DE3853422T2 - HIV-3-Retrovirus und seine Verwendung. - Google Patents

HIV-3-Retrovirus und seine Verwendung.

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Description

  • Unser Verständnis bezüglich AIDS (erworbenes Immunschwäche-Syndrom) hat deutliche Fortschritte gemacht. Es ist gezeigt worden, daß das wesentliche verursachende Agens ein nichts-transformierendes Retrovirus mit einem Tropismus für T4-Helfer-/Induktor-Lymphozyten (1,2) ist. Nach Schätzungen sind weltweit bereits Millionen von Menschen infiziert. Die Infektion mit diesem Virus führt, zumindest in einem signifikanten Prozentsatz der Fälle, zu einer fortschreitenden Erschöpfung der T4-Lymphozyten-Population bei gleichzeitiger Zunahme der Empfänglichkeit gegenüber opportunistischen Infektionen, die für diese Erkrankung charakteristisch sind.
  • Epidemiologische Untersuchungen deuten darauf hin, daß menschliches Immunschwächevirus Typ 1 (HIV-1), das das etiologische Agens ist, das für die Mehrheit der AIDS-Fälle verantwortlich ist, und das das gegenwärtig weitestverbreitete HIV ist, seinen Ursprung wahrscheinlich in Zentralafrika hatte (3). Die Entdeckung dieses Virus implizierte nicht notwendigerweise die Existenz anderer Typen der menschlichen Immunschwächeviren. Dennoch wurde in Westafrika eine zweite Gruppe von Retroviren identifiziert, die mit der menschlichen Immunschwäche assoziiert sind, nämlich das menschliche Immunschwächevirus Typ 2 (HIV-2) (4,5). Ein HIV-2-Virus ist in der EP-A-0 239 425 offenbart. Ein HIV-1- Virus ist in der WO 86/02383 offenbart. Andere, ähnliche, aber nicht identische, Retroviren sind auch aus Affen (Affen-Immunschwächevirus, SIV) wie afrikanische Grünaffen (6,7) und Makaken (8,9) isoliert worden. Es hat sich gezeigt, daß die Affenisolate genetisch näher mit HIV-2 verwandt sind als es HIV-1 ist, aber trotzdem sind sie verschieden (10).
  • Ein Charakteristikum der menschlichen Immunschwächeviren, das ihren Vergleich schwierig gestaltet, ist ihre genetische Variabilität; genetische Varianten treten spontan und mit großer Häufigkeit auf. Ein Vergleich der zahlreichen HIV-1-Isolate zeigte daß einige Regionen des Genoms sehr variabel sind, während andere ziemlich gut konserviert sind (11-16). Ähnliche Polymorphismen sind auch für HIV-2 beobachtet worden (17). Die Regionen mit der größten genetischen Stabilität sind wahrscheinlich die Regionen, die für die Regionen der viralen Proteine codieren, die strukturell oder enzymatisch wesentlich sind. Die viralen Gene mit der insgesamt größten genetischen Stabilität sind die Gene gag und pol, während einige Regionen des Genes env und die für regulatorische Proteine codierenden Gene wie art, tat, sor und 3'orf einen hohen Grad der Variabilität aufweisen. Einige der wesentlichen Strukturmerkmale der Genprodukte von gag und pol liegen offensichtlich nicht nur in allen Varianten eines bestimmten HIV-Typs vor, sondern sind, zumindest zu einem gewissen Maß, auch zwischen verschiedenen Virus-Typen konserviert. Gegen HIV-1 erzeugtes Antiserum kreuzreagiert mit den Genprodukten gag und pol von HIV-2, wenn auch mit einer geringeren Affinität als für die entsprechenden Genprodukte von HIV-1. Trotz der nachweisbaren immunologischen Kreuzreaktion gibt es auf dem Level der Nukleinsäure jedoch wenig Sequenz-Homologie. Zwischen diesen beiden Viren kann außer unter sehr wenigen stringenten Bedingungen keine bemerkenswerte Hybridisierung nachgewiesen werden (17).
  • Eine nähere Verwandtschaft kann zwischen SIVagm (STLV-III agm, nahezu oder völlig identisch mit dem HTLV IV (menschliches lymphotropes Virus Typ 4) (15)) und HIV-2 gezeigt werden. Immunologische Kreuzreaktionen sind nicht nur auf die Genprodukte von gag und pol beschränkt, sondern erstrecken sich auch auf die Genprodukte von env. Nichtsdestostrotz ergaben Genomanalysen von SIVagm und HIV-2, daß sie genetisch unterscheidbar sind (19). Für HIV-2 spezifische DNA-Sonden hybridisieren hevorzugterweise mit HIV-2, auch wenn sie mit SIVagm-Sequenzen hybridisieren können (18).
  • Wir berichten nun über die Isolierung und Charakterisierung eines neuen menschlichen Immunschwächevirus aus einer Frau und ihres Partners aus Kamerun. Geographisch kommt dieses Virus aus einer Region in Afrika, die zwischen Westafrika, wo HIV-2 endemisch ist, und Ost-Zentralafrika, wo HIV-1 endemisch ist, liegt. Es wird auf immunologische Weise gezeigt, daß dieses Isolat antigenisch näher mit HIV-1 als mit HIV-2 verwandt ist. Eine Analyse der Produkte einer partiellen Spaltung, erhalten mittels chemischer Spaltung der Genprodukte von gag und pol, zeigt jedoch, daß dieses Isolat weder HIV-1 noch HIV-2 ist. Dieses neue Isolat könnte eine evolutionäre Verbindung zwischen HIV-1 und HIV-2 darstellen. Dieses neue Virus wird im nachfolgenden mit HIV-3 bezeichnet.
  • Dementsprechend betrifft die Erfindung ein HIV-3-Retrovirus, das die wesentlichen morphologischen und immunologischen Eigenschaften des bei der European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC) unter der Nummer V 88060301 hinterlegten Retrovirus hat.
  • Ein Virus-Isolat wurde aus Blut einer symptomlosen Frau aus Kamerun, deren Partner ein HIV-seropositiver Mann mit allgemeiner Lymphadenopathie ist, gewonnen. Serum der Frau war mäßig positiv (Verhältnis OD/Cut-off von 4,5) in einem Festphasen-Enzym-Immunoassay (EIA, Organon Teknika). Es hatte einen niedriger Titer (1/40) im Immunofluoreszenz-Antikörper-Assay für HIV-1, gab aber zweideutige Ergebnisse in dem HIV-1 Western Blot-Assay mit klaren Banden bei p33, p53/55 und p64 und sehr schwachen Banden bei p24, gp41 und gp 120. Das Virus wurde mittels Cokultivierung der Lymphozyten der Frau mit PHA stimulierten Lymphozyten aus gesunden, nicht infizierten Donoren in einem Medium, das aus RPMI 1640, abgepuffert mit 20 mM HEPES (Hydroxyethylpiperazin-Ethansulfonat) und supplementiert mit 15 % fötalem Kälberserum, 5 ug/ml Hydrocortison, 75 U/ml Interleukin-2 (IL-2) und 2 ug/ml Polybren, isoliert.
  • Nach 52 Tagen in der Kultur wurde das Virus aufgrund der Gegenwart von Synzytien und auf der Grundlage einer positiven Immunofluoreszenz, beobachtet bei Inkubation eines gegen HIV gerichteten Vergleichs-Antiserums aus dem Labor mit Aceton-fixierten Zellen aus der Kultur, nachgewiesen. Die Gegenwart von Reverser Transkriptase in dem Kulturüberstand (10&sup4; cpm/ml 27-facher Hintergrund) wurde ebenfalls nachgewiesen. Zellfreier Kultur-Überstand wurde verwendet, um das Virus auf frische Lymphozyten zu passagieren. Nach 15 Tagen wurden wiederum ein CPE beobachtet und Reverse Transkriptase im Überstand nachgewiesen. Das Virus wurde in mit PHA stimulierten Lymphozyten aus gesunden Blutspendern weitervermehrt und auf permanente Zellinien leukämischen Ursprungs übertragen. Virusenthaltender Überstand wurde gleichzeitig mit Kultur-Überständen, von denen bekannt war, daß sie HIV-1 enthalten, in dem differentiellen Antigen-Einfangtest, der weiter unten genauer beschrieben ist, untersucht. Die Ergebnisse dieses Vergleichs deuteten darauf hin, daß das neue Isolat nicht HIV-1 war.
  • Das neue Virus wurde dann bezüglich seiner Protein-Antigene und Nukleinsäuren charakterisiert. Die zur Vermehrung des Virus verwendeten Zellinien können in Abhängigkeit vom Einzelfall die Zellinien CEM, HUT, Molt-4 oder MT4 oder irgendwelche anderen immortalisierten Zellinien sein, die den T4-Rezeptor auf ihrer Zelloberfläche tragen.
  • Eine bevorzugte Zellinie für die kontinuierliche Vermehrung von HIV-3 ist die Zellinie Molt-4. Molt-4-Zellen, die mit HIV-3 infiziert sind, wurden bei der ECACC am 3. Juni 1988 unter der Nummer V 88060301 hinterlegt. Das Etablieren einer chronisch infizierten Zellinie kann z. B. wie folgt durchgeführt werden:
  • Molt-4-Zellen (10&sup6;/ml) und vorzugsweise Zellen des Molt-4-Klons 8 (erhalten von N. Yamamoto, Yamaguchi, Japan) werden zusammen mit infizierten menschlichen Lymphozyten (10&sup6;/ml) in RPMI 1640-Kulturmedium, abgepuffert mit 20 mM HEPES und enthaltend 10 % fötales Kälberserum, kultiviert. Innerhalb von ein oder zwei Wochen wird in der Kultur ein cytopathischer Effekt beobachtet, auf den der Zelltod folgt.
  • Eine Fraktion der Zellen in der Kultur überlebt die Infektion und produziert das Virus kontinuierlich. Mit fortgesetzter Kultivierung nimmt die Zahl der Zellen zu, und die Zellen können passagiert werden. Überstände dieser Zellen können als Quelle für das Virus verwendet werden.
  • Außerdem betrifft die Erfindung das gereinigte Retrovirus mit den wesentlichen morphologischen und immunologischen Eigenschaften, die unten beschrieben sind. In vielen Fällen lassen sich die einzigartigen Eigenschaften von HIV-3 durch einen Vergleich mit derselben Art von Eigenschaften der anderen menschlichen Immunschwächeviren HIV-1 und HIV-2, einschätzen.
    • Kurze Beschreibung der Figuren
  • In den Figuren 1 bis 16 beziehen sich die Bezeichnungen HIV-3 (ANT 70) und HIV-3 (ANT 70 NA) auf zwei Stämme eines neuen HIV-3- Virus, die aus einer Frau aus Kamerun und ihrem Partner isoliert worden sind, und von denen der Stamm HIV-3 (ANT 70) unter ECACC V88060301 hinterlegt worden ist.
  • Figur 1 zeigt ein Verfahren, Spaltmuster von viralen Proteien zu erzeugen.
  • Figur 2 zeigt das differentielle Antigen-Einfangen an Virus enthaltenden Kultur-Überständen.
  • Das differentielle Antigen-Einfangen wird wie nachfolgend beschrieben durchgeführt. Die durchgezogene Linie stellt die Ergebnisse dar, die unter Verwendung eines gegen HIV-1 gerichteten Breitband-IgG erhalten wurden, während die gestrichelte Linie die Ergebnisse darstellt, die unter Verwendung von IgG erhalten wurden, das für HIV-1 ziemlich spezifisch ist. Die in den Spalten A-E gezeigten Titrationen sind für HIV-1 typisch.
  • Spalte F zeigt das Ergebnis, das mit HIV-3 (ANT 70) enthaltendem Überstand erhalten worden ist.
  • Figur 3 zeigt differentielles Antigen-Einfangen an HIV-1 und HIV-3 (ANT 70 NA)-Überständen.
  • Das differentielle Antigen-Einfangen wird wie nachfolgend beschrieben durchgeführt. Die durchgezogene Linie stellt die Ergebnisse dar, die unter Verwendung von Platten erhalten wurden, die mit dem gegen HIV- 1 gerichteten Breitband-IgG beschichtet waren, während die gestrichelte Linie die Ergebnisse darstellt, die unter Verwendung von Platten erhalten wurden, die mit einem IgG beschichtet waren, das mit anderen HIV- Typen als dem Typ HIV-1 weniger Kreuzreaktivität zeigt.
  • Figur 4 zeigt die Reaktivität von gegen HIV gerichteten Sera auf HIV-1- und HIV-2-Western Blot-Streifen.
  • Die Reaktivitäten von drei verschiedenen Sera auf HIV-1- und HIV-2- Western Blot-Streifen werden gezeigt. Sera: 1. Anti-HIV-I, 2. Anti-HIV-3 (ANT 70), 3. Anti-HIV-2 (Isolat 53). Die angezeigten Molekulargewichte sind die vom Hersteller (Dupont Biotech) angegebenen.
  • Figur 5 betrifft den Vergleich der Proteine gag und pol von verschiedenen HIV-1-Isolaten, HIV-2rod und HIV-3 (ANT 70).
  • Die Proteine wurden elektrophoretisch aufgetrennt und wie später beschrieben geblottet. Der Blot wurde zunächst mit einem gegen HIV gerichteten Breitband-Antiserum inkubiert. Dann wurde das Antiserum mit einem mit alkalischer Phosphatase markierten Konjugat mit gegen menschliches IgG gerichtetem Antikörper inkubiert, so daß die Proteine sichtbar gemacht wurden.
  • A: HIV-2rod, B: ein Laborisolat von HIV-1, C: HIV-3 (ANT 70), D: ein Laborisolat von HIV-1, E: HIV-1 (SF4).
  • Figur 6 zeigt einen Vergleich der Proteine von HIV-3 (ANT 70) und HIV-3 (ANT 70 NA).
  • Die Proteine wurden elektrophoretisch aufgetrennt und wie später beschrieben geblottet. Der Blot wurde zunächst mit dem BSR-Antiserum inkubiert. Dann wurde der Blot mit einem mit alkalischer Phosphatase markierten Konjugat mit gegen menschliches IgG gerichtetem Antikörper inkubiert, so daß die Proteine sichtbar gemacht wurden. Spur 1: HIV-3 (ANT 70 NA), Spur 2: HIV-3 (ANT 70), Spur 3: HIV-1 (SF4). Der offensichtliche Unterschied der Intensitäten in den Spuren 1 und 2 wird durch unterschiedliche Mengen aufgetragenen Materials verursacht.
  • Figur 7 bezieht sich auf die Fähigkeit verschiedener menschlicher gegen HIV-1 gerichteter Sera zum Einfangen viraler Antigene.
  • Eine Reihe menschlicher Sera wurde 1:1000 verdünnt und direkt auf Mikrotiter-Platten beschichtet. Mit Detergenzien behandelte Kultur-Überstände, die HIV-1 (SF4), HIV-3 (ANT70), HIV-2rod oder HIV-2 (Isolat 53) enthielten, wurden inkubiert, und das gebundene Antigen wurde unter Verwendung eines Konjugats aus anti-HIV/Meerettich-Peroxidase mit breitem Spektrum nachgewiesen. Die Sera 1-7 waren afrikanischen Ursprungs, während die Sera 8-11 von Europäern waren. Die größere Fähigkeit der afrikanischen Sera, Nicht-HIV-1-Antigen einzufangen, kann zum Teil durch ihre höhere Titer gegenüber p24 (Daten nicht gezeigt) erklärt werden.
  • Figur 8 zeigt die Wirkung der Beschichtung einer IgG-Verdünnung auf das Binden der HIV-Isolate.
  • Von vier verschiedenen Sera wurden nacheinander 2-fache Verdünnungen hergestellt, wobei bei einer Verdünnung von 1:1000 begonnen wurde. Diese Verdünnungen wurden verwendet, um Mikrotiter-Platten zu beschichten. Mit Detergenzien behandelte Überstände von HIV-1 (SF4), HIV-3 (ANT 70), HIV-2rod und HIV-2 (Isolat 53) wurden verdünnt, so daß sie auf Platten, die mit Antiserum beschichtet waren, etwa dieselbe optische Dichte ergaben, wie es in Spur B bei einer Verdünnung von 1:1000 dargestellt ist. Gebundenes Antigen wurde unter Verwendung des Konjugats aus Anti-HIV-IgG/Meerettich-Peroxidase mit breitem Spektrum nachgewiesen.
  • Figur 9 zeigt das Einfangen von Antigenen durch Virusisolate unter Verwendung menschlicher polyklonaler und gegen HIV-1 gerichteter, monoklonaler Antikörper der Maus.
  • Die Vertiefungen wurden beschichtet und inkubiert, wie es im Text beschrieben ist. Die verwendeten IgGs waren die folgenden:
  • 1. Gegen HIV gerichtetes, polyklonales IgG des Menschen, 2. MAb CLB 59, 3. MAb CLB 21, 4. MAb CLB 64, 5. MAb CLB 14, 6. MAb CLB 16, 7. MAb CLB 47, 8. MAb CLB 13.6 (Anti-p18), 9. MAb CLB 19.7, 10. MAb CLB 13.4 (Anti-p18).
  • Figur 10 ist ein Vergleich der Reaktivität von menschlichen, gegen HIV gerichteten Antisera mit verschiedenen Typen von HIV.
