合させるか、または既に複
数個のアミノアシル残基を含む予め入手あるいは形成し
た連続ペプチドフラグメントを適当な順序で連続的に縮
合させることから成る。上記アミノアシル残基もしくは
フラグメントの有する反応基のうち、ペプチド結合の形
成に関与するカルボキシル基およびアミノ基以外のもの
は総て予め保護しなければならない。しかしカルボキシ
ル基は、ペプチド結合の形成に先立って、ペプチド合成
の分野で良く知られた方法で活性化すると有利である。
あるいは他の場合には、例えば１−エチル−３−（３−
ジメチル−アミノプロピル）−カルボジイミドのような
カルボジイミド型の通常のカップリング試薬を用いてカ
ップリング反応を生起させてもよい。使用するアミノ酸
残基が付加的なアミン基（例えばリジン）または酸官能
基（例えばグルタミン酸）を有する場合、それらの官能
基は、アミン基であればカルボベンゾキシ基あるいはｔ
−ブチルオキシカルボニル基で、またカルボキシル基で
あればｔ−ブチルエステル基で保護し得る。他の反応基
の保護についても、同様の手続が有効である。例えば、
（システイン等の）ＳＨ基は、アセトアミドメチル基あ
るいはパラメトキシベンジル基で保護できる。 【０１２８】アミノ酸を１個ずつ結合してゆく逐次合成
の場合、合成はまずＣ末端アミノ酸を所望配列中の隣接
アミノアシル基に対応するアミノ酸と縮合させ、その後
前記のようにしてＮ末端アミノ酸まで逐次縮合させるこ
とによって実現することが好ましい。使用できる別の好
ましい技術がＲ．Ｄ．Ｍerrifield によって、“solid
phase peptide synthesis ”（Ｊ．Ａm. Ｃhem. Ｓo
c., 45, 2149-2154）に述べられている。 【０１２９】Ｍerrifield 法では、鎖の第一のＣ末端ア
ミノ酸をそのカルボキシル基によって適当な多孔ポリマ
ー樹脂に固定し、その際上記アミノ酸のアミノ基は例え
ばｔ−ブチルオキシカルボニル基で保護する。 【０１３０】第一のＣ末端アミノ酸を上記のようにして
樹脂に固定したらアミン基の保護基を、アミン基の保護
基がｔ−ブチルオキカルボニル基であれば樹脂を酸、即
ちトリフルオロ酢酸で洗浄することによって除去する。 【０１３１】次に、所望のペプチド配列の第二のアミノ
アシル基をもたらすべき第二のアミノ酸のカルボキシル
基を、樹脂に固定したＣ末端アミノ酸の保護基を除去さ
れたアミン基と結合させる。好ましくは、上記第二のア
ミノ酸のカルボキシル基は例えばジシクロヘキシルカル
ボジイミドで活性化しておき、又該アミノ酸のアミン基
は例えばｔ−ブチルオキシカルボニル基で保護してお
く。こうして所望のペプチド鎖の、最初の２個のアミノ
酸を含む第一の部分が得られる。先の場合と同様アミン
基の保護基を除去する。このようにアミノアシル基を順
次固定してゆくことによって所望のペプチドを得ること
ができる。 【０１３２】上述のようにして形成したペプチド鎖が様
々な側鎖基を有する場合、該側鎖基の保護基を次に除去
し得る。こうして得られた所望のペプチドは、例えばフ
ッ化水素酸で樹脂から分離し得、最後に通常の手続によ
って酸溶液から純粋な形態で回収し得る。 【０１３３】エピトープもしくは抗原決定基 (immunoge
nic determinant)を有する最小のペプチド配列で、特に
化学的に合成し易いものに関し、そのインビボでの免疫
原性を増大するには該ペプチド配列を生理学的に許容さ
れ得る無毒性のキャリヤー分子と共有結合によってカッ
プリングまたは「結合」させることが必要となり得る。 【０１３４】本発明による結合(conjugate) の実現に使
用し得るキャリヤー分子もしくは高分子担体の一例とし
て、破傷風トキソイド，オボアルブミン，血清アルブミ
ン，ヘモシアニン等のような天然タンパク質が挙げられ
る。例えばポリリシンあるいはポリ（Ｄ−Ｌ−アラニ
ン）−ポリ（Ｌ−リシン）といった合成高分子キャリヤ
ーも使用可能である。 【０１３５】通常20,000を上回る分子量を有する他の種
類の使用可能高分子キャリヤーが文献から公知である。 【０１３６】結合は、“Ｉnfect. and Immunity ”，3
3， 193-198（1981）にＦrantz 及びＲobertsonによっ
て述べられているような、あるいはまたＡpplied and
Ｅnvironmental Ｍicro- biology, Ｏctober 1981,
