DE3752319T2 - Prozess zur rekombinanten Herstellung von HIV-2 - Proteinen sowie Zellen, die HIV-2 - Proteine exprimiert - Google Patents
Prozess zur rekombinanten Herstellung von HIV-2 - Proteinen sowie Zellen, die HIV-2 - Proteine exprimiertInfo
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Description
- Diese Patentanmeldung ist eine Teilanmeldung zu der Anmeldung EP 87/40 0 151.4, eingereicht am 22.01.1987.
- Die Erfindung betrifft eine neue Klasse von Viren, welche die Fähigkeit haben, Lymphadenopathien hervorzurufen, die in der Folge das Syndrom der erworbenen Immunschwäche (AIDS) beim Menschen nach sich ziehen können. So werden Antigene beschrieben, die durch Antikörper erkannt werden können, die beim Menschen durch diese neue Klasse von Viren induziert werden, und die Antikörper, die durch aus diesen Viren gewonnene Antigene induziert werden.
- Die Anmeldung beschreibt außerdem Sequenzen von klonierter DNS, die entweder eine Sequenzanalogie oder eine Komplementarität zu der genomischen RNS des genannten Virus aufweisen. Sie beschreibt auch Verfahren zur Herstellung dieser Sequenzen von klonierter DNS.
- Die Patentanmeldung beschreibt auch Polypeptide, welche Aminosäuresequenzen enthalten, die durch die Sequenzen von klonierter DNS kodiert werden, wie auch Anwendungen dieser Antigene für die in vitro- Diagnose des möglichen Vorhandenseins bestimmter AIDS-Formen beim Menschen und, was bestimmte unter diesen betrifft, für die Herstellung von immunogenen Zusammensetzungen und von Impfstoffzusammensetzungen gegen dieses Retrovirus. Desgleichen beschreibt die Anmeldung die Anwendungen der genannten Antikörper zu denselben Zwecken und für bestimmte unter ihnen deren Anwendung zur Herstellung von Arzneimittelwirkstoffen gegen diese menschlichen AIDS-Formen.
- Die Erfindung beschreibt schließlich die Verwendung der Sequenzen von klonierter DNS und von Polypeptiden, die ausgehend von diesen Sequenzen erhalten werden, als Sonden in Kits für Diagnosezwecke.
- Die Isolierung und die Charakterisierung eines ersten als LAV bezeichneten Retrovirus, das als für die Entwicklung von AIDS verantwortlich erkannt worden war, war Gegenstand einer Beschreibung in einem Artikel von F. BARRE-SINOUSSI et al., 1983 (Science, Band 220, Nr. 45-99, 20, S. 868-871. Die Anwendung bestimmter Extrakte dieses Virus und insbesondere von bestimmten seiner Proteine zur Diagnose der Anwesenheit von Antikörpern gegen das Virus wurde eingehend in der Europäischen Patentanmeldung Nr. 138.667 beschrieben. Seither wurden andere ähnliche Stämme und Varianten des LAV isoliert. Es sei hier nur an jene unter den Bezeichnungen HTLV-III und ARV Bekannten erinnert.
- In Anwendung der neuen Nomenklaturregeln, die in Nature im Mai 1986 veröffentlicht wurden, sollen die Retroviren, die beim Menschen die oben erwähnten Lymphadenopathien und AIDS auszulösen vermögen, insgesamt durch "HIV", Abkürzung des englischen Ausdrucks "Human immunodeficiency Virus" (oder menschliches Immundefektvirus) bezeichnet werden. Die durch LAV und diese Varianten gebildete Untergruppe der Retroviren wurde ursprünglich durch die Ausdrücke "LAV Typ I" oder "LAV-I" bezeichnet. Eben diese Untergruppe wird nachfolgend durch die Bezeichnung HIV-1 bezeichnet, wobei beabsichtigt ist, daß der Ausdruck LAV noch beibehalten wird, um jenen unter den Retrovirusstämmen zu bezeichnen (insbesondere LAAV, IDAV-1 und IDAV-2), der zur Klasse der HIV-1-Viren gehört, die in der oben genannten Europäischen Patentanmeldung 138.667 beschrieben und in den nachfolgend beschriebenen Vergleichsversuchen verwendet wurde, nämlich LAVBRU, der bei der Collection des Cultures Nationales de Microorganismes (CNCM) des Institut Pasteur in Paris, Frankreich, am 15. Juli 1983 unter der Nr. I-232 hinterlegt worden ist.
- Das neue Retrovirus, das den Gegenstand des vorliegenden Patents ausmacht, und die früher als "LAV Typ II" oder "LAV II" bezeichneten Virusstämme, die ihm nahestehen und die wie jenes in der Lage sind, sich in menschlichen Lymphozyten zu vermehren, werden von nun an als "HIV-2" bezeichnet, wobei beabsichtigt ist, daß auf die Bezeichnungen bestimmter Isolate von HIV-2, die nachfolgend beschrieben werden, drei Buchstaben folgen, welche sich auf die Patienten beziehen, aus denen sie isoliert worden sind.
- Man kann die Gesamtheit "HIV-2" als eine Gesamtheit von Viren definieren, die in vitro einen Tropismus für menschliche T4-Lymphozyten aufweisen und die eine zytopathogene Wirkung hinsichtlich dieser Lymphozyten haben, wenn sie sich darin vermehren, wodurch sie dann entweder generalisierte und persistente Polyadenopathien oder eine AIDS- Erkrankung verursachen. Die HIV-2-Retroviren erwiesen sich als unterschiedlich von den Viren vom Typ HIV-1 unter den weiter unten erwähnten Bedingungen. Wie diese letzteren unterscheiden sie sich von den anderen bereits bekannten menschlichen Retroviren (HTLV-I und HTLV-II) Obwohl es eine ziemlich große genetische Variabilität des Virus gibt, haben die verschiedenen HIV-1-Stämme, die bis zum heutigen Tag aus Patienten aus Amerika, Europa, Haiti und Afrika isoliert worden sind, Antigenstellen oder -sites gemeinsam, die sich auf ihren Hauptproteinen: Protein des Kerns ("core") p25 und Hüllglykoprotein gpllO sowie Transmembranprotein gp41-43, erhalten haben. Diese Verwandtschaft erlaubt beispielsweise, den Prototypstamm LAV als Quelle von Antigenen für den Nachweis von Antikörpern gegen alle Viren der Klasse HIV-1 bei allen Personen, die diese tragen, gleich welcher Herkunft, zu verwenden. Dieser Stamm wird folglich gegenwärtig zum Nachweis von anti-HIV- 1-Antikörpern bei den Blutspendern und den Patienten durch die Immunfluoreszenztechniken, insbesondere durch die als ELISA, "Western-Blot" (oder Immunabdrücke) und "RIPA", englische Abkürzung von "Radio Immunoprecipitation Assay" (Radioimmunpräzipitationsassay) bezeichneten Techniken, verwendet.
- Bei einer mit einem HIV-1-Lysat an aus Westafrika stammenden Patienten durchgeführten serologischen Untersuchung wurde jedoch festgestellt, daß bestimmte von diesen seronegative oder sehr schwach positive Reaktionen ergaben, wobei sie jedoch klinische und immunologische AIDS-Symptome zeigten. Barin, F. et al. (Lancet ii, 1387, 1985).
- Ausgehend von in Kultur genommenen Lymphozyten von einem dieser Patienten wurde ein erstes HIV-2-Retrovirus isoliert, dessen elektronenmikroskopische Struktur und Proteinprofil in der SDS-Gelelektrophorese eine gewisse Ähnlichkeit mit den entsprechenden Daten von HIV-1 zeigten. Dieses neue HIV-2-Retrovirus zeigt aber insgesamt nur eine schwache Verwandtschaft mit HIV-1 sowohl im Hinblick auf die Antigenhomologie seiner Proteine als auch die Homologie seines genetischen Materials.
- CLAVEL et al. (Bericht (Compte Rendu) der Academie des Sciences - Band 302, April 1986) berichten über die Isolierung eines Retrovirus, das ähnliche morphologische und biologische Eigenschaften zu jenen des zuvor (im Mai 1983) isolierten LAV-1 aufweist, dessen Antigen- Verwandtschaft und molekulare Verwandtschaft mit LAV-1 aber sehr entfernt ist. Dieses Virus wurde bei zwei afrikanischen Patienten, die an AIDS erkrankt waren, isoliert. Die Entfernung dieses neuen Virus bezogen auf LAV-1 wird durch das Fehlen einer Reaktion während Hybridisierungsversuchen mit einer LAV-1-Sonde unter stringenten Bedingungen bestätigt.
- CLAVEL et al. (Nature, Band 324, 18-25, Dezember 1986) beschreiben die Ergebnisse der Klonierungsarbeiten und kommen zu dem Schluß, daß die Proteine von HIV-1 und HIV-2 unterschiedliche Größen haben und daß deren serologische Kreuzreaktivität auf das Hauptprotein des Kerns beschränkt ist, während das Hüllglykoprotein von HIV-2 durch für HIV-1 positive Seren nicht immunpräzipitiert wird. Die Ergebnisse der Hybridisierungsversuche zwischen dem Genom von HIV-1 und jenem von HIV-2 bestätigen, daß HIV-2 keine Variante von HIV-1 ist, daß diese Retroviren tatsächlich unterschiedlich sind.
- Brun-Vezinet et al. (The Lancet, 1987, Seiten 128-132) beschreiben die Charakterisierung von HIV-2-Isolaten und beschreiben die Antigene des HIV-2-Retrovirus wie auch Kreuzreaktionsuntersuchungen zwischen den Antigenen von HIV-1 und den Antigenen von HIV-2.
- Dieses neue Retrovirus oder Retroviren, die äquivalente Antigeneigenschaften und immunologische Eigenschaften aufweisen, können folglich Antigenquellen bilden für die Diagnose der Infektion durch dieses Virus und Varianten, die eine AIDS-Erkrankung auslösen, vom Typ von jener, die erstmals bei erkrankten Personen aus Afrika oder Personen nach einem Aufenthalt in Afrika beobachtet wurde.
- Die erste Isolierung dieses Virus erfolgte ausgehend von dem unter Heparin abgenommenen Blut einem 28jährigen heterosexuellen Kranken Person, der niemals eine Transfusion erhalten hatte und die nicht toxikoman war. Er zeigte seit 1983 eine starke chronische Diarrhoe, magerte stark ab (um 17 kg) mit intermittierendem Fieber. Unlängst wies er Infektionen durch Candida und Serratia auf, was eine für AIDS typische oesophagiale Candidose hervorrief.
- Dieser Patient zeigte außerdem Anämie, kutane Anergie, Lymphopenie, ein Verhältnis T4-Lymphozyten/T8-Lymphozyten von 0,15 mit einer T4-Lymphozytenzahl von unter 100 pro mm³ Serum. Seine in Kultur befindlichen Lymphozyten reagierten nicht auf die Stimulierung durch Phytohämagglutinin und Concanavalin A. Bei dieser erkrankten Person diagnostizierte man gleichfalls rezidivierende Bakteriämien, verursacht durch S. enteritidis, Kryptosporidiosen, Infektionen durch Isospora belli und zerebrale Toxoplasmosen.
- Die Gesamtheit dieser Symptome entsprach den "AIDS-related Complex"-Symptomen oder "ARC" (englische Abkürzung von "AIDS Related Complex") vom Typ von jenen, die durch das HIV-1-Virus verursacht werden. Diese unterschiedlichen Beobachtungen entsprachen gleichfalls den vom Centre de Contröle des Maladies (Center of Disease Control oder CDC) in Atlanta, Vereinigte Staaten, angewandten Kriterien.
- Das In-Kultur-Nehmen der Lymphozyten dieser erkrankten Personen und die Isolierung des Retrovirus erfolgten gemäß der bereits für die Isolierung von HIV-1 in dem Artikel von BARRE-SINOUSSI et al. (1) und in der Europäischen Patentanmeldung Nr. 84 401834/0 138 667 beschriebenen Technik. Nachfolgend wird sie kurz erwähnt. Während 3 Tagen durch Phytohämagglutinin (PHA) stimulierte Lymphozyten wurden in RPM1-16-40- Kulturmedium, dem 10% fötales Kälberserum und 10&supmin;&sup5; M β-Mercaptoethanol zugesetzt worden war, gezüchtet.
- Die Virusproduktion wurde durch dessen Reverse Transkriptase- Aktivität verfolgt. Im Kulturüberstand erschien der Peak/Spitzenwert der viralen Aktivität zwischen dem 14. und dem 22. Tag, danach wurde diese geringer. Es wurden der Verfall und das Absterben der Zellkultur verfolgt. Wie bei HIV-1 zeigten Schnitte von durch HIV-2 infizierten Lymphozyten im Elektronenmikroskop zur Reife gelangte Virionen und auf der Oberfläche der infizierten Zellen knospende Virusteilchen. Die für die Kultivierung dieser isolierten Viren eingesetzten Zelllinien können je nach Fall die Zelllinien vom Typ HUT, CEM, MOLT oder jede T4- Rezeptoren tragende, unsterblich gemachte Lymphozytenlinie sein.
- Das Virus wurde dann auf Lymphozytenkulturen von Blutspendern, danach auf kontinuierlichen Linien leukämischen Ursprungs, wie HUT 78, propagiert bzw. vermehrt. Es wurde durch seine Antigene und seine Nukleinsäure als deutlich von HIV-I verschieden charakterisiert. Das Virus wurde gereinigt, wie in den bereits erwähnten älteren Dokumenten beschrieben. Ein erstes Isolat dieses Virus wurde bei der C. N. C. M am 19. Dezember 1985 unter der Nr. I-502 hinterlegt. Es wurde später mit dem Namen LAV-II MIR bezeichnet. Ein zweites Isolat wurde bei der C. N. C. M. am 21. Februar 1986 unter der Nr. I-532 hinterlegt. Dieses zweite Isolat hat den Referenznamen LAV-II ROD. Nachfolgend wird zuweilen einfach auf MIR oder auf ROD Bezug genommen.
- Die Patentanmeldung beschreibt jede Variante der vorangehenden Viren oder jedes äquivalente Virus (z. B. HIV-2 IMRO und HIV-2 EHO, hinterlegt bei der CNCM am 19. Dezember 1986 unter den Nummern I-642 bzw. I-643), das Strukturproteine enthält, die die gleichen immunologischen Eigenschaften aufweisen wie diejenigen der HIV-2-Viren, hinterlegt bei der CNCM unter den Nummern I-502 oder I-532. Auf die Äquivalenzkriteriendefinitionen wird weiter unten noch näher einzugehen sein.