  • Die Lysate von HIV-1 (SF4), HIV-3 (ANT 70), HIV-2rod und HIV-2 (Isolat 53) wurden auf SDS-Polyacrylamidgelen elektrophoretisch aufgetrennt, auf Nitrozellulose geblottet und mit folgenden Sera inkubiert: Antiserum gegen HIV-1 mit einem hohen Titer (Spur A), Antiserum gegen HIV-1 mit einem niedrigen Titer (Spur B), Serum von der Frau, aus der HIV-3 (ANT 70) isoliert worden war (Spur C), Serum von ihrem Partner, aus dem HIV-3 (ANT 70 NA) isoliert worden war (Spur D) und Antiserum gegen HIV-2 von der Person, aus der HIV-2 (Isolat 53) isoliert worden war (Spur E).
  • Figur 11 zeigt Titrationen von gegen HIV gerichteten Sera mittels Enzym-Immuno-Assay.
  • Mikrotiterplatten wurden mit Lysaten von HIV-1 (SF4), HIV-3 (ANT 70) und HIV-2 (Isolat 53) beschichtet. Serum von einem mit HIV-1 infizierten Europäer (linke Spur), Antiserum gegen HIV-3 (ANT 70 NA) (mittlere Spur) und Antiserum gegen HIV-2 (Isolat 53) (rechte Spur) wurden in zweifachen Verdünnungen, beginnend bei einer Verdünnung von 1:100, auf allen drei beschichteten Platten titriert.
  • Figur 12 zeigt die Positionen von Methionin- und Tryptophan-Resten in den viralen Gen-Produkten gag und pol.
  • Die Aminosäure-Positionen für die p17-gag-Proteine sind angegeben, indem am ersten Methionin in der codierenden Sequenz begonnen wurde. Die Positionen für das p24-gag-Protein sind angegeben, indem an der proteolytischen Spaltungsstelle p17/p24 begonnen wurde. Die Positionen für das pol-Gen sind nach Ausrichtung an dem hoch-konservierten Tryptophan-Duplett in der HIV-1-Sequenz an den Positionen 556 und 557 dargestellt. Die Positionen einer konservierten Protease-Sequenz, der Protease/Reverse Transkriptase-Spaltungsstelle und der Reverse Transkriptase/Endonuclease-Spaltungsstelle sind angegeben. In diesem Fall werden die Begriffe p24 und p17 im genetischen Sinn verwendet, um sich auf das größte und das zweitgrößte virale Core-Protein zu beziehen. Der Begriff "HIV-2 (LAV2)" ist ein Synonym für HIV-2rod.
  • Figur 13 ist ein Vergleich eines partiellen Spaltprodukts der Genprodukte von gag und pol von HIV-1 (SF4) [HIV-1 in der Figur], HIV-3 (ANT 70) [Isolat 70 in der Figur], HIV-2rod [HIV-2 (LAV-2) in der Figur] und HIV-2 (Isolat 53) [Isolat 53 in der Figur]. Die Begriffe p24 und p17 werden im genetischen Sinn verwendet, um das größte und das zweitgrößte virale Core-Protein zu bezeichnen.
  • Figur 14 zeigt die Hybridisierung von cDNA-Sonden mit viraler RNA.
  • Virale RNA von HIV-1 (SF4), HIV-2rod und HIV-3 (ANT 70) wurden, wie es in dem Abschnitt Materialien und Methoden beschrieben ist, auf einen Membranfilter getüpfelt. Die Filter wurden entweder unter nichtstringenten (A) oder unter stringenten Bedingungen hybridisiert und dann autoradiographiert.
  • Figur 15 zeigt die Hybridisierung von cDNA (iso 70-11) von HIV-3 (ANT 70) mit genomischer DNA aus nicht- und mit HIV-infizierten Zellen.
  • Genomische DNA der unten aufgelisteten Zellinien wurde einer Restriktionsenzym-Spaltung unterworfen, elektrophoretisch aufgetrennt und geblottet. Die Hybridisierungen wurden wie in dem Abschnitt Materialien und Methoden beschrieben durchgeführt. Die Proben sind die folgenden: Spur Restriktionsenzym-Verdau lambda uninfiziert Hind
  • Spur A: Hybridisierung mit iso 70-11
  • Spur B: Hybridisierung mit dem Bgl II/Sal I-Fragment von iso 70- 11.
  • Figur 16 betrifft die Lage einer Reihe von Restriktionsenzym-Spaltungsstellen in dem HIV-3-Insert, das in der iso 70-11-DNA enthalten ist.
  • Das Fragment enthält keine internen Spaltungsstellen für EcoRI, Bam HI, Hinc II, oder Xba I.
    • 1. Morphologie
  • Die Elektronenmikroskopie von mit HIV-3 infizierten MT4-Zellen zeigte die Gegenwart extrazellulärer Virus-Partikel mit einem Durchmesser von ungefähr 120 nm, die aus einer äußeren Hülle bestehen, die einen inneren, länglichen Core mit einem Durchmesser von ungefähr 20 bis 40 nm umgibt, und der in einigen dünnen Schnitten im Gegensatz zu dem mehr oder weniger zylindrischen Erscheinen des Cores von HIV-1 leicht konusförmig erschien. Trotzdem ist HIV- 3 morphologisch HIV-1 und HIV-2 sehr ähnlich, läßt sich aber ohne weiteres von anderen menschlichen Retroviren wie HTLV-I und HTLV-II unterscheiden.
    • 2. Protein- und Glykoprotein-Antigene
  • Das in dem Kulturüberstand von mit HIV-3 infizierten Molt-4-Zellen vorhandene Virus wurde mittels Präzipitation mit Polyethylenglykol (durchschnittliches Molekulargewicht: 6.000) konzentriert und anschließend zentrifugiert. Das resultierende Pellet wurde in mit Phosphat gepufferter Salzlösung resuspendiert, auf ein 20 % Sukrose-Kissen geschichtet und bei 100.000 x g eineinhalb Stunden lang pellettiert. Das pellettierte Virus wurde dann in 62,5 mM Tris, pH 6,7, das 2 % 2-Mercapto-Ethanol, 1 % Natriumdodecylsulfat und 10 % Glyzerin enthielt, aufgeschlossen (dissoziiert), und die wesentlichen viralen Antigene wurden mittels Elektrophorese auf einem Polyacrylamid-Gel (12,5 %) unter denaturierenden Bedingungen aufgetrennt. Standards für das Molekulargewicht liefen auf demselben Gel mit, um eine Grundlage für die Abschätzung der Molekulargewichte zur Verfügung zu haben. Nachdem die Proteine einmal aufgetrennt waren, wurden sie elektrophoretisch auf Nitrozellulose-Papier (Western Blot) transferiert. Das Nitrozellulose-Papier wurde dann mit einem Antiserum inkubiert, das von einem mit einem HI-Virus infizierten Menschen stammte. In den anfänglichen Experimenten wurde ein Antiserum von einer Person, die mit HIV-1 infiziert war, und von dem vorher gezeigt worden war, daß es mit von gag- und pol-abgeleiteten Proteien von HIV-2 kreuzreagiert, das einen hohen Titer hatte, verwendet. Auf diese Weise konnten die Molekulargewichte der Genprodukte gag und pol von HIV-3 mit denen von HIV-1 und HIV-2 verglichen werden. Die Molekulargewichte, die für die Proteine von HIV-3 beobachtet wurden, sind ähnlich denen, die sowohl für HIV-1 als auch für HIV-2 beobachtet wurden. Trotzdem sind kleine, jedoch reproduzierbare, Unterschiede in den Molekulargewichten zwischen den Proteien von HIV-3 einerseits und von HIV-1 und HIV-2 andererseits offensichtlich.
  • Die Protein-Blots zeigten, daß HIV-3 wie auch HIV-1 und HIV-2 drei Core-Proteine besitzt. Im Fall von HIV-3 wurde gefunden, daß diese Proteine Molekulargewichte von etwa 12.000, 16.500 bzw. 25.000 haben. Üblicherweise werden Proteine häufig mit einem "p" für Protein oder mit "gp" für Glykoprotein und eine nachfolgende Zahl, die mit einem Faktor von 1000 multipliziert, das ungefähre Molekulargewicht des Polypeptids angibt, bezeichnet. Die drei Haupt- Core-Proteine von HIV-3 werden im nachfolgenden mit p12, p16 und p25 bezeichnet.
  • Es ist zu erwarten, daß die bestimmten Werte für das Molekulargewicht innerhalb einer Abweichung von 10 % von den wahren Werten korrekt sind. Dennoch besteht viel Verwirrung bezüglich der Werte von Molekulargewichten von Proteien, da der Aufbau der verwendeten Elektrophorese-Apparatur und die Quelle der Puffer- Bestandteile von Labor zu Labor abweichen. Es ist daher für den Vergleich der offensichtlichen Molekulargewichte der Protein-Antigene von HIV-3 im Vergleich mit denen von HIV-1 oder HIV-2 nötig, alle Proben der Elektrophorese auf demselben Gel zu unterwerfen. Ein derartiges Gel kann z. B. in Figur 5 betrachtet werden. Insbesondere ist es offensichtlich, daß, während im Fall des Haupt- Core-Proteins, die Werte für das Molekulargewicht der homologen Proteine der drei HI-Viren sehr nahe beinander liegen, das von HIV-1 abstammende Protein das kleinste ist. Das Haupt-Core-Protein von HIV-2 ist etwas größer als das von HIV-1, wie es kürzlich beschrieben worden ist. Das homologe Protein von HIV-3 ist ein klein bißchen größer als das Haupt-Core-Protein von HIV-2. Die berechneten Molekulargewichte dieser Proteine sind in Tabelle 1 angegeben. Tabelle 1 - Vergleich der Molekulargewichte der Genprodukte von gag und pol ENDO REVERSE TRANSKRIPTASE** TRANSMEMBRANPROTEIN ÄUSSERES MEMBRANPROTEIN
  • * Eine gewisse Variation im Molekulargewicht von Stamm zu Stamm ist für dieses Protein beobachtet worden.
  • ** Die Molekulargewichte sind für beide Spezies der Reversen Transkriptase angegeben.
  • Auf ähnliche Weise sind Unterschiede im Molekulargewicht auch zwischen den drei HI-Viren bezüglich des zweiten Core-Proteins offensichtlich. Dieses hat in den meisten Stämmen von HIV-1 ein Molekulargewicht von 18.000. Unterschiede im Molekulargewicht dieses Proteins von Stamm zu Stamm sind jedoch im Fall von HIV- 1 dokumentiert worden. Das Molekulargewicht dieses Proteins kann in einigen Isolaten 17.000 sein. Das homologe Protein von HIV-2 hat ein Molekulargewicht von ungefähr 16.000, während das Protein Von HIV-3 ein dazwischenliegendes Molekulargewicht von etwa 16.500 besitzt.
  • In Analogie zu HIV-1 und HIV-2 besitzt HIV-3 auch zwei Formen der viral codierten Reversen Transkriptase. Diese beiden Spezies unterscheiden sich auch leicht im Molekulargewicht von den entsprechenden Spezies in HIV-1 und HIV-2. Sie sind daher charakteristisch für HIV-3. Diese Molekulargewichte sind ebenfalls in Tabelle 1 zusammengestellt.
  • HIV-3 besitzt ein zusätzliches Polypeptid, abgeleitet vom pol-Gen, das eine Endonuklease mit einem offensichtlichen Molekulargewicht von 31.000 ist, und das sich nicht wesentlich im Molekulargewicht unterscheidet von den homologen Proteinen aus HIV-1 oder HIV-2.
  • Wenn Protein-Blots, die HIV-3-Proteine enthalten, mit Serum inkubiert werden, das von einem mit diesem Virus infizierten Menschen erhalten wurde, können zwei zusätzliche Proteine gesehen werden. Diese Proteine stammen von dem env-Gen und sind die viralen Hüll-Glykoproteine. Das kleinste Protein, das das Transmembran- Protein ist, wandert als eine breite Bande mit einem offensichtlichen Molekulargewicht von zwischen 40.000 und 45.000. Dieses Protein wird hiernach als gp41 bezeichnet, wobei zu verstehen ist, daß das Protein eine gewisse, ihm eigene Heterogenität bezüglich seines offensichtlichen Molekulargewichts und seiner Wanderung in Polyacrylamid-Gelen aufweist. Das größere Protein, das das äußere Membran-Protein ist, ist auf ähnliche Weise etwas diffus auf Polyacrylamid-Gelen und hat ein Molekulargewicht von etwa 120.000.
  • Dieses Protein wird im nachfolgenden als gp120 bezeichnet. Es sollte festgehalten werden, daß die offensichtlich heterogene Wanderung beider Spezies auf einem Polyacrylamid-Gel nicht in der Heterogenität der Polypeptid-Kette begründet ist, sondern vielmehr seine Ursache in der posttranslationalen Glykosylierung hat. Insbesondere ist das gp120 stark glykosyliert, und das offensichtliche Molekulargewicht, das man beobachten kann, zu einem gewißen Maße abhängig von der Zellinie, die verwendet worden ist, um das Virus zu produzieren.
  • Zusätzlich zu dem Western Blot können virale Protein-Antigene auch mittels des Radio-Immuno-Präzipitations-Assays (RIPA) sichtbar gemacht werden. Zu diesem Zweck können virale Proteine in vivo metabolisch markiert werden, indem mit HIV-3 infizierte Zellen in Gegenwart von 35 S-Cystein und 35 S-Methionin (200 uCi/ml = 7,4 x 10&sup6; Bq/ml) in RPMI 1640-Medium ohne diese beiden Amminosäuren, aber supplementiert mit dialysiertem fötalem Kälberserum, kultiviert werden. Nach 16 Stunden wird das markierte Virus aus dem Kulturüberstand mittels Zentrifugation über einem 20 % Sukrose-Kissen bei 100.000 x g für eineinhalb Stunden geerntet. Das resultierende, pellettierte Virus wird dann in RIPA-Puffer (20 mM Triethanolamin, pH 8,0, 0,5 M NaCl, 0,5 % Nonidet P40, 0,1 % Natriumdesoxycholat und 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid) resuspendiert.
  • Andererseits kann das Virus mit 125 I radioaktiv markiert werden, indem Chloramin T mittels der Technik, die dem auf dem Gebiet kundigen Fachmann vertraut ist, verwendet wird. In diesem Fall wird das Virus aus dem Überstand von infizierten Zellen gereinigt, indem das Virus durch ein Kissen von 20 % Sukrose pellettiert, in mit Phosphat gepufferter Salzlösung resuspendiert und mittels Ultrazentrifugation auf einem 20 bis 50 % Sukrose-Gradienten 12 Stunden lang bei 60.000 x g gebandet wird. Das gebandete Virus kann in dem fraktionierten Gradienten entweder mittels des Reverse Transkriptase-Assays oder mittels eines Antigen-Einfangassays lokalisiert werden. Die das Virus enthaltenden Fraktionen werden zusammengegeben und durch Zugabe von Triton X-100 auf eine Konzentration von 0,5 % gebracht. Das mit Triton X-100 lysierte Virus kann danach iodiert werden.
  • Für Immunopräzipitationen werden 100.000 bis 200.000 cpm markiertes virales Protein im RIPA-Puffer mit 5 ul eines Testserums in einem Volumen von 200 ul 16 Stunden lang bei 4 ºC umgesetzt. Die resultierenden Immun-Komplexe werden dann an Protein A- Sepharose (Pharmacia) gebunden, ausgiebig gewaschen, und die gebundenen Proteine werden mit Elektrophorese-Probenpuffer, der 1 % SDS enthält, eluiert. Die Antigene werden anschließend mittels Elektrophorese analysiert. Es folgt eine Autoradiographie.
  • Die Protein-Antigene von HIV-3 können unter Verwendung von zwei unterschiedlichen, jedoch ähnlichen Ansätzen im Vergleich zu den Antigenen von HIV-1 und HIV-2 charakterisiert werden. Einerseits können die Antigene auf der Grundlage ihrer Fähigkeit, mit Antisera von mit HIV-1 und HIV-2 infizierten Personen kreuzzureagieren, charakterisiert werden. Andererseits können Antisera von mit HIV-3 infizierten Personen, die Antikörper als Antwort auf die HIV-3- Antigene enthalten, verwendet werden, um die Kreuzreaktivität gegenüber HIV-1 und HIV-2-Proteinen zu testen. Die antigenen Beziehungen zwischen HIV-3 einerseits und HIV-1 und HIV-2 andererseits werden im wesentlichen in den nachfolgend gegebenen Beispielen aufgezeigt.
  • Die Ergebnisse dieser Experimente zeigen, daß HIV-3 mit HIV-2 nur entfernt verwandt ist, da eine Kreuzreaktivität nur bezüglich der viralen Core-Proteine und Genprodukte von pol beobachtet wird. Es wurde keine Kreuzreaktivität der env-Genprodukte beobachtet, wenn gegen HIV-2 gerichtetes Antiserum mit HIV-3-Proteinen inkubiert wurde, oder wenn gegen HIV-3 gerichtetes Antiserum mit HIV-2- Proteinen inkubiert wurde.
  • Im Gegensatz dazu ist HIV-3 mit HIV-1 näher verwandt, da gegen HIV-3 gerichtetes Antiserum nicht nur mit den Genprodukten von gag und pol von HIV-1 kreuzreagiert, sondern zu einem gewissen Maß auch mit den Genprodukten von env (gp41 und gp120) kreuzreagiert, wenn auch mit einer geringeren Affinität. Auf ähnliche Weise kreuzreagiert gegen HIV-1 gerichtetes Antiserum mit allen Protein-Antigenen von HIV-3, jedoch mit einer geringeren Affinität als für die Proteine von HIV-1.
