DE3587512T2 - Hüllenantigene vom menschlichen Immunodefizienz-Virus und deren Verwendungen. - Google Patents

Hüllenantigene vom menschlichen Immunodefizienz-Virus und deren Verwendungen.

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DE3587512T2 DE90105189T DE3587512T DE3587512T2 DE 3587512 T2 DE3587512 T2 DE 3587512T2 DE 90105189 T DE90105189 T DE 90105189T DE 3587512 T DE3587512 T DE 3587512T DE 3587512 T2 DE3587512 T2 DE 3587512T2
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Luc Mongagnier
Pierre Sonigo
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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft Antigene, besonders in einer gereinigten Form, des Lymphadenopathie-Virus (hier nachstehend abgekürzt als LAS bezeichnet) und des erworbenen Immunschwäche-Syndroms (hier nachstehend abgekürzt als AIDS bezeichnet) und ein Verfahren zur Herstellung dieser Antigene, besonders der Antigene der Hüllen dieser Viren. Die Erfindung betrifft auch glycosylierte oder nichtglycosylierte Polypeptide, die durch diese DNA-Sequenzen codiert werden.
  • Der Erreger von LAS oder AIDS, ein Retrovirus, ist von F. Barre-Sinoussi et al., Science 220 (1983), 868, identifiziert worden. Es weist die nachstehend beschriebenen Eigenschaften auf. Es ist T-lymphotrop, und es befällt bevorzugt Leu 3-Zellen (oder T4-Lymphocyten). Es weist eine Reverse-Transkriptase-Aktivität, für die die Gegenwart von Mg²&spplus; erforderlich ist, und eine starke Affinität für Poly(Adenylat-oligodesoxy-Thymidylat) (poly(A)-oligo (dT)12- 18) auf. Es weist eine Dichte von 1,16 bis 1,17 in einem Sucrose-Gradienten auf, einen durchschnittlichen Durchmesser von 139 Nanometer und einen Kern mit einem durchschnittlichen Durchmesser von 41 Nanometern. Virus-Antigene, besonders ein p25-Protein werden immunologisch von Antikörpern erkannt, die in Seren enthalten sind, die von an LAS oder AIDS leidenden Patienten stammen. Das p25-Protein, das ein Kern-Protein ist, wird von Antikörpern gegen das p24-Protein der HTLVI- und -II-Viren immunologisch nicht erkannt. Ferner fehlt dem Virus ein p19-Protein, das mit den HTLVI- und HTLVII-p19-Proteinen eine immunologische Kreuzreaktion zeigt.
  • Retroviren diesen Typs (gelegentlich wird abkürzend die übergeordnete Bezeichnung LAV verwendet) sind bei der "National Collection of Micro-organism Cultures" des INSTITUTE PASTEUR in Paris unter den Nummern I-232, I-240 und I-241 hinterlegt worden. Virusstämme, die unter dem morphologischen und immunologischen Gesichtspunkt dem LAV in jeder Hinsicht gleichen, sind in anderen Laboratorien isoliert worden. Es wird auf die Retrovirusstämme, die als HTLV-III bezeichnet werden und von Gallo, R. C. et al., Science 224 (1984), 500, bzw. Sarngadharan, M. G. et al., Science 224 (1984), 506, isoliert wurden, und auf das als ARV bezeichnete Retrovirus, das von Jay Levy, M. et al., Science 225 (1984), 840-842, isoliert wurde, beispielhaft Bezug genommen. Zur sprachlichen Vereinfachung erhalten die zuletzt erwähnten Viren neben anderen mit entsprechenden morphologischen und immunologischen Eigenschaften hier nachstehend die übergeordnete Bezeichnung "LAV". Es wird hinsichtlich der genaueren Beschreibung der LAV- oder ähnlicher Retroviren und der Verwendungen der Extrakte dieser Viren auf die am 14. September 1984 eingereichte europäische Patentanmeldung hingewiesen, die die Priorität der am 15. September 1983 eingereichten britischen Patentanmeldung mit der Nummer 83 24800 in Anspruch nimmt.
  • Anfänglich stellten die Kern-Antigene in den damals verwendeten Testsystemen die Haupt-Antigene der Virus-Lysate oder Extrakte dar, die durch Seren von mit AIDS oder LAS infizierten Patienten erkannt wurden. Ein p42-Protein, das als aus einem Hüll-Protein bestehend vorgeschlagen wurde, ist ebenfalls nachgewiesen worden. In derselben Weise beschrieben Gallo et al. ein p41-Protein, von dem auch angenommen wurde, eventuell ein Bestandteil der Virus-Hülle zu sein.
  • Es sind auch Verfahren zum Erhalt eines LAV-Virus beschrieben worden. Es kann im Hinblick auf die Herstellung des Virus in T-Lymphocyten-Kulturen, die entweder von Blut, der Nabelschnur oder auch den Knochenmarkszellen von erwachsenen Spendern in gutem Gesundheitszustand abstammen, besonders auf den schon erwähnten Artikel von Barre-Sinoussi, F.
  • et al. Bezug genommen werden. Dieses Verfahren umfaßt besonders die nachstehend beschriebenen wesentlichen Schritte: - Herstellung einer viralen Infektion dieser T- Lymphocyten nach der Aktivierung durch ein Lectin-Mitogen mit einer Virus-Suspension, die von einer unbehandelten Überstandsflüssigkeit von Lymphocyten stammt, die das Virus bilden (ursprünglich von einem mit AIDS oder LAS infizierten Patienten erhalten). - Kultivierung von mit TCGF infizierten Zellen in Gegenwart von anti-Interferon-Schafserum, - Durchführung einer Reinigung des gebildeten Virus (die Bildung beginnt üblicherweise zwischen dem 9. und dem 15. Tag nach der Infektion und dauert zwischen 10 und 15 Tagen), umfassend die Ausfällung des Virus in Polyethylenglycol zum Erhalt einer ersten Konzentrierung des Virus, im Anschluß daran eine Zentrifugation der erhaltenen Aufarbeitung in einem 20-60% Sucrose-Gradienten oder einem isotonischen Metrizanid-Gradienten (unter dem Warenzeichen Nycodenz® von Nyegaard, Oslo, im Handel erhältlich) und die Gewinnung des Virus mit der Bande, die eine Dichte von 1,16 bis 1,17 im Sucrose-Gradienten oder von 1,10 bis 1,11 im Nycodenz®-Gradienten aufweist.
  • Das LAV-Virus kann auch von permanenten Zellinien des Typs T, zum Beispiel der CEM-Zellinie oder von B-Lymphoblastoid-Zellinien gebildet werden, die zum Beispiel durch Transformation der von einem gesunden Spender stammenden Lymphocyten mit dem Epstein-Barr-Virus erhalten werden, wie dies beispielsweise in EP-A-0 165 120 beschrieben ist. Die erhaltenen permanenten Zellinien bilden kontinuierlich ein Virus (bei B-Lymphoblastoid-Zellinien als LAV-B bezeichnet), das wesentliche antigene und morphologische Merkmale der LAV-Viren besitzt (abgesehen davon, daß es gelegentlich in einer Bande mit etwas höherer Dichte als im vorstehenden Fall (insbesondere 1,18) in Sucrose erhalten wird). Die Endreinigung des Virus kann auch in einem Nycodenz-Gradienten durchgeführt werden.
  • Es wird auf den Artikel von Schüpbach et al., Science 224 (4. Mai 1984), 503-505, hingewiesen. Dieser Artikel beschreibt eine Untersuchung im Hinblick auf verschiedene Antigene des HTLV-III-Retrovirus.
  • Es werden Ergebnisse vorgestellt, die einen Hinweis auf ein Antigen enthalten, das auf einem Elektrophoresegel eine Lauf strecke zurücklegte, die einem Molekulargewicht von etwa 110 000 entsprach.
  • Schüpbach et al. erwähnten, daß dieses Antigen in einer Virus-Aufarbeitung nachgewiesen wurde, in den Zellen jedoch unterhalb der Nachweisgrenze lag.
  • Ein Verfahren zur Clonierung von DNA-Sequenzen, die mit der genomischen LAV-RNA hybridisierbar sind, ist bereits in EP-A-0 178 978 beschrieben worden. Nachstehend wird hinsichtlich des gemeinsamen Gegenstands mit den weiteren Verbesserungen in der hier beschriebenen Erfindung auf diese Anmeldung Bezug genommen.
  • Der Zweck dieser Erfindung ist die Bereitstellung von gereinigten, unveränderten Virus-Formen (oder Viren, die durch das verwendete Reinigungsverfahren weniger verändert werden) und von Verfahren zum Erhalt dieser unveränderten gereinigten Viren.
  • Die vorliegende Erfindung zielt darüberhinaus auf die Bereitstellung weiterer neuer Mittel, die neben ihrer Nützlichkeit zum Nachweis von LAV oder verwandten Viren (hier nachstehend allgemeiner als "LAV-Viren" bezeichnet), auch eine größere Vielseitigkeit, insbesondere beim Nachweis bestimmter Teile der genomischen DNA der Viren, deren Expressionsprodukte durch immunologische Verfahren nicht immer direkt nachweisbar sind. Die vorliegende Erfindung zielt darüberhinaus auf die Bereitstellung von Polypeptiden, die Sequenzen enthalten, die mit antigene Determinanten umfassenden Polypeptiden übereinstimmen, die in den durch das natürlich vorkommende LAV-Genom codierten und exprimierten Proteinen enthalten sind. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ferner die Bereitstellung von Mitteln zum Nachweis von mit LAV-Viren verwandten Proteinen, besonders zur Diagnose von AIDS oder Prä-AIDS oder, im Gegensatz dazu, zum Nachweis von Antikörpern gegen das LAV-Virus oder mit diesen verwandten Proteinen, besonders in Patienten, die an AIDS oder Prä-AIDS leiden, oder allgemeiner in asymptomatischen Trägern und in Blut-verwandten Produkten. Schließlich betrifft die Erfindung auch die Bereitstellung immunogener Polypeptide, und insbesondere schützender Polypeptide zur Verwendung in der Herstellung von Impfstoff-Zusammensetzungen gegen AIDS oder verwandte Syndrome.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft weitere, mit der genomischen LAV-RNA hybridisierbare DNA-Fragmente, wie hier nachstehend beschrieben, ebenso wie weitere cDNA-Varianten, die den gesamten LAV-Virus-Genomen entsprechen. Sie betrifft weiter rekombinante DNAs, die diese DNA-Moleküle oder cDNA- Fragmente enthalten.
  • Ein unverändertes, gereinigtes LAV-Retrovirus unterscheidet sich von den vorstehend definierten durch einen Gehalt an einem oder mehreren Hüll-Antigenen, der zur Sichtbarmachung ausreicht, wenn das Virus mit ³&sup5;S-Cystein, ohne nicht-markiertes Cystein, in einem Verhältnis von 200 Microcurie pro ml Medium markiert wird. Diese Antigene, besonders Glycoproteine, werden in vitro selektiv durch Seren von Patienten, die an AIDS oder LAS leiden, oder durch Seren von asymptomatischen Trägern des Virus erkannt.