- Die Anmeldung beschreibt auch ein Verfahren zur Herstellung des HIV-2-Virus oder von Varianten von jenem in den von T4-Lymphozyten abgeleiteten oder den T4-Phänotyp aufweisenden permanenten Zelllinien, wobei dieses Verfahren darin besteht, diese vorab mit dem HIV-2-Virus infizierten Linien zu züchten und, insbesondere wenn das Niveau der Umkehrtranskriptase (oder Reverse-Transkriptase)-Aktivität eine bestimmte Schwelle erreicht hat, die in das Kulturmedium freigesetzten Virusmengen zu gewinnen.
- Eine in Hinblick auf die Kultur von HIV-2 bevorzugte permanente Linie ist beispielsweise vom Typ HUT 78-Zellen. Eine durch HIV-2 infizierte HUT 78-Linie wurde am 06. Februar 1986 bei der CNCM unter der Nr. I-519 hinterlegt. Die Kultur wird beispielsweise, wie folgt, vorgenommen:
- Die HUT 78-Zellen (106/ml) werden in Cokultur mit normalen menschlichen infizierten Lymphozyten (106/ml) genommen. Das Kulturmedium besteht aus RPMI 1640 mit 10% fötalem Kälberserum. Am Ende von 15 bis 21 Tagen beobachtet man eine zytopathogene Wirkung der HUT 78-Zellen. Eine Woche nach dieser Beobachtung bestimmt man die reverse Transkriptase im Kulturüberstand quantitativ. Dann kann man beginnen, das Virus ausgehend von diesem Überstand zu gewinnen.
- Eine andere für die Kultur bevorzugte Linie gehört zu den unter der Bezeichnung CEM bekannten Zelllinien.
- Die Infektion, dann die Kultur der infizierten CEM-Zellen können insbesondere, wie folgt, vorgenommen werden.
- Man nimmt die Cokultur von vorab mit dem HIV-II-Virus infizierten T4-Lymphozyten und von nicht infizierten Zellen der Linie CEM während der für die Infektion der CEM notwendigen Zeitdauer vor. Man verfolgt überdies dann die Kulturbedingungen in einem geeigneten Medium, beispielsweise jenem, das nachfolgend beschrieben wird, weiter und, wenn die reverse Transkriptase-Aktivität der infizierten Zellen ein ausreichendes Niveau erreicht hat, gewinnt man das produzierte Virus ausgehend von dem Kulturmedium.
- Es erfolgte insbesondere eine Cokultur von menschlichen T4- Lymphozyten, die fünf Tage zuvor mit einem HIV-II-Virus-Stamm, der von einem nachfolgend als "ROD" bezeichneten Patienten stammte, infiziert worden waren, einerseits und von CEM andererseits unter den nachfolgend präzisierten Bedingungen.
- Es erwies sich, daß die zuvor durch Phytohämagglutinin aktivierten infizierten T4-Lymphozyten eine reverse Transkriptase-Aktivität von 5000 cpm/106 normale T-Lymphozyten drei Tage nach dem Beginn der Infektion aufwiesen. Die Kultur wurde weiterverfolgt, bis die gemessene reverse Transkriptase-Aktivität im Überstand 100 000 cpm erreicht hatte. Diese T4-Lymphozyten wurden dann mit den CEM-Zellen (3 · 10&sup6; normale infizierte T-Lymphozyten) in Kontakt gebracht und in dem folgenden Kulturmedium inkubiert: RPMI 1640, enthaltend 2,92 mg/ml L-Glutamin, 10% dekomplementiertes fötales Kälberserum, 2 ug/ml Polybren, 0,05% Anti- Interpheron-a-Serum, 100 000 ug/ml Penicillin, 10 ug/ml Streptomycin und 10 000 ug/ml Neomycin.
- Das Kulturmedium wurde zweimal wöchentlich gewechselt.
- Die Werte für die reverse Transkriptase-Aktivität, gemessen im Überstand, waren die folgenden:
- - am Tag 0: 1 000 (Grundrauschen)
- - am Tag 15: 20 000
- - am Tag 21: 200 000
- - am Tag 35: 1 000 000.
- Eine durch das HIV-2-Virus infizierte CEM-Kultur wurde bei der Collection Nationale de Culture de Microorganismes des Institut Pasteur (C. N. C. M.) unter der Nr. I-537 am 24. März 1986 hinterlegt. Einige Eigenschaften der Antigene und der Nukleinsäuren, die am Aufbau von HIV-2 beteiligt sind, ergeben sich aus den Versuchen, die unter den nachfolgend angegebenen Bedingungen ausgeführt wurden. Sie werden häufig durch Vergleich mit Eigenschaften des gleichen Typs, die sich auf andere Retrovirus-Typen, insbesondere HIV-1 und SIV, beziehen, besser gewürdigt.
- Im Folgenden wird Bezug genommen auf die Figuren, in denen:
- - die Fig. 1a, 1b und 1c sich auf Kreuzimmunpräzipitierungsversuche zwischen Seren von mit HIV-1 bzw. HIV-2 infizierten Patienten und von mit STLV-III infizierten Rhesusaffen einerseits und Virusextrakten von HIV-1 andererseits beziehen.
- - die Fig. 2a und 2b Vergleichsergebnisse in Bezug auf die elektrophoretischen Mobilitäten der Proteine von HIV-1, HIV-2 bzw. STLV-III in SDS-Polyacrylamidgelen zeigen.
- - die Fig. 3 Kreuzhybridisierungsergebnisse zwischen genomischen Sequenzen von HIV-1, HIV-2 und STLV-III einerseits und Sonden, die ver schiedene subgenomische Sequenzen des HIV-1-Virus enthalten, andererseits zeigt.
- - die Fig. 4 eine Restriktionskarte der von der RNS von HIV-2 ROD abgeleiteten cDNS ist.
- - die Fig. 5 eine Restriktionskarte eines Fragments E2 der von HIV- 2 abgeleiteten cDNS ist, wobei dieses Fragment einen dem 3'-LTR-Bereich von HIV-2 entsprechenden Bereich enthält.
- - die Fig. 6 die Nukleotidsequenz eines Teils von E2 ist, wobei diese Sequenz dem Bereich U3/R von HIV-2 entspricht.
- - die Fig. 7 folgendes zeigt:
- - einerseits und schematisch Strukturelemente von HIV-1 (Fig. 5A) und in Ausrichtung mit einem den 3'-LTR von HIV-1 enthaltenden Bereich die von dem Bereich E2 der cDNS von HIV-2 abgeleitete Sequenz und
- - andererseits die Ausrichtung der gemeinsamen Nukleotide, die jeweils in der von dem Bereich E2 von HIV-2 abgeleiteten Sequenz und in der entsprechenden Sequenz von HIV-1 enthalten sind, unter Vornahme einer bestimmten Anzahl von Deletionen und Insertionen (Fig. 5 B)
- - die Fig. 8 schematisch die Strukturen mehrerer Klone eines X- Phagen, der durch verschiedene von der von HIV-2 abgeleiteten cDNS stammende Inserts modifiziert worden ist, zeigt (Klone ROD4, ROD27 und ROD35); es sind gleichfalls schematisch in ein Plasmid pvc 18 subklonierte Sequenzen gezeigt, die ihrerseits von ROD4, ROD27 und ROD35 abgeleitet sind, wobei diese letzteren Sequenzen in Übereinstimmung mit den Bereichen ROD4, ROD27 und ROD35, von denen sie jeweils abstammen, angeordnet wurden.
- - die Fig. 9 die relativen Hybridisierungsintensitäten zwischen
- a) elf ausgehend von verschiedenen Bereichen des vollständigen HIV-1-Genoms entnommenen Fragmenten (schematisch dargestellt im unteren Teil der Figur einerseits und der cDNS von HIV-2, die in ROD4 enthalten ist, andererseits, und
- b) von HIV-II stammenden Fragmenten mit derselben cDNS zeigt.
- Allgemein stammen die in den Vergleichstests, deren Beschreibung folgt, verwendeten HIV-2-Antigene von dem Stamm HIV-2 MIR ab, der bei der C. N. C. M. unter der Nr. I-502 hinterlegt worden ist, und die von der genomischen DNS von HIV-2 abgeleiteten DNS-Sequenzen stammen von dem Stamm HIV-2 ROD ab, der bei der C. N. C. M. unter der Nr. I-532 hinterlegt worden ist.
- Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von einem der Proteine von HIV-2 (p12, p16 oder p26) oder von einem Protein, das die Struktur von gp140 hat, oder von bestimmten Teilen dieser Proteine, wobei dieses Verfahren gekennzeichnet ist durch die Insertion der entsprechenden Nukleinsäuresequenz in einen Vektor, der in der Lage ist, einen ausgewählten zellulären Wirt zu transformieren und die Expression eines in diesem Vektor enthaltenen Inserts zu erlauben, durch die Transformation dieses ausgewählten Wirts durch den genannten Vektor, der die genannte Nukleinsäuresequenz enthält, durch die Kultur des transformierten zellulären Wirts und durch die Gewinnung und die Reinigung des exprimierten Proteins.
- Insbesondere betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Proteins oder eines Glykoproteins oder eines Protein- oder Glykoproteinteils, bestehend aus dem Expressionsprodukt einer Nukleinsäuresequenz, welche vom Genom eines Retrovirus abgeleitet ist, gekennzeichnet durch
- - die Insertion der oben genannten, von einem menschlichen HIV-2- Retrovirus, das menschliche T4-Lymphozyten infizieren kann und in der Lage ist, beim Menschen eine AIDS-Erkrankung hervorzurufen, abgeleiteten Nukleinsäuresequenz in einen Vektor, der in der Lage ist, einen ausgewählten zellulären Wirt zu transformieren und die Expression eines in diesem Vektor enthaltenen Inserts in diesem Wirt zu erlauben, wobei das genannte HIV-2-Retrovirus durch die Isolate repräsentiert wird, die bei der CNCM unter den Nummern I-502, I-532, I-642 und I-643 oder bei der ECACC unter den Nummern 87.01.1001 und 87.01.1002 hinterlegt worden sind, oder die Insertion der oben genannten Nukleinsäuresequenz, die von einer Variante dieses Retrovirus abgeleitet ist, dessen Haupthüllglykoprotein durch Antikörper, die gegen das Haupthüllglykoprotein gp140 eines HIV-2-Retrovirus gebildet worden sind, erkannt wird,
- - das Einschleusen des die genannte Nukleinsäuresequenz enthaltenden Vektors in den ausgewählten Wirt,
- - die Kultur oder das Züchten des transformierten zellulären Wirts und
- - das Gewinnen und die Reinigung des durch die genannte Nukleinsäuresequenz exprimierten Proteins oder Proteinteils, wobei das Protein oder der Proteinteil fähig ist, eine spezifische immunologische Reaktion mit gegen das HIV-2-Retrovirus gerichteten Antikörpern zu erzeugen.
- Die Erfindung hat auch eine Zellkultur zum Gegenstand, die dadurch gekennzeichnet ist, daß sie durch eine rekombinante DNS, die eine zumindest teilweise von der RNS des menschlichen Retrovirus HIV-2 oder einer seiner Varianten abgeleitete Nukleinsäureseguenz enthält, unter Bedingungen transformiert worden ist, die die Produktion eines Proteins oder eines Proteinteils gemäß dem oben beschriebenen Verfahren erlauben, wobei die Nukleinsäure die Fähigkeit hat, mit der RNS des genannten menschlichen Retrovirus HIV-2 zu hybridisieren, und unter den stringenten Bedingungen mit den Sonden 1 bis 4, die jeweils die Nukleotide 990-1070, 990-1260, 2170-2240, 3370-3640 der von dem Genom von HIV-1 abgeleiteten DNS umfassen, nicht hybridisiert.
- Das Verfahren der Erfindung kann für die Herstellung eines Proteins oder eines Proteinteils, das bzw. der in Nachweisreaktionen von Antikörpern, die gegen das HIV-2-Retrovirus gerichtet sind, verwendet werden kann, angewendet werden.
- Das anfänglich in HUT 78 gezüchtete Virus wurde metabolisch durch ³&sup5;S-Cystein und ³&sup5;S-Methionin markiert, indem die infizierten Zellen in Gegenwart dieser radioaktiven Aminosäuren in einem Kulturmedium, das die entsprechende nicht markierte Aminosäure nicht enthielt, für eine Zeitspanne von 14 bis 16 Stunden inkubiert wurden, insbesondere gemäß der Technik, die in dem unter (21) in der am Ende der Beschreibung angegebenen Bibliographie aufgeführten Artikel beschrieben ist, was die Markierung mit ³&sup5;S-Cystein betrifft. Dann wird der Überstand geklärt, danach das Virus eine Stunde bei 100 000 g auf einem Kissen von 20% Saccharose ultrazentrifugiert. Die Hauptantigene des Virus werden durch Elektrophorese in einem Polyacrylamidgel (12,5%) unter denaturierenden Bedingungen (SDS) oder in einem Gel von Polyacrylamid (10%) und Bisacrylamid (0,13%) mit SDS (0,1% Endkonzentration) aufgetrennt. Als Referenzmolekulargewicht verwendet man die folgenden gefärbten Marker:
- BRL:
- Myosin: 200 kd
- Phosphorylase B: 97,4 kd
- RSA (BSA): 68 kd
- Ovalbumin: 43 kd
- α-Chymotrypsin: 25,7 kd
- β-Lactoglobulin: 18,4 kd
- Lysozym: 14,3 kd
- In anderen Versuchen wurden andere Molekulargewichtsmarker eingesetzt. Es wird insbesondere Bezug genommen auf die Fig. 1a, 1b und 1c, die auf andere bekannte Molekulargewichtsmarker (in diesen Figuren unter dem Buchstaben M.) hinweisen. Die Antigene werden noch besser unterschieden nach Immunpräzipitation (RIPA) oder durch Immunabdrücke (Western-Blot) unter Verwendung der im Serum der erkrankten Personen vorhandenen Antikörper: ihre durch deren apparente Migration/Wanderung ermittelten apparenten Molekulargewichte kommen jenen der Antigene von HIV-1 sehr nahe.
- Allgemein wird darauf hingewiesen, daß im nachfolgenden die Ziffern, die auf die Angaben "p" und/oder "gp" folgen, den annähernden Molekulargewichten der entsprechenden Proteine und/oder Glykoproteine, geteilt durch 1000, entsprechen. So hat z. B. p36 ein Molekulargewicht in der Größenordnung von 36 000. Es versteht sich jedoch dabei, daß diese Molekulargewichtswerte in einem Bereich von bis zu 5%, ja sogar 10% oder darüber schwanken können, je nach den für die Bestimmungen dieser Molekulargewichte eingesetzten Techniken.