Ｖol. 42, ｎ°4, 611-614にＰ．Ｅ．Ｋauffman によっ
て述べられているような公知方法で合成することができ
る。 【０１３７】一例として、次のカップリング剤が使用可
能である。：グルタルアルデヒド，エチルクロロホルメ
ート，水溶性カルボジイミド［Ｎ−エチル−Ｎ′（３−
ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド，ＨＣｌ］，
ジイソシアネート，ビス−ジアゾベンジジン，ジクロロ
及びトリクロロ−ｓ−トリアジン，臭化シアン，ベンゾ
キノン，並びに“Ｓcand. Ｊ．Ｉmmunol. ”，1978，Ｖ
ol. 8,p. 7-23 （Ａvrameas, Ｔernynck, Ｇuesdon）
に記載された諸カップリング剤。 【０１３８】ペプチドの１個以上の反応基とキャリヤー
の１個以上の反応基とを結合させるのに、如何なるカッ
プリング方法も用いることができる。また、結合を、タ
ンパク質合成に用いられる種類のカップリング剤、即ち
１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カ
ルボジイミド，Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール等の
存在下にペプチドのカルボキシル基とキャリヤーのアミ
ン基との間でかまたはその逆において実現すると有利で
ある。キャリヤーがヘモシアニンである場合は、例えば
ＢＯＱＵＥＴ，Ｐ． et al. がＭolec. Immunol., 19，
1441-1549(1982）に述べている方法によって、ペプチド
及びキャリヤーそれぞれのアミン基同士をグルタルアル
デヒドで結合させることもできる。 【０１３９】エピトープ保有ペプチドの免疫原性は、該
ペプチドを例えばグルタルアルデヒドその他のあるゆる
適当な結合剤（カップリング剤）の存在下にオリゴマー
化することによっても強化し得る。特に本発明は、上記
のようにして得られる水溶性の免疫原性オリゴマーであ
って、特に 2〜10個のモノマーユニットを含むものに係
わる。 【０１４０】本発明の糖タンパク質，タンパク質及びポ
リペプチド（以後総じて“抗原”と呼称する）は、ＬＡ
Ｖウィルス試料から精製状態で得ても、あるいはまた
−特にペプチドに関し−化学的合成によって得て
も、特にＬＡＳあるいはＡＩＤＳを診断し得るという観
点から生物学的媒質、特にヒトあるいは動物の血清のよ
うな生物学的流体における抗ＬＡＶ抗体の存在を検出す
る方法において有用である。 【０１４１】本発明は特に、抗ＬＡＶ抗体を有するヒト
の血清中に前記抗体を検出するのにエンベロープ糖タン
パク質（あるいは該糖タンパク質のエピトープを有する
ポリペプチド）を用いるインビトロ検出法に係わる。上
記以外のポリペプチド−特にコアタンパク質エピトー
プを有するもの−も使用可能である。 【０１４２】本発明方法の好ましい具体例は、− 上記抗原の１種以上を所定量だけ滴定マイクロプレ
ートのカップ内に入れること、− 前記カップ内へ、診断されるべき生物学的流体即ち
血清を希釈したものを希釈度を上げながら導入するこ
と、− マイクロプレートをインキュベートすること、− マイクロプレートを適当な緩衝液で注意深く洗浄す
ること、− 特異的に標識した、血液免疫グロブリンに対する抗
体をカップ内に添加すること、及び− 生物学的流体中にＬＡＶ抗体が存在することを指示
する形成された抗原抗体複合体を検出すること を含む。 【０１４３】抗免疫グロブリン抗体の標識は、基質を加
水分解し得る諸酵素中から選択した酵素によって実施す
るのが有利であり、前記基質はその放射線吸収に、少な
くとも所定の波長帯内で変化を蒙る。基質を好ましくは
対照との比較において検出することによって、疾病の潜
在的危険あるいは実在が測定できる。 【０１４４】このように好ましい方法は、特にＥＬＩＳ
Ａ技術による酵素免疫測定法式あるいは螢光抗体法式検
出である。滴定は、螢光抗体法による測定か、あるいは
直接的または間接的酵素免疫測定であり得る。こうし
て、調査血清中の抗体を定量的に滴定し得る。 【０１４５】本発明はまた、ＬＡＶウィルスに対する抗
体のインビトロ検出のための診断キット自体にも係わ
り、このキットは本明細書中に規定したポリペプチドの
いずれかと、診断アッセイの実施に必要な総ての生物学
的及び化学的試薬並びに備品とからなる。好ましいキッ