  • Ein bevorzugtes Antigen gemäß der vorstehenden Definition, das aus einem Lysat dieses Virus erhältlich ist (oder durch vorsichtiges Reinigen der Virus-Hülle), ist ein Glycoprotein, das ein Molekulargewicht in der Größenordnung von 110 000 Dalton aufweist. Dies wurde durch einen Vergleich seiner Lauf strecke mit den Laufstrecken von Standardproteinen, die bekannte Molekulargewichte aufwiesen, im selben Laufsystem festgestellt. Insbesondere wurden vergleichende Messungen 18 Stunden bei einer Spannung von 18 V auf einem 12,5% Polyacrylamidgel durchgeführt, wobei die nachstehend aufgeführten Standardproteine (Vertrieb durch Amersham) verwendet wurden:
  • - Lysozym-(¹&sup4;C)-Methyl (MG: 14 300), - Kohlendioxid-(¹&sup4;C)-Methyl (MG: 30 000), - Ovalbumin-(¹&sup4;C)-Methyl (MG: 46 000), - Rinderserumalbumin-(¹&sup4;C)-Methyl (MG: 69 000), - Phosphorylase b-(¹&sup4;C)-Methyl (MG: 92 500), - Myosin-(¹&sup4;C)-Methyl (MG: 200 000).
  • Die Erfindung betrifft auch die Antigene selber, besonders das mit einem Molekulargewicht von etwa 110 000- 120 000, das auch die Eigenschaft aufweist, durch Seren von Patienten, die an AIDS oder LAS leiden, oder durch Seren von Personen erkannt zu werden, die den LAV-Viren oder ihren Analoga ausgesetzt worden waren. Diese Antigene weisen weiter die Eigenschaft auf, mit Concanavalin A Komplexe zu bilden, wobei der Komplex in Gegenwart von O-Methyl-α-D-mannopyranosid dissoziierbar ist. Die erfindungsgemäßen Antigene können auch andere, zum Beispiel unter dem Namen "Linsen- Lectin" bekannte Lectine binden. Das bevorzugte erfindungsgemäße Antigen mit einem Molekulargewicht von 110 000 ist auch empfindlich gegen die Wirkung von Endoglycosidasen. Diese Wirkung wird durch das aus dem Antigen mit einem Molekulargewicht von 110 000 hergestellte Protein deutlich, das ein Molekulargewicht in der Größenordnung von 90 000 aufweist, wobei letzteres beispielsweise durch Immunpräzipitation oder Trennung unter Verwendung der Unterschiede in den Molekulargewichten (unterschiedliche Laufstrecken auf einem Gel) abtrennbar ist.
  • Bevorzugte erfindungsgemäße Antigene werden von Glycoproteinen gebildet.
  • Die Erfindung betrifft auch das Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Viren. Dieses Verfahren unterscheidet sich wesentlich von den vorstehend beschriebenen auf der Stufe des abschließenden Reinigungsschrittes. Der Reinigungsschritt des erfindungsgemäßen Verfahrens wird insbesondere nicht weiter in Gradienten durchgeführt, sondern schließt die Durchführung von Differential-Zentrifugationen ein, die direkt mit den Überständen der Kulturmedien der bildenden Zellen durchgeführt werden. Diese Zentrifugations-Verfahren umfassen besonders eine erste Zentrifugation bei einer Winkelgeschwindigkeit der Zentrifugation, besonders bei 10 000 UpM, die die Entfernung von nicht-viralen Bestandteilen, insbesondere von zellulären Bestandteilen ermöglicht, und anschließend eine zweite Zentrifugation bei einer höheren Winkelgeschwindigkeit, besonders bei 45 000 UpM, um den eigentlichen Virus-Niederschlag zu erhalten. In bevorzugten Ausführungsformen wird in der ersten Zentrifugation 10 Minuten mit 10 000 UpM und in der zweiten 20 Minuten mit 45 000 UpM zentrifugiert. Dies sind natürlich nur Orientierungswerte, wobei es sich versteht, daß es der Fähigkeit des Spezialisten überlassen bleibt, zur Trennung der zellulären und der viralen Bestandteile die Zentrifugations-Bedingungen zu modifizieren.
  • Diese Modifikation des Reinigungsverfahrens hat die Herstellung von viralen Aufarbeitungen zur Folge, aus denen das erwähnte Antigen leichter als aus Virus-Aufarbeitungen gewonnen werden kann, die durch die früher verwendeten Verfahren gereinigt wurden. Auf jeden Fall werden die schließlich durch das erfindungsgemäße Verfahren erhaltenen Viren durch Seren von Patienten oder Personen, die den LAV- Viren oder morphologisch und hinsichtlich der Antigenität ähnlichen Stämmen ausgesetzt worden sind, leichter gebunden.
  • Die erfindungsgemäßen Antigene selbst können aus den vorstehend beschriebenen Viren durch deren Lyse (oder andere geeignete Verfahren) in Gegenwart eines geeigneten Detergens und durch Gewinnung und Trennung der freigesetzten Antigene erhalten werden. Die Lyse des Virus wird zweckmäßigerweise in Gegenwart von Aprotinin oder einem anderen zur Hemmung der Protease-Wirkung geeigneten Wirkstoff durchgeführt. Die Trennung der erfindungsgemäßen Antigene kann anschließend durch irgendein bekanntes Verfahren durchgeführt werden; beispielsweise ist es möglich, eine Trennung der Proteine aufgrund ihrer jeweiligen unterschiedlichen Laufstrecken in einem vorgegebenen Gel durchzuführen, worauf das gesuchte Protein aus dem Bereich des Gels isoliert wird, in der es bei streng festgelegten Bedingungen unter Berücksichtigung seines Molekulargewichts nach der Durchführung einer Elektrophorese üblicherweise gefunden wird. Die erfindungsgemäßen Antigene können jedoch aufgrund ihrer Affinität für Lectine, insbesondere Concanavalin A oder Linsen-Lectin, vom Lysat der vorstehend beschriebenen Viren abgetrennt werden. Das verwendete Lectin wird vorzugsweise auf einem festen Träger, zum Beispiel dem vernetzten, aus Agarose stammenden und unter dem Warenzeichen Sepharose vertriebenen Polymer immobilisiert. Nach dem Waschen der gebundenen Antigene mit einem geeigneten Puffer können die Antigene in einer geeigneten Weise, besonders durch Verwendung von gelöstem O- Methyl-α-D-mannopyranosid eluiert werden.
  • Eine sorgfältigere Reinigung dieser Antigene kann durch Immunpräzipitation mit Seren von Patienten durchgeführt werden, von denen bekannt ist, daß sie gegen dieses Protein wirksame Antikörper aufweisen, mit konzentrierten Antikörper-Präparaten (polyclonalen Antikörpern) oder erneut mit insbesondere gegen das erfindungsgemäße Antigen gerichteten monoclonalen Antikörpern, insbesondere gegen das mit dem Molekulargewicht von 110 000, das nachstehend durch die Abkürzung gp110 bezeichnet wird.
  • Weitere Eigenschaften der Erfindung werden auch bei der nachstehenden Beschreibung der Isolierung eines erfindungsgemäßen Virus und von Antigenen beschrieben, insbesondere eines Hüll-Antigens des Virus. Es wird auf die Figuren Bezug genommen, wobei:
  • Fig. 1 eine Kopie einer photographischen Reproduktion von Gelspuren darstellt, die zur Durchführung von Elektrophoresen von Lysatextrakten von T-Lymphocyten verwendet wurden, die durch eine LAV-Suspension infiziert bzw. nichtinfiziert (Kontrollen) worden waren;
  • Fig. 2 und 3 die Restriktionskarte eines vollständigen LAV-Genoms (Clon λ19) oder von dessen Fragmenten darstellen;
  • Fig. 4a bis 4e die vollständige Sequenz eines viralen LAV-Genoms darstellen;
  • Fig. 5 und 6 Teile der drei möglichen Lesephasen der genomischen LAV-RNA als Diagramm darstellen, einschließlich der offenen, in jedem der Lesephasen erscheinenden Leseraster (ORF).
    • I - Herstellung des Virus und der Antigene
  • T-Lymphocyten, die von einem gesunden Spender stammten und mit LAV1 unter den von Barre-Sinoussi, F. et al. beschriebenen Bedingungen auf CEM-Zel1en infiziert worden waren, die von an Leukämie leidenden Patienten stammten-und auch in vitro mit LAV1 infiziert worden waren, wurden in einem Medium kultiviert, das 200 Microcurie ³&sup5;S-Cystein enthielt und dem nicht-markiertes Cystein fehlte. Die infizierten Lymphocyten wurden in einem nicht-denaturierenden Medium kultiviert, um den Abbau des gesuchten Antigens zu verhindern. Im Anschluß daran wurde mit der Überstandsflüssigkeit des Kulturmediums zur Entfernung der nichtviralen Bestandteile eine erste Zentrifugation von 10 Minuten bei 10 000 UpM und danach zur Sedimentierung des Virus eine zweite Zentrifugation von 20 Minuten bei 45 000 UpM durchgeführt. Das Virus-Pellet wurde anschließend in Gegenwart von Aprotinin (5%), insbesondere unter den im Artikel von Barre-Sinoussi, F. et al. beschriebenen Bedingungen durch Detergens lysiert.
  • Dasselbe Verfahren wurde an Lymphocyten wiederholt, die als Kontrolle aus einem gesunden Spender gewonnen worden waren.
  • Die verschiedenen Lysate wurden anschließend durch Seren von Patienten, die an AIDS oder LAS litten, immunpräzipitiert. Seren, die von gesunden Spendern oder von mit anderen Krankheiten infizierten Spendern stammten, wurden ebenfalls immunopräzipitiert. Mit den Medien wurde anschließend in einem SDS-Polyacrylamidgel eine Elektrophorese durchgeführt.
  • Die Ergebnisse sind in Fig. 1 dargestellt. Die von 1 bis 6 numerierten Gelspuren wurden von Aufarbeitungen erhalten, die mit ³&sup5;S-Cystein markiert worden waren. Die Spuren mit den Nummern 7 bis 10 zeigen Ergebnisse, die an infizierten und nicht-infizierten, mit ³&sup5;S-markierten Lymphocyten- Aufarbeitungen beobachtet wurden. Die Spur M entspricht schließlich den Lauf strecken der vorstehend identifizierten Standardproteine, deren Molekulargewichte im rechten Teil der Figur angegeben sind.
  • Die Bezeichnung der markierten viralen Proteine erscheint im linken Teil der Figur.
  • Es ist zu beobachten, daß die Spuren 7 und 9 das spezifische, mit ³&sup5;S-Methionin markierte LAV-Protein p25 zeigen. Die Abwesenheit des gleichen Proteins auf den Spuren 8 und 10 entspricht den Ergebnissen, die an einer von gesunden Lymphocyten stammenden Aufarbeitung erhalten wurden.