- Die Wiederholung der Versuche hat eine genauere Bestimmung der apparenten Molekulargewichte der HIV-2-Antigene ermöglicht. So wurde festgestellt, daß die Molekulargewichte der drei Proteine des Kerns ("core"), denen anfänglich Molekulargewichte in der Größenordnung von 13 000, 18 000 bzw. 25 000 zugeschrieben wurden, tatsächlich apparente Molekulargewichte aufwiesen, die näher an den folgenden Werten waren: 12 000, 16 000 bzw. 26 000. Diese Proteine werden nachfolgend jeweils mit den Abkürzungen p12, p16 und p26 bezeichnet.
- Ebenso die Existenz von Protein- oder Glykoproteinbanden, für deren apparente Molekulargewichte Werte ermittelt wurden, die sich zwischen 32 000 und 42 000 bis 45 000 bewegen können. Die Wiederholung der Messungen hat schließlich die genaue Feststellung einer Bande ermöglicht, die einem apparenten Molekulargewicht von 36 000 entspricht. Im Folgenden wird diese Bande durch die Abkürzung p36 bezeichnet. Auch wird immer wieder eine andere Bande bei 42 000 bis 45 000 (p42) beobachtet. Das eine oder das andere von p36 oder p42 bildet wahrscheinlich ein Transmembranglykoprotein des Virus.
- Immer wieder wurde ein Haupthüllglykoprotein mit einem Molekulargewicht in der Größenordnung von 130-140 kd beobachtet: dieses Glykoprotein wird nachfolgend durch den Ausdruck gp140 bezeichnet. Es ist angebracht, darauf hinzuweisen, daß die Molekulargewichte allgemein mit einer Genauigkeit von ± 5% ermittelt wurden, wobei sich diese Genauigkeit bei den Antigenen von hohem Molekulargewicht ein wenig verringern kann, wie man für das gp140 festgestellt hat (Molekulargewicht von 140 kd ± 10%). Die Gesamtheit dieser Antigene wird (wenn sie durch 35- Cystein markiert sind) durch Seren von erkrankten Personen, die anti- HIV-1-Antikörper enthalten, in den im Labor eingesetzten Nachweissystemen oder durch Einsatz der Tests, die HIV-1-Lysate einsetzen, wie jene, die von DIAGNOSTICS PASTEUR unter der Marke "ELAVIA" vertrieben werden, kaum oder überhaupt nicht erkannt. Nur das Protein p26 wurde durch derartige Seren geringfügig immunpräzipitiert. Das Hüllprotein wurde dies nicht. Das Serum der durch das neue Virus (HIV-2) infizierten erkrankten Person erkannte ein p34-Protein von HIV-1 schwach. In dem eingesetzten Nachweissystem wurden die anderen HIV-1-Proteine nicht erkannt.
- Dafür besitzt HIV-2 bestimmte Proteine, die eine bestimmte immunologische Verwandtschaft mit ähnlichen Strukturproteinen oder -glykoproteinen, die unter analogen Bedingungen ausgehend von einem Retrovirus, das unlängst ausgehend von in Gefangenschaft lebenden Rhesusaffen der Spezies der Rhesusmakaken isoliert worden ist, abtrennbar sind, aufweisen, während diese immunologische Verwandtschaft gegenüber anderen Proteinen oder Glykoproteinen dazu neigt, im Hintergrund zu bleiben. Dieses letztere Retrovirus, vor dem angenommen wird, daß es das ätiologische Agens der AIDS-Erkrankungen bei den Affen ist, wurde von den Forschern, die es isoliert haben, mit der Bezeichnung "STLV-IIImac" bezeichnet (nachfolgende bibliographische Referenzen (16-18)). Aus Bequemlichkeit der Ausdrucksweise wird es nachfolgend lediglich durch den Ausdruck "STLV-III" (oder ferner durch den Ausdruck SIV, englische Abkürzug von "Simian Immunodeficiency Virus" (Immundefektvirus des Affen)) bezeichnet.
- Ein anderes, als "STLV-IIIAGM" (oder SIVACM) bezeichnetes Retrovirus wurde bei freilebenden grünen Meerkatzen isoliert. Aber im Gegensatz zu dem Virus, das bei dem Rhesusaffen vorhanden war, scheint die Anwesenheit von "STLV-IIIACM" bei der afrikanischen grünen Meerkatze eine Krankheit vom AIDS-Typ nicht auszulösen.
- Dennoch bleibt die immunologische Verwandtschaft der Strukturproteine und -glykoproteine und folglich die Verwandtschaft von deren Nukleinsäuresequenzen von HIV-II einerseits und der Retroviren STLV-IIImac und STLV-IIIACM andererseits begrenzt. Versuche haben es erlaubt, eine erste Differenzierung zwischen den Retroviren, die den Menschen oder den Affen zu infizieren vermögen, zu etablieren; daraus geht folgendes hervor:
- - das Virus HIV-II vermehrt sich nicht chronisch in den Lymphozyten des Rhesusaffen, wenn es in vivo und unter Arbeitsbedingungen, die die Entwicklung des STLV-IIImac-Virus erlauben, wie sie von N. L. Letvin et al., Science (1985), Band 230, 71-75, beschrieben wurden, injiziert worden ist.
- Diese offensichtliche Unfähigkeit von HIV-2, sich beim Affen unter natürlichen Bedingungen zu entwickeln, erlaubt es, das HIV-II-Virus einerseits und die Isolate des STLV-III-Virus andererseits biologisch zu unterscheiden.
- Unter Einsatz der gleichen Techniken wie jene, die weiter oben genannt wurden, wurde festgestellt, daß man ausgehend von STLV-III gleichfalls erhalten kann:
- - ein Hauptkernprotein p27 mit einem Molekulargewicht in der Größenordnung von 27 Kilodalton,
- - ein Haupthüllglykoprotein gp140
- - ein wahrscheinlich transmembranales Protein p32, das bei RIPA nicht beobachtet wurde, wenn das Virus vorab durch ³&sup5;S-Cystein markiert worden war, das aber bei den Immunabdruckassays (Western-Blots) in Form breiter Banden beobachtet werden kann.
- Es hat sich gezeigt, daß das Haupthüllglykoprotein von HIV-2 immunologisch dem Haupthüllglykoprotein von STLV-III näher steht als dem Haupthüllglykoprotein von HIV-1.
- Diese Feststellungen ergeben sich nicht nur aus der Höhe der Molekulargewichte: 130-140 Kilodalton für die Hauptglykoproteine von HIV-2 und von STLV-III gegenüber ungefähr 110 für das Haupthüllglykoprotein von HIV-1, sondern auch aus dem Niveau der immunologischen Eigenschaften, da von durch HIV-2 infizierten erkrankten Personen abgenommene Seren und insbesondere gegen das gp140 von HIV-2 gebildete Antikörper das gp140 von STLV-III erkennen, während in ähnlichen Versuchen die gleichen Seren und die gleichen Antikörper von HIV-2 das gp110 von HIV-1 nicht erkennen. Die anti-HIV-1-Seren, die niemals mit dem gp140 von HIV-2 reagiert haben, präzipitieren jedoch ein durch ³&sup5;S-Cystein markiertes Protein von 26 kd, das in den Extrakten von HIV-II enthalten ist.
- Das Hauptprotein des Kerns ("core") von HIV-2 scheint ein mittleres Molekulargewicht (ungefähr 26 000) aufzuweisen, das zwischen jenem des p25 von HIV-1 und des p27 von STLV-III liegt.
- Diese Beobachtungen ergeben sich aus Versuchen, die mit ausgehend von HIV-2, isoliert aus einem der oben erwähnten Patienten, erhaltenen Virusextrakten ausgeführt wurden. Ähnliche Ergebnisse wurden mit Virusextrakten von HIV-2, isoliert aus dem zweiten Patienten, erhalten.
- Mit HIV-1, HIV-2 bzw. STLV-III infizierte Zellen wurden in einem Medium, das 200 uCi/ml ³&sup5;S-Cystein in einem Medium, das kein nicht markiertes Cystein enthielt, enthielt, während 16 Stunden inkubiert. Die geklärten Überstände wurden bei 60 000 g während 90 min zentrifugiert. Die Bodensätze wurden in einem RIPA-Puffer (1) lysiert, mit verschiedenen Seren immunpräzipitiert, dann einer Elektrophorese auf einem mit Natriumdodecylsulfat versetzten Polyacrylamidgel (SDS-PAGE) unterworfen.
- Die beobachteten Ergebnisse werden durch die Fig. 1a, 1b und 1c veranschaulicht.
- In der Fig. 1a sind die Immunpräzipitationsergebnisse angegeben, die zwischen einem ausgehend von einer Zelllinie CEM C1.13 erhaltenen Virusextrakt von HIV-1 und den jeweiligen folgenden Seren beobachtet werden:
- - positives anti-HIV-1-Serum (Bahn 1),
- - von dem weiter oben erwähnten ersten Patienten erhaltenes Serum (Bahn 2),
- - Serum eines afrikanischen gesunden Trägers von anti-HIV-1- Antikörpern (Bahn 3),
- - ausgehend von einem mit STLV-III infizierten Makaken erhaltenes Serum (Bahn 4) und
- - Serum des oben erwähnten zweiten Patienten (Bahn 5).
- In der Fig. 1b werden die Immunpräzipitationsergebnisse angegeben, die zwischen den ausgehend von dem ersten Patienten nach vorab erfolgter Kultur auf HUT-78-Zellen erhaltenen Antigenen von HIV-2 und verschiedenen Seren, insbesondere dem Serum des oben erwähnten ersten Patienten (Bahn 1), dem positiven anti-HIV-1-Serum (Bahn 2), dem Serum des durch STLV-III infizierten Makaken (Bahn 3), dem Serum des oben genannten zweiten Patienten (Bahn 4), beobachtet werden.
- Schließlich veranschaulicht die Fig. 1c die Ergebnisse einer Immunpräzipitation, die zwischen den Antigenen eines STLV-III-Isolats, erhalten aus einem ein Affen-AIDS aufweisenden Makaken, beobachtet werden. Die eingesetzten Seren, auf die sich die Bahnen 1 bis 5 beziehen, sind die gleichen wie jene, die weiter oben in Bezug auf die Fig. 1a angegeben wurden.
- M bezieht sich auf die Marker Myosin (200 kd), Galactosidase (130 kd), Rinderserumalbumin (69 kd), Phosphorylase B (93 kd), Ovalbumin (46 kd) und Carboanhydrase (30 kd).
- Die Fig. 2a und 2b zeigen die Vergleichsergebnisse hinsichtlich der elektrophoretischen Mobilitäten der Proteine von HIV-1, HIV-2 und STLV-III.
- Die Fig. 2a bezieht sich auf die Versuche, die mit durch ³&sup5;S- Cystein markierten Virusextrakten nach Immunpräzipitation auf SDS-PAGE ausgeführt wurden. Die verschiedenen Bahnen beziehen sich auf die folgenden Virusextrakte: aus dem Patienten 1 erhaltenes Virus, das durch das von demselben Patienten stammende Serum immunpräzipitiert worden ist (Bahn 1), Extrakt des gleichen Virus, immunpräzipitiert mit einem negativen Vergleichsserum, das von einer Person, die keine anti-HIV-1- oder anti-HIV-2-Antikörper trägt, stammt, (Bahn 2), Extrakt von STLV- III-Virus, immunpräzipitiert durch ein von einem durch STLV-III infizierten Makaken stammendes Serum (Bahn 3), Immunpräzipitationen, die zwischen Extrakten des gleichen Virus und einem negativen Vergleichsserum, einem Extrakt von HIV-1, der durch ein Serum eines AIDS-infizierten europäischen Patienten immunpräzipitiert worden ist, beobachtet werden (Bahn 4).
- Die Fig. 1b zeigt die Ergebnisse, die in Western-Blot-Versuchen (Immunabdruck-Versuchen) erhalten wurden. Von nicht infizierten oder infizierten HUT-78-Zellen stammende Zelllysate wurden einer SDS-PAGE- Elektrophorese unterworfen, dann elektrophoretisch auf einen Nitrocellulosefilter transferiert, bevor man sie mit dem Serum des ersten oben erwähnten Patienten (Serum 1/100 verdünnt) reagieren ließ. Der Nitrocellulosefilter wurde dann gewaschen und der Nachweis der gebundenen Antikörper mit durch ¹²&sup5;I markiertes anti-menschliches IgG von der Ziege durchgeführt.
- Die in den Bahnen 1, 2 und 3 beobachteten Flecken beziehen sich jeweils auf die Agglutinationsassays zwischen dem genannten Serum und Extrakten von nicht infizierten HUT-78-Zellen (Bahn 1), Extrakten von mit einem HIV-2-Virus infizierten HUT-78-Zellen (Bahn 2) und Extrakten von durch STLV-III infizierten HUT-78-Zellen (Bahn 3). Die Zahlen, die an den Rändern von jeder der Bahnen erscheinen, entsprechen den annähernden Molekulargewichten der repräsentativsten Virusproteine (Molekulargewichte in Kilodalton).
- Die RNS des Virus, abgeschieden auf einen Filter gemäß der "Spot- Blot"-Technik, hybridisierte unter stringenten Bedingungen mit der DNS von HIV-1 nicht.
- Unter "stringenten Bedingungen" versteht man: die Bedingungen, bei denen die Hybridisierungsreaktion zwischen der RNS von HIV-2 und der ausgewählten, mit ³²P radioaktiv markierten (oder auf unterschiedliche Weise markierten) Sonde, dann die Wäschen der Sonde vorgenommen werden. Die Hybridisierung auf einer Membran erfolgt bei 42ºC in Gegenwart einer wäßrigen Lösung mit 50% (Vol./Vol.) 0,1% SDS/5 · 55c, insbesondere Formamid während 18 Stunden. Die Membran, auf der die Hybridisierungsreaktion vorgenommen wurde, wird dann bei 65ºC in einem Puffer, der 0,1% SDS und 0,1 · SSC enthält, gewaschen.
- Unter "nichtstringenten Bedingungen" versteht man die Bedingungen, bei denen die Hybridisierungsreaktion und die Wäschen vorgenommen werden. Die Hybridisierung erfolgt durch Inkontaktbringen mit der ausgewählten, mit ³²P markierten (oder auf andere Weise markierten) Sonde, nämlich bei 42ºC in einem Puffer 5 · SSC, 0,1% SDS, enthaltend 30% Formamid, während 18 Stunden. Das Waschen der Membran erfolgt bei 50ºC mit einem Puffer, der 0,1% SDS und 2 · SSC enthält.