トは、ＥＬＩＳＡアッセイを実施するのに必要な全試薬
を含む。即ち好ましいキットは、先に述べたポリペプチ
ドのいずれかに加えて適当な緩衝液及び抗ヒト免疫グロ
ブリンを含み、前記抗ヒト免疫グロブリンは免疫螢光分
子かあるいは酵素によって標識される。この最後の場合
の好ましいキットはまた、酵素によって加水分解され得
る基質をも含み、この基質は少なくとも所定波長におい
て信号、特に変化した放射線吸収を示し、この信号が、
キットで調べた生物学的流体中に抗体が存在することを
指示する。 【０１４６】本発明は、薬学的あるいは生理学的に受容
され得る適当なキャリヤーと共に、いずれかの抗原、即
ち先に開示したポリペプチド、全抗原、特にその精製さ
れたgp 110 フラグメント即ち免疫原性フラグメント、
融合ポリペプチド、あるいはオリゴペプチドから成る活
性成分を有するワクチン組成物にも係わる。 【０１４７】好ましい活性成分の第一の種類は gp 110
免疫原である。 【０１４８】当該分野で考慮されるべき他の好ましい活
性成分は、ＬＡＶの完全なゲノムについて推論され得る
ように 250個に満たない、好ましくは 150個に満たない
アミノ酸ユニットしか含有しないペプチドから成り、更
に好ましくは先に規定したＡsn−Ｘ−Ｓer及びＡsn−Ｘ
−Ｓerから選択された１個以上の残基を含有するペプチ
ドから成る。ワクチン成分の製造に好ましく用い得るペ
プチドは、先に規定したペプチド (a)〜(f) である。非
限定的な一例として、ワクチン組成物の投与量はインビ
ボで、即ち宿主、特にヒト宿主において抗体を産生させ
るのに有効な程の量が適当であり得る。適当な投与量範
囲は、ポリペプチド，タンパク質あるいは糖タンパク質
10〜500 マイクログラム／kg，例えば50〜100 マイクロ
グラム／kgである。 【０１４９】本発明による様々なペプチドはそれ自体を
抗体の、好ましくは様々なペプチドそれぞれに特異的な
モノクローナル抗空他製造に用いることもできる。上記
モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマの製造に
は、通常の製造及びスクリーニング方法を用いる。それ
自体本発明の一部である上記モノクローナル抗体は、Ｌ
ＡＶあるいは関連ウィルスを含有する生物学的標本、特
にヒトから得られた標本における様々なポリペプチドあ
るいはタンパク質の相対比率を確認し、更には決定する
のに非常に有用である。 【０１５０】本発明は更に、先に述べた組換え体によっ
て形質転換される、上記ＤＮＡフラグメントを発現し得
る宿主（原核あるいは真核細胞）に係わる。 【０１５１】最後に、本発明は、ヒト起源の真核細胞、
特にそのポリメラーゼがＬＡＶのＬＴＲを識別し得るリ
ンパ球の形質転換のためのベクターにも係わる。このベ
クターは特に該ベクター中にＬＡＶのＬＴＲが存在する
ことを特徴とし、前記ＬＴＲは、所定タンパク質を自身
の制御下に配置してコードするＤＮＡ挿入断片の適当な
宿主における有効な転写及び翻訳を可能にするプロモー
タとして活性である。 【０１５２】当然ながら本発明はＬＡＶの等価物と見做
され得るレトロウィルスに属するゲノムのあるゆる変異
体並びに実質的に等価の特性を有する対応ＤＮＡフラグ
メント（ＯＲＦ）にも適用される。 【０１５３】後記請求の範囲各項は生成物（糖タンパク
質，ポリペプチド，ＤＮＡ等）のあらゆる等価物を包含
するものと理解されるべきであり、その際等価物とは、
上記請求の範囲各項の何れかにおいて定義された所定ポ
リペプチドから例えば、１個以上のアミノ酸の点で区別
されるが、前記所定ポリペプチドと実質的に同じ免疫学
的もしくは免疫原的特性を有する生成物即ちポリペプチ
ドである。ＤＮＡにも同様の等価の法則が当て嵌まり、
該法則は前記ＤＮＡがコードするポリペプチドに係わる
等価の法則と関連付けられると理解される。 【０１５４】また、本明細書で言及する全文献、並びに
本明細書中で特定してないが本明細書中に特に示した特
許出願及び特許と深い関連を有する特許出願及び特許の
総ては本明細書に参考として含まれると見做されるべき
であると理解される。 【０１５５】本明細書中で引用した参考文献を下記に列
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【図面の簡単な説明】 【図１】ＬＡＶ懸濁液により感染されたＴリンパ球及び