  • In den folgenden Beispielen wird gezeigt, daß HIV-3 antigenisch im wesentlichen von HIV-1 verschieden ist. Dies erfolgt auf Basis von 1. einem unterschiedlichen Reaktivitätsmuster mit gegen HIV-1 gerichtetem Antiserum im Vergleich zu dem Muster, das für HIV-1 beobachtet wird; 2. einer drastisch reduzierten Fähigkeit, von monoklonalen Antikörpern der Maus erkannt zu werden, die gegen die Core-Proteine p24 und p17 von HIV-1 erzeugt wurden, und 3. bevorzugter Erkennung der HIV-3-Proteine, einschließlich der Hüllproteine, im Vergleich zu den HIV-1-Proteinen durch Antisera von mit HIV-3 infizierten Personen.
  • Trotz der für menschliche Immunschwächeviren typischen genetischen Variation wird ein Test, basierend z. B. auf HIV-1-Proteinen, abgeleitet von einem speziellen Stamm, zufriedenstellend für den Nachweis von Antikörpern funktionieren, die als Antwort auf andere Varianten von HIV-1 erzeugt worden sind. Dies kann insbesondere auch in dem Beispiel gesehen werden, in dem monoklonale Antikörper auf ihre Fähigkeit zur Reaktion mit Antigenen, die von HIV-1-, HIV-2- und HIV-3-Isolaten gewonnen wurden, getestet wurden. In diesem Fall wurden die monoklonalen Antikörper gegen die Core- Proteine von HIV-1 des Stammes III B erzeugt. Diese reagieren sehr stark gegenüber Proteinen, die von HIV-1 des Stammes SF4 abstammen. Im Gegensatz dazu reagieren diese monoklonalen Antikörper nur schwach mit den Core-Proteinen von HIV-3. Dies deutet darauf hin, daß die antigenen Unterschiede zwischen HIV-1 und HIV-3 von einer solchen Größe sind, daß immunologische Assays auf der Grundlage der Verwendung von Proteinen von HIV-1 nicht geeignet sind, um Sera von mit HIV-3 infizierten Personen zu testen.
  • Schließlich sind in den unten angegebenen Beispielen Unterschiede bezüglich der Zahl und/oder Positionen von Methionin- und Tryptophan-Resten in den am höchsten konservierten Genprodukten gag und pol dargestellt.
    • 3. Nucleinsäuren von HIV-3 A. Virale RNA von HIV-3
  • Die RNA von HIV-3 hybridisierte unter stringenten Hybridisierungsbedingungen nicht mit DNA von HIV-1, wenn sie nach der "Dot Blot"-Technik auf einen Hybond-H (Amersham)-Filter aufgebracht wurde.
  • Unter "stringenten Bedingungen" oder "nicht-stringenten Bedingungen" werden die Bedingungen verstanden, bei denen die tatsächliche Hybridisierung und/oder die nachfolgenden Waschschritte durchgeführt werden. Dot-Blot-Hybridisierungen wurden ausgeführt, indem Verdünnungen von viraler RNA von HIV-1 des Stammes SF4, von HIV-2rod und HIV-3 des Stammes ANT 70 auf Hybond-H-Filter getüpfelt wurden.
  • Die Verdünnungsreihen für jedes Virus entsprachen viraler RNA, die von Äquivalenten von 5, 2,5, 1,25 und 0,62 ml Kulturüberstand pellettiert worden war. Die RNA wurde mittels UV-Bestrahlung für 2 Minuten auf dem Filter fixiert und der Hybridisierung unterworfen, indem der Filter mit einer mit 32 P markierten DNA-Sonde in Berührung gebracht wurde. Die ausgewählte Sonde war von einer Sequenz von HIV-1, die die Nucleotide 487-4.652 (Sac I - Eco RI) umfaßte. Sie umfaßt einen Teil der 5'LTR (lange terminale Wiederholung), die gesamte Region von gag und den größten Teil des pol-Gens, subkloniert in dem Vektor pUC 13. Die Hybridisierung der mit 32 P markierten Sonde mit dem Filter wurde unter stringenten Bedingungen in 3 X SSC, 0,5 % Milchpulver, 1 % SDS, 10 % Dextransulfat, 50 % Formamid (v/v) 18 Stunden lang bei 42 ºC durchgeführt (1 X SSC entspricht 0,15 M NaCl, 0,015 M Natriumcitrat). Die nachfolgenden Waschschritte wurden unter stringenten Bedingungen in 0,1 X SSC und 0,1 % SDS bei 65 ºC durchgeführt (Waschgänge 2 - 30 Minuten). Der Filter wurde dann getrocknet und mit verstärkenden Folien bei -70 ºC autoradiographiert. Nach der Autoradiographie waren nur Punkte sichtbar, die viraler RNA von HIV-1 entsprachen. Es wurde keine Hybridisierung mit HIV-2 oder einem der beiden Stämme von HIV-3 beobachtet. Es scheint daher, daß HIV-3 mit HIV-1 nur entfernt verwandt ist.
    • B. cDNA und Subklone von cDNA, die von HIV-3 abstammen
  • Die Bedingungen, unter denen cDNA entsprechend den Sequenzen von HIV-3 synthetisiert und kloniert wurde, werden unten beschrieben. HIV-3 (Stamm ANT 70) von 1 Liter Kultur wurde mit Polyethylenglykol 6000 präzipitiert, erneut in mit Phosphat gepufferter Salzlösung gelöst und durch ein 20 % Sukrose-Kissen pellettiert. Das resultierende Pellet des Virus wurde in 6 M Guanidiniumchlorid in 20 mM Dithiothreitol und 0,5 % Nonidet P-40 gelöst. CsCl wurde bis zu einer Konzentration von 2 M zugegeben, und die das aufgebrochene Virus enthaltende Lösung wurde auf ein 1,2 ml-Kissen von 5,7 M CsCl, das 0,1 M an EDTA war, geschichtet. Virale RNA wurde durch 20-minütige Zentrifugation bei 25.000 U/min in einem Beckman SW28-Rotor bei 15 ºC pellettiert. Die pellettierte RNA wurde wieder gelöst, mit Phenol extrahiert und mit Ethanol und 2 M LiCl präzipitiert.
  • Ein Fünftel der viralen RNA, die wie oben beschrieben hergestellt wurde, wurde verwendet für den ersten Schritt in der Synthese von cDNA, die einen Oligo(dt)-Primer verwendete, der dazu diente, die Synthese des ersten cDNA-Strangs zu primen.
  • Ein kommerziell von Amersham erhältlicher Kit wurde für die Herstellung der cDNA von HIV-3 verwendet. Außerdem wurde eine exogen zugegebene Reverse Transkriptase verwendet, so daß der erste Strang synthetisiert wurde. Diese Synthese des zweiten Strangs wurde unter Verwendung von DNA-Polymerase I von E. coli in Gegenwart von RNase H durchgeführt, so daß der RNA-Strang des RNA/DNA-Hybrids wegverdaut wurde.
  • Die Synthese des zweiten Strangs wurde in Gegenwart von 32 P-dCTP durchgeführt, um die cDNA zu markieren. Die resultierende cDNA wurde mit T4 DNA-Polymerase behandelt, so daß glatte Enden erzeugt wurden. Die cDNA wurde methyliert, um eventuelle interne Spaltungsstellen für EcoRI zu schützen. Dann wurde sie an EcoRI-Linker, die ebenfalls von Amersham geliefert wurden, gekoppelt. Die Erkennungsstellen für EcoRI wurden dann gespalten, und die cDNA wurde auf einem 1,2 % Agarose-Gel der Größe nach aufgetrennt. Die Region in dem Gel, die einer Länge der cDNA von 500 bis 2.000 bp entsprach, wurde ausgeschnitten. Die cDNA wurde eluiert und in den Vektor pUC13, der zuvor mit EcoRI gespalten und dephosphoryliert worden war, kloniert. Die DNA wurde dann verwendet, um kompetente Zellen von E. coli MC1016 (lambda) zu transformieren. Die resultierenden Kolonien wurden auf Pall-Membranen (Pall Biodyne) transferiert, lysiert und mit 1,5 M NaCl, 0,5 M NaOH denaturiert und mit 3 M NaOAc, pH 5,5, neutralisiert. Das Absuchen der Kolonien auf solche, die ein Insert von HIV-3 enthalten, wurde unter mäßig stringenten Bedingungen in einem Puffer über Nacht bei 65 ºC unter Verwendung von mit 32 P markiertem Plasmid, das das SacI/EcoRI-Fragment von HIV-1 von oben enthielt, durchgeführt, der 5 X SSC, 5 X Denhardt-Lösung, 0,2 % SDS, 250 mg/ml denaturierte Lachssperm-DNA enthielt. Nach der Hybridisierung wurden die Filter wie folgt gewaschen:
  • 1. 1 Stunde in 2 X SSC, 0,1 % SDS bei Raumtemperatur.
  • 2. 30 Minuten in 0,1 X SSC, 0,1 % SDS bei Raumtemperatur.
  • 3. 20 Minuten in 2 X SSC, 0,1 % SDS bei 42 ºC.
  • 4. 20 Minuten in 0,1 X SSC, 0,1 % SDS bei 42 ºC.
  • Nach der Autoradiographie des Filters wurden mehrere schwach positive Kolonien identifiziert, die dann zum Analysieren hochgezogen wurden. Es wurde erwartet, daß das positive Signal entweder die Folge einer schwachen Homologie mit den Regionen von gag oder pol von HIV-1 oder einer gewissen Sequenz-Homologie mit der R-Region von LTR ist.
    • C. In cDNA von HIV-3 enthaltene Sequenzen
  • Ein das größte Insert tragender Klon, von dem gefunden wurde, daß er eine Länge von etwa 1.600 bp hat, und der die Bezeichnung iso 70-11 erhielt, wurde für die Sequenz-Analyse ausgewählt. Eine Reihe von Subklonen des Inserts wurden hergestellt, indem das Insert mit verschiedenen Restriktionsenzymen verdaut und die resultierenden Fragmente in den Vektor pUC13 subkloniert wurden. Die Bestimmungen der Sequenzen wurden nach dem Didesoxy-Verfahren, beschrieben von Sanger (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463-5467, 1977) unter Verwendung eines von Boehringer vertriebenen Kits, der 17mer lange M13-Primer verwendet, durchgeführt. Die Sequenz-Analyse des cDNA-Klons iso 70-11 zeigte, daß das Insert dem 3'-Ende des viralen Genoms entsprach, das eine Poly-A-Kette an seinem 3'-Ende besaß.
  • Das HIV-3-Retrovirus enthält eine 3'-LTR, die aus einer U3- Region und einer R-Region zusammengesetzt ist. Wie die 3'- LTR-Region von HIV-1 enthält auch der Klon iso 70-11 ein AATAAA-Polyadenylierungssignal etwa 23 Nucleotide vom 3'- Ende der R-Region entfernt. Die Analyse der HIV-3-Sequenz zeigte eine Homologie von etwa 70 % mit der entsprechenden 3'-LTR-Sequenz von HIV-1 und eine Homologie von weniger als 55 % mit der entsprechenden Sequenz von HIV-2.
  • Das Retrovirus, wie es bei der ECACC unter der Nummer V88060301 hinterlegt worden ist, enthält in seinem env-Gen eine Sequenz entsprechend der nachfolgenden Nucleotid-Sequenz:
  • Die HIV-3-Sequenz weist eine Homologie von weniger als 60 % zu den entsprechenden Sequenzen in HIV-1 und HIV-2 auf. Die Sequenz stammt von einem Teil des Genoms von HIV-3, der für das Transmembran-Hüllprotein codiert.
  • Es wurde gefunden, daß die in der RNA des neuen Virus enthaltenen Sequenzen weder mit dem env-Gen von HIV-1 noch mit den Sequenzen, die in der LTR-Region des Genoms von HIV-1 enthalten sind, hybridisiert. Das SalI/BglII-Restriktionsfragment, das in dem env-Gen von HIV-3 gelegene Sequenzen enthält, wurde aus der DNA des Klons iso 70-11 ausgeschnitten, mit 32 P markiert und unter stringenten Bedingungen mit einem Filter hybridisiert, der genomische DNA enthielt, die aus Zellen isoliert worden war, die mit HIV-1 (Stamm SF2) und HIV-3 (Stamm ANT 70) infiziert worden waren. Eine Hybridisierung wurde nur mit DNA entsprechend den mit HIV-3 infizierten Zellen beobachtet. Auf ähnliche Weise war die einzige nachweisbare Hybridisierung die mit DNA aus Zellen, die mit HIV- 3 infiziert waren, wenn das gesamte Plasmid iso 70-11 markiert und als Sonde unter stringenten Hybridisierungsbedingungen verwendet wurde. Das zeigt, daß HIV-3 nur entfernt mit HIV-1 verwandt ist, und daß der Klon iso 70-11 als Hybridisierungssonde geeignet ist, um HIV-3 von den anderen beiden bekannten Immunschwächeviren zu unterscheiden.
  • Umgekehrt zeigten die Hybridisierungen unter Verwendung der Sequenzen von gag - pol von HIV-1 als markierte Sonde für den Nachweis der Kreuzhybridisierung mit HIV-3-RNA keine nachweisbare Hybridisierung, wenn die Hybridisierung unter stringenten Bedingungen durchgeführt wurde. Dies wiederum zeigt, daß die Viren nur entfernt verwandt sind, und daß eine Unterscheidung zwischen HIV-1 und HIV-3 auf dem Level der Nucleinsäuren in der Region des Genoms getroffen werden kann, die die Gene gag und pol umfaßt. Diese markierte Sonde hybridisierte jedoch mit RNA, die von dem Stamm SF4 von HIV-1 abstammte.
  • Außerdem betrifft die Erfindung eine Zusammensetzung, die zumindest ein Antigen umfaßt. Dieses Antigen ist insbesondere ein Protein oder ein Glykoprotein des HIV-3-Retrovirus. Eine derartige Zusammensetzung kann in Verfahren zum Nachweis von Antikörpern und in Kits zum Durchführen derartiger Verfahren verwendet werden.
  • Das HIV-3-Virus hat sich als Quelle für Antigene zum Nachweis von Antikörpern in Menschen, die mit dem HIV-3 in Berührung gekommen sind, als brauchbar erwiesen. Als solches kann das Virus gezüchtet und nach den bereits beschriebenen Verfahren konzentriert werden. Ein Lysat kann durch Behandlung des Virus mit einem geeigneten Detergens hergestellt werden. Ein bevorzugtes Detergens für die Herstellung eines Gesamtlysates des Virus ist Triton X-100 in einer Konzentration von 0,5 %. Ein anderes bevorzugtes Detergens ist Nonidet P-40 (NP-40), das ebenfalls in einer Konzentration von 0,5 % verwendet wird.
  • Alternativ dazu kann virales Protein aus Lysaten des Virus gereinigt werden. Ein bevorzugtes Verfahren zur Reinigung dieser Proteine ist die Affinitätschromatographie. Zum Beispiel können die viralen Antigene auf einem präparativen Polyacrylamid-Gel gereinigt und die einzelnen Antigene in gereinigter Form eluiert werden. Diese können weiter verwendet werden, um z. B. in Kaninchen Antisera zu erzeugen, die für die jeweiligen viralen Proteine spezifisch sind. Die von dem Kaninchen- Serum abgeleitete Fraktion der IgG kann an eine feste Phase wie CNBr-aktivierte Sepharose 4B (Pharmacia) gekoppelt und zur selektiven Entfernung einzelner viraler Antigene aus viralen Lysaten verwendet werden. Diese Proteine können dann unter Verwendung eines Puffers mit niedrigem pH von dem Affinitätsträger eluiert und unter Verwendung von standardgemäßen Chromatographie-Techniken weiter gereinigt werden. Ein Beispiel einer solchen Technik ist in Montelaro et al., J. of Virology (1982) 42: 1029-1030.
  • Die Erfindung betrifft im allgemeinen jede Zusammensetzung, die für die Diagnose einer Infektion mit HIV-3 oder für Tests mit prognostischem Wert verwendet werden kann. Diese diagnostischen Verfahren umfassen den Nachweis von Antikörper in Serum oder einer anderen Körperflüssigkeit, der gegen zumindest eines der Antigene von HIV-3 gerichtet ist.
  • Bevorzugte Zusammensetzungen sind virale Lysate oder gereinigte Antigene, die zumindestens eines der viralen Core-Proteine p12, p16 und p25 oder mindestens eines der Hüllproteine gp41 oder gp120 oder eines der von dem pol-Gen abgeleiteten Proteine wie p31 enthalten. Besonders bevorzugte Zusammensetzungen sind solche, die z. B. die folgenden Proteine gleichzeitig enthalten:
  • - p25 und gp120
  • - p25 und gp41
  • - p25, gp41 und gp120
  • - p12, p16 und p25
  • - p25, p31 und gp120
  • Es sollte jedoch richtig verstanden werden, daß die oben erwähnten Zusammensetzungen nur als Beispiele dienen, und daß sich die Erfindung auf alle Lysate oder Protein-Präparationen, die eines oder mehrere der oben erwähnten Proteine oder Glykoproteine enthalten, bezieht.
  • Die Erfindung betrifft auch jede Zusammensetzung, in der ein virales Lysat von HIV-3 in Verbindung mit auf ähnliche Weise hergestellten Proteinen aus HIV-1 und/oder HIV-2 für die allgemeine Diagnose einer Infektion oder eines Kontaktes mit einem menschlichen Immunschwächevirus verwendet wird, ohne daß die absolute Identität des Virus bestimmt und nachgewiesen wird. Solche Zusammensetzungen könnten z. B. aus einem Gemisch von Lysaten von HIV-1, HIV-2 und HIV-3 oder aus den folgenden Bestandteilen zusammengesetzt sein:
  • - Core-Proteine von HIV-1, HIV-2 und HIV-3, insbesondere das Haupt-Core-Protein jedes Virus-Typs, das dem Protein p25 von HIV-3 homolog ist.