- Es wurden gleichfalls Hybridisierungsversuche mit einer Hybridisierungssonde, gebildet aus einem rekombinanten pBT1-Plasmid, erhalten durch Klonierung der aus λJ19 stammenden DNS von HIV-1 (Cell 1985, Band 40, S. 9) in den Vektor pUC18, ausgeführt. Bei nichtstringenten Bedingungen wurde lediglich eine sehr schwache Hybridisierung zwischen der RNS von HIV-2 und der klonierten, von HIV-1 abgeleiteten DNS beobachtet.
- Von anderen Sonden, die klonierte HIV-1-Sequenzen enthalten, wurden verwendet:
- a) ausgehend von Subklonen des HIV-1-Genoms erstellte und in den Phagen M13 insertierte einzelsträngige Sonden der subgenomischen DNS von HIV-1. Die klonierten Bereiche betreffen das Gen Protease oder das Gen "Endonuklease".
- Nur eine Sonde des Endonukleasebereichs von HIV-1 (Sequenz von Nukleotiden zwischen den Basen Nr. 3760 und 4130) lieferte bei nichtstringenten Bedingungen eine schwache Hybridisierung mit HIV-2. Die Sonde "Protease" (Sequenz von HIV-1-Nukleotiden zwischen den Basen Nr. 1680 und 1804) hybridisierte sogar bei nichtstringenten Bedingungen mit HIV-2 nicht.
- b) eine Sonde pRS3, gebildet durch die den "Hüllºbereich von HIV-1 kodierende Sequenz (Subklonierung in pUC18), ergab bei nichtstringenten Bedingungen keine Hybridisierung mit HIV-2.
- Die "Spot-Blot"-Technik wird auch als "Dot-Blot" (Transfer durch Flecken) bezeichnet.
- Zusätzliche Hybridisierungsergebnisse zwischen genomischen RNS von HIV-1, HIV-2 und STLV-III einerseits und Sonden, die unterschiedliche subgenomische Sequenzen des HIV-1-Virus enthalten, andererseits sind in Fig. 3 dargestellt.
- Die Überstände der verschiedenen Kulturmedien (in einer Menge von 0,5 bis 1 ml für jeden Fleck) wurden während 5 min bei 45 000 Umdrehungen pro Minute zentrifugiert; die Bodensätze wurden in einem 0,1% SDS enthaltenden NTE-Puffer resuspendiert und auf einen Nitrocellulosefilter abgeschieden. Jener wurde in einem Medium 2 · SSC (NaCl 0,3 M, Natriumcitrat 0,03 M) vorgequollen. Nach Backen (während 2 h bei 80ºC) wurden die Filter mit verschiedenen Sonden, die genomische Subfragmente von HIV-1 enthielten, unter nichtstringenten Bedingungen (30% Formamid, 5 · SSC, 40ºC) hybridisiert, mit einer Lösung 2 · SSC, enthaltend 0,1% SDS, bei 50ºC gewaschen, dann während 48 h bei -70ºC mit Verstärkungsschirmen autoradiographiert.
- Die Sonden 1-4 sind einzelsträngige Sonden, erhalten durch die "prime cut"-Methode, wie in (25) beschrieben. Dabei wurden einzelsträngige, von dem M13-Virus stammende Fragmente, die subgenomische HIV-I- Inserts trugen (30), an Oligomerfragmente (17 Nukleotide), die von M13 stammten (BIOLABS), ligiert. Der Komplementärstrang wurde dann mit dem Klenow-Enzym in einem TM-Puffer (Tris 10 mM, pH 7,5, MgCl&sub2;, 10 mM) in Gegenwart von dATP, dGTP, dTTP und dCTP, markiert in alpha-Position durch ³²P (Amersham, 3000 Ci/mmol), synthetisiert. Die DNS wurde dann durch die geeigneten Restriktionsenzyme verdaut, hitzedenaturiert und einer Elektrophorese auf einem denaturierenden Polyacrylamidgel (enthaltend 6% Acrylamid, 8 M Harnstoff in einem TDE-Puffer) unterworfen. Das Gel wurde dann während 5 min autoradiographiert. Die Sonde wurde dann ausgeschnitten und in einen Puffer von NaCl, 300 mM, SDS, 0,1% eluiert. Die spezifischen Aktivitäten (AS) dieser einzelsträngigen Sonden wurden zu 5·10&sup8;-10&sup9; Zerfälle pro Minute/Mikrogramm (dpm/ug) geschätzt.
- Die in den verschiedenen Sonden enthaltenen charakteristischen Sequenzen sind die folgenden:
- Sonde 1: Nukleotide 990-1070,
- Sonde 2: Nukleotide 980-1260,
- Sonde 3: Nukleotide 2170-2240,
- Sonde 4: Nukleotide 3370-3640.
- Die vorangehenden Numerierungen der Nukleotide sind jene, die in dem unter (30) als Referenz angegebenen Artikel ins Auge gefaßt wurden. Schließlich besteht die Sonde 5 in einem pUC-18-Plasmid, das das EcoRl-Sacl-Fragment von HIV kloniert in λJ19 trägt (31), welches Gegenstand einer Nick-Translation war, um eine AS von ungefähr 10&sup8; dpm/ug zu erhalten.
- Die relativen Anordnungen der in den Sonden enthaltenen subgenomischen Fragmente gegenüber dem vollständigen Genom von HIV-1 sind schematisch in der Fig. 3 angegeben. Die verschiedenen Flecken entsprechen jeweils:
- - Fleck A: ausgehend von einer Kultur von durch HIV-1 infizierten CEM C1.13-Zellen erhaltene Viren,
- - Fleck B: ausgehend von durch STLV-III infizierten HUT-78-Zellen erhaltene Viren,
- - Flecken C und D: Isolate, die jeweils ausgehend von den Viren der zwei oben erwähnten afrikanischen Patienten erhalten wurden,
- - Fleck E: negativer Vergleichszellextrakt, erhalten ausgehend von nicht infizierten HUT-78-Zellen,
- - Fleck F: Virus, das aus einem an AIDS leidenden Patienten aus Zaire erhalten und auf normalen T-Lymphozyten in Gegenwart von TCGF kultiviert worden ist.
- Alle Flecken wurden mit einer Virusmenge entsprechend 25 000 dpm an reverse Transkriptase-Aktivität mit Ausnahme für die Flecken C: 15 000 dpm, erhalten.
- Die gemachten Beobachtungen waren die folgenden:
- Die genomischen RNS der zwei HIV-2-Isolate, erhalten ausgehend von gereinigten Viruspartikeln, hybridisierte unter den oben angegebenen stringenten Bedingungen mit keiner der Sonden, obwohl die Viruspartikel ausgehend von Überständen von Kulturen von hochgradig infizierten Zellen, was eine hohe reverse Transkriptase-Aktivität nachwies, isoliert und gereinigt worden sind.
- Unter den oben angegebenen nichtstringenten Bedingungen wurden die folgenden Beobachtungen gemacht.
- Alle Sonden hybridisierten intensiv mit den erhaltenen genomischen RNS der Vergleichspräparationen von HIV-1 und einem anderen Isolat, erhalten aus einem an AIDS leidenden Patienten aus Zaire.
- Zwei der erhaltenen Sonden (Nukleotide 990-1070 und 990-1260, die beide aus dem gag-Bereich von HIV-1 stammen) hybridisierten leicht mit den Flecken der Extrakte der HTV-2-Retroviren; nur eine dieser zwei Sonden (Nukleotide 990-1260) zeigte auch eine leichte Hybridisierung mit dem Fleck von STLV-III (Fig. 3). Was die Sonde betrifft, die ein Fragment des pol-Bereichs (Nukleotide 2170-2240) enthält, wurde eine Hybridisierung mit STLV-III und, aber auf viel geringere Weise, mit der RNS von HIV-2 beobachtet. Die andere Sonde des pol-Bereichs (Nukleotide 3370-3640) ergab keinerlei Hybridisierung mit keinem der Flecken von HIV-2 und von STLV-III.
- Schließlich hybridisierte die durch Nick-Translation modifizierte und die Gesamtheit des env-Gens und den LTR (Nukleotide 5290-9130) von HIV-1 enthaltende Sonde weder mit den RNS von STLV-III noch mit jenen von HIV-2.
- Festgestellt wurde ferner, daß eine andere Sonde, die das 5'-Ende des Leserasters von pol von HIV-1 (entsprechend dem Proteasebereich) enthielt, weder mit den RNS von HIV-2 noch mit den RNS von STLV-III hybridisierte.
- Aus dem Vorangegangenen resultiert folglich ferner, daß das HIV-2- Virus in struktureller Hinsicht weiter von dem HIV-1-Virus entfernt erscheint als von STLV-III. Gleichwohl unterscheidet sich HIV-2 signifikant von STLV-III, was aus den unterschiedlichen Ergebnissen hervorgeht, die beobachtet wurden, was das Infektionsvermögen der HIV-2-Viren betrifft, das bei den Affen praktisch Null ist verglichen mit dem bestimmten Infektionsvermögen der STLV-III bei den gleichen Affenspezies.
- Die Restriktionskarten und die Sequenzen der genomischen RNS von HIV-2 oder der ausgehend von diesen genomischen RNS erhaltenen cDNS sind für den Fachmann zugänglich, als die bei der C. N. C. M. hinterlegten HIV-2-Stämme nach geeigneter Vermehrung das für die Bestimmungen dieser Restriktionskarten und Nukleotidsequenzen erforderliche genetische Material in dessen Hände legen können. Die Bedingungen, unter denen die Restriktionskarte des Genoms von einem der HIV-2-Isolate dieser Erfindung erstellt wurde, und die Bedingungen, unter denen bestimmte der von diesen Genomen abgeleiteten cDNS-Teile sequenziert wurden, werden nachfolgend beschrieben.
- Die Restriktionskarte des Genoms eines für die HIV-2-Retroviren repräsentativen Retrovirus ist in der Fig. 4 angegeben. Die Restriktionskarte eines wichtigen Fragments dieser cDNS befindet sich in der Fig. 5. Schließlich wurde ein Teil dieses letzteren Fragments sequenziert.
- Diese Sequenz und eine bestimmte Anzahl der Restriktionsstellen, die sie enthält, sind in der Fig. 6 angegeben. Die gesamte klonierte cDNS - oder klonierte Fragmente dieser cDNS - können ihrerseits als spezifische Hybridisierungssonden verwendet werden.
- Die Bedingungen, unter denen die oben genannte cDNS erhalten wurde, werden nachfolgend beschrieben.
- Der erste Schritt der Herstellung dieser cDNS umfaßte die Erzeugung eines als Primer dienenden Oligo(dT) oder eines cDNS-Initiatorstrangs durch die Ausführung einer endogenen, durch ein Detergens aktivierten Reaktion an ausgehend von Überständen von infizierten CEM- Zellen erhaltenen, gereinigten Virionen unter Verwendung der reversen Transkriptase von HIV-2. Die CEM-Zelllinie war eine CD4+ Lymphoblastoid-Zelllinie, die von G. E. Foley et al. in Cancer 18: 522-529 (1965), dessen Inhalt als Teil der vorliegenden Beschreibung betrachtet wird, beschrieben worden ist. Diese eingesetzten CEM-Zellen werden mit einem ROD-Isolat, von dem sich erwiesen hat, daß es kontinuierlich bedeutende Mengen von HIV-2 erzeugt, infiziert.
- Nach der Synthese des zweiten Strangs (in Anwesenheit von Nukleotiden und einer bakteriellen DNS-Polymerase) wurden die doppelsträngi gen cDNS in einen M13-Bakteriophagen-Vektor TG130 insertiert. Es wurde eine Phagenbank von 10º rekombinanten M13-Phagen erhalten und in situ einem Screening mit einer HIV-1-Sonde unterworfen. Jene enthält ein Fragment von 1,5 kb, das von dem 3'-Ende der von der RNS des Isolats LAV abgeleiteten cDNS stammt (in Fig. 7 A gezeigt). Es wurden ungefähr 50 positive Plaques nachgewiesen, gereinigt und durch eine Kreuzhybridisierung der Inserts und Sequenzierung der Enden charakterisiert.
- Diese Vorgehensweise erlaubte die Isolierung von verschiedenen Klonen, die annähernd komplementäre Sequenzen zu dem 3'-Ende der polyadenylierten RNS des "langen terminalen Wiederholungs"-Bereichs LTR (englische Abkürzung von "long terminal repeat" von HIV-1, beschrieben von S. Wain Hobson et al. in Cell 40: 9-17 (1985), dessen Inhalt hier als Teil der Beschreibung angesehen wird, enthalten.
- Das Wichtigste der Inserts der betreffenden Gruppe von M13-Klonen, die mit dem 3'-LTR-Bereich von HIV-1 hybridisieren, ist ein mit E2 bezeichneter Klon von ungefähr 2 kb. Wie der 3'-LTR-Bereich von HIV-1 enthält der Klon E2 ein AATAAA-Signal, das sich ungefähr 20 Nukleotide stromaufwärts von einem terminalen poly-A-Abschnitt befindet, und einen 3'-LTR-Bereich, der jenem von HIV-2 entspricht. Nach partieller Sequenzierung erweist es sich, daß dieser 3'-LTR-Bereich von HIV-2 eine entfernte Verwandtschaft zu der homologen Domäne von HIV-1 aufweist.
- Die Fig. 5 ist eine Restriktionskarte des Fragments von E2 (längliche rechteckige Zone), insertiert in das Plasmid pSPE2, das es enthält. Es umfaßt einen Teil des R-Bereichs, den U3-Bereich von HIV-2. Die Figur läßt die Grenzen der Bereiche R und U3 nicht hervortreten. Die Sequenz eines Teils von E2 ist in der Fig. 6 angegeben. Darin sind die Positionen von spezifischen Restriktionsstellen angegeben. Das geringe Ausmaß an Verwandtschaft zwischen den 3'-LTR-Bereichen von HIV- 1 und HIV-2 wird durch die Fig. 7 veranschaulicht. Tatsächlich können mit Hilfe von ca. 100 Insertionen oder Deletionen nur ungefähr 50% der Nukleotide der zwei LTR in Übereinstimmung ("alignement") gebracht werden (Sequenzhomologie von ungefähr 50%). Im Vergleich dazu liegt die Sequenzhomologie der entsprechenden Regionen der amerikanischen und afrikanischen Isolate verschiedener Varianten von HIV-1 ohne Insertion noch Deletion über 95%.