  • Die Spuren 3 und 5 entsprechen den Ergebnissen, die an Aufarbeitungen von infizierten und mit ³&sup5;S-Cystein markierten Lymphocyten erhalten wurden. Die Proteine p25 und p18, die charakteristischen Kernproteine von LAV, und das auch für LAV spezifische Glycoprotein gp110 waren ebenfalls vorhanden. Abbildungen, die einem Protein p41 entsprechen (Molekulargewicht der Größenordnung 41 000), erschienen, obgleich weniger deutlich, in den verschiedenen Aufarbeitungen.
  • Das erfindungsgemäße Virus und das erfindungsgemäße Antigen können entweder durch Lectine, besonders Concanavalin A ausgefällt oder an eine Sepharos®-Concanavalin A- Säule gebunden werden. Insbesondere die Reinigung der Hüll- Glycöproteine kann, wie nachstehend beschrieben, durchgeführt werden. Diese Bindung kann insbesondere durch Inkontaktbringen eines in einem geeigneten Puffer gelösten Lysats des LAV-Virus mit an Sepharose® gebundenem Concanavalin A durchgeführt werden. Ein geeigneter Puffer weist die nachstehend beschriebene Zusammensetzung auf:
  • Tris 10 mM
  • NaCl 0,15 M
  • Cacl&sub2; 1 mM
  • MgCl&sub2; 1 mM
  • Triton 1% (Warenzeichen des Detergens im Handel) pH-Wert 7,4
  • Nach der Durchführung der Bindung wird das Sepharose®-Concanavalin A mit einem Puffer der gleichen Zusammensetzung gewaschen, wobei die Tritor®-Konzentration auf 0,1% vermindert wurde. Die Elution wird anschließend mit einer 0,2 M O-Methyl-α-D-mannopyranosidlösung im Waschpuffer durchgeführt.
  • Das Protein kann durch Immunpräzipitation mit Antikörpern weiter konzentriert werden, die in Seren von mit dem AIDS-Virus infizierten Patienten enthalten sind, oder mit polyclonalen Antikörpern, die aus einem Serum erhalten werden, das von einem zuvor gegen das "unveränderte" erfindungsgemäße Virus oder das vorstehend beschriebene Glycoprotein immunisierten Tier stammt. Das Protein kann anschließend durch Dissoziation des Komplexes mittels einer Lösung, die einen geeigneten ionischen Salzgehalt aufweist, gewonnen werden. Vorzugsweise wird die Antikörper-Aufarbeitung selbst in einer bekannten Weise auf einem unlöslichen Träger, beispielsweise vom Sepharos® B-Typ immobilisiert.
  • Es ist auch möglich, monoclonale Antikörper zu verwenden, die von zuvor gegen gp110 hergestellten Hybridomen sekretiert werden. Diese monoclonalen Antikörper sowie die sie produzierenden Hybridome bilden auch einen Teil der Erfindung.
  • Ein Verfahren zur Herstellung und Selektion von monoclonalen Antikörpern, die gegen das gp110 Glycoprotein gerichtet sind, ist nachstehend beschrieben.
    • Immunisierung der Mäuse
  • Es wurden Gruppen von 6 bis 8 Wochen alten BALB/c- Mäusen verwendet. Eine Gruppe erhält das Virus, das das vorstehend beschriebene Glycoprotein trägt, und eine andere ein gereinigtes Glycoprotein gp110. Das bei allen Mäusen identische Immunisierungsverfahren umfaßt die Injektion von 10 mg der antigenen Aufarbeitung in Gegenwart von komplettem Freunds Adjuvans am Tag 0, anschließend erneut, jedoch in Gegenwart von inkomplettem Freunds Adjuvans am Tag 14 und ohne Adjuvans an den Tagen 28 und 42. Die ersten drei Injektionen werden intraperitoneal, die vierte intravenös verabreicht.
    • Fusion und Kultivierung der Hybride
  • Die nicht-sekretierende Myelom-Variante 5.53 P3·63 Ag8, die Azaguanin-resistent ist und von der MOPC-21- Zellinie stammt, wird verwendet. In Gegenwart von Polyethylenglycol 4000 wird am 45. Tag durch das Verfahren von Fazekas de St-Groth und Scheidegger die Fusion mit immunisierten Maus-Splenocyten durchgeführt. Die Selektion der Hybride in RPMI 1640 "HAT" -Medium wird unter Verwendung derselben Kultivierungstechniken auf Platten durchgeführt, die 24 Vertiefungen aufweisen (bekannt unter der Bezeichnung Costar).
  • Die Hybridome, die Antikörper von geeigneter Spezifität bilden, werden anschließend in Gegenwart einer "ernährenden" Schicht aus syngenen Thymocyten in Platten, die 96 Vertiefungen aufweisen, cloniert. Die so selektierten, Antikörper-bildenden Clone werden anschließend immer noch in Gegenwart von Thymocyten in Platten mit 24 Vertiefungen vermehrt. Sobald in einer der Vertiefungen die Konfluenz auftritt, wird der Clon intraperitoneal in eine BALB/c-Maus injiziert, die 8 Tage zuvor eine Pristan- Injektion erhalten hatte, und/oder in Flüssigkultur gehalten wird.
    • Darstellung der anti-LAV-Antikörper
  • Fünf verschiedene Verfahren ermöglichen die Charakterisierung der Clone, die Antikörper von geeigneter Spezifität bilden. In einer ersten Stufe werden die Hybride, die Antikörper bilden, durch einen ELISA-Test ermittelt, der Maus-Immunglobuline in den Überstandsflüssigkeiten zeigt. In dieser ersten Selektion werden durch Verwendung eines ELISA- Tests, der anti-LAV-Antikörper zeigt, oder durch Immunfluoreszenz an Virus-bildenden menschlichen Zellen Überstände gesucht, die gegen virale Bestandteile gerichtete Antikörper aufweisen. Schließlich werden die Überstandsflüssigkeiten durch Radio-Immunpräzipitation des mit Cystein markierten Virus und durch das Western-Blot-Verfahren an einer viralen Aufarbeitung, die die Bestimmung der Spezifitäten dieser anti-LAV-Antikörper ermöglichen, analysiert.
    • Ergebnisse
  • Die von den verschiedenen Fusionen erhaltenen Zellen werden in 648 Vertiefungen kultiviert. Ihre mikroskopische Untersuchung zeigt, daß die Mehrzahl dieser Vertiefungen einen einzelnen Hybridclon enthält, der fähig ist, in einem selektiven "HAT"-Medium zu wachsen. Mehr als 50% von ihnen bilden Antikörper, die bei einer ELISA-anti-Virus-Antikörper-Untersuchung eine positive Antwort bewirken. Die repräsentativsten Fusionen werden durch das Western-Blot- Verfahren getestet und einige von ihnen subcloniert, wobei ihre jeweiligen Spezifitäten und Reaktivitäten im anti- Virus-Antikörper-ELISA und ihre Verhaltensweisen unter den Kultivierungsbedingungen berücksichtigt werden. Es werden insbesondere die Hybride selektiert, die Antikörper bilden, die selektiv das virale Glycoprotein gp110 erkennen, das ein Molekulargewicht von etwa 110 kD aufweist. Sämtliche Subclonierungen ergeben Antikörper-bildende Clone, die nach der Expression in syngene Mäuse injiziert werden. Eine Analyse der Spezifitäten der in den unterschiedlichen Ascites- Flüssigkeiten vorhandenden Antikörper bestätigt die Spezifität der Ascites-Antikörper hinsichtlich des gp110.
  • Die erhaltenen monoclonalen Antikörper können selbst zur Reinigung von Proteinen verwendet werden, die eine auch in gp110 vorhandene antigene Stelle enthalten. Die Erfindung betrifft daher auch diese Reinigungsverfahren als solche. Dieses Verfahren wird vorteilhaft an Virus-Lysaten, Lysaten von T-Lymphocyten oder weiteren LAV oder entsprechendes bildenden Zellen angewandt, wenn die unkontrollierte Abtrennung von gp110 während des Reinigungsverfahrens des Virus vor seiner Lysis sorgfältig vermieden worden ist. Es ist unnötig zu sagen, daß das Verfahren auch an jeder Lösung verwendet werden kann, die gp110 oder ein Protein, Polypeptid oder Glycoprotein enthält, das eine antigene Stelle umfaßt, die üblicherweise vom Hüll-Protein getragen und durch den monoclonalen Antikörper erkannt wird. Zur Durchführung dieses Verfahrens ist es vorteilhaft, die monoclonalen Antikörper auf einem festen Träger zu immobilisieren, der bevorzugt für Affinitätschromatographie-Verfahren verwendbar ist. Diese monoclonalen Antikörper werden beispielsweise an ein dreidimensional vernetztes Agarosegitter, unter dem Warenzeichen Sepharose von der schwedischen Firma Pharmacia A. G. vertrieben, beispielsweise durch das Bromcyan-Verfahren gebunden.
  • Die Erfindung betrifft daher auch ein Verfahren zur Trennung der betreffenden Antigene, wobei das Verfahren das Inkontaktbringen eines Antigen-Gemisches, das die interessierenden Antigene einschließt (zum Beispiel ein Virus-Lysat oder -Extrakt), mit einer Affinitätssäule umfaßt, die die vorstehend beschriebenen monoclonalen Antikörper trägt, um die durch die monoclonalen Antikörper selektiv erkannten Polypeptide, Proteine oder Glycoproteine selektiv zu binden, die Gewinnung der letzteren durch Dissoziation des Antigen- Antikörper-Komplexes unter Verwendung eines geeigneten Puffers, insbesondere einer Lösung von geeigneter Ionenstärke, beispielsweise eines Salzes, vorzugsweise Ammoniumacetat (das bei der Gefriertrocknung des Präparats keinen Rückstand bildet), einer auf einen pH-Wert von 2 bis 4 angesäuerten Lösung oder eines Glycin-Puffers beim gleichen pH-Wert, und die Gewinnung der eluierten Polypeptide, Proteine oder Glycoproteine.
  • Es versteht sich von selbst, daß die Erfindung auch Polypeptid-Fragmente betrifft, die niedrigere Molekulargewichte aufweisen und antigene Stellen tragen, die durch die gleichen monoclonalen Antikörper erkannt werden. Es ist für den Fachmann klar, daß die Verfügbarkeit von monoclonalen Antikörpern, die das gp110-Glycoprotein binden, auch den Zugriff auf kleinere Peptidsequenzen oder Fragmente ermöglicht, die eine gemeinsame antigene Stelle oder ein gemeinsames Epitop enthalten. Fragmente von kleinerer Größe können unter Verwendung von bekannten Verfahren erhalten werden. Ein derartiges Verfahren umfaßt beispielsweise die Spaltung der ursprünglich größeren Polypeptide durch Enzyme, die zur Spaltung an spezifischen Stellen fähig sind. Zur beispielhaften Darstellung solcher Proteine kann das Enzym von Staphylococcus aureus V8, α-Chymotrypsin, Maus-Unterkiefer- Drüsen-Protease, die von der Firma Boehringer vertrieben wird, Vibrio alginolyticus chemovar iophagus-Collagenase, die unter anderem die Peptide Gly-Pro, Gly-Ala etc. spezifisch bindet, erwähnt werden.