  • - Hüll-Glykoproteine von HIV-1, HIV-2 und HIV-3, und insbesondere die äußeren Hüll-Glykoproteine von jedem Virus-Typ, homolog dem gp120 von HIV-3.
  • - Core-Proteine von HIV-1, HIV-2 und HIV-3, zusammen mit den Hüll-Glykoproteinen von HIV-1, HIV-2 und HIV-3, insbesondere das Haupt-Core-Protein eines jeden Virus-Typs, homolog dem Protein p25 von HIV-3, zusammen mit dem wesentlichen äußeren Hüll-Protein eines jeden Virus, homolog dem gp120 von HIV-3.
  • - Eine Kombination der Core-Proteine und Hüll-Proteine von HIV-1, HIV-2 und HIV-3, insbesondere homolog zu den Proteinen p25 und gp120 von HIV-3, und ein Protein, abgeleitet von dem pol-Gen von HIV-1, HIV-2 und HIV-3, insbesondere die Proteine eines jeden Virus-Typs, die zu dem Endonuklease-Protein p31 von HIV-3 homolog sind.
  • Außerdem betrifft die Erfindung gereinigte Antigene, die bei der Polyacrylamid-Gelelektrophorese eine einzelne Bande erzeugen. Diese Antigene haben die immunologischen Eigenschaften der Proteine, wie sie in Anspruch 1 definiert worden sind. Diese Antigene werden von dem Serum von Personen erkannt, die gegen HIV-3 gerichtete Antikörper tragen. Die Aminosäure- Sequenzen, die diesen Antigenen entsprechen, können ohne weiteres dadurch bestimmt werden, daß die einzelnen Proteine entweder mittels präparativer Elektrophorese oder mittels Affinitätschromatographie isoliert und die Aminosäure-Sequenz der Proteine mittels Edman-Abbau bestimmt werden. Die Erfindung betrifft daher auch alle Proteine, Glykoproteine oder Peptide, die entweder direkt von dem Virus abgeleitet sind oder durch Klonierung von cDNA-Fragmenten des Virus in bakterielle Expressionsvektoren oder in virale Expressionsvektoren für die Expression eingefügter DNA in Säugetier- oder Insektenzellen hergestellt werden. Die exprimierten Proteine werden dann nach den oben beschriebenen Verfahren gereinigt. Außerdem betrifft die Erfindung auch synthetische Peptide, die entweder nach der Merrifield-Synthese oder Fmoc-Chemie hergestellt worden sind, die nachfolgend bis zur Homogenität gereinigt sein können, und die in ihren Sequenzen Epitope enthalten, die sie mit den natürlichen Antigenen von HIV-3 teilen.
  • Antigene, die Epitope mit viralen Proteinen teilen, können auf einfache Weise anhand ihrer Reaktion mit Antikörpern, die in dem Serum von mit HIV-3 infizierten Personen vorkommen, erkannt werden. Dies erfolgt entweder mittels Western-Blotting oder der Radioimmunopräzipitation. Im Fall der kleinen Peptide, die nicht an Nitrozellulose binden können, gilt, daß diese Peptide mittels Bindung an Nylon-Membranen (Pall Biodyne oder Amersham) und nachfolgende Reaktion der Membran mit gegen HIV-3 gerichtetem Antiserum nachgewiesen werden können. Insbesondere betrifft die Erfindung die Core-Proteine von HIV- 3, p12, p16 und p25. Außerdem betrifft die Erfindung die beiden Hüll-Glykoproteine von HIV-3, gp41 und gp120. Die Erfindung betrifft außerdem Polypeptide, deren Synthese unter der Direktive von Expressionsvektoren steht, die mittels rekombinanter DNA-Technologie konstruiert worden sind. Die Herstellung eines derartigen Konstruktes umfaßt das Ausschneiden der wesentlichen codierenden Regionen aus der cDNA von HIV-3, die bei Einfügung in einen Expressionsvektor, der die notwendigen Signalsequenzen aufweist, die Synthese des Proteins von HIV-3 steuert.
  • Außerdem betrifft die Erfindung Verfahren zum Nachweis von Antikörpern gegen das Retrovirus HIV-3 in einer biologischen Flüssigkeit, insbesondere für die Diagnose von möglicher oder bestehender ARC oder AIDS, die durch das Retrovirus HIV-3 verursacht werden. Das Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß Körperflüssigkeit einer diagnostisch zu untersuchenden Person mit einer Zusammensetzung in Berührung gebracht wird, die eines oder mehrere der Proteine oder Glykoproteine von HIV-3 enthält. Alternativ kann die Körperflüssigkeit auch mit einem Lysat des Virus oder mit einem Antigen, das Epitope aufweist, die dem HIV-3 zu eigen sind, nachgewiesen werden. Schließlich erfolgt der Nachweis durch Nachweis des immunologischen Konjugats, das sich zwischen den gegen HIV-3 gerichteten Antikörpern und dem (den) verwendeten Antigen(en) gebildet hat.
  • Bevorzugte Verfahren umfassen z. B. Immunofluoreszenz-Assays oder immunoenzymatische Assays.
  • Immunofluoreszenz-Assays umfassen typischerweise die Inkubation von z. B. Serum aus der zu testenden Person mit Zellen, die mit HIV-3 infiziert sind, und die mit kaltem Aceton fixiert und permeabilisiert worden sind. Gebildete Immun-Komplexe werden entweder mittels direkter oder mittels indirekter Verfahren nachgewiesen und umfassen die Verwendung von Antikörpern, die mit menschlichen Immunglobulinen spezifisch reagieren. Der Nachweis wird unter Verwendung von Antikörpern, an die eine Fluoreszenz-Markierung wie Fluorescein oder Rhodamin gekoppelt worden ist, erzielt.
  • Die immunoenzymatischen Assays können z. B. wie folgt durchgeführt werden:
  • - eine spezifische Menge Virus-Extrakt von HIV-3 oder einer Zusammensetzung, auf die gemäß der Erfindung Bezug genommen wird, wird in die Vertiefungen einer Mikrotiter- Platte gegeben.
  • - Überschüssiges, ungebundenes Material wird nach einer geeigneten Inkubationszeit durch Waschen entfernt.
  • - Eine geeignete Verdünnung oder Verdünnungen von Serum oder einer anderen Körperflüssigkeit, die auf die Gegenwart von Antikörpern, gerichtet gegen eines oder mehrere der Proteine oder Glykoproteine von HIV-3, untersucht werden soll, wird/werden in die Vertiefungen eingeführt.
  • - Die Mikrotiter-Platte wird über einen Zeitraum, der nötig ist, damit die Bindungsreaktion erfolgen kann, inkubiert.
  • - Die Platte wird gründlich gewaschen.
  • - Die Gegenwart von Immun-Komplexen wird unter Verwendung von Antikörpern nachgewiesen, die menschliche Immunglobuline spezifisch binden, und die mit einem Enzym, vorzugsweise aber nicht beschränkt darauf, mit Merrettich- Peroxidase, alkalischer Phosphatase oder β-Galaktosidase, markiert worden sind. Dieses Enzym kann ein farbloses oder nahezu farbloses Substrat in ein hochgradig gefärbtes Produkt überführen. Alternativ dazu kann man für das Nachweissystem ein Enzym verwenden, das in Gegenwart des richtigen Substrats bzw. der Substrate Licht emittiert.
  • - Die Menge des gebildeten Produktes wird entweder visuell, spektrophotometrisch oder luminometrisch nachgewiesen und wird mit einer auf ähnliche Weise behandelten Kontrolle verglichen.
  • Zu anderen Nachweissystemen, die ebenfalls verwendet werden können, zählen solche, die auf der Verwendung von Protein A aus dem Cowan-Stamm I von Staphylococcus aureus, von Protein G aus der Gruppe C einer Streptococcus-Spezies (Stamm 26RP66) oder von Systemen basieren, die Gebrauch machen von der Bindungsreaktion zwischen Biotin und Avidin.
  • Ein anderes Verfahren des immunoenzymatischen Nachweises der Gegenwart von Antikörpern, die gegen eines oder mehrere der Antigene von HIV-3 gerichtet sind, ist der Western Blot. Die viralen Antigene werden elektrophoretisch aufgetrennt und auf eine Nitrozellulose-Membran oder einen anderen geeigneten Träger transferiert. Die zu untersuchende Körperflüssigkeit wird dann mit der Membran in Berührung gebracht. Die Gegenwart des gebildeten Immun-Komplexes wird nach dem bereits beschriebenen Verfahren nachgewiesen. In einer abweichenden Ausführung dieser Verfahren wird gereinigtes virales Antigen in Reihen oder Punkten auf eine Membran aufgebracht, und man läßt es daran binden. Die Membran wird daraufhin mit der zu untersuchenden Körperflüssigkeit in Berührung gebracht. Die gebildeten Immun-Komplexe werden unter Verwendung der zuvor beschriebenen Techniken nachgewiesen.
  • Die Gegenwart von Antikörpern in einer Körperflüssigkeit kann auch durch Agglutination nachgewiesen werden. Lysate von HIV- 3 oder ein Lysat von HIV-3, eine Zusammensetzung von Antigenen oder gereinigten Antigenen, auf die gemäß der Erfindung Bezug genommen wird, werden zur Beschichtung von z. B. Latex-Partikeln, die eine einheitliche Suspension bilden, verwendet. Wenn die Latex-Partikel mit Serum gemischt werden, das gegen das vorhandene Antigen gerichtete Antikörper enthält, wird die Agglutination der Latex-Partikel verursacht. Die Gegenwart großer Aggregate kann visuell nachgewiesen werden.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem markierte Extrakte von HIV-3 oder Zusammensetzungen, wie sie vorher beschrieben worden sind. Die Markierung kann von jeder Art sein, so z. B. enzymatisch, chemisch, fluoreszierend oder radioaktiv.
  • Außerdem betrifft die Erfindung ein Verfahren, um die Gegenwart von Antigenen von HIV-3 in Körperflüssigkeiten nachzuweisen. Dies kann z. B. auf die folgende Art erreicht werden:
  • - Die IgG-Fraktion des Antiserums entweder von mit HIV-3 infizierten Menschen oder von Tieren, denen ein Lysat von HIV-3 oder eine Zusammensetzung, wie bereits beschrieben, injiziert worden sind, wird in die Vertiefung einer Mikrotiter-Platte gegeben.
  • - Nach einem geeigneten Zeitraum, der die Adsorption erlaubt, wird überschüssiges, nicht gebundenes Material weggewaschen.
  • - Eine das nachzuweisende Antigen enthaltende Körperflüssigkeit wird in die Vertiefung gegeben.
  • - Die Mikrotiter-Platte wird zur Inkubation über einen geeigneten Zeitraum stehen gelassen, so daß eine Bindung erfolgen kann.
  • - Die Platte wird dann mit einem geeigneten Puffer gründlich gewaschen.
  • - Die Gegenwart von gebundenem Antigen wird entweder direkt oder indirekt nachgewiesen. Der Nachweis erfolgt z. B. mittels Verwendung von Immunglobulinen, die auf ähnliche Weise für das (die) nachzuweisende(n) Antigen(e) spezifisch sind, und die markiert worden sind, vorzugsweise mit einem der zuvor genannten Enzyme.
  • - Ein geeignetes Substrat wird dann zugegeben, und der Grad der Reaktion wird mit einer Kontrolle verglichen, so daß die Menge des vorhandenen Antigens gemessen werden kann.
  • Außerdem betrifft die Erfindung einen Kit für den Nachweis von gegen HIV-3 gerichteten Antikörpern in biologischen Flüssigkeiten, der ein Lysat von HIV-3 oder eine Zusammensetzung, wie oben beschrieben, und eine Vorrichtung zum Nachweis der gebildeten immunologischen Komplexe umfaßt.
  • Im Falle von Kits zum Nachweis spezifischer Antikörper mittels immunoenzymatischer Verfahren würde ein solcher Kit die folgenden Bestandteile enthalten:
  • - Ein Lysat von HIV-3 oder eine Zusammensetzung einer der drei schon beschriebenen Typen, vorzugsweise in gereinigter Form, und vorzugsweise an einen festen Träger wie eine Mikrotiter-Platte gekoppelt.
  • - Ein Konjugat zwischen einem Enzym und einer Fraktion von Immunglobulinen, die an die nachzuweisenden Antikörper binden kann, oder ein Konjugat zwischen einem Enzym und dem bakteriellen Protein A oder G.
  • - Ein Antigen zur Kontrolle, daß keine Epitope besitzt, die von irgendeinem menschlichen Immunschwächevirus geteilt werden.
  • - Geeignete Puffer zur Durchführung der Assays.
  • - Ein geeignetes Substrat für das Enzym.
  • Kits für den Nachweis von spezifischen Antikörpern, die markiertes Antigen verwenden, würden die folgenden Bestandteile umfassen:
  • - Ein geeignet markiertes Antigen oder eine Kombination von Antigenen der bereits beschriebenen Typen.
  • - Protein A oder gegen menschliche Immunglobuline gerichtete Antikörper, vorzugsweise gekoppelt an einen unlöslichen Träger wie Protein A-Sepharose 4B (Pharmacia) oder einen gleichwertigen Träger.
  • - Ein Antigen zur Kontrolle, das von gegen HIV-3 gerichteten Antisera nicht erkannt wird.
  • - Geeignete Puffer zur Durchführung des Assays.
  • - Falls geeignet, Substrate zum Nachweis des enzymatisch markierten Antigens.
  • Zum Nachweis von Antigenen von HIV-3 in biologischen Flüssigkeiten entwickelte Kits umfassen die folgenden Bestandteile:
  • - Gegen HIV-3 gerichtete Immunglobuline, vorzugsweise gekoppelt an einen festen Träger wie eine Mikrotiterplatte.
  • - Gegen HIV-3 gerichtete Immunglobuline in Konjugation mit einem Enzym.
  • - Ein Antigen zur negativen Kontrolle, das von den gegen HIV-3 gerichteten Immunglobulinen nicht erkannt wird.
  • - Ein Antigen zur positiven Kontrolle, das aus einem der Antigene von HIV-3 oder der schon beschriebenen Zusammensetzungen von HIV-3 besteht.
  • - Geeignete Puffer zur Durchführung des Tests.
  • - Ein geeignetes Substrat zum Nachweis des gebundenen Enzyms.
  • Außerdem enthält die immunogene Zusammensetzung ein Hüll- Glykoprotein des Retrovirus HIV-3, insbesondere gp41 oder gp120, in Verbindung mit einem pharmazeutisch verträglichen Vehikel, das für die Bildung von gegenüber HIV-3 wirksamen Vakzinen geeignet ist. Die Erfindung betrifft außerdem jegliche Peptide oder Polypeptide, die innerhalb ihrer Sequenz das Protein-Gerüst von einem der Proteine des Retrovirus HIV-3 gemäß Anspruch 1 enthalten. Die Erfindung betrifft außerdem Peptide, die aus der Addition, Substitution oder Deletion von Aminosäuren, die die allgemeinen immunologischen Eigenschaften der genannten Peptide nicht beeinflussen, resultieren.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung lassen sich auch monoklonale Antikörper erhalten, die durch ihre Fähigkeit gekennzeichnet sind, spezifisch Epitope zu erkennen, die in den Antigenen von HIV-3 oder den zuvor definierten Zusammensetzungen enthalten sind. Insbesondere sind solche monoklonalen Antikörper Gemäß der vorliegenden Erfindung erhältlich, die spezifisch gegen die besagten Antigene erzeugt und mittels herkömmlicher Techniken produziert worden sind. Mitumfaßt sind monoklonale Antikörper menschlichen Ursprungs, die dadurch hergestellt werden, daß BZellen von mit HIV-3 infizierten Personen z. B. durch Transformation der B-Zellen mit dem Epstein-Bar-Virus und Subklonierung der Transformanden immortalisiert werden.
  • Polyklonale Antisera können in Tieren erzeugt werden, wobei die Antisera ein oder mehrere Antigene von HIV-3 erkennen, und die dadurch produziert werden, daß Tiere mit gereinigtem HIV-3, einem Antigen von HIV-3 oder einer Kombination von
  • Antigenen und insbesondere den Proteinen oder Glykoproteinen von HIV-3 infiziert werden.
  • Die entweder polyklonalen oder monoklonalen Antikörper können für eine große Vielzahl von Zwecken verwendet werden. Diese Zwecke umfassen die Neutralisation einer Infektiosität von HIV-3, den Nachweis von Antigenen von HIV-3 in biologischen Flüssigkeiten oder in infizierten Zellen und die Reinigung von Antigenen (Proteinen oder Glykoproteinen) von HIV-3.
  • Die Erfindung betrifft außerdem Nukleinsäuren, die ggf. markiert sind, und die die Sequenzen entsprechend dem gesamten RNA-Genom des Retrovirus HIV-3 nach Anspruch 1 umfassen. Diese Nukleinsäuren können als cDNA oder als Rekombinanten, die diese cDNA enthalten, verwendet werden. Solche cDNAs können als Sonden für den spezifischen Nachweis von Sequenzen von HIV-3 in biologischen Flüssigkeiten, Geweben und Zellen verwendet werden. Die Sonden werden vorzugsweise ebenfalls markiert, entweder radioaktiv oder chemisch, wobei alternativ enzymatische, fluoreszierende oder lumineszierende Markierungen verwendet werden, die den Nachweis der Sonden ermöglichen. Bevorzugte Sonden für den spezifischen Nachweis von HIV-3 und für die Diagnose einer Infektion mit HIV-3 sind Sonden, die die gesamte oder einen Teil der cDNA enthalten, die zum Genom von HIV-3 komplementär ist. In diesem Zusammenhang kann eine besonders vorteilhafte Sonde als eine solche gekennzeichnet werden, die insbesondere die Nukleinsäure-Sequenz enthält, die in dem Klon iso 70-11 enthalten ist, und die die virale Sequenz LTR-R enthält, die an den 5'- und 3'- Enden der viralen, genomischen RNA und an den 5'- und 3'- Enden der integrierten, proviralen DNA sitzt.