- Der Klon E2 wurde als HIV-2-spezifische Sonde für die Identifizierung der von HIV-2 stammenden Sequenzen, die in anderen Klonen enthalten sind, auf Hybridisierungsfiltern verwendet. Diese Sonde weist gleichfalls genomische RNS von HIV-2 unter stringenten Bedingungen nach. Sie erlaubt ebenfalls den Nachweis durch die sogenannte "Southern-Blot"-Methode an der DNS von CEM-Zellen oder analogen Zellen, die durch ein ROD-Isolat oder andere Isolate von HIV-2 infiziert sind. Unter den gleichen Stringenzbedingungen wird in Hybridisierungsversuchen dieser Sonde mit cDNS, die von nicht infizierten Zellen oder durch HIV-1 infizierten Zellen stammen, keinerlei Signal nachgewiesen. Diese Ergebnisse bestätigten die exogene Natur von HIV-2 gegenüber HIV-1. Eine Spezies von ungefähr 10 kb, die wahrscheinlich der nichtintegrierten viralen DNS entspricht, wurde als Hauptkomponente in der nicht verdauten DNS von durch HIV-2 infizierten Zellen nachgewiesen. Eine andere DNS mit einer apparenten Größe von 6 kb, die möglicherweise einer zirkulären Form der viralen DNS entspricht, wurde ebenfalls nachgewiesen.
- Die anderen Teile des Genoms von HIV-2 wurden ebenfalls identifiziert. Zu diesem Zweck wurde eine genomische Bank in dem lambda-Phagen L47 konstruiert. Der lambda-Phage L47.1 wurde von W. A. M. Loenen et al. in Gene 10: 249-259 (1980), eine Veröffentlichung, deren Inhalt als Teil der vorliegenden Beschreibung angesehen wird, beschrieben.
- Die genomische Bank wird mit Fragmenten, erhalten durch Verdau der von der mit HIV-2ROD infizierten CEM-Zelllinie stammenden DNS nach Verdau mit dem Enzym Sau3AI, konstruiert.
- Ungefähr 2 · 10&sup6; Plaques von Rekombinanten wurden in situ mit einem Klon gescreent, der das markierte Insert E2 der cDNS von HIV-2 enthält. Auf Platten wurden zehn rekombinante Phagen nachgewiesen und gereinigt. Die Restriktionskarten von drei dieser Phagen, gekennzeichnet durch ihr Hybridisierungsvermögen in einem "Southern-Blot" mit dem Insert E2 unter stringenten Bedingungen wie auch mit subgenomischen Sonden von HIV-1 unter nicht stringenten Bedingungen.
- Es wurde ein Klon, der ein Insert von 9,5 kb trug und sich von der vollständigen viralen zirkulären DNS, die das vollständige Genom von HIV-2 enthielt, ableitete, identifiziert. Er wurde als "Lambda ROD 4" bezeichnet. Die zwei anderen Klone, Lambda ROD 27 und Lambda ROD 35, die sich von integrierten Proviren ableiten, die LTR-Sequenzen der kodierenden viralen Sequenzen und angrenzende Sequenzen zellulärer DNS tragen. Die verschiedenen Sequenzen ergeben sich aus der Fig. 8.
- Fragmente der Lambda-Klone wurden in dem Plasmidvektor pUC18 subkloniert. Die von λ ROD 4, λ ROD 27 und λ ROD 35 stammenden Fragmente bzw. Subklone in dem oben genannten Plasmidvektor erscheinen ebenfalls in der Fig. 8. Es wurden die folgenden Subklone erhalten.
- - pROD 27-5, abgeleitet von Lambda ROD 27, enthält einen Bereich von 5,2 kb des Genoms von HIV-II und angrenzende zelluläre Sequenzen (5'-LTR und kodierende virale 5'-Sequenz um eine EcoRI-Stelle herum).
- - pROD 4.8, abgeleitet von Lambda ROD 4, enthält ein Hindill- Fragment von ungefähr 5 kb. Dieses Fragment entspricht dem zentralen Teil des HIV-2-Genoms.
- pROD 27-5' und pROD 4.8 enthalten Inserts von HIV-2, die sich gegenseitig überlappen.
- pROD 4.7 enthält ein HindIII-Fragment von 1,8 kb von Lambda ROD 4; dieses Fragment ist in der 3'-Richtung bezogen auf das subklonierte Fragment in p ROD 4.8 angeordnet und enthält ungefähr 0,8 kb virale kodierende Sequenzen und einen zwischen den BamHl- und HindIII-Klonierungsstellen des linken Arms des Phagen Lambda (Lambda L 47.1) gelegenen Teil.
- pROD 35 enthält alle kodierenden HIV-2-Sequenzen in 3-Richtung bezogen auf die EcoRI-Stelle, das 3'-LTR-Ende und ungefähr 4 kb angrenzende Nukleinsäuresequenzen zellulären Ursprungs.
- - pROD 27-5' und pROD 35, die in E. coli HB 101 enthalten sind, wurden bei der CNCM am 21. November 1986 unter den Nummern I-626 bzw. I-633 hinterlegt.
- - pROD 4.7 und pROD 4.8, die in E. coli TG1 enthalten sind, wurden bei der CNCM am 21. November 1986 unter den Nummern 1-627 und 1- 628 hinterlegt.
- Das vollständige Genom von HIV-2 ROD, dessen Restriktionskarte in der Fig. 4 abgebildet ist, wurde ausgehend von pROD 35, das vorab mit EcoRI linearisiert wurde, und von pROD 27-5' rekonstituiert. Das EcoRI- Insert von pROD 27-5 wurde in der korrekten Orientierung in die EcoRI- Stelle von pROD 35 ligiert.
- Der Verwandtschaftsgrad zwischen HIV-2 und den anderen Retroviren des Menschen oder des Affen wurde durch wechselseitige Hybridisierungsversuche abgeschätzt. Die relative Homologie zwischen den verschiedenen Bereichen von Genomen von HIV-1 und von HIV-2 wurde durch Hybridisierungsversuche von Fragmenten, die aus dem klonierten HIV-1-Genom bzw. radioaktiv markiertem Lambda ROD 4 stammten, bestimmt. Die relativen Positionen dieser Fragmente (numeriert von 1 bis 11) gegenüber dem Genom von HIV-1 sind in dem unteren Teil der Fig. 9 angegeben.
- Selbst unter sehr schwach stringenten Bedingungen (Tm - 42ºC) hybridisieren die Genome von HIV-1 und HIV-2 lediglich auf Ebene ihrer jeweiligen gag,-Gene (Flecken 1 und 2), der reverse Transkriptase- Bereiche in pol (Fleck 3), der pol-Endbereiche, der Q-Gene (oder sor) (Fleck 5) und der F-Gene (oder 3'-orf) und 3'-LTR (Fleck 11). Das zum Nachweisen der ersten cDNS-Klone von HIV-2 eingesetzte HIV-1-Fragment entspricht dem Subklon des Flecks 11, der unter nicht stringenten Bedingungen relativ gut mit HIV-2 hybridisiert. Ein Signal, das von dem Fleck 5 stammt, ist das einzige, das nach einem stringenten Waschen erhalten bleibt. Das Hüllgen, der Bereich des tat-Gens und ein Teil von hol erscheinen sehr divergierend. Diese Daten wie auch die mit LTR erhaltene Sequenz (Fig. 3) zeigen, daß HIV-2 (jedenfalls auf Ebene seiner Hülle) keine Variante von HIV-1 ist.
- Man beobachtet, daß HIV-2 SIV (beschrieben von M. D. Daniel et al. in Science 228: 1201-1204 (1985), deren Inhalt als Teil der vorliegenden Beschreibung angesehen wird) näher steht als HIV-1.
- Alle Proteine von SIV einschließlich des Hüllproteins werden durch Seren von durch HIV-2 infizierten Patienten immunpräzipitiert, wohingegen die serologische Kreuzreaktivität von HIV-1 und HIV-2 auf die Proteine des Kerns beschränkt ist. Indessen können SIV und HIV-2 durch die weiter oben erwähnten Unterschiede auf Ebene der Molekulargewichte ihrer Proteine unterschieden werden.
- Was die Nukleotidsequenzen betrifft, stellt man ebenfalls fest, daß HIV-2 eine Verwandtschaft mit SIV aufweist.
- Außerdem erlaubt die Charakterisierung von HIV-2 auch, den Bereich des Hüllglykoproteins, der für die Anheftung des Virus auf der Oberfläche der Zielzellen und die spätere Internalisierung des Virus verantwortlich ist, einzugrenzen. Die Wechselwirkung erfolgt durch Vermittlung des CD4-Moleküls selbst und es scheint, daß HIV-1 und HIV-2 den gleichen Rezeptor benützen. Obwohl große Unterschiede zwischen den env- Genen von HIV-1 und HIV-2 bestehen, können die begrenzten homologen Bereiche der Hüllen der zwei HIV als Anheftungskomgonenten für einen gemeinsamen Rezeptor der T4-Lymphozyten angesehen werden. Diese Stellen sind dazu aufgerufen, die Trägerepitope der Immunogenität von Peptiden, die eingesetzt werden könnten, um beim Menschen eine Immunschutzreaktion gegen die HIV-Viren auszulösen, zu bilden.
- Vorteilhafte Sequenzen für die Bildung von Sonden in Hybridisierungsreaktionen mit dem genetischen Material von Viren oder Proviren tragenden Patienten, insbesondere zum Nachweis der Anwesenheit von HIVe-Virus-RNS in deren Lymphozyten, enthalten eine Nukleotidsequenz, die aus der Kombination des 5 kb-HindIII-Fragments von ROD 4 und dem cDNS- Fragment E2 resultiert. Die Versuche können gemäß jeglichen Methoden, insbesondere gemäß den "Northern-Blot"-, "Southern-Blot"- und "Dot- Blot"-Techniken, ausgeführt werden.
- Ergänzende Eigenschaften der Erfindung ergeben sich ferner auf nicht einschränkende Weise während der folgenden Beschreibung von Beispielen der Identifizierung von bestimmten Teilen des retroviralen Genoms und der Produktion einer bestimmten Anzahl von rekombinanten DNS unter Einsatz von verschiedenen Teilen einer von dem retroviralen Genom von HIV-2 abgeleiteten cDNS.
- DNS-Sonde für die Verwendung in den Kits zur Diagnose von HIV-2 Eine ausgehend von gereinigten Virionen erhaltene, zu der RNS des Genoms komplementäre cDNS wurde gemäß der folgenden Methode hergestellt:
- Der nach 48 h Kultur von durch ein HIV-2 ROD-Isolat von HIV-2 infizierten CEM-Zellen erhaltene Überstand wurde ultrazentrifugiert. Der das Virion enthaltende Zentrifugationsbodensatz wurde auf einem Sucrosegradienten zentrifugiert, um einen neuen Zentrifugationsbodensatz zu bilden, im wesentlichen durch die gleiche Methode wie jene, die in der bereits erwähnten Europäischen Patentanmeldung 84/401 234/0 138 667 beschrieben wurde.
- Die gereinigte HIV-2-Präparation wurde für die cDNS-Synthese verwendet, indem eine endogene, durch ein Detergens aktivierte Reaktion eingesetzt wurde.
- Zusammengefaßt, wurde die Virionenpräparation einer Reaktionsmischung, enthaltend 50 mM Tris-HCl, 5 mM MgCl&sub2;, 10 mM DTT, 0,025% des unter der Marke TRITON vertriebenen Detergens und 50 uM von jedem der 4 Desoxynukleosidtriphosphate und einen oligo(dT)-Initiator, zugesetzt. Die Reaktion wurde während 90 min bei 37ºC ausgeführt.
- Nach Phenol-Extraktion der in dem ersten Reaktionsmedium anwesenden Proteine wurde die zweite cDNS-Kette in Gegenwart von RNAse, DNS- Polymerase 1 von E. coli und 4 Desoxynukleotiden während 1 h bei 15ºC und 1 h bei 22ºC synthetisiert. Überhängende Enden wurden an dieser doppelsträngigen cDNS durch die Wirkung von T4-DNS-Polymerase erzeugt. Alle Reagenzien dieses Verfahrens sind im Handel erhältlich (cDNS-Kit der Firma AMERSHAM) und wurden wie vom Lieferanten empfohlen verwendet.
- Nach (1) Ligation von Adaptoren (Linkem), die eine EcoRl-Stelle enthielten (vertrieben von Pharmacia), an die überhängenden cDNS-Enden in Gegenwart einer T4-DNS-Ligase (vertrieben von BIOLABS), (2) Verdau dieser "Linker" durch die Restriktionsendonuklease EcoRl und (3) Entfernung der "Linker"-Fragmente durch eine AcA 34 (LKB-IBF)-Gelfiltration (unter der Marke ULTROGEL vertriebene Gelsäule) wird die cDNS in einen durch EcoRl geschnittenen Vektor M 13 TG 130 insertiert. Nach Transformation des E. coli-Stamms TG1 wurde eine cDNS-Bank erhalten. Man erhielt ungefähr 104 rekombinante M13-Plaques.
- Um in der cDNS-Bank rekombinante M13-Klone, die die cDNS von HIV-2 enthalten, zu selektieren, wurde die Plattenhybridisierungstechnik eingesetzt. Die DNS der M13-Plaques wurde auf Nitrocellulosefilter transferiert und mit subgenomischen HIV-1-Sonden, abgeleitet vom Klon "lambda J19" eines LAV- (oder HIV-)Virus, der in der Europäischen Patentanmeldung beschrieben wurde, hybridisiert. Diese Sonde umfaßte ein Insert, gebildet aus einem Abschnitt von HIV-1-DNS, der eine ungefähre Länge von 1500 Basenpaare (bp) aufwies. Dieses Insert wurde durch zwei HindIII-Restriktionsstellen im Inneren des offenen Leserasters des "env"-Gens bzw. in dem R-Segment des 3'-LTR-Endes von HIV-1 begrenzt. Diese Sonde mit einer Länge von ungefähr 1500 Basenpaaren (bp) enthielt das 3'-Ende des env-Gens, die Gesamtheit des F-Gens, das Segment U3 und einen Teil des LTR-Segments R.