  • Es ist auch möglich, durch Clonierung von Fragmenten, die einer aus Genomen von LAV-Varianten konstruierten cDNA entnommen worden sind, Polypeptide oder Fragmente von Hüll- Antigenen des Virus zu erhalten.
  • Die Fig. 2 und 3 sind Restriktionskarten einer solchen cDNA, die insgesamt 9,1 bis 9,2 kb umfaßt. Die von cDNA-Fragmenten codierten Polypeptide befinden sich in der Region, die sich von der KpnI-Stelle (Position 6100) bis zur BgIII-Stelle (Position 9150) der Restriktionskarte von Fig. 2 erstreckt. Das Vorhandensein einer charakteristischen Stelle eines Hüll-Antigens des LAV-Virus oder eines ähnlichen Virus in einem exprimierten Polypeptid (in einer geeigneten Wirtszelle, die zuvor durch ein entsprechendes Fragment oder durch einen das Fragment enthaltenden Vektor transformiert worden ist) kann durch jedes geeignete immunchemisches Verfahren nachgewiesen werden.
  • Die Erfindung betrifft insbesondere Polypeptide, die von hier nachstehend definierten cDNA-Fragmenten codiert werden. Sie betrifft auch die Nucleinsäure-Fragmente selbst, die eine cDNA-Variante einschließen, die einem vollständigen retroviralen LAV-Genom entspricht, das durch eine Reihe von Restriktionsstellen in der hier nachstehend beschriebenen Reihenfolge (vom 5'-Ende zum 3'-Ende) charakterisiert ist.
  • Die Koordinaten der aufeinander folgenden Stellen des gesamten LAV-Genoms (vgl. auch die Restriktionskarte von λJ19 in Fig. 2) werden hier nachstehend, unter Bezug auf die HindIII-Stelle (gewählt als Koordinate 1), die in der R- Region liegt, auch angegeben. Die Koordinaten werden mit einer Genauigkeit von ±200 bp geschätzt:
  • HindIII 0
  • SacI 50
  • HindIII 520
  • PstI 800
  • HindIII 1100
  • BgIII 1500
  • KpnI 3500
  • KpnI 3900
  • EcoRI 4100
  • EcoRI 5300
  • SalI 5500
  • KpnI 6100
  • BgIII 6500
  • BgIII 7600
  • HindIII 7850
  • BamHI 8150
  • XhoI 8600
  • KpnI 8700
  • BgIII 8750
  • BgIII 9150
  • SacI 9200
  • HindIII 9250
  • Eine weitere erfindungsgemäße DNA-Variante enthält gegebenenfalls eine weitere HindIII-Stelle etwa an der Koordinate 5550.
  • Es wird auch auf Fig. 1 Bezug genommen, die eine genauere Restriktionskarte der Gesamt-DNA (λJ19) darstellt.
  • Eine noch detailliertere Nucleotidsequenz einer bevorzugten erfindungsgemäßen DNA ist hier nachstehend in den Fig. 4a-4e dargestellt.
  • Die Erfindung betrifft ferner weitere bevorzugte DNA- Fragmente und Polypeptidsequenzen (glycosyliert oder nichtglycosyliert), auf die hier nachstehend Bezug genommen wird.
    • Sequenzierung von LAV
  • Die Sequenzierung und Bestimmung der besonders interessierenden Stellen wurden an einem rekombinanten Phagen durchgeführt, der dem in der vorstehend genannten EP 0 178 978 beschriebenen λJ19 entspricht. Ein Verfahren zu seiner Herstellung wird in dieser Anmeldung beschrieben.
  • Die gesamte rekombinante Phagen-DNA vom Clon λJ19 (in der früheren Anmeldung beschrieben) wurde gemäß der Vorschrift von Deininger, Analytical Biochem. 129 (1983), 216, mit Ultraschall behandelt. Die DNA wurde 12 Stunden bei 16ºC einer Klenow-Reaktion unterworfen. Mit der DNA wurde in einem 0,8% Agarosegel eine Elektrophorese durchgeführt, die DNA im Größenbereich von 300-600 bp wurde ausgeschnitten, elektroeluiert und ausgefällt. Die resuspendierte DNA (in 10 mM Tris, pH-Wert 8; 0,1 mM EDTA) wurde in M13mp8-RF-DNA (durch das Restriktionsenzym SmaI gespalten und anschließend mit alkalischer Phosphatase behandelt) unter Verwendung von T4-DNA- und RNA-Ligasen ligiert (Maniatis, T. et al. (1982), Molecular Cloning - Cold Spring Harbor Laboratory). Ein E. coli-Stamm mit der Bezeichnung TG1 wurde für die weitere Untersuchung verwendet. Dieser Stamm weist den nachstehend beschriebenen Genotyp auf:
  • Δlac pro, supE, thi.F'traD36, proAB, lacIq, ZΔ15, r&supmin;
  • Dieser E. coli TGI-Stamm weist die Besonderheit auf, daß Rekombinante leicht erkannt werden können. Die blaue Farbe der Zellen, die mit Plasmiden transfiziert sind, die nicht mit einem LAV-DNA-Fragment rekombiniert haben, wird nicht modifiziert. Die Zellen, die mit einem rekombinanten Plasmid transfiziert sind, das ein LAV-DNA-Fragment enthält, ergeben dagegen weiße Kolonien. Das verwendete Verfahren ist in Gene 26 (1983), 101, beschrieben.
  • Dieser Stamm wurde unter Verwendung des Hanahan- Verfahrens (Hanahan D., J. Mol. Biol. 166 (1983), 557) mit dem Ligierungsgemisch transformiert. Die Zellen wurden auf einer Trypton-Agarose-Platte mit IPTG und X-Gal in weicher Agarose ausplattiert. Weiße Plaques wurden entweder entnommen und abgesucht oder unter Verwendung von Nitrozellulose- Filtern direkt in situ abgesucht. Ihre DNA-Moleküle wurden mit nick-translatierten DNA-Insertionen von pUC18-HindIII- Subclonen von λJ19 hybridisiert. Dies ermöglichte die Isolierung der Plasmide oder Subclone von λ, die in der nachstehend beschriebenen Tabelle identifiziert sind. Im Bezug auf diese Tabelle sollte auch darauf hingewiesen der den, daß auf die Bezeichnung eines jeden Plasmids die Hinterlegungsnummer einer Zellkultur von E. coli TGI, die das entsprechende Plasmid enthält, bei der "Collection Nationale des Cultures de Micro-organismes" (C.N.C.M.) des Pasteur Instituts in Paris, Frankreich, folgt. Auch eine nicht-transformierte TGI-Zellinie wurde bei der C.N.C.M. unter der Nr. I-364 hinterlegt. Sämtliche Hinterlegungen fanden am 15. November 1984 statt. Die Größen der entsprechenden, vom LAV-Genom stammenden Insertionen sind auch angegeben worden. Tabelle Haupt-Merkmale der rekombinanten Plasmide -pJ19-1-Plasmid
  • Positiv hybridisierende M13-Phagen-Platten wurden 5 Stunden kultiviert, und die einzelsträngigen DNA-Moleküle extrahiert.
  • Die M13mp8 Subclone von λJ19-DNA-Molekülen wurden nach dem Didesoxy-Verfahren und der Technologie, die von Sanger et al. entwickelt wurden (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 (1977), 5463) und dem M13-Clonierungs- und Sequenzierungs-Handbuch (Amersham (1983)) sequenziert. Es wurden der 17-mer Oligonucleotid-Primer α-³&sup5;SdATP (400Ci/mmol, Amersham) und die 0,5x-5x Puffer-Gradienten-Gele (Biggen, M. D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 50 (1983), 3963) verwendet. Die Gele wurden gelesen und über die Programme von Staden (Staden, R., Nucl. Acids Res 10 (1982), 4731) in den Computer eingegeben. Sämtliche einschlägigen Literaturhinweise und geeigneten Verfahren können dem M13-Clonierungs- und Sequenzierungs-Handbuch von Amersham entnommen werden.
  • Die vollständige DNA-Sequenz von λJ19 (auch als LAV- Ia bezeichnet) ist in den Fig. 4 bis 4e dargestellt.
  • Die Sequenz wurde aus der Sequenz der Insertion des Phagen λJ19 rekonstruiert. Die Numerierung beginnt an der Cap-Stelle, die experimentell lokalisiert wurde (s. u.). Wichtige genetische Elemente, größere offene Leseraster und ihre erwarteten Produkte sind zusammen mit den HindIII- Clonierungsstellen angegeben. Die potentiellen Glycosylierungs-Stellen im env-Gen sind oben mit einem Strich versehen. Die NH&sub2;-terminale Sequenz von p&sub2;&sub5;gag, die durch Protein-Micro-Sequenzierung bestimmt wurde, ist eingerahmt.
  • Jedes Nucleotid wurde im Durchschnitt 5,3 Mal sequenziert: 85% der Sequenz wurde an beiden Strängen bestimmt und der Rest mindestens zweimal in unabhängigen Clonen sequenziert. Die Basenzusammensetzung ist T, 22,2%; C, 17,8 %; A, 35,8%; G, 24,2%; G + C, 42%. Das Dinucleotid GC ist stark unterrepräsentiert (0,9%), wie dies bei eukaryotischen Sequenzen üblich ist (Bird 1980).
  • Die Fig. 5 und 6 liefern eine graphische Darstellung der Längen der aufeinander folgenden offenen Leserahmen, die den aufeinander folgenden Lesephasen entsprechen (auch mit den Zahlen "1" "2" und "3" bezeichnet, die auf der linken Seite von Fig. 5 erscheinen). Die relativen Positionen dieser offenen Leseraster (ORF) in bezug auf die Nucleotid-Struktur des LAV-Genoms werden durch die Reihe von Zahlen angegeben, die die jeweiligen Positionen der entsprechenden Nucleotide in der DNA-Sequenz wiedergeben. Die vertikalen Striche entsprechen den Positionen der jeweiligen Stopcodons.
  • Die nachstehend beschriebenen Gene und DNA-Fragmente können aufgrund der verschiedenen dargestellten Leseraster unterschieden werden. Es wird anschließend auch auf die von diesen Genen und Fragmenten codierten Proteine oder Glycoproteine Bezug genommen. Auf das env-Gen und weitere Gene wird in der nachstehend dargestellten Tabelle auch Bezug genommen.