  • Trotz alledem ist die Erfindung so zu verstehen, daß die Sonden, die für die Diagnose einer Infektion mit HIV-3 verwendet werden können, keineswegs auf die oben beschriebenen Sonden beschränkt sind. Vielmehr umfaßt die Erfindung alle Sequenzen, die von dem Genom von HIV-3 oder seinen natürlicherweise vorkommenden Varianten abstammen. Es sind alle Sequenzen umfaßt, die für die viralen Core-Proteine (gag-Gen), die beiden Formen der Reversen Transkriptase und die Endonuklease (pol- Gen) und die beiden viralen Hüll-Glykoproteine (env-Gen) codieren.
  • Die Erfindung betrifft außerdem Sequenzen von Nukleinsäuren von HIV-3, die in einen Vektor eingebaut worden sind, und die die cDNA eingefügt enthalten. Eine derartige Konstruktion kann zur Replikation der viralen cDNA oder ihrer Fragmente in einem Organismus oder einer Zelle, die verschieden von dem natürlichen Wirt sind, verwendet werden, so daß ausreichende Mengen der für die diagnostischen Zwecke zu verwendenden Sonde zur Verfügung gestellt werden.
  • Eine auf solche Weise erzeugte Sonde kann für einen diagnostischen Test für den spezifischen Nachweis von HIV-3 verwendet werden, wobei der Test die folgenden wesentlichen Schritte umfaßt:
  • - Markierung der wie oben beschriebenen Sonde mittels der zuvor beschriebenen Verfahren.
  • - In Kontakt bringen der Sonde mit DNA aus infizierten Zellen oder mit viraler RNA aus infizierten Zellen oder biologischen Flüssigkeiten unter stringenten Hybridisierungsbedingungen, nachdem die DNA oder RNA vorzugsweise auf eine Membran aufgebracht worden ist und für die Sonde zugänglich gemacht ist.
  • - Waschen der Membran mit einem Puffer unter Bedingungen, bei denen die stringenten Bedingungen aufrecht erhalten werden.
  • - Nachweis der markierten Sonde, vorzugsweise mittels Autoradiographie in den Fällen, in denen die Sonde radioaktiv markiert worden ist, oder mittels einer geeigneten Immunonachweistechnik in den Fällen, da die Sonde chemisch markiert worden ist.
  • Die Erfindung betrifft außerdem ein Verfahren zur Herstellung des Retrovirus HIV-3, das dadurch gekennzeichnet ist, daß menschliche T4-Lymphozyten oder Lymphozyten-Zellinien des Menschen von leukämischem Ursprung, die den Phänotyp T4&spplus; tragen, mit Lymphozyten oder Zellinien, die zuvor mit einem Isolat des Retrovirus HIV-3 infiziert worden sind, kultiviert werden, und daß das Retrovirus aus dem Kulturmedium wiedergewonnen und gereinigt wird. Die Erfindung betrifft auf ähnliche Weise ein Verfahren zur Herstellung von Antigenen des Retrovirus HIV-3, dadurch gekennzeichnet, daß das Retrovirus, vorzugsweise mit einem Detergens, lysiert und das Lysat, das die Antigene enthält, wiedergewonnen wird.
  • Die Erfindung betrifft außerdem ein Verfahren zur Herstellung eines der Proteine oder Glykoproteine p12, p16, p25, p31, gp41, gp120 oder Reverse Transkriptase, wie sie zuvor definiert worden sind, von HIV-3, dadurch gekennzeichnet, daß die für die Proteine oder Glykoproteine codierende Nukleinsäure in einen Expressionsvektor eingeführt wird, ein Wirt mit dem Vektor tranformiert, der transformierte Wirt kultiviert und das exprimierte Protein wiedergewonnen und gereinigt wird. Das Verfahren umfaßt Vektoren, die die Synthese von Fusionsproteinen steuern können, und umfaßt bakterielle Expressionsvektoren, Säugetier-Expressionsvektoren wie das Vaccinia-Virus und Vektoren auf der Basis des Baculovirus für die Expression der klonierten Gene in Insektenzellen, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein.
    • BEISPIELE MATERIAL UND METHODEN Virus und Zellkultur a) Virusstämme und Zellinien
  • HUT-78-Zellen, die chronisch mit ARV-4 (HIV-1 SF4) infiziert sind, und die ursprünglich von J. Levy, San Francisco, USA (20) isoliert worden sind, und nicht-infizierte HUT-78-Zellen wurden von S. Sprecher, Brüssel, Belgien, zur Verfügung gestellt. LAV-2rod, ursprünglich von L. Montagnier, Paris, und CEM-Zellen wurden von J. De Smeyter, Leuven, Belgien, erhalten. Das Isolat 53, ein Isolat von HIV-2, wurde in diesem Labor (21) isoliert.
    • b) Virusisolierungen
  • Virusisolierungen wurden auf ähnliche Weise durchgeführt, wie von Levy und Shimabukuro (22) beschrieben, wobei Änderungen eingeführt wurden. Lymphozyten von Patienten wie auch von gesunden Donoren wurden aus heparinisiertem Gesamtblut auf Lymphoprep (Nyegaard und Co., Oslo, Norwegen) und in RPMI 1640, ein Medium, das 20 mM HEPES, 15 % fötales Kälberserum (Gibco), 5 ug/ml Hydrokortison (Merck), 75 U/ml IL-2 und 2 ug/ml Polybren (Aldrich) enthielten, kultiviert.
  • Die Lymphozyten von gesunden Donoren wurden mit 2 ug/ml Phytohämagglutinin (PHA, Wellcome) 3 Tage lang vor dem Gebrauch stimuliert. Frische, mit PHA stimulierte Lymphozyten wurden den Kulturen für die Virusisolierung alle 3 bis 4 Tage zugegeben. Die Kulturen wurden auf einen cytopathischen Effekt und Immunofluoreszenz unter Verwendung eines polyklonalen Vergleichs-Antiserums mit breiter Spezifität (23) untersucht. Die Kulturen wurden auch auf die Gegenwart von Antigen in den Kultur-Überständen (Innotest VCA- HIV, Innogenetics) untersucht. Das Vergleichsantiserum (BSR) breiter Spezifität, das verwendet wurde, stammte von einem mit HIV-1 infizierten Donor. Es wurde experimentell gezeigt, daß es einen ausgesprochen hohen Titer (≥ 1.000.000 in einem Enzym-Immunoassay auf der Basis eines rekombinanten p24-Proteins von HIV-1) hatte. Außerdem zeigte sich, daß es mit den Genprodukten von gag und pol der anderen Typen von HIV, insbesondere von HIV-2, stark kreuzreagierte. Die Reverse Transkriptase wurde ebenfalls im wesentlichen so wie beschrieben (24) nachgewiesen.
  • Um chronisch infizierte, permanente Zellinien zu etablieren, wurden mit Virus infizierte, primäre Lymphozyten mit Zellen des Klons 8 von Molt 4 cokultiviert (25). Diese Zellen wurden freundlicherweise von N. Yamamoto, Yamaguchi, Japan, zur Verfügung gestellt. Die primären Lymphozyten wurden auf Zellwachstum beobachtet. Die Produktion von Virus wurde mittels des Reverse Transkriptase-Assays und des Einfangens von Antigen ermittelt.
    • Differentielles Einfangen von Antigen
  • Es wurde ein Testsystem entwickelt, mittels dessen eine Unterscheidung zwischen HIV-1 und anderen verwandten, menschlichen Immunschwächeviren getroffen werden kann. Das System beruht auf einem Vergleich der Fähigkeit von zwei verschiedenen polyklonalen Präparaten von IgG, mit Detergens behandeltes Virus in Kulturüberständen einzufangen. Eines dieser Präparate hat eine breite gegen HIV gerichtete Spezifität aufgrund seines außergewöhnlich hohen Titers, insbesondere gegenüber dem Haupt-Core-Protein. Das andere Präparat hat einen geringeren Titer und reagiert vorzugsweise mit HIV-1. Der Nachweis des eingefangenen Antigens wird dadurch erreicht, daß ein Konjugat von IgG breiter Spezifität mit Meerettich-Peroxidase verwendet wird. Der Test weist vor allem, aber nicht ausschließlich, das Core-Protein p24 nach.
    • Gegen HIV-1 gerichtete monoklonale Antikörper
  • Das Panel der verwendeten monoklonalen Antikörper ist beschrieben worden (26). Die Antikörper wurden gegen native, virale Proteine in mit Triton X-100 aufgebrochenen Präparaten von HIV-1 zubereitet.
    • Protein-Analyse a) Elektrophorese
  • Die Polyacrylamid-Gelelektrophorese der viralen Proteine wurde im wesentlichen wie bei Maizel (27) beschrieben durchgeführt.
    • b) Blotten von Proteinen
  • Das Blotten wurde entweder in einer Bio-Rad Transblot- Zelle 4 Stunden lang bei 400 mA unter Verwendung des Carbonat-Puffers, wie von Dunn (28) beschrieben, oder unter Verwendung des LKB Halbtrocken-Blotting-Apparates für 1 Stunde bei 0,8 mA/cm² in 48 mM Tris, 39 mM Glycin, 0,0375 % Natriumdodecylsulfat (SDS) und 20 % Methanol, durchgeführt.
    • c) Erzeugung von partiellen Spaltprodukten
  • Die viralen Proteine wurden nach der in Fig. 1 gezeigten Technik analysiert. Es wurde der Vorteil ausgenutzt, daß entsprechende Proteine von den verschiedenen Isolaten ähnliche Molekulargewichte haben. Die Proteine wurden auf 12,5 % SDS-Polyacrylamid-Gelen gemeinsam mit einer Marker-Spur von Proteien von ARV-4, die im Anschluß an die Elektrophorese ausgeschnitten wurde, aufgetrennt, geblottet und mit einem gegen HIV gerichteten Antiserum inkubiert, so daß die Positionen der viralen Proteine zu erkennen waren.
  • Der Marker-Blot wiederum wurde verwendet, um die ungefähren Positionen der viralen Proteine, die zu spalten waren, in dem mit Coomassie-Blau gefärbten Teil des Geles zu lokalisieren. Horizontale Gelscheiben, die die Proteine enthalten, wurden ausgeschnitten, in Glasröhrchen übertragen und einer chemischen Spaltung unterworfen.
    • 1. Spaltung mit Cyanbromid
  • Die Gelscheibe wurde mit 10 ml einer frisch hergestellten Lösung von CNBr (40 mg/ml; Merck) in 0,3 N HCl 3 Stunden bei Raumtemperatur in einem Abzug inkubiert. Nach der Inkubation wurde die Gelscheibe mit SDS-Probenpuffer für die Elektrophorese in der zweiten Dimension equilibriert.
    • 2. BNPS-Skatol-Spaltung
  • Die Gelscheibe wurde mit 10 ml einer frisch hergestellten gesättigten Lösung von 2-(2'-Nitrophenylsulfenyl)-3-methyl-3'- bromindolinin (BNPS-Skatol, Pierce) 3 Stunden bei Raumtemperatur unter Ausschluß von Licht in 70 % Essigsäure/30 % Wasser; enthaltend 0,1 % Phenol, inkubiert. Nach der Inkubation wurde die Gelscheibe durch wiederholtes Waschen in SDS-Elektrophorese-Probenpuffer equilibriert.
  • Nach der Spaltung wurden die einzelnen Spuren aus den Gelscheiben ausgeschnitten um 90 º gedreht und auf das obere Ende eines 10 bis 20 % SDS-Polyacrylamid-Gradientengels gegeben. Nach Beendigung der Elektrophorese wurde das Gel auf Nitrozellulose (Schleicher und Schüll) geblottet und mit PBS, das 1 mg/ml Casein (Merck) enthielt, blockiert. Nur Spaltprodukte mit Molekulargewichten von über 10 kD können sichtbar gemacht werden, da Peptide mit niedrigeren Molekulargewichten nicht wirksam an Nitrozellulose binden. Die Blots wurden mit einem gegen HIV gerichteten Antiserum mit breitem Spektrum und dann mit einem Konjugat aus gegen menschliches IgG gerichtetem Antikörper der Ziege mit alkalischer Phosphatase (Promega) inkubiert. Die partiellen Spaltprodukte wurden dann durch die Reaktion mit 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat und Nitroblau-Tetrazolium (Sigma) sichtbar gemacht.
    • Virale Nukleinsäuren a) Hybridisierung gegen virale RNA
  • Virus aus Kulturüberständen wurde dadurch geerntet, daß mittels Zentrifügation bei 26.500 U/min über einen Zeitraum von 1 1/2 Stunden bei 4 ºC durch Kissen von 20 % Sucrose pelletiert und in 10 mM Tris, pH 7,4, 10 mM NaCl, 10 mM EDTA, enthaltend 0,5 % SDS, aufgebrochen wurde. Aliquots des aufgebrochenen Virus wurden in Mengen entsprechend 5, 2,5, 1,25 und 0,62 ml der ursprünglichen Kulturüberstände auf eine Membran von Hybond H (Amersham) getüpfelt. Die auf den Filter niedergeschlagene RNA wurde mittels Bestrahlung mit ultraviolettem Licht über einen Zeitraum von 2 Minuten an die Membran fixiert. Die an den Filter gebbundene RNA wurde dann einer Hybridisierung mit einer cDNA-Sonde von HIV-1 unterworfen, die mittels Nick-Translation mit ³²P-dCTP markiert worden war. Die Hybridisierung wurde unter stringenten Bedingungen in 3 x SSC, 0,5 % Milchpulver, 1 % SDS, 10 % Dextransulfat und 50 % Formamid 18 Stunden bei 42 ºC durchgeführt. Nach der Hybridisierung wurde der Filter zweimal unter stringenten Bedingungen in 0,1 x SSC und 0,1 % SDS 30 Minuten gewaschen. Hybridisierung wurde mittels Autoradiographie bei -70 ºC mit Verstärkerfolien nachgewiesen. Auf ähnliche Weise wurden Hybridisierungen auch unter Verwendung einer Sonde durchgeführt, die von der env-Region von HIV-2 abgeleitet ist.
  • Es wurden auch Hybridisierungen unter nicht-stringenten Bedingungen in 5 x SSC, 25 % Formamid, 5 x Denhardts-Lösung, 10 % Dextransulfat und 100 ug/ml denaturierter Lachssperm-DNA bei 37 ºC uber Nacht durchgeführt. Der filter wurde nachfolgend 4 x 15 Minuten in 5 x SSC, 0,1 % SDS bei Raumtemperatur gewaschen und autoradiographiert.
    • Herstellung der cDNA von ANT 70
  • Virus wurde aus 1 Liter Kulturüberstand unter Verwendung von Polyethylenglykol 6000 pelletiert, in PBS gelöst und durch ein 20 % Sucrose-Kissen pelletiert. Das resultierende Pellet des Virus wurde in 6 M Guanidiniumchlorid in 20 mM Natriumphosphat-Puffer, pH 6,5, enthaltend 20 mM Dithiothreitol und 0,5 % NP-40, aufgebrochen. Festes CsCl wurde bis zu einer Konzentration von 2 M zugegeben. Die das aufgebrochene Virus enthaltende Lösung wurde auf ein Kissen von 5,7 M CsCl, enthaltend 0,1 M EDTA, geschichtet. Die virale RNA wurde mittels Zentrifugation bei 25.000 U/min über 20 Stunden bei 15 ºC in einem SW 28-Rotor von Beckman pelletiert. Nach der Zentrifugation wurde die RNA wiederum gelöst, mit Phenol extrahiert und mit Ethanol und 2 M LiCl präzipitiert.
  • Ein Fünftel der hergestellten viralen RNA wurde verwendet, um den ersten Schritt bei der Synthese von cDNA unter Verwendung eines von Amersham gelieferten Kits zu steuern. Die cDNA-Synthese wurde unter Verwendung von Oligo-(dT) gestartet. Die Synthese wurde unter Verwendung der Reversen Transkriptase durchgeführt, die in dem Kit enthalten ist. Die Synthese des zweiten Strangs wurde unter Verwendung von DNA-Polymerase I von E. coli in Gegenwart von RNase H durchgeführt, so daß der RNA-Strang des Hybrids aus RNA/DNA abverdaut wurde. Die Synthese des zweiten Strangs wurde in Gegenwart von ³²P-dCTP durchgeführt, so daß die cDNA markiert wurde. Die resultierende cDNA wurde mit T4 DNA-Polymerase behandelt, so daß glatte Enden erzeugt wurden. Die cDNA wurde methyliert, um mögliche innere Spaltstellen für EcoRI zu schützen, und wurde dann an EcoRI-Linker (Amersham) gekoppelt. Die Spaltstellen für EcoRI in den Linkern wurden dann gespalten, und die cDNA wurde auf einem 1,2 % Agarosegel nach größe aufgetrennt. Die Region des Gels, die einer Länge der cDNA von 500 bis 2.000 Basenpaaren entspricht, wurde ausgeschnitten. Die cDNA wurde eluiert und in den Vektor pUC13 kloniert, der zuvor mit EcoRI gespalten und dephosphoryliert worden war. Nach der Ligation wurde die DNA verwendet, um kompetente Zellen MC1016 (lambda) von E. coli zu transformieren. Die resultierenden Kolonien wurden auf Membranfilter (Pall Biodyne) transferiert, lysiert und mit 1,5 M NaCl, 0,5 M NaOH denaturiert und mit 3 M NaOAc, pH 5,5, neutralisiert. Das Screenen der Kolonien, die ein Insert von HIV-3 enthielten, wurde durch Hybridisierung unter mäßig stringenten Bedingungen in 5 x SSC, 5 x Denhardts-Lösung, 0,2 % SDS, 250 ug/ml denaturierter Lachssperm-DNA bei 65 ºC über Nacht durchgeführt. Die Hybridisierung wurde unter Verwendung des SacI-EcoRI-Fragments von HIV-1 durchgeführt. Nach der Hybridisierung wurden die Filter wie folgt gewaschen:
  • 1. 1 Stunde in 2 x SSC, 0,1 % SDS bei Raumtemperatur.