- Die Sonde, die das Hindlil-Insert von 1,5 kb enthielt, wurde mit ³²P-dCTP und -dTTP (3000 Ci · 10&supmin;³ mol) durch Inkubation der Sonde in Gegenwart von Initiatoren und Klenow-DNS-Polymerase I während 4 h bei 15ºC (unter Einsatz eines Kits von AMERSHAM) markiert. Die Hybridisierungsversuche mit den cDNS-Klonen der Bank wurden während der gesamten Nacht unter Bedingungen geringer Stringenz innerhalb einer Lösung eines Hybridisierungsmediums, enthaltend 5X SSC, 5X Denhart, 25% Formamid, 100 ug/ml denaturierte Lachssperma-DNS und die markierte Sonde (2 · 10&sup7; cpm mit einer Spezifität von 109 cpm/ug) bei 37ºC ausgeführt. Die Filter wurden nacheinander drei Waschschritten unterworfen in Gegenwart der drei Lösungen, deren Zusammensetzungen nachfolgend angegeben sind:
- Wäsche Nr. 1 : 5X SSC, 0,1% SDS bei 25ºC während 4 · 15 min Wäsche Nr. 2 : 2X SSC, 0,1% SDS bei 42ºC während 2 · 30 min Wäsche Nr. 3: 0,1X SSC, 0,1% SDS bei 65ºC während 2 · 30 min.
- Jeder Wäsche folgte eine Autoradiographie der Filter.
- Nach der Wäsche Nr. 1 wurden mehrere positive Klone nachgewiesen und wurden dies ferner nach der Wäsche Nr. 2. Indessen verschwanden alle Signale nach der Wäsche Nr. 3. Dies zeigt an, daß die positiven Klone lediglich eine geringe Verwandtschaft mit dem HIV-1-Genom aufwiesen, die gleichwohl ausreichend war, um die genannte Selektion zu bewirken. Die positiven Klone wurden erneut gepickt, erneut auf Platten aufgebracht und von neuem mit der gleichen Sonde unter den Stringenzbedingungen entsprechend Wäsche Nr. 1 hybridisiert. Die Hauptzahl von diesen war nach wie vor positiv.
- Die Klone wurden auch selektiert, indem eine menschliche Gesamt- DNS-Sonde unter Bedingungen mittlerer Stringenz eingesetzt wurde, und durch Hybridisierung in 5X SSC, 5X Denhart und 40% Formamid, gefolgt von einem Waschen in 1X SSC, 0,1% SDS, bei 50ºC. Keiner der zuvor positiven Klone wurde nachgewiesen und entsprach folglich nicht der spezifischen repetitiven DNS oder der cDNS der ribosomalen RNS.
- Die positiven rekombinanten M13-Klone wurden in einem flüssigen Medium gezüchtet und charakterisiert:
- Eine M13-DNS vom Einzelstrangtyp wurde ausgehend von jedem individuellen Klon erhalten und die Synthese des zweiten Strangs wurde mit einer 17-meren M13-Initiatorsequenz und dem Klenow-Enzym ausgeführt. Die Inserts wurden mittels EcoRl (BOEHRINGER) ausgeschnitten und durch Elektrophorese auf einem Agarosegel analysiert. Die Mehrzahl der Insets enthielt 200 bis 600 und 200 bp mit Ausnahme des als E2.1 bezeichneten Klons, der eine Länge von ungefähr 3kbp hatte.
- Mehrere Klone wurden partiell sequenziert, indem die Didesoxy- Methode von Sanger et al., beschrieben in Proc. Natl. Acad. Sci. 74: 5463-7 (1977), eingesetzt wurde.
- Verschiedene unabhängige Klone enthielten ähnliche Nukleotidsequenzen mit Ausnahme der poly-A-Ketten an ihren 3'-Enden, deren Längen unterschiedlich waren. Diese Ergebnisse zeigen, daß diese cDNS-Klone von der RNS-Matrize abgeleitet waren. Die detaillierte Sequenzanalyse dieser das 3'-Ende des HIV-2-Genoms umfassenden cDNS-Klone zeigte eine begrenzte Verwandtschaft mit HIV-1.
- (a) Gewinnung der genomischen RNS von HIV-2: Ein infizierter Überstand wurde zentrifugiert (50 000 Umdrehungen, 30 min). Der Bodensatz des Rückstands wurde in 10 mM Tris, pH 7,5, 1 mM EDTA, 0,1% SDS resuspendiert. Einer der Insertionsklone F1.1 wurde markiert und als Sonde für die Hybridisierung mit der genomischen RNS verschiedener Virusisolate gemäß der "Dot-Blot"-Technik verwendet.
- Die "Dot-Blot"-Technik umfaßte die folgenden Schritte:
- (i) Aufbringen der Probe (HIV-2-Lysat) in Flecken auf eine Nitrocellulosemembran, die vorab in 20X SSC (3 M NaCl, 0,3 M Natriumcitrat) vorgequollen und an der Luft getrocknet worden ist, (ii) Backenlassen der Membran während 2 h bei 80ºC und (iii) Ausführen der Hybridisierung.
- Diese Hybridisierung wurde unter Bedingungen hoher Stringenz (5X SSC, 5X Denhart, 50% Formamid bei 42ºC) ausgeführt. Ihr folgte ein Waschen in 0,1X SSC, 0,1% SDS bei 65ºC. Unter diesen Bedingungen hybridisiert die Sonde stark mit den Flecken, die von zwei unabhängigen HIV-2- Isolaten, einschließlich LAV-II ROD, von dem die klonierte cDNS stammte, stammten. Eine schwaches Hybridisierungssignal wurde mit dem durch STLV-IIImac (T-lymphotropes Affen-Virus (ebenfalls bekannt als "SIV") vom Typ III, Makaken) gebildeten Fleck nachgewiesen und keinerlei Hybridisierung wurde mit den Isolaten von HIV-1 nachgewiesen.
- Die "Southern-Blot"-Experimente, die den Klon E-2.1, der das 2 kb- Insert enthielt, als mittels 'ZP markierte Sonde einsetzten, ergaben keinerlei Hybridisierung mit DNS von nicht infizierten Zellen, wiesen aber Banden in durch HIV-2 infizierten abgelösten Zellen unter Bedingungen hoher Stringenz nach. HIV-2 zeigt einen Polymorphismus auf Ebene seiner Restriktionskarte äquivalent zu jenen der Restriktionskarten von HIV-1. Mit der vollständigen zellulären DNS von infizierten Zellen werden zwei Arten von Signalen durch die "Southern-Blot"-Methode nachgewiesen: (1) in DNS-Fraktionen mit Molekulargewichten PM von ungefähr 20 kb und mehr in dem Fall von integrierten Formen des Virus und (2) in den Fraktionen mit geringeren PM (9, 10 kb) im Fall des nicht in das Genom integrierten Virus.
- Diese Eigenschaften sind hochspezifisch für ein Retrovirus.
- Bestimmte Versuche, die an infizierten Zellen mit STLV-ITI (SIV-3) ausgeführt wurden, haben erlaubt, festzustellen, daß das Affen- Retrovirus von HIV-2 relativ entfernt ist (das Signal wird nur unter Bedingungen niedriger Stringenz nachgewiesen). Diese Experimente zeigen, daß die genannten Sonden den spezifischen Nachweis von HIV-2 erlauben.
- Der positive M13-Klon E 2-1 wurde selektiert und in einen Plasmidvektor subkloniert. Die DNS des rekombinanten M13 (TG 130)-Phagen E-2 wurde in Form einer einzelsträngigen DNS (M-13-ROD-E2), die das den 3'- Abschnitt des HIV-2-Genoms (erhalten ausgehend von HIV-2-ROD) enthaltende Insert von 2 kb enthielt, gereinigt. Dieses Insert wurde in das Plasmid pSP65, beschrieben von Melton, D. A. in 357 Nucleic Acid Res. 12: 035-7056 (1984), transferiert.
- Eine zweite Kette wurde in vitro in Anwesenheit der 17-meren Initiatorseguenz (AMERSHAM), der vier Nukleotide A,C,T,G und der DNS- Polymerase I (Klenow) konstruiert. Das EcoRl-Insert wurde durch EcoRl- Verdau ausgeschnitten und auf einem Agarosegel gereinigt, dann mit pSP65, das seinerseits vorab mit EcoRl verdaut worden war, ligiert. Die Ligationsmischung wurde eingesetzt, um den Stamm E. coli DH1 zu transformieren, und Rekombinanten wurden dank ihrer Ampicillinresistenzfähigkeit selektiert. Die identifizierten Rekombinanten wurden in LB- Medium (Luria-Medium), enthaltend 50 ug/ml Ampicillin, gezüchtet. Diese rekombinanten Plasmide wurden gereinigt und hinsichtlich des Vorhandenseins des korrekten insertierten Fragments kontrolliert.
- Einer der erhaltenen Klone, der durch die Referenz pSPE2 bezeichnet wird, wurde bei der CNCM in Paris, Frankreich, unter der Aufnahmenummer I-595 am 05. September 1986 hinterlegt.
- Die von den cDNS von HIV-2 abgeleiteten und sich in die genannte Sonde insertiert erweisenden Inserts enthielten die Nukleotidsequenz, die weiter oben in Zusammenhang mit einem Teil von E2 definiert worden ist.
- HIV-2-Virionen wurden ausgehend von 5 l eines Überstands einer Kultur einer mit einem ROD-Isolat infizierten CEM-Linie gereinigt. Ein erster cDNS-Strang wurde in Kontakt mit gereinigtem sedimentiertem Virus in Gegenwart eines Oligo(dT)-Initiators und unter Einsatz einer endogenen, durch ein Detergens aktivierten Reaktion gemäß der von Alizon et al., Nature 312: 757-760 (1984) beschriebenen Technik synthetisiert. Die cDNS-RNS-Hybride wurden durch eine Extraktion durch eine Phenol- Chloroform-Mischung und durch eine Ethanolpräzipitation gereinigt. Der zweite cDNS-Strang wurde in Gegenwart von DNS-Polymerase-I/RNAse H gemäß der von Gubler und Hoffman beschriebenen Methode erzeugt. Die Beschreibung dieses Artikels wird als Teil der vorliegenden Beschreibung angesehen.
- Die doppelsträngige cDNS wurde in Gegenwart von T4-DNS-Polymerase unter Einsatz der Bestandteile eines von AMERSHAM vertriebenen cDNS- Synthesekits mit überhängenden Enden versehen.
- Von PHARMACIA vertriebene EcoRl-Adaptoren (Linker) wurden an das Ende der cDNS angeheftet; die so modifizierte cDNS wurde nach Verdau in Gegenwart von EcoRl in einen dephosphorylierten Phagenvektor M13tg130, der seinerseits durch EcoRl verdaut worden ist, ebenfalls vertrieben von AMERSHAM, insertiert. Nach Transformation des E. coli-Stamms TG1 wurde eine cDNS-Bande erhalten. Plaques von Rekombinanten (10') wurden in situ auf Filtern, die Wiederholungen erlaubten, durch Hybridisierung mit dem Klon J19, der das bereits weiter oben erwähnte, von HIV-1 stammende Hind III-Fragment von 1,5 kb enthält, gescreent.
- Die Filter wurden in Gegenwart eines Mediums, enthaltend 5 · SSC, 5 · DENHARDT-Lösung, 25% Formamid, denaturierte Lachssperma-DNS (100 Mikrogramm/mml) bei 37ºC während 4 h vorhybridisiert, dann während 16 h in dem gleichen Puffer (Tm -42ºC) in Gegenwart eines Zusatzes von markierter Sonde (4 · 10&sup7; cbm), um eine endgültige Lösung von Hybridisierungspuffer, die 10&sup6; cpm/ml enthält, bereitzustellen) hybridisiert. Das Waschen erfolgte mit einer Lösung von 5 · SSC, 0,1% SDS bei 25ºC während 2 h (wobei es sich versteht, daß 20 · SSC einer Lösung von 3 M NaCl und 0,3 M Natriumcitrat entspricht. Die eine positive Reaktion zeigenden Plaques wurden gereinigt und die einzelsträngigen DNS von M13 wurden präpariert und deren Enden wurden gemäß der Methode von Sanger et al. sequenziert.
- Die DNS wurden aus infizierten CEM-Zellen, die kontinuierlich HIV- 1 bzw. HIV-2 produzierten, extrahiert. Proben von DNS dieser zwei Retroviren, von denen bestimmte durch 20 ug PstI verdaut wurden, andere nicht verdaut wurden, wurden einer Elektrophorese auf einem 0,8%-igen Agarosegel unterworfen und durch die "Southern"-Methode auf eine Nylonmembran transferiert. Kleine Volumen von infiziertem Überstand, wieder aufgenommen in einem 0,1% SDS enthaltenden NTE-Puffer, mit den gleichen reverse Transkriptase-Aktivitäten wurden auf Nitrocellulose, die vorab in einer 2 · SSC-Lösung vorgequollen worden war, aufgebracht.
- Eine Vorhybridisierung erfolgte in einer 50% Formamid, 5 · SSC, 5 x Denhardt und 100 mg/ml denaturierte Lachssperma-DNS enthaltenden Lösung während 4 h bei 42ºC. Eine Hybridisierung wurde in dem gleichen Puffer, dem man 10% Dextransulfat und 10&sup6; cpm/ml markiertes E2-Insert (spezifische Aktivität 10&sup9; cpm/ug) zugesetzt hatte, während 16 h bei 42ºC ausgeführt. Dann wurden zwei Waschschritte mit einer Lösung von 0,1 · SSC, 0,1% SDS während jeweils 30 min vorgenommen. Nach Exposition gegenüber einem Verstärkungsschirm während 16 h wird der Southern-Fleck in 0,4 N NaOH enthybridisiert, neutralisiert und unter den gleichen Bedingungen mit der mit 10&sup7; cpm/ug markierten HIV-1-Sonde erneut hybridisiert.
- Die DNS der durch HIV-IIROD infizierten CEM-Zellen (Fig. 2, Bahnen a und c) wird mit Sau3A partiell verdaut. Die 9-15 kb-Fraktion wurde auf einem 5-40%-igen Sucrose-Gradienten selektiert und an die BamHI- Arme des Vektors lambda L47.1 ligiert. Die nach in vitro-Verpackung und Abscheidung auf den E. coli-Stamm LA 101 erhaltenen Plaques (2 · 106) wurden in situ durch Hybridisierung mit dem Insert E2 der klonierten cDNS gescreent. Auf Platten wurden ungefähr 10 positive Klone gereinigt und auf E. coli C600 recBC vermehrt. Die Klone lambda ROD 4, ROD 27 und ROD 35 wurden amplifiziert und deren DNS durch Erstellung von deren Restriktionskarten und durch Hybridisierung durch die "Southern"-Methode mit dem HIV-II-cDNS-Klon unter stringenten Bedingungen und mit den Son den gag-pol von HIV-1 unter nicht tringenten Bedingungen charakterisiert.
- Die Fig. 8 zeigt schematisch die Strukturen von 3 der erhaltenen rekombinanten Phagen ROD 4, ROD 27 und ROD 35.