    • Das Hüll-Gen (oder ORF-env)
  • env: Das offene Leseraster von env weist sehr nahe am Anfang (8. Triplett) möglicherweise ein Methionin-Initiator- Codon auf. Wenn das so ist, dann stimmt das Molekulargewicht des vermutlichen env-Vorläufer-Proteins (861 Aminosäuren, MG-berechnet = 97 376) mit der Größe des LAV-Glycoproteins (110 kd und 90 kd nach Glycosidase-Behandlung) überein. Es gibt 32 mögliche N-Glycosylierungsstellen (Asn-X-Ser/Thr), die in den Fig. 4d und 4e durch einen oberhalb gezogenen Strich markiert sind. Eine interessante Eigenschaft von env ist die sehr hohe Zahl von Trp-Resten an beiden Enden des Proteins.
  • Die DNA-Sequenz, von der angenommen wurde, daß sie die Hüll-Proteine codiert, erstreckt sich vermutlich von der Nucleotidposition 5746 (beginnend mit 5' AAA GAG GAG A
  • . . . 3') bis zur Nucleotidposition 8208 (endend mit A ACT AAA GAA 3'). Die Polypeptidstrukturen der Sequenzen des Hüll-Proteins entsprechen denen, die gemäß der "Phase 3"- Lesephase gelesen werden.
  • Es wird angenommen, daß der Startpunkt der env- Transkription auf der Höhe des ATG-Codons an der Position 5767-5769 ist.
  • Es gibt drei hydrophobe, für die retroviralen Hüll- Proteine (Seiki et al., 1983) charakteristische Bereiche, die einem Signalpeptid (von den Nucleotiden 5815-5850 bp codiert), einem zweiten Bereich (7315-7350 bp) und einem Transmembran-Abschnitt (7831-7890 bp) entsprechen. Vor dem zweiten hydrophoben Bereich (7315-7350 bp) ist ein Abschnitt, der reich an Arg + Lys ist. Es ist möglich, daß er eine proteolytische Spaltungsstelle darstellt, die in Analogie zu anderen retroviralen Proteinen ein äußeres Hüllpolypeptid und ein Membran-gebundenes Protein liefert (Ciki et al., 1983, Kiyokawa et al., 1984). Ein auffälliges Merkmal der LAV-Hüll-Protein-Sequenz ist, daß der dem Transmembran-Abschnitt folgende Bereich ungewöhnlich lang (150 Reste) ist. Das env-Protein zeigt keine Homologie zu irgendeiner Sequenz in Protein-Datenbanken. Das kleine Aminosäure- Motiv, das es üblicherweise in den Transmembran-Proteinen sämtlicher Leukämie-Retroviren gibt (Cianciolo et al., 1984), ist in LAV-env nicht vorhanden.
  • Die Erfindung beschreibt außerdem insbesondere die DNA-Sequenz, die sich von Nucleotid 5767 bis Nucleotid 8208 oder sogar 8350 erstreckt und von der angenommen wird, daß sie das gp110 (Hüll-Glycoprotein der LAV-Viren, das ein Molekulargewicht von etwa 110 000 Dalton aufweist) codiert, das etwa an dem gleichen Nucleotid wie die ein Molekulargewicht von etwa 90 000 Dalton aufweisende und durch Glycosidase-Behandlung von gp110 erhaltene Polypeptid-Grundstruktur der Glycoprotein-Sequenz beginnt.
  • Die Erfindung betrifft ferner gereinigte Polypeptide, die die Aminosäure-Struktur (oder Polypeptid-Grundstruktur) von gp110 bzw. gp90 aufweisen, die der direkten Translation der DNA-Sequenzen und Fragmente entsprechen, die vorstehend genauer definiert worden sind (Fig. 4d und 4e).
  • Die Erfindung betrifft ferner neutralisierende Epitope enthaltende Polypeptide.
  • Die Lage der neutralisierenden Epitope geht außerdem noch aus der Fig. 4d hervor. Es wird insbesondere auf die in die Aminosäure-Sequenzen der Hüll-Proteine (Lesephase 3) eingeschlossenen, oberhalb mit Strichen versehenen Gruppen von drei Buchstaben Bezug genommen, die allgemein durch die Formeln Asn-X-Ser oder Asn-X-Thr bezeichnet werden können, in denen X eine andere mögliche Aminosäure sein kann. Daher weist das anfängliche Protein-Produkt oder die Polypeptid- Grundstruktur des env-Glycoproteins ein Molekulargewicht von mehr als 91 000 auf. Man nimmt an, daß diese Gruppen üblicherweise glycosylierte Gruppen tragen. Diese Asn-X-Ser- und Asn-X-Thr-Gruppen und die angefügten glycosylierten Gruppen bilden zusammen die hydrophilen Bereiche des Proteins, und man nimmt an, daß sie im Hinblick auf die normale Konformation der Proteine am Rand liegen und nach außen weisen. Dementsprechend werden sie als Epitope angesehen, die in Impfstoff-Zusammensetzungen effizient ins Spiel gebracht werden können.
  • Die Erfindung betrifft daher besonders die Peptidsequenzen, die in den env-Proteinen enthalten sind und diesen entnommen werden können (oder die die gleiche Aminosäure- Struktur aufweisen) und eine Größe von nicht mehr als 200 Aminosäuren aufweisen.
  • Es wird angenommen, daß die bevorzugten erfindungsgemäßen Peptide (hier nachstehend als a, b, c, d, e, f bezeichnet) denen entsprechen, die durch die Nucleotidsequenzen codiert werden, die sich jeweils zwischen den nachstehend beschriebenen Positionen erstrecken:
  • a) von etwa 6171 bis etwa 6276
  • b) '' '' 6337 '' '' 6387
  • c) '' '' 6466 '' '' 6516
  • d) '' '' 6562 '' '' 6696
  • e) '' '' 6937 '' '' 7005
  • f) '' '' 7612 '' '' 7746
  • Weitere hydrophile Peptide im offenen Leseraster von env werden hier nachstehend genauer beschrieben. Sie werden an der Aminosäure (1 = Lysin) beginnend, die durch AAA an Position 5746-5748 in der LAV-DNA-Sequenz (Fig. 4d und 4e) codiert wird, und dann gemäß ihrer Reihenfolge im Hinblick auf die Endsequenz definiert. Die ersten und die zweiten Zahlen jedes Peptids beziehen sich auf seine N-terminalen bzw. C-terminalen Aminosäuren.
  • Diese hydrophilen Peptide sind: Aminos. 8 bis 23 einschl., Aminos. 397 bis 424 einschl., Tabelle 1: Lage und Größen der offenen Leseraster des Virus 1. Triplett Stop Keine Aminosäuren MG berechnet
  • Die Erfindung betrifft insbesondere alle DNA-Fragmente, auf die hier vorstehend genauer Bezug genommen worden ist und die offenen Leserastern entsprechen. Es versteht sich von selbst, daß ein Fachmann fähig ist, diese alle zu erhalten, beispielsweise durch Spaltung einer vollständigen DNA, die dem gesamten Genom einer LAV-Art entspricht, zum Beispiel durch deren partielle oder vollständige Spaltung mit einem geeigneten Restriktionsenzym und durch anschließende Gewinnung der betreffenden Fragmente. Die unterschiedlichen, vorstehend beschriebenen DNA-Moleküle können auch als eine Quelle von geeigneten Fragmenten verwendet werden. Es können die Verfahren verwendet werden, die hier nachstehend zur Isolierung der Fragmente beschrieben werden, die zuvor in den hier vorstehend beschriebenen Plasmiden eingeschlossen waren und nachfolgend zur DNA-Sequenzierung verwendet wurden.
  • Selbstverständlich können auch andere Verfahren verwendet werden. Einige davon sind in EP-A-0 178 978 beispielhaft dargestellt worden. Es wird beispielsweise auf die nachstehend beschriebenen Verfahren Bezug genommen:
  • a) DNA kann mit geeigneten Selektionsmarkern durch mehrere Verfahren in Säugerzellen transfiziert werden: z. B. durch Calciumphosphat-Präzipitation, Polyethylenglycol, Protoplastenfusion etc . .
  • b) DNA-Fragmente, die Genen entsprechen, können in Expressionsvektoren für E. coli, Hefe- oder Säugerzellen cloniert und die erhaltenen Proteine gereinigt werden.
  • c) Die provirale DNA kann zur Erzeugung von fusionierten Polypeptiden mit dem "shot-gun"-Verfahren (Fragmentierung) in prokaryotische Expressionsvektoren eingeführt werden. Rekombinante, die als Antigen kompetente Fusionsproteine herstellen, können durch einfaches Absuchen der Rekombinanten mit anti-LAV-Antigen-Antikörpern identifiziert werden.
  • Die Erfindung betrifft ferner insbesondere DNA- Rekombinante, besonders modifizierte Vektoren, die eine der vorstehend beschriebenen DNA-Sequenzen einschließen, die zur Transformation entsprechender Mikroorganismen oder Zellen, insbesondere eukaryotischer Zellen, beispielsweise Hefen, zum Beispiel Saccharomyces cerevisiae, oder höherer eukaryotischer Zellen, insbesondere Säugerzellen, und zur Ermöglichung der Expression dieser DNA-Sequenzen in den entsprechenden Mikroorganismen oder Zellen angepaßt sind.
  • Insbesondere betrifft die Erfindung solche modifizierten rekombinanten DNA-Vektoren, die durch die vorstehend beschriebenen DNA-Sequenzen modifiziert wurden und die fähig sind, höhere eukaryotische Zellen, insbesondere Säugerzellen zu transformieren. Vorzugsweise wird eine der vorstehend beschriebenen Sequenzen unter die direkte Kontrolle eines Promotors gestellt, der in den Vektoren enthalten ist und der durch die Polymerasen der Zellen erkannt wird, so daß die ersten exprimierten Nucleotid-Codons den ersten Tripletts der vorstehend definierten DNA-Sequenzen entsprechen. Daher betrifft diese Erfindung auch die entsprechenden DNA- Fragmente, die durch ein geeignetes Verfahren aus LAV- Genomen oder entsprechenden cDNA-Molekülen erhalten werden können. Ein derartiges Verfahren umfaßt beispielsweise die Spaltung der LAV-Genome oder cDNA-Moleküle durch Restriktionsenzyme, vorzugsweise auf der Stufe der Restriktionsstellen, die die Fragmente umgeben und nahe an ihren jeweiligen entgegengesetzten Enden liegen, die Gewinnung und Identifizierung der gesuchten Fragmente nach der Größe, falls erforderlich, eine Überprüfung ihrer Restriktionskarten oder Nucleotidsequenzen (oder durch eine Reaktion mit monoclonalen Antikörpern, die spezifisch gegen Epitope gerichtet sind, die von diesen von den DNA-Fragmenten codierten Polypeptiden getragen werden) und ferner, falls erforderlich, die Verkürzung der Enden der Fragmente, beispielsweise durch ein exonucleolytisches Enzym, zum Beispiel Bal31, zum Zweck der Kontrolle der gewünschten Nucleotidsequenzen der DNA-Fragment-Enden oder, umgekehrt, die Reparatur der Enden mit dem Klenow-Enzym und gegebenenfalls die Ligierung der letzteren an synthetische Polynucleotid-Fragmente, um die Rekonstitution der Nucleotid-Enden der Fragmente zu ermöglichen. Diese Fragmente können anschließend in einen der Vektoren inseriert werden, um die Expression des entsprechenden Polypeptids durch die damit transformierte Zelle zu bewirken. Das entsprechende Polypeptid kann anschließend aus den transformierten Zellen gewonnen werden, falls nach deren Lyse erforderlich, und durch Verfahren, beispielsweise die Elektrophorese, gereinigt werden. Es ist unnötig zu sagen, daß alle üblichen Verfahren zur Durchführung dieser Arbeitsschritte verwendet werden können.