  • 2. 30 Minuten in 0,1 x SSC, 0,1 % SDS bei Raumtemperatur.
  • 3. 20 Minuten in 2 x SSC, 0,1 % SDS bei 42 ºC.
  • 4.20 Minuten in 0,1 x SSC, 0,1 % SDS bei 42 ºC.
  • Nach dem Waschen wurden die Filter unter Verwendung von Verstärkerfolien bei -70 ºC autoradiographiert.
  • Hybridisierungen wurden auch unter nicht-stringenten Bedingungen, wie sie für die nicht-stringente Hybridisierung der Sonde von HIV-1 und HIV-2 verwendet wurde, durchgeführt.
    • c) Analyse der cDNA-Klone
  • Kolonien, die ein positives Hybridisierungssignal ergaben, wurden für die Analyse hochgezogen. Plasmide wurden isoliert, mit EcoRI gespalten, und einer Agarosegel-Elektrophorese unterworfen, so daß die Gegenwart eines Inserts bestätigt und seine Größe bestimmt wurde. Von 96 analysierten Kolonien wurden 17 ein Insert enthaltende Kolonien gefunden. 5 Inserts wurden für die weitere Analyse genommen und lagen in einem Größenbereich von etwa 800 bis 1.600 Basenpaaren Länge.
    • d) Bestimmungen von Sequenzen
  • Bestimmungen von Nucleotidsequenzen wurden nach dem Didesoxynukleotid-Verfahren von Sanger (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463-5467, 1977) unter Verwendung eines von Boehringer gelieferten Kits durchgeführt. Das Sequenzieren wurde unter Verwendung von 17mer M13-Primern durchgeführt.
    • e) Hybridisierungen zwischen cDNA von ANT 70 und viraler RNA von HIV-1 und HIV-2
  • Der cDNA-Klon von ANT 70, der das größte Insert enthält (iso 70-11) wurde für die Hybridisierung mit dem Filter, auf dem die viralen RNAS aufgebracht worden waren, verwendet.
  • Die Hybridisierung wurde unter stringenten Bedingungen in 3 x SSC, 0,5 % Milchpulver, 1 % SDS, 10 % Dextransulfat und 50 % Formamid 18 Stunden bei 42 ºC durchgeführt. Nach der Hybridisierung wurde der Filter mit 0,1 x SSC, 0,1 % SDS bei 65 ºC (Waschvorgänge von 2 - 30 Minuten) gewaschen, woraufhin der Filter bei -70 ºC mit einer Verstärkerfolie autoradiographiert wurde.
  • Genomische DNA wurde auch aus Zellen hergestellt, die mit HIV-1 (SF4), Isolat ANT 70, hergestellt worden war. Auch genomische DNA aus infizierten Kontrollzellen wurde zubereitet. Nach der Spaltung mit einem Restriktionsenzym wurde die genomische DNA auf einem 0,8 % Agarosegel aufgetrennt, auf eine Hybond N-Membran (Amersham) transferiert und dann mit mit ³²P-markierter DNA vom Klon iso 70-11 unter stringenten Bedingungen in 50 % Formamid, 10 % Dextransulfat, 3 x SSPE (1 x SSPE = 180 mM NaCl, 10 mM NaH&sub2;PO&sub4;, pH 7,4, 1 mM EDTA, pH 7,4), 1 % SDS und 0,5 % Milchpulver hybridisiert. Nach der Hybridisierung wurde der Filter wie folgt gewaschen:
  • 1. 15 Minuten mit 2 x SSC, 0,1 % SDS bei Raumtemperatur
  • 2. 15 Minuten mit 0,5 x SSC, 0,1 % SDS bei Raumtemperatur
  • 3. 15 Minuten mit 0,1 x SSC, 0,1 % SDS bei Raumtemperatur
  • 4. 30 Minuten mit 0,1 x SSC, 1 % SDS bei 52 ºC.
  • Der Filter wurde dann unter Verwendung einer Verstärkerfolie bei -70 ºC autoradiographiert.
    • Ergebnisse Virus-Isolierung
  • Als Teil einer kontinuierlichen Studie über die heterosexuelle Übertragung von HIV wurde eine Virus-Isolierung aus Blut einer Frau aus Kamerun und ihres Partners durchgeführt. Wie zuvor werden die beiden isolierten Stämme als HIV-3 (ANT 70) (Frau) und HIV-3 (ANT 70 NA) (Mann) bezeichnet. Der Einfachheit halber werden auch die kürzeren Ausdrücke ANT 70 und ANT 70 NA verwendet. Die Frau ist der Partner eines HIV-seropositiven Mannes mit allgemeiner Lymphadenopathie. Serum der Frau war in dem Enzyrnimmunosorbens-Assay (EIA, Organon Teknika) mäßig positiv (Verhältnis OD/Cut-Oft 4,5) und hatte in dem Immunofluoreszenz-Antikörperassay auf HIV-1 eine niedrigen Titer (1/40), gab aber zweideutige Ergebnisse in dem HIV-1-Western-Blot-Assay mit klaren Banden bei p33, p53/55 und p64, aber mit sehr schwachen Banden bei p24, gp41 und gp120. Die Frau hatte einen erhöhten IgG- und IgM-Spiegel im Serum und ein Verhältnis CD4/CDB von 0,46. Virus wurde durch Cokultivierung von Lymphozyten der Frau mit mit PHA-stimulierten Lymphozyten von gesunden, nicht-infizierten Donoren isoliert. Nach 52 Tagen in der Kultur wurde Virus in der Kultur nachgewiesen, wie es aufgrund der Gegenwart von Synzytien und auf der Grundlage von positiver Immunofluoreszenz, die dann beobachtet wurde, wenn ein gegen HIV gerichtetes Antiserum als Laborvergleich mit mit Aceton fixierten Zellen aus der Kultur inkübiert wurde, ermittelt wurde. Die Gegenwart von Reverser Transkriptase in dem Kulturüberstand (10&sup4; cpm/ml, 27facher Hintergrund) wurde auch nachgewiesen.
  • Zellfreier Kulturüberstand wurde verwendet, um das Virus auf frische Lymphozyten zu passagieren. Nach 15 Tagen wurde wiederum ein CPE beobachtet und Reverse Transkriptase im Überstand nachgewiesen. Ein Vergleich eines mit Detergens behandelten Kulturüberstands dieses Isolats (ANT 70) mit anderen Isolaten mittels differentiellem Antigen-Einfangen zeigte jedoch, daß dieses Isolat nicht HIV-1 war.
  • Diese Ergebnisse sind in Fig. 2 dargestellt. Aufgrund der niedrigeren OD-Werte ist es offensichtlich, daß das Isolat (ANT 70) im Gegensatz zu den anderen Isolaten von den für HIV-1 spezifischen IgG nur mäßig erkannt wird, wie die anderen Isolate jedoch von IgG breiter Spezifität (Spur F) ohne weiteres eingefangen wurde. Die anderen Isoiate, von denen daraufhin unter Verwendung eines für HIV-1 spezifischen monoklonalen Antikörpers (CLB MAb 14) gezeigt wurde, daß es sich um Stämme von HIV-1 handelte, ergaben alle höhere OD-Werte auf den mit spezifischen IgG beschichteten Platten im Vergleich zu Platten, die mit Vergleichs-IgG breiter Spezifität beschichtet worden waren.
  • Es wurde ein Versuch unternommen, das Virus durch Cokultivierung von primären Lymphozyten, infiziert mit dem Isolat (ANT 70), mit Zellen des Klons 8 von Molt-4 in eine permanente Zellinie zu überführen. In der Anfangsphase der Infektion wurde ein intensiver zytopathischer Effekt mit Bildung von Synzytium und Zelltod beobachtet. Innerhalb mehrerer Wochen wurde Zellwachstum festgestellt. Die Zellen ergaben eine positive Immunofluoreszenz, wenn sie unter Verwendung eines gegen HIV gerichteten Antiserums mit breitem Spektrum getestet wurden. Die Gegenwart von Antigen und Reverser Transkriptase war in dem Kulturuberstand ohne weiteres nachweisbar.
  • Auf ähnliche Weise wurde Virus aus dem Partner der Frau isoliert, aus der das Isolat (ANT 70) isoliert worden war (Stamm ANT 70 NA). Der Mann litt an Lymphadenopathie und wurde nach dem CDC-Klassifizierungssystem in die Klasse 3 eingestuft. Der Mann hatte auch einen erhöhten Spiegel an IgM und IgG im Serum und ein Verhältnis von CD4/CDB von 0,4. Am Tag 18 wurde Virus im Überstand der Kultur nachgewiesen. Mit Detergens behandelter Überstand, der dieses Virus enthielt, wurde auch mittels differentiellem Antigen-Einfangen analysiert. Es wurde gefunden, daß er mit dem Isolat (ANT 70) (Fig. 3) auf ähnliche Weise reagierte. Das Binden des von diesem Isolat abgeleiteten Antigens war wiederum geringer mit für HIV-1 spezifischem IgG als mit dem IgG der breiten Spezifität.
  • Das Serum der Person, von der das Isolat (ANT 70 NA) gewonnen wurde, wurde mit Western Blot-Streifen von HIV-1 und HIV-2 (Biotech) inkubiert. Zusätzliche Streifen wurden auch mit Serum eines mit HIV-1 infizierten Donors sowie mit Serum von der Person inkubiert, aus der HIV-2 (Isolat 53) isoliert worden war. Diese Ergebnisse sind in Fig. 4 dargestellt. Das Serum von der mit ANT 70 NA infizierten Person kreuzreagierte tatsächlich mit allen Proteinen von HIV-1 einschließlich der Hüllproteine in erheblichem Maße. Im Gegensatz dazu kreuzreagierte das Serum des mit HIV-2 infizierten Menschen nur mit dem Protein gag p24, der Endonuklease p34 und der Reversen Transkriptase p68. Das gegen HIV-1 gerichtete Serum erkannte nur das Protein gag p26 von HIV-2, während das Serum des Trägers von ANT 70 NA dieses Protein und die Reverse Transkriptase von HIV-2 erkannte.
    • Charakterisierung der viralen Proteine
  • Das Virus in dem Kulturüberstand wurde unter Verwendung von Polyethylenglykol 6000 (Merck) präzipitiert. Das resultierende Material wurde wieder gelöst und durch ein 15 % Sukrosekissen pelletiert. Das pelletierte Virus wurde in SDS-Probenpuffer aufgelöst und mittels Polyacrylamid-Gelelektrophorese und anschließendem Protein-Blotten analysiert. Der Blot, dargestellt in Fig. 5, wurde mit einem gegen HIV gerichteten Serum breiter Spezifität inkubiert, so daß die viralen Proteine nachgewiesen wurden. Das BSR-Antiserum reagiert nicht nur mit allen viralen Proteinen von HIV-1, sondern es kreuzreagiert auch mit den Genprodukten des gag- und pol-Gens von HIV-2. Dieses Antiserum erkennt auch die Genprodukte des gag- und des pol-Gens von ANT 70 sehr deutlich. Es ist klar, daß die Molekulargewichte der Genprodukte von ANT 70 von den Molekulargewichten sowohl von HIV-1 als auch HIV-2 verschieden sind. Die Molekulargewichte der verschiedenen viralen Proteine sind in Tabelle 1 zusammengefaßt. Die Variabilität des Proteins p17/p18 von HIV-1 beruht auf einer Insertion von 6 Aminosäuren, die bei manchen Stämmen zwischen den Positionen 120 und 121 in der Sequenz HXB2 von HIV-1 vorkommt. Ein Vergleich der Proteine von ANT 70 und ANT 70 NA ist in Fig. 6 dargestellt. Die Molekulargewichte von allen Proteinen von ANT 70 NA sind identisch mit den Molekulargewichten von ANT 70.
  • Um auch die antigenen Beziehungen zwischen HIV-1, HIV-2 und ANT 70 zu untersuchen, wurden eine Reihe von afrikanischen und europäischen gegen HIV-1 gerichteten Sera 1:1000 verdünnt und zur Beschichtung von Mikrotiterplatten für das Einfangen von Antigenen verwendet.
  • Mit Detergens behandelter Kulturüberstand, der HIV-1, ANT 70, HIV-2 (LAV-2rod) und HIV-2 (Isolat 53) enthielt, wurde verdünnt. Es wurde auch die Fähigkeit eines jeden Antiserums zum Einfangen der vier verschiedenen Isolate untersucht. Repräsentative Ergebnisse sind in Fig. 7 dargestellt. Diesem Experiment kann entnommen werden, daß die Fähigkeit der verschiedenen Sera zum Einfangen von HIV-1 keineswegs in Beziehung zu ihrer Fähigkeit steht, entweder HIV-2 oder ANT 70 einzufangen. Ganz im Gegenteil, die Fähigkeit dieser Sera zum Einfangen von LAV-2rod, dem Prototyp-Stamm von HIV-2, korreliert stark mit der Fähigkeit dieser Sera, das Isolat 53 einzufangen, das ebenfalls ein Stamm von HIV-2, jedoch ein unabhängiges Isolat, ist.
  • Diese Daten zeigen an, daß ANT 70 weder HIV-1 noch HIV-2 ist.
  • In einer Reihe von ähnlichen Experimenten des Antigen-Einfangens wurden vier afrikanische gegen HIV-1 gerichtete Sera ausgewählt, um ihre Fähigkeit, HIV-1, ANT 70, HIV-2 (LAV- 2rod) und HIV-2 (Isolat 53) zu binden, wenn die IgG in verschiedenen Verdünnungen beschichtet wurden, einzuschätzen.
  • Die Kulturüberstände wurden verdünnt, so daß etwa dieselbe optische Dichte erzielt wurde, wenn auf Platten eingefangen wurde, die mit den IGG beschichtet waren, wie sie in Spur B von Fig. 8 verwendet worden sind. Verdünnungen der vier Sera wurden beschichtet, und Virus enthaltender Überstand wurde zugegeben. Es wurde die Annahme getroffen, daß ähnliche Viren ähnliche Titrationskurven ergeben sollten. In der Tat reagieren in Fig. 5 LAV-2rod und das Isolat 53 mit den beschichteten IgG auf ähnliche Weise. Andererseits gab ANT 70 intensivere Signale bei höheren Verdünnungen der IgG als beide Isolate von HIV-2. Die Form der mit ANT 70 erhaltenen Kurven ähnelt eher den Kurven, die für HIV-1 erhalten wurden, außer daß die optischen Dichten durchgehend geringer sind.
    • Kreuzreaktivität von monoklonalen Antikörpern der Maus. gerichtet gegen das Core-Protein p24 von HIV-1
  • Ein Panel monoklonaler Antikörper (MAbs) der Maus, hergestellt gegen das Core-Protein p24 von HIV-1, wurde auf die Fähigkeit getestet, mit den Isolaten ANT 70 und HIV-2 kreuzzureagieren. Grundsätzlich kann jedes Panel monoklonaler Antikörper gegen p24 von HIV-1 verwendet werden, solange die Serie monoklonale Antikörper umfaßt, die mit verschiedenen Epitopen auf dem Molekül von p24 von HIV-1 reagiert. Aszitesflüssigkeit, die die Antikörper enthält, wurde verdünnt und verwendet, um Mikrotiterplatten zu beschichten. Mit Detergens behandelte, Virus enthaltende Überstände wurden dann zu den beschichteten Vertiefungen gegeben. Gebundenes Antigen wurde unter Verwendung von BSR-HIV-IgG, konjugiert an Merrettich- Peroxidase, nachgewiesen. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Fig. 9 dargestellt.
  • In Kontrol-Vertiefungen, die mit polyklonalem IgG eines breiten Spektrums beschichtet worden waren, ergaben alle Virus enthaltenden Überstände optische Dichten, die die Grenzen des Ablesegeräts der Mikrotiterplatte überschritten. Wenn jedoch in den Vertiefungen, die mit den verschiedenen monoklonalen Antikörpern beschichtet waren, getestet wurde, ergab sich ein völlig anderes Muster. Zuvor durchgeführte Studien zeigten an, daß alle getesteten MAbs gegen verschiedene Epitope auf dem p24-Molekül reagierten. Davon ausgenommen waren nur die Mabs CLB 59 und CLB 21, von denen gezeigt wurde, daß sie dieselben Epitope erkennen. Diese beiden Mabs reagieren wie erwartet stark mit HIV-1 und ergeben auch ein meßbares Signale mit ANT 70. Sie reagieren jedoch nicht mit den HIV-2- Stämmen. Zwei andere MAbs, CLB 64 und CLB 14, banden HIV-1 gut und zeigten eine schwache Affinität für ANT 70 und für die beiden lsolate von HIV-2. Insbesondere ist gezeigt worden, daß der MAb CLB 14 alle lsolate von HIV-1 gut erkennt (> 150 getestet). Dieser MAb muß daher an ein sehr stark konserviertes Epitop binden, dessen Reste auch in anderen menschlichen Immunschwächeviren nachgewiesen werden können. Die anderen MAbs gegen p24 (CLB 16, 47 und 19.7) und zwei andere MAbs, die gegen das Protein p18 von HIV-1 gerichtet sind (CLB 13.4 und CLB 13.6) erkennen weder ANT 70 noch die beiden Isolate von HIV-2, fangen aber die entsprechenden Antigene von HIV-1 ein.