- Die rechteckigen länglichen Bereiche dieser Schemata entsprechen proviralen Sequenzen, die von den DNS der anfänglich infizierten CEM- Zellen stammen, wobei die weißen Bereiche retroviralen Bereichen, die punktierten Bereiche Bereichen der zellulären DNS und die geschwärzten Bereiche dem LTR in den viralen Frequenzen entsprechen.
- Die feinen, durch die Buchstaben L und R bezeichneten Linien entsprechen den von dem Vektor des Phagen Lambda L47.1, der für die Klonierung diente, stammenden Armen.
- Bestimmte der Restriktionsstellen sind ebenfalls angegeben: es handelt sich insbesondere um die folgenden Stellen:
- B: BamHI; E: EcoRI; H: Hindill; K: KonI; Ps: PstI; Pv: PvuII; S. SacI; X: XbaI.
- Diese viralen Sequenzen haben Abschnitte mit der Sequenz E2 gemeinsam. Die relativen Positionen dieser durch Hybridisierung mit E2 bestimmten Abschnitte ergeben sich ebenfalls in den Figuren.
- ROD 4 ist von einer zirkulären viralen DNS abgeleitet. ROD 27 und ROD 35 sind von in eine zelluläre DNS-Struktur integrierten Proviren abgeleitet.
- Schließlich kann man in diesen Figuren die unter den weiter oben angegebenen Bedingungen subklonierten Inserts und deren relative Positionen gegenüber den entsprechenden Sequenzen von ROD 4, ROD 27 und ROD 35 ersehen.
- Es handelt sich insbesondere um die Inserts der Plasmide pROD 27- 5', pROD 35-3', pROD 4.6, pROD 4.8 und pROD 4.7.
- Die Fig. 9 ist eine Repräsentation der relativen Intensitäten der Flecken einer Hybridisierung, die zwischen ROD-4 und jeweils Subfragmenten 1 bis 11, die aus unterschiedlichen Teilen einer einzelsträngigen, von dem M13-Subklon, der eine von dem vollständigen LAV-Genom abgeleitete Nukleinsäure enthält, stammenden DNS stammen, vorgenommen wurde. Die relativen Positionen dieser verschiedenen Fragmente gegenüber dem vollständigen Genom von LAV (bestimmt durch Sequenzierung) sind in dem unteren Teil der Figur angegeben. Der Punkt 12 entspricht einem Vergleichsfleck, der unter Einsatz einer Vergleichs-DNS des Phagen Lambda realisiert wurde.
- Die Hybridisierungsversuche bei der Fleckentransfermethode ("Dot- Blot") wurden unter den Bedingungen niedriger Stringenz des Beispiels II ausgeführt. Unter Einsatz des rekombinanten Lambda ROD 4, der die gesamte cDNS von HIV 2 enthält, als Sonde. Die Wäschen wurden dann nacheinander unter den folgenden Bedingungen vorgenommen:
- 2 · SSC, 0,1% SDS bei 25ºC (Tm -42ºC), 1 · SSC, 0,1% SDS bei 60ºC (Tm - 20ºC) und 0,1 · SSC, 0,1% SDS bei 60ºC (Tm -3ºC).
- Die gezeigten Flecken wurden nach radiographischer Exposition während einer Nacht erhalten.
- Die durch HIV-2 infizierten Patienten wurden unter Personen, die zwischen September 1985 und September 1986 in dem Krankenhaus Egas Moniz von LISSABON für die stationäre Behandlung oder für eine Konsultation zugelassen worden sind, ausgewählt.
- Um diese Auswahl vorzunehmen, wurden alle Personen, die aus Afrika stammten oder sich in Afrika aufgehalten hatten, einem serologischen Test unterzogen, um zugleich die Anwesenheit von Antikörpern gegen HIV- 1 (Immunfluoreszenz-IFA- und/oder ELISA) und gegen HIV-2 (IFA) zu untersuchen. Nur die Patienten, für die serologisch die Infektion mit HIV-2 nachgewiesen wurde, blieben weiterhin in dieser Studie.
- Bei 12 Patienten wurde die Isolierung von HIV ausgeführt, wie kurz beschrieben. Die Lymphozyten des peripheren Bluts der Patienten (PBL) wurden mit PHA stimuliert, in Cokultur mit mit PHA stimulierten normalen menschlichen PBL gezüchtet und in Gegenwart von Interleukin-2 (IL- 2) gehalten. Die Kulturen wurden kontrolliert, um das gegebenenfalls bestehende Vorhandensein einer zytopathogenen Wirkung (CPE) festzustellen und um die reverse Transkriptase (RT)-Aktivität im Überstand zu messen.
- IFA-Platten wurden, wie folgt, hergestellt: mit HIV-2 infizierte MOLT-4-Zellen wurden zweimal in PBS gewaschen und auf IFA-Glasplättchen aufgebracht (104 Zellen pro Vertiefung), dann an der Luft getrocknet und durch Aceton in der Kälte fixiert. Für den IFA-Test wurden diese Zellen während 45 min bei 37ºC einer Reaktion unterworfen, wobei das Testserum 1/10 verdünnt wurde, wurden gewaschen, getrocknet und einer Reaktion mit an anti-Mensch-IgG, -A, -M von der Ziege konjugiertem Fluorescein (1/100 verdünnt) während 30 min bei 37ºC unterworfen. Nach dem Waschen wurden die Zellen mit 0,006% Evans-Blau gefärbt, in eine Mischung von 90% Glycerol, 10% PBS eingebracht und mittels eines Fluoreszenzmikroskops untersucht.
- Bestimmte Patientenseren wurden untersucht, um die Anwesenheit von anti-HIV-1-Antikörpern zu bestimmen, indem die im Handel unter der Bezeichnung ELAVIA (Pasteur Diagnostics) oder ABBOTT verfügbaren serologischen Tests verwendet wurden.
- Mit HIV-1 oder HIV-2 infizierte CEM-Zellen wurden in Gegenwart von ³&sup5;S-Cystein (200 uCl/ml) während 16 h kultiviert. Der Überstand wurde gesammelt, die Viruspartikel wurden zentrifugiert und auf einem RIPA- Puffer (Tris-HCl, 50 mM, pH 7,5, NaCl, 150 mlvi, EDTA, 1 mM, 1% Triton X100, Natriumdesoxycholat, 0,1%, SDS, 0,1%) lysiert. Für jede Reaktion wurden 50 Mikroliter verdünntes Lysat entsprechend 105 cpm mit 5 Mikrolitern eines Testserums während 18 h bei 4ºC in Reaktion gebracht. Immunkomplexe wurden mittels an PHARMACIA-Sepharose fixiertem Protein A gebunden, gewaschen und während eines Kochens von 2 min eluiert. Die eluierten Antigene wurden durch SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese und durch Autoradiographie analysiert.
- Isolierte Viren in PBL von Patienten wurden zentrifugiert und in Tris-HCl, 10 mM, pH 7,5, NaCl, 10 mM, EDTA, 1 mlvi, SDS, 0,5%, lysiert. Ein Mikroliter jedes Lysats entsprechend einer RT-Aktivität von 50 000 cpm wurde auf einen Nitrocelluloseträger aufgebracht. Eine Hybridisierung und ein Waschen wurden unter Bedingungen hoher Stringenz ausgeführt: Hybridisierung in 6X SSC, 5X Denhart, 50% Formamid während 18 h bei 42ºC; und Waschen in 0,1X SSC, 0,1% SDS bei 65ºC. Es wurden mit ³²P markierte HIV-1- und HIV-2-Sonden (spezifische Aktivität von 108 cpm/Mikrogramm) verwendet. Die HIV-1-Sonde entspricht dem vollständigen Genom des Isolats LAVsRU und die HIV-2-Sonde leitet sich von einer klonierten DNS des Isolats LAV-2ROD von 2 Kilobasen ab.
- 30 Patienten, bei denen man eine HIV-2-Infektion durch serologischen oder viralen Nachweis nachwies, wurden untersucht. Unter diesen 30 Patienten zählte man 12 Männer und 18 Frauen. Das mittlere Alter betrug 35 Jahre bei einem Intervall von 11 bis 55 Jahren. Alle Patienten mit Ausnahme von einem hatten mehrere Jahre in Westafrika verbracht: 26 waren in Guinea-Bissau geboren und hatten dort gelebt und 2 stammten von den Kapverdischen Inseln. 1 Patient war ein Bub von 11 Jahren aus Angola, der mehrere Jahre auf den Kapverdischen Inseln verbracht hatte. Der einzige Europäer der untersuchten Population war ein Portugiese von 40 Jahren, der 8 Jahre in Zaire verbracht hatte, jedoch jeden Aufenthalt in Westafrika bestritt.
- Unter den 30 Patienten hatten 17 AIDS entsprechend den anerkannten CDC-Kriterien. Das Hauptsymptom bei diesen Patienten war die chronische Diarrhoe, in den meisten Fällen begleitet von einem Gewichtsverlust von mehr als 10 kg in einem Jahr. Bei 10 Patienten war die Diarrhoe mit dem Vorliegen einer akuten Darminfektion verbunden; in 7 Fällen war das pathogene Agens allein Isospora belli, 1 Patient war ausschließlich durch Cryptosporidium befallen und 2 wiesen die 2 pathogenen Agentien zugleich auf. In 3 Fällen wurde keinerlei unerwartetes pathogenes intestinales Agens festgestellt. Unter den 17 Fällen von an AIDS erkrankten Personen diagnostizierte man bei 8 oesophagiale Candidosen. 6 AIDS- Patienten wiesen respiratorische Symptome auf. Bei 2 von diesen wurde eine Lungentuberkulose diagnostiziert und bei einem von diesen ein nicht idenfiziertes unterschiedliches Mikrobakterium festgestellt. 2 Patienten litten unter einer Lungenaspergillose als Folge einer Tuberkulose. 2 andere AIDS-Patienten zeigten wiederkehrende Phasen von Pneumonie ohne Identifizierung des pathogenen Agens und 1 Patient hatte eine Pneumonie vom Typ Pneumocystis carinii, die erst post mortem diagnostiziert wurde. Vier der 17 AIDS-Patienten hatten ein Kaposi-Sarkom: in 3 Fällen trat es auf die Haut beschränkt auf und bei einem anderen Patienten ergab eine Untersuchung post mortem disseminierte Läsionen im Viszeralbereich. Störungen des Zentralnervensystems traten bei 2 AIDS- Patienten auf: 1 hatte ein Cerebrallymphom und der andere hatte eine subakute Enzephalitis unbekannter Ursache. 4 Patienten wiesen die Symptome des "AIDS-related Complex" (ARC) auf: 2 hatten diffuse Lymphade nopathien mit persistierendem Fieber, 1 hatte eine chronische Diarrhoe mit Gewichtsverlust und 1 hatte wiederkehrende Phasen von Bronchopneumonie und multiple Lymphadenopathien.
- Unter den verbleibenden 9 Patienten hatten 9 keinerlei Symptome, die in Zusammenhang mit der Infektion durch HIV gebracht werden konnten, 1 war lediglich an einer Lungentuberkulose erkrankt, 1 hatte lediglich diffuse persistierende Lymphadenopathien und 1 wies eine neurologische Syphillis auf. Während der Studiendauer von 12 Monaten sind 7 Patienten gestorben, die sämtlich AIDS hatten.
- Jeder Patient war Gegenstand von mindestens einer serologischen Untersuchung, um gleichzeitig die Anwesenheit von Antikörpern gegen HIV-1 und HIV-2 zu untersuchen. Alle Seren der Patienten wurden durch IFA-Test untersucht, um die Antikörper gegen HIV-2 festzustellen, und alle erwiesen sich als positiv. Unter diesen wurden 21 hinsichtlich der anti-HIV-2-Antikörper auch durch einen RIPA-Test untersucht: alle haben eindeutig das Hüllglykoprotein von hohem Molekulargewicht des Virus, das als gp140 bezeichnet wird, präzipitiert und 16 von diesen haben gleichfalls mit dem Hauptprotein des Kerns, p26, reagiert, während nur eines mit einem anderen viralen Protein des Kerns, das als p16 bezeichnet wird, reagiert.
- In diesen Seren wurde die Anwesenheit von Antikörpern untersucht, die Kreuzreaktionen mit HIV-1 zeigten, indem die verschiedenen Tests eingesetzt wurden. Für 24 Seren wurde ein IFA-Test eingesetzt: 12 sind negativ, 10 sind schwach reaktiv und 2 positiv. In einem ELISA-Test wurden 21 Seren untersucht: 16 waren negativ und 5 waren positiv. Schließlich wurde in 11 Seren die Anwesenheit von Antikörpern gegen die Proteine von HIV-1 durch die RIPA-Methode untersucht. 3 von diesen zeigten absolut keine Reaktion und dies mit keinerlei viralem Protein, nur 2 präzipitierten mit dem Protein p34, das von dem pol-Gen stammt, und 5 reagierten mit dem Protein p25, Hauptprotein des Kerns. 2 Seren reagierten nur schwach mit dem Glykoprotein gpllO der Hülle des HIV-1- Virus. Diese zwei Seren wie auch alle während der IFA- oder ELISA-Tests bezüglich der anti-HIV-1-Antikörper positiven Seren reagierten stark mit dem gp140 von HIV-2 in einem RIPA-Test, was eher auf eine Infektion mit HIV-2 als mit HIV-1 hinweist. Nur bei 1 Patient, der nicht zur untersuchten Population gehörte, wurde serologisch festgestellt, daß er mit HIV-1 infiziert war und nicht durch HIV-2. Dieser Patient war eine Frau von 21 Jahren aus Zentralafrika (Insel Sao Tome), die AIDS hatte.
- Die Isolierung der Viren in den peripheren Blutlymphozyten wurde an 12 Patienten vorgenommen. Bei 11 von diesen zwei wurde ein HIV mittels des Vorhandenseins einer zytopathogenen Wirkung und der Messung eines Peaks der mit der reverse Transkriptase-Aktivität assoziierten Partikel in den Kulturüberständen isoliert.
- Diese 11 Isolate wurden durch Einsatz der "Dot-Blot"- Hybridisierungstechnik als Isolate von HIV-2 identifiziert. Die ausgehend von 10 Isolaten erhaltenen viralen Flecken zeigten eine starke Hybridisierung unter den stringenten Hybridisierungs- und Waschbedingungen mit einer von einer klonierten cDNS von HIV-2 abgeleiteten HIV-2- Sonde, während unter den gleichen Bedingungen keiner von diesen mit den HIV-1-Sonden hybridisierte. Ein Isolat hybridisierte nur schwach mit einer HIV-2-Sonde, hybridisierte aber nicht mit einer HIV-1-Sonde.