感染されない（対照）Ｔリンパ球の溶解抽出物の電気泳
動図である。 【図２】完全ＬＡＶゲノム（クローンλＪ19）の制限地
図である。 【図３】ＬＡＶウイルスゲノムの完全配列図である。 【図４ａ】ＬＡＶゲノムＲＮＡの読み取り枠（ＯＲＦ）
を示す配列図である。 【図４ｂ】ＬＡＶゲノムＲＮＡのＯＲＦを示す配列図
（図４ａのつづき）である。 【図４ｃ】ＬＡＶゲノムＲＮＡのＯＲＦを示す配列図
（図４ｂのつづき）である。 【図４ｄ】ＬＡＶゲノムＲＮＡのＯＲＦを示す配列図
（図４ｃのつづき）である。 【図４ｅ】ＬＡＶゲノムＲＮＡのＯＲＦを示す配列図
（図４ｄのつづき）である。 【図５】ＬＡＶゲノムＲＮＡの３個の可能な読み取り相
の一部及びその相の各々に現われるＯＲＦを示す概略説
明図である。 【図６】ＬＡＶの末端長反復配列（ＬＴＲ）の概略説明
図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ベルナール・クリユスト フランス国、75012・パリ、リユ・ド ウ・マダガスカル、７ (72)発明者 ソランジユ・シヤマレ フランス国、75015・パリ、リユ・ルク ルブ、324 (72)発明者 フランソワ・クラヴエル フランス国、75016・パリ、リユ・ド ウ・ラソンプシオン、83 (72)発明者 ジヤン−クロード・シエルマン フランス国、78310・エランクール、ク ロ・デルガル・２ (72)発明者 フランソワーズ・バール−シヌーシ フランス国、92130・イツシー−レ−ム リノー、リユ・デルヴアン、50 (72)発明者 マルク・アリゾン フランス国、75005・パリ、リユ・ド ユ・カルデイナル・ルモワンヌ、71 (72)発明者 ピエール・ソニゴ フランス国、75015・パリ、リユ・ギユ タンベール、23 (72)発明者 コル・ストワール フランス国、92320・シヤテイヨン、ヴ イラ・ドウニーズ、４・ビス (72)発明者 オリヴイエ・ダノ フランス国、75015・パリ、プラス・ロ レ、１ (72)発明者 シモン・ヴアン−オブソン フランス国、78180・モンテイニ・レ・ ブルトヌー、リユ・ジヤン・ドウ・ラ・ フオンテーヌ、３ (56)参考文献 特開 昭62−26300（ＪＰ，Ａ) 特開 昭61−173782（ＪＰ，Ａ) Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．227（１. Ｆｅｂ 1985）ｐ．484−492 Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．313（24．Ｊ ａｎ 1985）ｐ．277−284 Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌ．40（Ｊａｎ 1985）ｐ．９−17 (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12N 15/00 C12P 21/00 C07K 14/15 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (1)

  1. (57)【特許請求の範囲】 １．約１１０，０００の分子量を有する糖タンパク質ま
    たはこれから誘導されたより低分子量の抗原のポリペプ
    チド骨格を有し、ＬＡＶウィルスエンベロープに対する
    抗体を含むヒト由来の血清で認識できる精製された生成
    物であり、但し前記ポリペプチドのポリペプチド骨格が
    明細書記載の図４ａ〜４ｅのヌクレオチド番号５７６７
    とヌクレオチド番号７３１４の間に伸びる核酸断片によ
    ってコードされるものである前記精製生成物の製造方法
    であって、対応しているポリペプチドをコードしている
    ＬＡＶ ＤＮＡ配列を発現させることのできる培養細胞
    をこのＬＡＶ ＤＮＡ配列で改変されたベクターによっ
    て形質転換し、この培養細胞から前記生成物を含む発現
    産物を回収し、前記生成物を他の発現産物から分離する
    ことを包含する前記方法。 ２．精製生成物の分離が、前記エンベロープポリペプチ
    ドを特異的に認識するモノクローナル抗体と接触させる
    ことで行なわれる請求項１に記載の方法。
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