  • Die Erfindung betrifft insbesondere auch clonierte Sonden, die ausgehend von jedem erfindungsgemäßen DNA- Fragment hergestellt werden können und somit rekombinante DNA-Molekülen, die solche Fragmente enthalten, insbesondere alle Plasmide, die in prokaryotischen oder eukaryotischen Zellen amplifizierbar sind und diese Fragmente tragen.
  • Unter Verwendung der clonierten DNA-Fragmente als eine molekulare Hybridisierungs-Sonde - entweder durch Markierung mit Radionucleotiden oder mit fluoreszierenden Reagenzien - kann LAV-Virion-RNA im Blut, in Körperflüssigkeiten und Blutprodukten (z. B. von anti-hämophilen Faktoren wie Faktor VIII-Konzentraten) und in Impfstoffen, z. B. im Hepatis B-Impfstoff direkt nachgewiesen werden. Es ist schon dargestellt worden, daß das gesamte Virus in Kulturüberständen von LAV-bildenden Zellen nachgewiesen werden kann. Ein geeignetes Verfahren, um diesen Nachweis zu erreichen, umfaßt die Immobilisierung des Virus auf einem Träger, z. B. unter anderem auf Nitrozellulose-Filtern etc., das Aufbrechen des Virions und die Hybridisierung mit markierten (radioaktiv-markierten oder "kalten" Fluoreszenz- oder Enzym-markierten) Sonden. Eine derartige Vorgehensweise ist bereits für das Hepatitis B-Virus im peripheren Blut entwickelt worden (gemäß Scotto, J. et al., Hepatology 3 (1983) , 379-384).
  • Erfindungsgemäße Sonden können auch zum schnellen Absuchen von genomischer DNA verwendet werden, die aus Gewebe von Patienten mit LAV-verwandten Symptomen stammt, um festzustellen, ob die provirale DNA oder RNA in Wirtsgeweben und weiteren Geweben vorhanden ist.
  • Ein für derartiges Absuchen verwendbares Verfahren umfaßt die nachstehend beschriebenen Schritte: Extraktion von DNA aus dem Gewebe, Restriktionsenzym-Spaltung der DNA, Elektrophorese der Fragmente und Southern-Blotting von genomischer DNA aus Geweben, und anschließende Hybridisierung mit markierter, clonierter proviraler LAV-DNA. Eine Hybridisierung in situ kann auch verwendet werden.
  • Lymphatische Flüssigkeiten und Gewebe und weitere nicht-lymphatische Gewebe von Menschen, Primaten und anderen Säugerarten können auch abgesucht werden, um festzustellen, ob weitere evolutionär verwandte Retroviren existieren. Die vorstehend beschriebenen Verfahren können verwendet werden, obwohl Hybridisierung und Waschen unter nicht-stringenten Bedingungen durchgeführt werden.
  • Die erfindungsgemäßen DNA-Moleküle oder DNA-Fragmente können auch zur Durchführung der Expression von viralen LAV- Antigenen zu diagnostischen Zwecken verwendet werden.
  • Die Erfindung betrifft allgemein die Polypeptide als solche, ohne zu unterscheiden, ob sie chemisch synthetisiert, aus viralen Aufarbeitungen isoliert oder durch die unterschiedlichen erfindungsgemäßen DNA-Moleküle exprimiert werden, insbesondere durch die ORFs oder Fragmente davon, und zwar nach der Transformation mit einem geeigneten Vektor, der zuvor durch die entsprechenden DNA-Moleküle modifiziert worden ist in geeigneten Wirten, insbesondere in prokaryotischen oder eukaryotischen Wirten.
  • Die Erfindung betrifft generell auch jedes der Polypeptid-Fragmente (oder Moleküle, besonders Glycoproteine, die dasselbe Polypeptid-Grundgerüst, wie die hier vorstehend beschriebenen Polypeptide aufweisen), die ein für ein LAV-Protein oder Glycoprotein charakteristisches Epitop tragen, wobei das Polypeptid oder Molekül dann N-terminale bzw. C-terminale Enden aufweist, die frei oder unabhängig voneinander kovalent an Aminosäuren gebunden sind, die andere als die sind, die normalerweise in den größeren Polypeptiden oder Glycoproteinen der LAV-Viren mit ihnen verbunden sind, wobei die zuletzt beschriebenen Aminosäuren dann frei sind oder zu einer anderen Polypeptidsequenz gehören. Insbesondere betrifft die Erfindung Hybrid-Polypeptide, die hier vorstehend genauer beschriebene Epitop-tragende Polypeptide, rekombiniert mit anderen, normalerweise in den LAV- Proteinen fremden Polypeptid-Fragmenten enthalten, die Größen aufweisen, welche ausreichen, um eine erhöhte Immunogenität der Epitop-tragenden Polypeptide zu liefern, wobei die fremden Polypeptid-Fragmente entweder als Immunogen inert sind oder die immunogenen Eigenschaften der Epitoptragenden Polypeptide nicht stören.
  • Derartige Hybrid-Polypeptide, die bis zu 150, und sogar 250 Aminosäuren enthalten können, bestehen üblicherweise aus den Expressions-Produkten eines Vektors, der ab initio eine Nucleinsäure-Sequenz enthält, die unter der Kontrolle eines geeigneten Promotors oder Replikons in einem geeigneten Wirt exprimierbar ist, wobei die Nucleinsäure- Sequenz jedoch zuvor durch Insertion einer DNA-Sequenz modifiziert wurde, die das Epitop-tragende Polypeptid codiert.
  • Die Epitop-tragenden Polypeptide, insbesondere die, deren N-terminale und C-terminale Aminosäuren frei sind, sind auch durch chemische Synthese zugänglich, und zwar gemäß Verfahren, die in der Proteinchemie gut bekannt sind.
  • Die Synthese von Peptiden in homogener Lösung und in fester Phase ist gut bekannt.
  • Diesbezüglich kann auf das Syntheseverfahren in homogener Lösung zurückgegriffen werden, das von Houbenweyl in dem Werk mit dem Titel "Methoden der Organischen Chemie" (Methods of Organic Chemistry) Hrsg. E. Wunsch, Bd. 15-I und II, Thieme, Stuttgart 1974, beschrieben wurde.
  • Dieses Syntheseverfahren besteht aus einer schrittweisen Kondensierung von jeweils zwei einzelnen aufeinander folgenden Aminosäuren in der geeigneten Reihenfolge oder von zuvor verfügbaren oder hergestellten, aufeinander folgenden Peptidfragmenten, die schon mehrere Aminoacyl-Reste in der jeweilig richtigen Reihenfolge enthalten. Abgesehen von den Carboxyl- und Aminogruppen, die an der Bildung der Peptidbindungen beteiligt sind, muß Sorge dafür getragen werden, daß alle anderen reaktionsfähigen Gruppen, die von diesen Aminoacyl-Gruppen oder Fragmenten getragen werden, zuvor geschützt werden. Vor der Bildung der Peptidbindungen ist es jedoch vorteilhaft, die Carboxylgruppen gemäß den in der Peptidsynthese vertrauten Verfahren zu aktivieren. In einer anderen Ausführungsform kann auf Kupplungsreaktionen zurückgegriffen werden, die übliche Kupplungsreagenzien ins Spiel bringen, beispielsweise vom Carbodiimid-Typ, wie 1-Ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid. Wenn die verwendete Aminosäuregruppe eine weitere Aminogruppe (z. B. Lysin) oder eine weitere Säurefunktion (z. B. Glutaminsäure) trägt, können diese Gruppen durch Carbobenzoxy- oder t-Butyloxycarbonyl-Gruppen, bezüglich der Aminogruppen, oder durch t-Butylester-Gruppen, hinsichtlich der Carboxyl-Gruppen, geschützt werden. Ähnliche Verfahren sind zum Schutz von weiteren reaktiven Gruppen verfügbar. Es können beispielsweise SH-Gruppen (z. B. im Cystein) durch eine Acetamidomethyl - oder Paramethoxybenzyl -Gruppe geschützt werden.
  • Bei fortschreitender Synthese, Aminosäure für Aminosäure, beginnt die Synthese vorzugsweise durch die Kondensation der C-terminalen Aminosäure mit der Aminosäure, die der benachbarten Aminoacyl-Gruppe in der gewünschten Sequenz entspricht usw., Schritt für Schritt, bis zur N- terminalen Aminosäure. Ein weiteres verläßliches, bevorzugtes Verfahren ist das von R. D. Merrifield in "Solid phase peptide synthesis" (J. Am. Chem. Soc., 45, 2149-2154) beschriebene.
  • Im Merrifield-Verfahren wird die erste C-terminale Aminosäure der Kette mit Hilfe ihrer Carboxylgruppe an ein geeignetes poröses, polymeres Harz fixiert, worauf die Aminogruppe der Aminosäure, beispielsweise durch eine t- Butyloxycarbonyl-Gruppe geschützt wird.
  • Wenn die erste C-terminale Aminosäure so an das Harz gebunden worden ist, wird die Schutzgruppe der Aminogruppe durch Waschen des Harzes mit einer Säure, d. h. Trifluoressigsäure, entfernt, falls die Schutzgruppe der Aminogruppe eine t-Butyloxycarbonyl-Gruppe ist.
  • Anschließend wird die Carboxylgruppe der zweiten Aminosäure, die die zweite Aminoacyl-Gruppe der gewünschten Peptidsequenz liefern soll, an die ungeschützte Aminogruppe der an das Harz gebunden, C-terminalen Aminosäure gekoppelt. Es ist vorzugsweise die Carboxylgruppe dieser zweiten Aminosäure aktiviert worden, beispielsweise durch Dicyclohexylcarbodiimid, während seine Aminogruppe geschützt worden ist, zum Beispiel durch eine t-Butyloxycarbonyl-Gruppe. Der erste Teil der gewünschten Peptidkette, der die ersten beiden Aminosäuren umfaßt, wird so erhalten. Wie vorstehend beschrieben, wird die Schutzgruppe der Aminogruppe anschließend entfernt, und es kann mit der Bindung der nächsten Aminoacyl-Gruppe und so weiter fortgefahren werden, bis das gesamte gewünschte Peptid erhalten wird.