    • Reaktion von menschlichen gegen HIV gerichteten Antisera gegenüber viralen Proteinen
  • Protein-Blots von viralen Proteinen von HIV-1 (ARV 4), ANT 70 und HIV-2 (LAV2rod) wurden nach der Elektrophorese von Extrakten, die mittels Detergens löslich gemacht worden waren, hergestellt und mit verschiedenen menschlichen Sera (Fig. 10) inkubiert. Spur A zeigt die Reaktion des Vergleichserums breiter Spezifität aus dem Labor mit den drei Virus-Isolaten. In Spur B wurde ein gegen HIV-1 gerichtetes Antiserum mit dem Blot inkubiert. Es erkennt vorzugsweise die Proteine von HIV-1. Das Serum der Frau, aus der ANT 70 isoliert wurde (Spur C) und ihres Partners, aus dem ANT 70 NA isoliert wurde (Spur D), wurden auf ihre Fähigkeit, andere virale Isolate zu erkennen, untersucht. Diese beiden Sera erkennen vorzugsweise ANT 70 einschließlich dem Hüllprotein gp120 dieses Virus. Das Serum des Partners hat einen höheren Titer als das Serum der Frau, aus der ANT 70 isoliert wurde, und erkennt das gp41 von HIV- 1. Diese beiden Sera haben eine höhere Affinität für ANT 70 als für die Isolate von HIV-1 oder HIV-2. Im Gegensatz dazu bindet das Serum aus der Penson, aus der das Isolat 53 von HIV-2 isoliert wurde, vorzugsweise an Proteine von HIV-2 und erkennt das Hüllprotein gp120 von HIV-2 dieses Virus ebenso wie das Transmembran-Protein gp41 (Spur E). Es reagiert nicht mit den Glykoproteinen von HIV-1 oder ANT 70. Diese Ergebnisse zeigen außerdem an, daß ANT 70 sowohl von HIV-1 als auch von HIV-2 verschieden ist.
  • Enzym-Immunosorbens-Assays unter Verwendung von Beschichtungen mit viralen Proteinen wurden als Titrationen von gegen HIV-1, gegen ANT 70 und gegen HIV-2 gerichteten Sera in Mikrotiterplatten durchgeführt, die mit viralen Lysaten von HIV- 1 (ARV-4), ANT 70 und HIV-2 (Isolat 53) beschichtet worden waren. Zweifache Verdünnungen eines jeden Serums, ausgehend von einer anfänglichen Verdünnung von 1:100, wurden auf ihre Fähigkeit, das beschichtete Antigen zu binden, getestet. Gebundener Antikörper wurde unter Verwendung eines Meerettich- Peroxidase markierten Ziege anti-Mensch IgG-Konjugats nachgewiesen. Diese Ergebnisse sind in Fig. 11 dargestellt. Das gegen HIV-1 gerichtete Serum erkannte vorzugsweise die Proteine von HIV-1, zeigt aber eine bedeutende Kreuzreaktion mit den Proteinen von ANT 70. Die Proteine von HIV-2 wurden kaum nachgewiesen. Im Gegensatz dazu erkannte das gegen ANT 70 gerichtete Serum vorzugsweise die Proteine von ANT 70, es zeigte eine Kreuzreaktivität gegenüber den Proteinen von HIV-1 und reagierte besser mit den mit HIV-2 beschichteten Vertiefungen als es das gegen HIV-1 gerichtete Serum tat, was deutlich wurde aufgrund der erhaltenen höheren Werte für die optische Dichte. Das gegen HIV-2 gerichtete Serum hatte einen sehr geringen Titer, reagierte aber trotzdem am besten mit den Proteinen von HIV-2. Kein nachweisbares Signal wurde mit den mit HIV-1 oder ANT 70 beschichteten Vertiefungen beobachtet. Die Unfähigkeit, Kreuzreaktionen in diesem Beispiel nachzuweisen, beruht unzweifelhafterweise auf dem niedrigen Titer dieses gegen HIV gerichteten Serums.
    • Analyse von Produkten einer partiellen chemischen Spaltung von viralen Proteinen
  • Die beiden für die chemische Spaltung verwendeten Reagenzien, Cyanbromid und BNPS-Skatol, wurden wegen ihrer hohen Spezifitäten für Methionin (29) bzw. Tryptophan (30) ausgewählt. Diese beiden Aminosäuren sind auch ziemlich hydrophob, und es ist daher auch weniger wahrscheinlich, daß sie in Epitopen auf den äußeren Oberflächen des Protein-Moluküls gefunden werden (31). Die Untersuchung publizierter Aminosäure-Sequenzen der Genprodukte von gag und pol von HIV-1 (32 - 36), HIV-2 (19), SIVagm (10), SIVmac (9), des infektiösen Pferde- Anämievirus (EIAV 37) und Visna (38) zeigt, daß viele der Positionen der Methionin-Reste in diesen Proteinen und zu einem sogar noch größeren Ausmaß die Tryptophan-Reste besonders konserviert sind (Fig. 12), obwohl es zwischen diesen verschiedenen Isolaten nur eine geringe Aminosäure-Homologie gibt. Außerdem ist die Variation bezüglich dieser Reste innerhalb der Spezies sehr klein oder sogar gar nicht vorhanden, was zumindest für den Fall von HIV-1 (36) und wahrscheinlich auch für alle menschlichen und Affen-Immunschwäche-Retroviren zutrifft.
  • Die Muster der partiellen Verdauungen der Produkte der gag und pol-Gene von HIV-1, ANT 70, HIV-2 (LAVrod) und HIV-2 (Isolat 53) sind in Fig. 13 dargestellt.
  • Die Untersuchung der CNBR-Spaltmuster für das Protein p24 aus den vier lsolaten zeigt, daß die für HIV-2 (LAV-2rod) und HIV-2 (Isolat 53) erzeugten Muster identisch sind. Es werden jedoch unterschiedliche Muster für HIV-1 und für ANT 70 beobachtet. Somit bestehen deutliche Unterschiede in den Positionen der Methionin-Reste des Haupt-Core-Proteins von HIV-1, ANT 70 und HIV-2. Im Fall des Core-Proteins p17 werden Unterschiede zwischen den beiden Isolaten von HIV-2 beobachtet. Eine Analyse der veröffentlichten Sequenz für HIV-2rod zeigt an, daß es ein Methionin 18 Aminosäuren entfernt vom Carboxyl-Ende dieses Proteines gibt. Wir ziehen die Schlußfolgerung, daß dieses Methionin in dem entsprechenden Protein von dem Isolat 53 fehlen muß. Es ist auch möglich, aus dem Spaltmuster die Gegenwart eines Methionins nahe (10 - 15 Aminosäuren) eines der Enden von p16 von ANT 70 abzuleiten. Die Spaltung der retroviralen Reversen Transkriptase mit CNBr zeigt, daß die Proteine von den beiden Isolaten HIV-2 wiederum identisch sind, während verschiedene Muster sowohl für die Proteine von HIV-1 als auch für die von ANT 70 beobachtet werden. Im Falle der Endonuklease p31, abgeleitet von dem 3'- Teil des pol-Gens, können Ahnlichkeiten zwischen allen Isolaten abgeleitet werden, obwohl einige geringere Unterschiede offensichtlich sind.
  • Die Spaltung des Proteins p24 der vier Isolate mit BNPS-Skatol resultiert in sehr ähnlichen Mustern. Es wird aus Fig. 8 klar, daß dies zu erwarten ist, da die Tryptophan-Positionen in diesem Protein sehr hoch konserviert sind, insbesondere für die Retroviren von menschlichem und Affen-Ursprung. Wir folgern daraus, daß die Tryptophan-Positionen in dem Protein p25 von ANT 70 auch diesem Muster entsprechen. Die Untersuchung der Muster zeigt jedoch, daß geringere Unterschiede beobachtet werden können, nicht in dem Gesamt-Erscheinungsbild des Musters, sondern vielmehr in den offensichtlichen Molekulargewichten der durch Spaltung erzeugten Spezies. Insbesondere werden Unterschiede bei den offensichtlichen Molekulargewichten der zentralen Punkte in jedem Muster nachgewiesen. Wie erwartet sind die Muster für HIV-2 (LAV-2rod) und HIV-2 (Isolat 53) identisch. Der zentrale Punkt in dem Muster für ANT 70 hat jedoch ein größeres offensichtliches Molekulargewicht, während der zentrale Punkt für HIV-1 (ARV-4) ein geringeres Molekulargewicht hat. Bezüglich dem Protein p16 erscheinen die Positionen der Tryptophane in dem Protein von ANT 70 den Positionen der Tryptophane, die in dem Protein von HIV-2 gefunden wurden, mehr zu ähneln. Das Protein p17 von HIV-1 hat ein Tryptophan 16 Aminosäuren vom Amino-Terminus des Proteins und ergibt einen zusätzlichen Punkt, der in den Mustern von ANT 70 und HIV-2 nach der Spaltung mit BNPS- Skatol nicht beobachtet wird. Das Tryptophan entsprechend dem an der Position 36 in dem Protein p17 von HIV-1 ist in allen Isolaten konserviert.
  • Die durch die Spaltung der Reversen Transkriptase erzeugten Muster von den vier Isolaten sind komplex. Es ist aber wieder einmal offensichtlich, daß die beiden lsolate von HIV-2 identisch sind. Es werden für ANT 70 Muster erhalten, die weder dem Muster, das für HIV-1 erhalten wurde, noch dem Muster, das für HIV-2 erhalten wurde, entspricht. Es werden Unterschiede in den offensichtlichen Molekulargewichten der Spaltprodukte der Endonuklease p31 beobachtet, aber die aus den entsprechenden Proteinen von HIV-1, ANT 70 und HIV-2 erzeugten Muster zeigen auch gemeinsame Merkmale, die eine konservierte Struktur nahelegen.
    • Ergebnisse Virale Nukleinsäuren a) Hybridisierung von cDNA von HIV-1 und HIV-2 mit viralen RNAs
  • Die Kreuzhybridisierung von Nukleinsäuren von HIV-1 mit RNA der Viren HIV-1 und ANT 70 wurde mittels Hybridisierung mit dem Restriktionsfragment SacI-BglII von HIV- 1, das in den Vektor pUC13 eingefügt worden war, ermittelt. Dieses Fragment enthält einen Teil der 5'-LTR einschließlich der R-Region, das gesamte Gen gag und den größten Teil des Genes pol von HIV-1. Unter stringenten Hybridisierungsbedingungen wurde Hybridisierung nur zwischen dieser Sonde und der von HIV-1 (SF4) abgeleiteten RNA beobachtet. Zwischen der Sonde und entweder HIV-2 oder ANT 70 (Fig. 14) wurde keine Hybridisierung beobachtet. Dies weist darauf hin, daß die Regionen gag und pol von HIV-2 und ANT 70 von der entsprechenden Region von HIV-1 deutlich unterschiedlich sind.
  • Die verwendete Sonde von HIV-2 enthält eine Sequenz von etwa 1000 Basenpaaren von dem Gen env von HIV-2. Diese Sonde hybridisierte unter stringenten Hybridisierungsbedingungen nur mit RNA von HIV-2. Weder mit HIV-1 noch mit HIV-3 wurde eine Hybridisierung beobachtet.
    • b) Homologie zwischen der cDNA von ANT 70 und den Sequenzen von HIV-1 und HIV-2
  • Der cDNA-Klon iso 70-11 wurde als Sonde verwendet, um den Grad der Homologie auf der Nukleinsäureebene zwischen den verschiedenen Isolaten des Virus einzuschätzen. Der Filter, auf den Aliquots von HIV-1, HIV-2 und ANT 70 abgeschieden worden waren, wurde einer Hybridisierung unter stringenten Bedingungen unterworfen. Die Ergebnisse sind ebenfalls in Fig. 14 dargestellt. Das Experiment zeigt, daß unter stringenten Hybridisierungsbedingungen zwischen keinem der Virus-lsolate eine Kreuzhybridisierung nachgewiesen werden kann. Die von ANT 70 abgeleitete Sonde hybridisiert nur mit ANT 70. DNA des cDNA-Klons iso 70- 11 von ANT 70 wurde für die Hybridisierung von Blots von Restriktionsenzym-Verdaus zellulärer, genomischer DNA, von mit HIV-1 und ANT 70 infizierten Zellen sowie von DNA von nicht-infizierten Zellen verwendet. Die Ergebnisse sind in Fig. 15 dargestellt. Bei keiner anderen Spur als bei denjenigen, die Verdaus von genomischer DNA von mit ANT 70 infizierten Zellen enthielten, wurde Hybridisierung beobachtet. Auch dies weist darauf hin, daß das Insert iso 70-11 nicht von zellulären Sequenzen stammt.
  • Eine zusätzliche Hybridisierung wurde unter Verwendung des Fragmentes SacI-BglII aus dem Insert iso 70-11 durchgeführt, das dem linken Ende des Inserts entspricht, das am weitesten von den Sequenzen entfernt ist, die vermutlich in der LTR enthalten sind. Dieses Fragment sollte in Analogie mit HIV-1 und HIV-2 den Sequenzen des Genes env entsprechen. Die Hybridisierung mit diesem Fragment ergab dieselben Banden, die auch die Hybridisierung mit dem gesamten Fragment ergab.
    • c) Sequenz-Analyse des Klons iso 70-11
  • Die Lokalisierung einer Reihe von Restriktionsenzym-Stellen in dem Insert Iso 70-11 von ANT 70 ist in Fig. 16 dargestellt. Subklone des Inserts in pUC13 wurden erzeugt und unter Verwendung des Didesoxynukleotid-Verfahrens sequenziert.
  • Die Gegenwart eines Poly-A-Schwanzes bestätigte, daß das Insert Iso 70-11 von dem 3'-Ende der viralen RNA stammt.
  • Benachbart dem Poly-A-Schwanz ist die der R-Region der viralen 3'-LTR entsprechende Sequenz. Die in der cDNA von ANT 70 enthaltene Sequenz und die viralen Sequenzen, der diese entsprechen, sind unten dargestellt: 1. LTR von HIV-3 Polyadenylierungssignal 2. Sequenzen vom 3'-ORF von HIV-3 3. Codierende Sequenzen des Gens env von HIV-3
    • Diskussion
  • Wir haben ein neues, mit menschlicher Immunschwäche assoziiertes Retrovirus aus einer Frau aus Kamerun (ANT 70) und ihrem Partner (ANT 70 NA) isoliert. Zu der Zeit, als die Virus-Isolierung ursprünglich durchgeführt wurde, war die Frau nur leicht seropositiv; ergab in Western Blot-Untersuchungen zweideutige Ergebnisse und war klinisch frei von Symptomen. Seit dieser Zeit begann die Frau, einige der Symptome des AIDS-bezogenen Komplexes (ARC) zu entwickeln. Im Gegensatz dazu litt ihr Partner, von dem wir ebenfalls ein Virus mit denselben Eigenschaften wie das ursprüngliche Isolat isolieren konnten, an Lymphadenopathie und hat seitdem andere für MDS charakteristische Symptome entwickelt. Dieses neue Isolat kann daher als ein menschliches Immunschwäche-Virus angesehen werden. Die Tatsache, daß dasselbe Virus von Sexualpartnern isoliert werden konnte, legt auch eine Art der Übertragung nahe, die ähnlich der für menschliche Retroviren ist.
  • Das Virus wurde zuerst auf der Grundlage seiner veränderten Eigenschaft, in einem differentiellen Antigen-Einfangtest eingefangen zu werden, als von HIV-1 verschieden erkannt. Dieser Test hat sich als ausgesprochen zuverlässig erwiesen, um zwischen Stämmen von HIV-1 und nicht-HIV-Stämmen zu unterscheiden. Auch auf dem Protein-Level zeigt sich, daß dieses Isolat nicht HIV-1 ist. Dies beruht auf 1) unterschiedlichen Molekulargewichten der viralen Proteine, 2) unterschiedlichen Mustern der Kreuzreaktivität mit gegen HIV-1 gerichtetem Antiserum im Vergleich mit HIV-1, 3) einer drastisch reduzierten Fähigkeit von monoklonalen Antikörpern der Maus, die gegen die Core-Proteine p24 und p17 von HIV-1 erzeugt worden sind, erkannt zu werden, 4) bevorzugte Erkennung von Proteinen von ANT 70 im Vergleich zu Proteinen von HIV-1 durch Antisera aus dem Träger des Virus und 5) Mustern der partiellen Spaltung der vier höchst-konservierten viralen Proteine, die nicht zu den Mustern passen, die erhalten werden, wenn Proteine von HIV-1 derselben Behandlung unterworfen werden. Nichtsdestotrotz erkennen die Sera der zwei mit diesem Virus infizierten Individuen das Hüllprotein gp41 von HIV-1. Aufgrund derselben Kriterien, wie sie oben aufgeführt worden sind, ist es auch klar, daß ANT 70 nicht HIV-2 ist. In der Tat sind die antigenen Unterschiede zwischen ANT 70 und HIV-1 geringer als die Unterschiede zwischen HIV-2 und HIV-1. Dies wird insbesondere anhand der in den Figuren 8 und 10 dargestellten Resultate deutlich.
  • Weitere deutliche Hinweise dafür, daß ANT 70 ein von HIV-1 und von HIV-2 verschiedenes, einzigartiges Virus ist, kommen von den partiellen Peptid-Kartierungen. Wir haben gezeigt, daß es bedeutende Unterschiede in den am höchst konservierten viralen Proteinen gibt. Die beiden Isolate von HIV-2, die zum Vergleich verwendet wurden, ergaben im wesentlichen identische Spaltmuster, außer in dem Fall der Spaltung mit CNBr des Core-Proteins p17. Es sollte jedoch festgestellt werden, daß das Core-Protein p17 eine größere Variabilität aufweist als das Protein p24, was zumindest in den Stämmen von HIV-1 (34) zutrifft. Ob dies auch für HIV-2 zutrifft, bleibt bis zur Ermittlung der Sequenz von mehr Stämmen, als bisher analysiert worden sind, abzuwarten.
  • Angesichts der Tatsache, daß ANT 70 antigenisch näher mit HIV-1 verwandt ist als es HIV-2 ist, wie es aufgrund des höheren Grades der Kreuzreaktivität, die sich sogar auf das Hüll-Protein gp41 erstreckt, ersichtlich ist, war es notwendig festzustellen, daß ANT 70 mehr als eine einfache genetische Variante von HIV-1 ist. Dies wurde dadurch möglich, daß die Lokalisierung einiger der am höchsten konservierten Aminosäuren in einer Reihe von viralen Proteinen, die einer genetischen Variation am wenigsten zugänglich sind, untersucht wurde. Die Tatsache, daß wesentliche Unterschiede in den Spaltmustern festgestellt wurden, zeigt an, daß HIV-1, HIV-2 und ANT 70 drei genetisch verschiedene Viren sind. Andererseits zeigte dieselbe Serie von Experimenten auch Ähnlichkeiten zwischen diesen Viren, was bedeuten kann, daß alle drei von einem gemeinsamen Vorläufer abstammen.
  • Die Hybridisierungsdaten bestätigen auch die Feststellung, daß ANT 70 sowohl von HIV-1 als auch von HIV-2 grundsätzlich verschieden ist. Solange wie die Bedingungen, unter denen die Hybridisierung durchgeführt wird, stringent sind, kann eine Unterscheidung zwischen den drei Virus-Typen leicht getroffen werden.
  • Die Analyse der Sequenzen der cDNAS zeigte, daß das Insert von dem 3'-Ende des viralen Genoms stammt. Eine Analyse der Homologie zwischen diesen Sequenzen und der Sequenz von HIV-1 und HIV-2 zeigt, daß ANT 70, insbesondere in den LTR-Sequenzen (etwa 70 %-ige Homologie), etwas näher mit HIV-1 verwandt ist. Die Unterschiede sind trotzdem von einer derartigen Größe, daß die Möglichkeit ausgeschlossen werden kann, daß ANT 70 einfach eine genetische Variante von HIV-1 ist. Die 3'-LTR von ANT 70 enthält auch Signalsequenzen, die typisch für retrovirale LTRs sind.
  • Es ist gefunden worden, daß Sequenzen entsprechend dem Gen env von ANT 70 mit den Sequenzen von HIV-1 oder HIV-2 sogar weniger verwandt sind. Während es zutrifft, daß retrovirale env-Gene häufig eine genetische Variabilität aufweisen, sind die Unterschiede in der Sequenz zwischen den Varianten selten mehr als 10 %. Das Ausmaß der Homologie zwischen ANT 70 einerseits und HIV-1 und HIV-2 andererseits stellte sich jedoch als geringer als 60 % heraus. Ein solcher Unterschied in der Homologie zeigt, gemeinsam mit den Ergebnissen der Hybridisierungen, daß ANT 70 einer neuen Klasse von menschlichen Immunschwäche-Retroviren angehört.
  • Die Existenz eines dritten Typs von menschlichem Immunschwächevirus hat unmittelbare epidemiologische Implikationen und Folgen für das Testen von Blutbanken. Wie gezeigt worden ist, reagieren Antikörper von mit diesem Virus infizierten Menschen vorzugsweise mit diesem Virus, obwohl diese Antikörper auch mit Proteinen von HIV-1 kreuzreagieren. Während es möglich war, eine positive Reaktion von ANT 70 NA-Serum in Enzym-Immunoassays, Immunofluoreszenz-Assays und Western Blot- Assays auf der Grundlage von Proteinen von HIV-1 nachzuweisen, impliziert die Tatsache, daß das positive Signal aufgrund einer Kreuzreaktion erfolgte, zwangsläufig, daß die Sensitivität solcher Untersuchungen auf als Antwort auf dieses Virus produzierte Antikörper geringer sein wird. Dies wurde mittels der Ergebnisse des Enzym-Immunoassays (Fig. 11) klar gezeigt. Außerdem ist ein Kriterium für die seropositive Reaktion in dem Western Blot-Assay die Gegenwart von nachweisbaren Antikörpern gegen das Protein gag und/oder das Protein pol und eines der Hüllproteine. Da im Falle der beiden mit ANT 70 bzw. ANT 70 NA infizierten Personen eine Kreuzreaktion mit dem p24 und den Hüllproteinen von HIV-1 beobachtet wurde, ist der Schluß, der ausnahmslos gezogen wird, derjenige, daß diese Personen zwar mit HIV-1 infiziert sind, aus irgendwelchen Gründen jedoch keine hohen Titer gegen HIV-1 entwickeln. Es ist daher möglich, daß dieses Virus weiter verbreitet ist, als es gegenwärtig wahrgenommen wird. Unter einem epidemiologischen Gesichtspunkt ist es wesentlich, spezifische diagnostische Tests für dieses Virus zu entwickeln, um die Grenzen des geographischen Gebiets in Afrika, in dem das Virus gefunden werden kann, und das Ausmaß, in dem dieses Virus verbreitet worden ist, zu ermitteln.
    • Literaturstellen:
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Claims (31)

1. HIV-3-Retrovirus, hinterlegt bei der European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC) unter der Nr. V88060301, wobei dieses hinterlegte Virus die folgenden wesentlichen morphologischen und immunologischen Eigenschaften aufweist:
- das Virus weist einen Tropismus für T4-Lymphozyten auf;
- das Virus ist zytotoxisch für die es infizierenden Lymphozyten;
- das Virus hat einen Durchmesser von etwa 120 nm;
- das Virus besitzt eine Magnesium-abhängige Reverse Transkriptase-Aktivität;
- es kann in irnmortalisierten Zellinien, die den T4-Rezeptor tragen, kultiviert werden;
- Lysate des Virus enthalten ein p25-Protein, das nach Bestimmungen mittels Western Blot-Analyse und partieller CNBr-Spaltung von dem p19-Protein von HTLV-I und den p24-Proteinen von HIV-1 und HIV-2 immunologisch verschieden ist;
- Lysate des Virus enthalten ein gp120-Protein, das nach Bestimmungen mittels Western Blot-Analyse von dem gp110-Protein von HTLV-I, dem gp120 von HIV-1 und dem gp120 von HIV-2 immunologisch verschieden ist;
- das Lysat des Virus enthält außerdem ein gp41-Glykoprotein mit einem Molekulargewicht von 40.000 bis 45.000;
- die genomische RNA von HIV-3 hybridisiert unter stringenten Hybridisierungsbedingungen weder mit den Sequenzen von HIV- 1 noch mit den Sequenzen von HIV-2;
- Lysate des Virus enthalten ein p16-Protein, das sich nach Bestimmungen mittels partieller CNBr-Spaltung von dem p17 von HIV-1 und von HIV-2 unterscheidet;
- Lysate des Virus enthalten ein p12-Protein, das sich nach Bestimmungen mittels Western-Blot-Analyse von dem p12 von HIV-1 und von HIV-2 unterscheidet;
- Lysate des Virus enthalten eine p31-Endonuklease, die sich nach Bestimmungen mittels partieller CNBR-Spaltung von der p31- Endonuklease von HIV-1 und von HIV-2 unterscheidet;
und wobei dieses HIV-3-Retrovirus CNBr- und BNPS-Skatol-Spaltmuster für das p25-Protein, das p16-Protein, das p31-Protein und die Reverse Transkriptase gemäß den in Figur 13 dargestellten Mustern hat.
2. Das Retrovirus nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleotidsequenz seiner genomischen RNA, die eine R-Region und eine U3-Region umfaßt, auch eine Nukleotidsequenz umfaßt, die der folgenden Nukleotidsequenz entspricht:
3. Das Retrovirus nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß es in seinem Env-Gen eine der folgenden Nukleotidsequenz entsprechende Sequenz enthält:
4. Das Retrovirus nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß seine RNA praktisch weder mit dem Env-Gen und der LTR nahe diesem, insbesondere nicht mit der Nukleotidsequenz 8352 bis 9538 von HIV-1, noch mit den Sequenzen der Pol-Region des HIV-1-Genoms unter stringenten Bedingungen hybridisiert.
5. Zusammensetzung, umfassend einen Gesamtextrakt oder ein Gesamtlysat des Retrovirus nach einem der vorhergehenden Ansprüche.
6. Die Zusammensetzung nach Anspruch 5, außerdem umfassend das Lysat von HIV-1, HIV-2 oder eines Gemisches von beiden.
7. Die Zusammensetzung nach Anspruch 5 oder 6, umfassend zumindest eines der Antigene des HIV-3-Retrovirus, wie es in Anspruch 1 definiert ist.
8. Die Zusammensetzung nach Anspruch 5 oder 6, außerdem umfassend Proteine, die von HIV-1 und/oder HIV-2 abstammen.
9. Die Zusammensetzung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß sie zumindest eines der inneren Core-Proteine, insbesondere p12, p16 oder p25 mit den augenscheinlichen Molekulargewichten in der Größenordnung von 12.000, 16.000 bzw. 25.000, des Retrovirus enthält.
10. Die Zusammensetzung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet,
daß sie zumindest eines der Hüllproteine, insbesondere gp41 oder gp120, wie sie in Anspruch 1 definiert sind, und die die augenscheinlichen Molekulargewichte in der Größenordnung von 40.000 bis 45.000 bzw. 120.000 haben, des Retrovirus enthält.
11. Gereinigtes Antigen eines HIV-3-Virus nach einem der Ansprüche 1 bis 4, das die immunologischen Eigenschaften eines der retroviralen Proteine, wie in Anspruch 1 definiert, von HIV-3 besitzt.
12. Das Antigen nach Anspruch 11, dadurch erhalten, daß der Gesamtprotein-Extrakt von HIV-3 einer Gel-Elektrophorese unterworfen und das p12-Protein in einer an sich bekannten Weise isoliert wird.
13. Das Antigen nach Anspruch 11, dadurch erhalten, daß der Gesamtprotein-Extrakt von HIV-3 einer Gel-Elektrophorese unterworfen und das p16-Protein in einer an sich bekannten Weise isoliert wird.
14. Das Antigen nach Anspruch 11, dadurch erhalten, daß der Gesamtprotein-Extrakt von HIV-3 einer Gel-Elektrophorese unterworfen und das p25-Protein in einer an sich bekannten Weise isoliert wird.
15. Das Antigen nach Anspruch 11, dadurch erhalten, daß der Gesamtprotein-Extrakt von HIV-3 einer Gel-Elektrophorese unterworfen und das gp41-Protein in einer an sich bekannten Weise isoliert wird.
16. Das Antigen nach Anspruch 11, dadurch erhalten, daß der Gesamtprotein-Extrakt von HIV-3 einer Gel-Elektrophorese unterworfen und das gp120-Protein in einer an sich bekannten Weise isoliert wird.
17. Verfahren zum Nachweis von Antikörpern gegen das HIV-3-Retrovirus nach einem der Ansprüche 1 bis 4 in einer biologischen Flüssigkeit wie Serum oder Spinalflüssigkeit, insbesondere für die Diagnose von möglicherweise oder tatsächlich bestehendem ARC oder AIDS auf Grund des HIV-3-Retrovirus, dadurch gekennzeichnet, daß die zu untersuchende Körperflüssigkeit einer Person mit einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 7 bis 10 oder mit einem Antigen nach einem der Ansprüche 11 bis 16 in Berührung gebracht und das immunologische Konjugat nachgewiesen wird, das zwischen den gegen HIV-3 gerichteten Antikörpern und dem (den) verwendeten Antigen(en) gebildet wird.
18. Das Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß der Nachweis dieses immunologischen Konjugats dadurch erzielt wird, daß das immunologische Konjugat mit einem markierten Reagens, ausgewählt aus gegen menschliches Immunglobulin gerichteten Antikörpern oder bakteriellem Protein A oder Protein G, umgesetzt und der gebildete Komplex zwischen dem Konjugat und dem Reagens nachgewiesen wird.
19. Kit zum Nachweis von gegen HIV-3 gerichteten Antikörpern in einer biologischen Flüssigkeit, umfassend
- eine Zusammensetzung wie in einem der Ansprüche 7 bis 10 definiert oder ein Antigen wie in einem der Ansprüche 11 bis 16 definiert, und
- ein Mittel zum Nachweis des gebildeten immunologischen Komplexes.
20. Der Kit nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß das Mittel zum Nachweis des immunologischen Komplexes anti-menschliches Immunglobulin oder Protein A und Mittel zum Nachweis des Komplexes umfaßt, der zwischen den gegen HIV-3 gerichteten Antikörpern, die in dem nachgewiesenen immunologischen Konjugat enthalten sind, gebildet worden sind.
21. Immunogene Zusammensetzung, die ein Hüll-Glykoprotein eines HIV-3-Retrovirus nach einem der Ansprüche 1 bis 4, insbesondere gp41 oder gp120, in Verbindung mit einem pharmazeutisch verträglichen Vehikel enthält, das für die Zusammenstellung von gegenüber HIV-3 wirksamen Vakzinen geeignet ist.
22. Nukleinsäure, gegebenenfalls markiert, umfassend die Sequenzen, die dem gesamten RNA-Genom des HIV-3-Retrovirus nach einem der Ansprüche 1 bis 4 entspricht.
23. Die Nukleinsäure nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß sie Nukleotid-Sequenzen, die für die Aminosäure-Sequenzen von p12, p16 oder p25, wie sie in Anspruch 1 definiert sind, kodieren.
24. Die Nukleinsäure nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß sie Nukleotid-Sequenzen, die für die Aminosäure-Sequenzen der Glykoproteine gp41 und gp120, wie sie in Anspruch 1 definiert sind, kodieren.
25. Die Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 22 bis 24, eingefügt in einen Vektor, so daß ein rekombinanter Vektor gebildet wird, der diese Nukleinsäure umfaßt.
26. Verfahren zum Nachweis eines HIV-3-Retrovirus nach einem der Ansprüche 1 bis 4 oder zum Nachweis seiner RNA in einer biologischen Flüssigkeit oder einem biologischen Gewebe, dadurch gekennzeichnet, daß die in der biologischen Flüssigkeit oder dem biologischen Gewebe enthaltenen Nukleinsäuren unter stringenten Hybridisierungsbedingungen mit einer Sonde, die eine Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 22 bis 24 enthält, in Berührung gebracht wird, das gebildete Hybrid mit einer Lösung, die die stringenten Bedingungen aufrechterhält, gewaschen und das gebildete Hybrid nachgewiesen wird.
27. Verfahren zur Herstellung eines HIV-3-Retrovirus nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß menschliche T4- Lymphozyten oder von ihnen abgeleitete, permanente Zellinien, die den T4-Phänotypus tragen, mit Lymphozyten oder Zellinien, die kürzlich mit einem Isolat des HIV-3-Retrovirus, wie er in Anspruch 1 definiert ist, infiziert worden sind, kultiviert werden, und daß das Retrovirus aus dem Kulturmedium wiedergewonnen und gereinigt wird.
28. Verfahren zur Herstellung von Antigenen eines HIV-3-Retrovirus, wie er in einem der Ansprüche 1 bis 4 definiert worden ist, dadurch gekennzeichnet, daß das Retrovirus lysiert und das die Antigene enthaltende Lysat wiedergewonnen wird.
29. Verfahren zur Herstellung eines der Proteine oder Glykoproteine p12, p16, p25, gp 41 und gp120, wie sie zuvor definiert worden sind, dadurch gekennzeichnet, daß die entsprechende Nukleinsäure-Sequenz in einen Expressionsvektor eingefügt wird, ein Wirt mit diesem Vektor transformiert und der transformierte Wirt kultiviert wird und das exprimierte Protein wiedergewonnen und gereinigt wird.
30. Verfahren zur Herstellung einer Hybridisierungssonde zum Nachweis der RNA eines HIV-3-Retrovirus nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß eine der DNA-Sequenzen nach den Ansprüchen 22 bis 24 mittels in vitro-Rekombination in einen Klonierungsvektor eingebracht wird, der erhaltene, modifizierte Vektor in einem geeigneten zellulären Wirt kloniert und die Hybridisierungssonde wiedergewonnen wird.
31. Verfahren zum Nachweis von Antigenen eines HIV-3-Retrovirus nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß eine Obeffläche mit einer gegen HIV-3 erzeugten Immunglobulin-Fraktion beschichtet wird, eine Körper- oder Kulturflüssigkeit, die analysiert werden soll, mit den Immunglobulinen in Kontakt gebracht und der zwischen den Immunglobulinen und dem Antigen gebildete Komplex nachgewiesen wird.
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