  • Die Schutzgruppen der unterschiedlichen Seitengruppen (falls vorhanden) der so gebildeten Peptidkette können anschließend entfernt werden. Das gesuchte Peptid kann anschließend vom Harz gelöst werden, beispielsweise durch Fluorwasserstoffsäure, und schließlich nach üblichen Verfahren in reiner Form aus der Säurelösung gewonnen werden.
  • Hinsichtlich der Peptidsequenzen von kleinster Größe, die ein Epitop oder eine immunogene Determinante tragen, und insbesondere derjenigen, die durch chemische Synthese leicht zugänglich sind, kann es zur Erhöhung ihrer immunogenen in vivo Eigenschaften erforderlich sein, sie kovalent an ein physiologisch verträgliches und nicht-toxisches Träger- Molekül zu kuppeln oder zu konjugieren.
  • Als Beispiele von Träger-Molekülen oder macromolekularen Trägern, die zur Herstellung der erfindungsgemäßen Konjugate verwendet werden können, werden natürliche Proteine erwähnt, beispielsweise Tetanus-Toxoid, Ovalbumin, Serumalbumine, Hämocyanine etc . . Synthetische macromolekulare Träger, beispielsweise Polylysine oder Poly(D-L-Alanin) - poly(L-Lysin)-Moleküle können auch verwendet werden.
  • Weitere Arten von verwendbaren macromolekularen Trägern, die üblicherweise Molekulargewichte von mehr als 20 000 aufweisen, sind aus der Literatur bekannt.
  • Die Konjugate können durch bekannte Verfahren synthetisiert werden, die beispielsweise von Frantz und Robertson in "Infect. and Immunity" 33 (1981), 193-198, oder von P. E. Kauffman in Applied and Environmental Microbiology Bd. 42, Nr. 4, (Oktober 1981), 611-614, beschrieben werden.
  • Es können beispielsweise die nachstehend genannten Kupplungs-Wirkstoffe verwendet werden: Glutaraldehyd, Ethylchlorkohlensäureester, wasserlösliche Carbodiimide (N-Ethyl- N'(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid, HCl), Diisocyanate, bis-Diazobenzidin, Di- und Trichlor-s-triazine, Bromcyane, Benzochinon, genauso wie Kupplungs-Wirkstoffe, die in "Scand. J. Immunol." 8 (1978), 7-23, (Avrameas, Ternynck, Guesdon) erwähnt werden.
  • Es kann jedes Kupplungsverfahren zur Bindung einer oder mehrerer reaktiver Gruppen des Peptids auf der einen Seite, und einer oder mehrerer reaktiver Gruppen des Trägers auf der anderen Seite verwendet werden. Es ist erneut vorteilhaft, die Kupplung in Gegenwart eines in der Proteinsynthese verwendeten Kupplungs-Wirkstoffs, d. h. z. B. 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid, N-Hydroxybenzotriazol etc., zwischen den Carboxyl- und Aminogruppen durchzuführen, die im Peptid und im Träger, oder umgekehrt, enthalten sind. Die Kupplung zwischen Aminogruppen, die im Peptid bzw. im Träger enthalten sind, kann, wenn der Träger Hämocyanin ist, auch mit Glutaraldehyd, beispielsweise gemäß dem von Boquet, P. et al., Molec. Immunol. 19 (1982), 1441-1549, beschriebenen Verfahren erreicht werden.
  • Die Immunogenität von Epitop-tragenden Peptiden kann auch durch ihre Oligomerisierung, beispielsweise in Gegenwart von Glutaraldehyd oder eines anderen geeigneten Kupplungs-Wirkstoffs verstärkt werden. Insbesondere betrifft die Erfindung so erhaltene wasserlösliche immunogene Oligomere, die besonders 2 bis 10 monomere Einheiten umfassen.
  • Die Glycoproteine, Proteine und Polypeptide (üblicherweise hier nachstehend als erfindungsgemäße "Antigene" bezeichnet, unabhängig davon, ob sie in einem gereinigten Zustand aus LAV-Virus-Aufarbeitungen oder durch rekombinante DNA-Technologie erhalten werden) sind in Verfahren zum Nachweis der Gegenwart von anti-LAV-Antikörpern in biologischen Medien nützlich, insbesondere biologischen Flüssigkeiten, beispielsweise Seren vom Menschen oder von Tieren, insbesondere mit Blick auf die mögliche Diagnose von LAS oder AIDS.
  • Insbesondere betrifft die Erfindung ein in vitro- Verfahren zur Diagnose unter Verwendung eines Hüll-Glycoproteins (oder eines Polypeptids, das ein Epitop dieses Glycoproteins trägt) zum Nachweis von anti-LAV-Antikörpern in Seren von Personen, die diese besitzen. Andere Polypeptide - insbesondere die, die ein Epitop eines Kernproteins tragen - können auch verwendet werden.
  • Eine bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens umfaßt:
  • - Verteilung einer bekannten Menge eines oder mehrerer dieser Antigene in die Vertiefungen einer Microtiterplatte; - Ansteigende Verdünnungen der biologischen Flüssigkeit, d. h. Serum zur Diagnose in diesen Vertiefungen; - Inkubation der Microtiterplatte; - Sorgfältiges Waschen der Microtiterplatte mit einem geeigneten Puffer; - Zugabe von spezifischen, markierten Antikörpern gegen Immunglobuline des Blutes in die Vertiefungen; und - Nachweis des gebildeten Antigen-Antikörper-Komplexes, der dann die Gegenwart von LAV-Antikörpern in der biologischen Flüssigkeit anzeigt.
  • Es ist vorteilhaft, die anti-Immunglobulin-Antikörper mit einem Enzym zu markieren, das aus denen ausgewählt wird, die zur Hydrolyse eines Substrat fähig sind, wobei das Substrat, wenigstens innerhalb eines bekannten Wellenlängenbereichs, eine Veränderung seiner Strahlungsabsorption erfährt. Der Nachweis des Substrats, vorzugsweise im Vergleich mit einer Kontrolle, liefert anschließend einen Meßwert des potentiellen Risikos oder des tatsächlichen Vorhandenseins der Krankheit.
  • Derartige bevorzugte Verfahren sind immunenzymatische- oder auch Immunfluoreszenz-Nachweise, insbesondere gemäß dem ELISA-Verfahren. Antikörper-Titrationen können durch Immunfluoreszenz oder direkte oder indirekte immun-enzymatische Bestimmungen nachgewiesen werden. Quantitative Titrationen von Antikörpern in den untersuchten Seren können durchgeführt werden.
  • Die Erfindung betrifft auch Diagnose-Kits als solche zum in vitro Nachweis von anti-LAV-Virus-Antikörpern, wobei die Kits neben irgendeinem der hier genannten Polypeptide und sämtlichen biologischen und chemischen Reagenzien auch die notwendige Ausstattung zur Durchführung diagnostischer Tests umfassen. Bevorzugte Kits umfassen sämtliche Reagenzien, die zur Durchführung der ELISA-Tests erforderlich sind. Derart bevorzugte Kits werden neben einem der Polypeptide, auch geeignete Puffer und anti-Mensch Immunglobuline einschließen, wobei die anti-Mensch Immunglobuline entweder mit einem immunfluoreszenten Molekül oder einem Enzym-Molekül markiert werden. Im letzten Fall umfassen bevorzugte Kits dann auch ein Substrat, das durch das Enzym hydrolysierbar ist und ein Signal liefert, insbesondere eine veränderte Absorption einer Strahlung, mindestens in einer bekannten Wellenlänge, wobei das Signal anschließend das Vorhandensein eines Antikörpers in der mit diesem Kit zu untersuchenden biologischen Flüssigkeit anzeigt.
  • Die Erfindung betrifft auch Impfstoff-Zusammensetzungen, deren aktiver Grundbestandteil aus mindestens einem der Antigene besteht, d. h. aus den hier vorstehend beschriebenen vollständigen Polypeptid-Antigenen, besonders aus gereinigtem gp110 oder dessen immunogenen Fragmenten, Fusions-Polypeptiden oder Oligopeptiden in Verbindung mit einem geeigneten pharmazeutisch oder physiologisch verträglichen Träger.
  • Ein erster Typ des bevorzugten aktiven Grundbestandteils ist das gp110-Immunogen.
  • Weitere bevorzugte, aktive, in Betracht kommende Grundbestandteile in diesem Bereich bestehen aus Peptiden, die weniger als 200, vorzugsweise weniger als 150 Aminosäuren enthalten, die aus den vollständigen Genomen der LAV- Viren ableitbar sind und noch stärker bevorzugt aus Peptiden, die eine oder mehrere Gruppen enthalten, die aus Asn- X-Ser und Asn-X-Thr, wie vorstehend definiert, ausgewählt sind. Bevorzugte Peptide zur Verwendung in der Herstellung von Impfstoff-Grundbestandteilen sind die vorstehend unter (a) bis (f) definierten Peptide. Mit Hilfe eines Beispiels, das nicht begrenzend sein soll, kann erläutert werden, daß geeignete Dosierungen der Impfstoff-Zusammensetzungen im Wirt, insbesondere in einem menschlichen Wirt, in vivo wirksam Antikörper erzeugen sollen. Geeignete Dosierungen reichen von 10 bis 500 Microgramm Polypeptid, Protein oder Glycoprotein pro kg, beispielsweise 50 bis 100 Microgramm pro kg.
  • Die unterschiedlichen erfindungsgemäßen Peptide können selber auch zur Herstellung von Antikörpern, vorzugsweise monoclonalen Antikörpern, die für die jeweils unterschiedlichen Peptide spezifisch sind, verwendet werden. Zur Herstellung von Hybridomen, die die monoclonalen Antikörper sekretieren, werden übliche Herstellungs- und Absuchverfahren verwendet. Diese monoclonalen Antikörper, die selbst Teil der Erfindung sind, liefern dann sehr nützliche Werkzeuge zur Identifizierung und selbst zur Bestimmung der relativen Verhältnisse der unterschiedlichen Polypeptide oder Proteine in biologischen Proben, insbesondere Proben vom Menschen, die LAV oder verwandte Viren enthalten.
  • Die Erfindung betrifft ferner Wirte (prokaryotische oder eukaryotische Zellen), die durch die vorstehend beschriebenen Rekombinanten transformiert sind und die fähig sind, die DNA-Fragmente zu exprimieren.
  • Schließlich betrifft die Erfindung auch Vektoren zur Transformation von eukaryotischen Zellen menschlichen Ursprungs, insbesondere von Lymphocyten, deren Polymerasen fähig sind, die LTRs von LAV zu erkennen. Insbesondere sind die Vektoren durch die Gegenwart eines darin enthaltenden LAV-LTR gekennzeichnet, wobei der LTR dann als ein Promotor aktiv ist, der unter seiner Steuerung in einem geeigneten Wirt die wirksame Transkription und Translation einer ein bestimmtes Protein codierenden DNA-Insertion ermöglicht.
  • Es ist unnötig zu sagen, daß die Erfindung sich auf sämtliche Genom-Varianten und die entsprechenden DNA-Fragmente (ORFs) erstreckt, die im wesentlichen gleiche Eigenschaften aufweisen, wobei sämtliche Genome zu Retroviren gehören, die als LAV-Äquivalente angesehen werden können.
  • Es versteht sich von selbst, daß die nachstehend aufgeführten Ansprüche auch sämtliche äquivalenten Produkte (z.
  • B. Glycoproteine, Polypeptide, DNAs etc.) enthalten sollen, wobei ein Äquivalent ein Produkt d. h. ein Polypeptid ist, das von einem bestimmten, in einem der Ansprüche definierten zum Beispiel durch eine oder mehrere Aminosäuren unterschieden werden kann, während es im wesentlichen noch dieselben immunologischen oder immunogenen Eigenschaften aufweist. Eine gleiche Äquivalenzregel soll für die DNA-Moleküle gelten, wobei es selbstverständlich ist, daß die Äquivalenzregel dann an die Äquivalenzregel, die die Polypeptide betrifft, die sie codieren, gebunden ist.
    • Druckschriften
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Claims (22)

.an
1. Gereinigtes Peptid, herausschneidbar aus einem gereinigten Hüllglycoprotein des LAV-Virus mit einem Molekulargewicht im Bereich von 110 000, meßbar durch seinen Wanderungsabstand in einem Wanderungssystem im Vergleich mit den Abständen von Standardproteinen mit bekannten Molekulargewichten im gleichen Wanderungssystem, wobei das Glycoprotein nach Behandlung mit Endoglycosidasen und nachfolgender Entfernung der Zuckerreste ein Protein mit einem Molekulargewicht von etwa 90 000 Dalton liefert, meßbar im gleichen Wanderungssystem, oder aus einem Polypeptid, das das gleiche Polypeptidgrundgerüst wie obiges Glycoprotein hat, wobei das Peptid eine Größe aufweist, die 200 Aminosäuren nicht überschreitet.
2. Gereinigtes Peptid, dadurch gekennzeichnet, daß es sich von einem gereinigten Peptid nach Anspruch 1 unterscheidet, wobei es im wesentlichen die gleichen immunologischen oder immunogenen Eigenschaften, wie das entsprechende nicht-modifizierte Peptid aufweist, wobei solche Peptide beispielsweise eine oder mehrere Aminosäuren aufweisen, die von denen eines bestimmten Peptids nach Anspruch 1 verschieden sind.
3. Gereinigtes Peptid nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß es mindestens ein neutralisierendes Epitop enthält, wobei ein solches Epitop insbesondere eine Aminosäuresequenz mit der Formel Asn-X-Ser oder Asn-X-Thr umfaßt, wobei X jede andere mögliche Aminosäure ist.
4. Gereinigtes Peptid nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß es mindestens ein neutralisierendes Epitop enthält, wobei ein solches Epitop insbesondere eine Aminosäuresequenz mit der Formel Asn-X-Ser oder Asn-X-Thr umfaßt, wobei X jede andere mögliche Aminosäure ist und das Epitop glycosyliert ist oder nicht.
5. Gereinigtes Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß es von der Nucleotidsequenz codiert wird, die sich jeweils zwischen den folgenden Positionen erstreckt
a) Nucleotide 6171 bis 6276 mit der folgenden Aminosäuresequenz
oder b) Nucleotide 6337 bis 6387 mit der folgenden Aminosäuresequenz
c) Nucleotide 6466 bis 6516 mit der folgenden Aminosäuresequenz
oder
d) Nucleotide 6562 bis 6696 mit der folgenden Aminosäuresequenz
oder
e) Nucleotide 6937 bis 7005 mit der folgenden Aminosäuresequenz
oder
f) Nucleotide 7612 bis 7746 mit der folgenden Aminosäuresequenz:
6. Gereinigtes Peptid nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß es aus der folgenden Gruppe ausgewählt ist, wobei die erste und letzte Aminosäure jeweils der N-terminalen bzw. C-terminalen Aminosäure entsprechen, Aminosäuren 8-23 einschließlich, nämlich Met-Arg-Val-Lye
Aminosäuren 63-78 einschließlich, nämlich
Aminosäuren 82-90 einschließlich, nämlich
Aminosäuren 97-123 einschließlich, nämlich
Aminosäuren 127-183 einschließlich, nämlich
Aminosäuren 191-201 einschließlich, nämlich
Aminosäuren 239-294 einschließlich, nämlich
Aminosäuren 300-327 einschließlich, nämlich
Aminosäuren 334-381 einschließlich, nämlich
Aminosäuren 397-424 einschließlich, nämlich Cys-Asn-Ser
Gly-Ser-Asp- Aminosäuren 466-500 einschließlich, nämlich
Aminosäuren 510-523 einschließlich, nämlich
Aminosäuren 551-577 einschließlich, nämlich
Aminosäuren 594-603 einschließlich, nämlich
Aminosäuren 621-630 einschließlich, nämlich
Aminosäuren 657-679 einschließlich, nämlich
Aminosäuren 719-758 einschließlich, nämlich
Aminosäuren 780-803 einschließlich, nämlich
7. Gereinigtes Peptid nach den Ansprüchen 3 und 4, dadurch gekennzeichnet, daß es ausgewählt ist aus der folgenden Gruppe, wobei die erste und letzte Aminosäure jeweils der N-terminalen bzw. C-terminalen Aminosäure entsprechen,
Aminosäuren 127-183 einschließlich, nämlich
Aminosäuren 197-201, einschließlich, nämlich
Aminosäuren 239-294 einschließlich, nämlich
Aminosäuren 300-327 einschließlich, nämlich
Aminosäuren 334-381 einschließlich, nämlich
Aminosäuren 397-424 einschließlich, nämlich
Aminosäuren 466-500 einschließlich, nämlich
Aminosäuren 621-630 einschließlich, nämlich
8. Gereinigtes Peptid nach einem der Ansprüche 3 oder 7, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Epitop-tragendes Peptid ist und insbesondere, daß es ein immunogenes Peptid ist.
9. Gereinigtes Peptid nach Anspruch 8, in einer oligomeren Form, insbesondere ein wasserlösliches immunogenes Oligomer.
10. Hybridpolypeptid, umfassend ein Peptid nach einem der Ansprüche 3, 4, 7 oder 8 und mit N-terminalen und C-terminalen Enden, die kovalent an andere Aminosäuren gebunden sind als an die, die normalerweise mit diesen im gp110 von LAV assoziiert sind, wobei die letztgenannten Aminosäuren dann frei sind oder zu einer anderen Polypeptidsequenz gehören, insbesondere einer Sequenz mit einer Größe, die ausreicht, um eine verbesserte Immunogenität bereitzustellen.
11. Zusammensetzung von Peptiden, dadurch gekennzeichnet, daß sie mindestens zwei Peptide nach einem der Ansprüche 1 bis 8 umfaßt.
12. Immunogene Zusammensetzung, umfassend ein gereinigtes Peptid nach Anspruch 1, 2, 7 oder 8, oder ein gereinigtes Oligomer nach Anspruch 9, oder ein Hybridpolypeptid nach Anspruch 10 und einen geeigneten pharmazeutischen Träger.
13. DNA-Sequenz, dadurch gekennzeichnet, daß sie ein Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 8 codiert.
14. DNA-Sequenz nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß sie in einen Vektor eingebaut ist.
15. Verfahren zur chemischen Synthese eines Peptids oder Polypeptids nach einem der Ansprüche 1 bis 8, gekennzeichnet durch:
aufeinanderfolgende Kondensation entweder von aufeinanderfolgenden Aminosäuren in Zweiergruppen in der richtigen Ordnung oder aufeinanderfolgenden Peptidfragmenten, die vorher zugänglich waren oder gebildet wurden und schon einige Aminoacylreste in der geeigneten Reihenfolge enthalten, wobei alle reaktiven Gruppen außer den Carboxyl- und Aminogruppen, die an der Bildung der Peptidbindung beteiligt sind, geschützt sind,
gegebenenfalls Aktivierung der Carboxylgruppen vor der Bildung der Peptidbindung,
Gewinnung des gebildeten Peptids oder Polypeptids.
16. Verfahren zur Herstellung eines Peptids nach einem der Ansprüche 1 bis 8, gekennzeichnet durch:
Transformation eines prokaryontischen oder eukaryontischen Wirtes mit einem geeigneten Vektor, der vorher durch die entsprechende DNA gemäß Anspruch 13 modifiziert wurde, unter Bedingungen, die die Produktion des gewünschten Peptids ermöglichen,
Gewinnung und Reinigung des so erhaltenen Peptids, beispielsweise durch Elektrophorese.
17. Verfahren zur in vitro-Diagnose des Vorliegens von anti- LAV-Antikörpern in biologischen Medien, dadurch gekennzeichnet, daß es das Inkontaktbringen der biologischen
Flüssigkeit mit dem Produkt eines der Ansprüche 1 bis 8 unter Bedingungen umfaßt, die für die Bildung eines Komplexes zwischen den Antikörpern und dem Produkt geeignet sind, und Nachweis des Komplexes als Hinweis auf die Gegenwart der Antikörper in der biologischen Flüssigkeit.
18. Kit für die in vitro-Diagnose der Gegenwart von Antikörpern gegen LAV-Virus in Flüssigkeiten, umfassend:
ein Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 8 oder eine Zusammensetzung nach Anspruch 11,
biologische und chemische Reagenzien, die zur Durchführung des diagnostischen Tests notwendig sind, z. B. geeignete Puffer, anti-menschliche Immunglobuline, die vorher mit einer Fluoreszenzmolekül oder einem Enzym markiert wurden,
wenn die anti-menschlichen Immunglobuline mit einem Enzym markiert wurden, ein Substrat, das durch das Enzym hydrolysierbar ist und ein Signal liefert, das die Gegenwart eines Antikörpers in der biologischen Flüssigkeit anzeigt.
19. Verfahren zur Herstellung von monoclonalen Antikörpern gegen ein gereinigtes Peptid nach einem der Ansprüche 1
bis 9, umfassend die folgenden Schritte:
- Fusion von Myelomzellen eines vorher mit diesem gereinigten Peptid immunisierten Tieres mit Splenocyten zum Erhalt von Hybridomen; - Auswahl der Hybridomen, die die Antikörper mit Spezifität für das gereinigte Peptid produzieren, - Gewinnung der Antikörper gegen das gereinigte Peptid.
20. Antikörper, dadurch gekennzeichnet, daß er durch das gereinigte Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 9 erkannt wird.
21. Antikörper nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß es ein monoclonaler Antikörper ist.
22. Verwendung von Antikörpern nach Anspruch 20 oder 21, zur Identifizierung des Hüllglycoproteins des LAV-Virus, oder auch für die Bestimmung des relativen Anteils dieses Antigens in einer biologischen Probe, die LAV oder verwandte Viren enthält.
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