- Es wurden 13 Patienten untersucht, um die Anzahl von deren zirkulierenden Lymphozyten, die als (CD4+) T-Helfer ("helper")-Zellen identifiziert wurden, und das Verhältnis von T-Helferzellen/T-Suppressorzellen auszuwerten. Von diesen Patienten hatten 11 AIDS: deren Anzahlen von T-Helferzellen betrugen 243 bis 300 pro Mikroliter und deren mittleres T-Helferzellen/T-Suppressorzellen-Verhältnis war 0,25 bis 0,15. 1 Patient zeigte klinische ARC-Symptome, hatte eine Anzahl von T-Helfer-Lymphozyten von 240/Mikroliter und ein Verhältnis von 0,18. Ein anderer Patient, der eine neurologische Syphillis und keinerlei evident mit HIV in Zusammenhang stehendes Symptom aufwies, hatte eine Anzahl von T-Helfer-Lymphozyten von 690 pro Mikroliter und ein Verhältnis von 0,82.
- In dieser Studie wurde die Infektion durch HIV-2 bei 30 afrikanischen Patienten aus Westafrika nachgewiesen, die entweder AIDS hatten oder Symptome des ARC-Komplexes oder keinerlei in Zusammenhang mit AIDS stehende klinische Symptome hatten. Die Ergebnisse erlauben gleichwohl, daraus zu schließen, daß HIV-2 als hauptsächliches verursachendes/ätiologisches Agens von AIDS bei den Patienten aus Westafrika angesehen werden muß. Die serologischen und viralen Ergebnisse, die beobachtet wurden, zeigen, daß bei diesen Patienten die Infektion durch HIV-2 nicht häufig mit einer Infektion durch HIV-1 assoziiert ist.
- Trotz bedeutenden Antigen-betreffenden und genetischen Unterschieden weisen HIV-1 und HIV-2 einen ähnlichen Tropismus für die CD4+ T- Lymphozyten auf, haben ähnliche zytopathogene Wirkungen, eine ähnliche Morphologie und teilen gemeinsame Immunreaktionsepitope für bestimmte ihrer Hauptproteine.
- In dem Maße, wie alle Patienten aus Westafrika, die mit HIV infiziert waren und hier untersucht wurden, als durch HIV-2 infiziert ermittelt wurden, während keiner durch HIV-1 infiziert war, könnte das neue HIV-2-Virus die Hauptursache von AIDS in Westafrika sein.
- Die mit HIV-2 verbundenen AIDS-Symptome unterscheiden sich nicht von jenen des mit HIV-1 assoziierten AIDS in Zentralafrika: Das häufigste Symptom besteht in chronischen Diarrhoen mit einem bedeutenden Gewichtsverlust, Störungen, die zumeist auf Isospora belli und/oder Cryptosporidium zurückzuführen sind. Die Häufigkeit anderer akuter Infektionen, wie Candidosen, durch Mikrobakterien (einschließlich M. tuberculosis) und Toxoplasmosen, vergleichbar mit derjenigen, die man bei den an mit HIV-1 assoziiertem AIDS erkrankten Afrikanern kennt. Die Pneumonie vom Typ Pneumocystis carinii, die als eine überaus übliche Komplikation bei den an AIDS erkrankten Personen in den USA und in Europa angesehen wird, wurde während unserer Studie nur einmal festgestellt und Meningitis-Erkrankungen vom Cryptococcus-Typ wurden nicht nachgewiesen.
- Gleichwohl sind die unter den an AIDS, das mit einer Infektion durch HIV-2 verbunden ist, erkrankten Patienten festgestellten immunologischen Anomalien, identisch mit jenen, die während einer AIDS- Erkrankung, die mit HIV-1 verbunden ist, beschrieben wurden.
- Unter den 30 Patienten, die in ihrem Serum Antikörper aufwiesen, die mit den HIV-2-Antigen reagierten, hatten nur 7 von diesen spezifische Antikörper gegen HIV-1, die durch IFA- oder ELISA-Tests nachweisbar waren. Während eines RIPA-Tests beobachtet man, daß diese 7 Patienten Antikörper aufweisen, die gegenüber den Hauptproteinen des Kerns p25 (HIV-1) oder p26 (HIV-2), die stark immunreaktive Epitope gemein haben, eine Reaktion zeigen. 5 Patienten wiesen keine solchen Antikörper auf: diese 5 Patienten zeigen negative Reaktionen in ELISA-Tests gegenüber HIV-1. 2 von diesen zeigen negative Reaktionen in IFA-Tests und 3 von diesen zeigen sehr schwache Reaktionen. Indessen, obwohl be stimmte von diesen nicht vollständig untersucht worden sind, wurden 9 Patienten beobachtet, die in ihrem Serum Antikörper des viralen p26- Proteins des Kerns von HIV-2 aufwiesen und die eine schwache Reaktion oder eine negative Reaktion in für HIV-1 spezifischen IFA- oder ELISA- Tests zeigten. Diese Ergebnisse heben die Bedeutung der Aufnahme von HIV-2-Antigen in serologische HIV-Tests, die in Afrika und vielleicht an anderen Orten eingesetzt werden, heraus.
- Ein Retrovirus wurde aus den peripheren Lymphozyten von 11 Patienten isoliert. In allen Fällen wurde in 2 Wochen das Viruswachstum erzielt, gekennzeichnet durch das Vorhandensein einer reverse Transkriptase-Aktivität im Kulturüberstand und durch eine zytopathogene Wirkung. Indessen erscheint diese zytopathogene Wirkung von unterschiedlicher Bedeutung für die verschiedenen Isolate: bestimmte Isolate zeigten eine bedeutende Anzahl von Synzytien großer Größe begleitet von einer bedeutenden Zelllyse, während andere nur wenige Synzytien begrenzter Größe, die nur selten die Lebensfähigkeit der Kultur beeinflußten, aufwiesen.
- Alle RNS bis auf jene eines einzigen Isolats hybridisieren mit einer von einer klonierten cDNS von HIV-2 abgeleiteten Sonde, die das 3'- Ende des Genoms repräsentiert, unter Bedingungen hoher Stringenz. Keine hybridisiert unter den gleichen Bedingungen mit einer HIV-1-Sonde. Dies zeigt, daß die diese Patienten infizierenden Isolate zu demselben Virustyp gehören. Nur ein Isolat hybridisiert, aber selten, mit einer HIV-2-Sonde zugleich unter Bedingungen hoher und niedriger Stringenz und hybridisiert nicht mit HIV-1. Dieses Virus wurde indessen bei einem Patienten isoliert, der in seinem Serum Antikörper aufwies, die in der Lage waren, mit allen Antigenen von HIV-2 während eines RIPA-Tests zu reagieren.
- Allgemein beschreibt die Patentanmeldung außer dem HIV-2-Virus und seinen Varianten jedes äquivalente, für den Menschen infektiöse Virus, das für HIV-2 charakteristische immunologische Eigenschaften aufweist. Allgemein bezieht sich die Patentanmeldung auf jedes Virus, das außer den Eigenschaften, die die bei der CNCM hinterlegten HIV-2-Viren aufweisen, ferner die folgenden Eigenschaften aufweist.
- Das präferentielle Ziel des HIV-2-Retrovirus wird durch die menschlichen Leu 3-Zellen (oder T4-Lymphozyten) gebildet und hinsichtlich der "immortalisierten" (unsterblich gemachten) Zellen, die von diesen T4-Lymphozyten abgeleitet sind, beispielsweise durch die im Rah men dieser Anmeldung in Betracht gezogenen Zellen der Linien HUT-78. In anderen Worten weist es einen spezifischen Tropismus für diese Zellen auf. Es kann in permanenten Linien des Typs HUT, CEM, MOLT oder analogen Linien, die das T4-Protein exprimieren, gezüchtet werden. Es ist für die T8-Lymphozyten nicht infektiös. Es ist für die menschlichen T4- Lymphozyten zytotoxisch. Der zytopathische Charakter der HIV-2-Viren hinsichtlich der T4-Lymphozyten manifestiert sich insbesondere durch das Auftreten von mehrkernigen Zellen. Es hat eine reverse Transkriptase-Aktivität, die die Anwesenheit von Mg²&spplus;-Ionen erfordert und eine starke Affinität für die Poly(adenylat-oligodesoxythymidylase) (poly(A)-oligo(dT) 12-18) aufweist. Es hat in einem Sucrose-Gradienten eine Dichte von ungefähr 1,16. Es hat einen mittleren Durchmesser von 140 Nanometern und einen Kern mit einem mittleren Durchmesser von 41 Nanometern. Die Lysate dieses Virus enthalten ein Protein p26, das immunologisch mit dem Protein p24 des HTLV-I-Virus oder des HTLV-II-Virus nicht kreuzreagiert. Diese p26-Proteine weisen folglich ein ein wenig (um ungefähr 1000) höheres Molekulargewicht als die entsprechenden p25 von HIV-1 und ein etwas weniger hohes (erneut von der Größenordnung von ungefähr 1000) Molekulargewicht als die entsprechenden p27 von SIV auf. Die HIV-2-Lysate enthalten außerdem ein Protein p16, das immunologisch durch das Protein p19 von HTLV-I oder von HTLV-II in Radioimmunpräzipitierungsassays RIPA (Abkürzung des englischen Ausdrucks "radioimmunoprecipitation assay") nicht erkannt wird. Sie enthalten außerdem ein Hüllglykoprotein mit einem Molekulargewicht in der Größenordnung von 130 000-140 000, das mit gp110 von HIV-1 immunologisch nicht kreuzreagiert, das aber im Gegenzug mit dem Hüllglykoprotein gp140 von STLV-III immunologisch kreuzreagiert. Diese Lysate enthalten ferner Proteine oder Glykoproteine, die durch ³&sup5;S-Cystein markiert werden können, mit Molekulargewichten jeweils in der Größenordnung von 36 000 und 42 000- 45 000. Die genomische RNS von HIV-2 hybridisiert unter stringenten Bedingungen mit der genomischen RNS von HIV-1 nicht. Unter nichtstringenten Bedingungen hybridisiert sie auch nicht mit der Nukleotidsequenz, die von HIV-1 abgeleitet ist und das env-Gen und den benachbart angeordneten LTR enthält. Insbesondere hybridisiert sie weder mit der Sequenz der Nukleotide 5290-9130 von HIV-1 noch mit Sequenzen des pol- Bereichs des HIV-1-Genoms, insbesondere mit der Sequenz der Nukleotide 2170-2240. Unter nichtstringenten Bedingungen hybridisiert sie schwach mit Nukleotidsequenzen des HIV-1-Bereichs, insbesondere den Sequenzen der Nukleotide 990-1070 und 990-1260.
- Es ist anzumerken, daß jegliche für den Menschen infektiöse Retroviren, die in der Lage sind, AIDS auszulösen, die oben erwähnten essentiellen Eigenschaften aufweisen und deren genomische RNS in der Lage ist, unter den stringenten Bedingungen mit jenen der Virusstämme von HIV-2, die bei der C. N. C. M. hinterlegt worden sind, (oder mit einer cDNS oder einem cDNS-Fragment, abgeleitet von diesen genomischen RNS, zu hybridisieren, als ein Äquivalent von HIV-2 angesehen werden müssen.
- Die Anmeldung bezieht sich ferner auf jedes der Antigene, insbesondere Proteine und Glykoproteine in gereinigtem Zustand, wie sie ausgehend von HIV-2 erhalten werden können. Man spricht von "gereinigten" Proteinen oder Glykoproteinen, wenn diese Proteine oder Glykoproteine in einer Polyacrylamidgelelektrophorese lediglich zu einzelnen Banden führen, insbesondere unter den experimentellen Bedingungen, die weiter oben angegeben worden sind. Jede Prozedur, die zur Trennung und/oder zur Reinigung, um jedes von diesen zu erhalten, geeignet ist, kann verwendet werden. Als Beispiel für einsetzbare Techniken kann jene, die von R. C. MONTELARO et al., J. of Virology, Juni 1982, S. 1029-1038, beschrieben worden ist, erwähnt werden.
- Allgemein beschreibt die Anmeldung alle Antigene, insbesondere Proteine, Glykoproteine oder Polypeptide, die von einem HIV-2 stammen und immunologische Eigenschaften haben, die äquivalent sind zu jenen von HIV-2. Zwei Antigene werden im Rahmen dieser Unterlagen als "äquivalent" bezeichnet, sobald sie durch die gleichen Antikörper, insbesondere Antikörper, die ausgehend von einem Serum, erhalten ausgehend von einem Patienten, der mit einem HIV-2 infiziert worden ist, isoliert werden können, erkannt werden oder sobald sie den nachfolgend angegebenen Bedingungen/Kriterien "immunologischer Äquivalenz" entsprechen.
- Unter den äquivalenten Polypeptiden, Proteinen oder Glykoproteinen müssen Fragmente der vorangehenden Antigene (oder durch chemische Synthese rekonstituierte Peptide) eingeordnet werden, sobald sie zu immunologischen Kreuzreaktionen mit den Antigenen, von denen sie abgeleitet sind, führen. In anderen Worten betrifft die Erfindung jedes Polypeptid, das identische oder ähnliche Epitope, die durch die gleichen Antikörper erkannt werden können, mit den oben genannten Antigenen gemein hat. Zu diesem letzteren Typ von Polypeptiden gehören die Expressions produkte von entsprechenden DNS-Sequenzen, die die entsprechenden Polypeptidsequenzen kodieren.
- Das HIV-2-Virus erweist sich als einsetzbar als Quelle von Antigenen für den Nachweis von Antikörpern bei allen Personen, die mit dem HIV-2-Virus in Berührung gekommen sind.
- Allgemein kann jede Zusammensetzung, die für die Diagnose des Vorhandenseins von Antikörpern gegen mindestens eines der Antigene von HIV-2 in einem flüssigen biologischen Serum, insbesondere von Personen, die mit HIV-2 in Berührung gekommen sind, einsetzbar ist, für die selektive Diagnose der entsprechenden AIDS-Variante angewendet werden, indem die Diagnosetechniken eingesetzt werden, wie sie in der vorstehend zitierten Europäischen Patentanmeldung beschrieben wurden, sofern nur Extrakte, Lysate oder ferner gereinigte Antigene von HIV-2 anstelle von jenen von HIV-I verwendet werden. In dieser Hinsicht bezieht sich die Anmeldung auf Zusammensetzungen, die mindestens eines der Proteine p12, p16, p26, wobei es sich um interne Proteine handelt, oder mindestens eines der Glykoproteine p36 oder gp140 enthalten. Als Beispiele für Zusammensetzungen seien jene erwähnt, die gleichzeitig enthalten:
- - p26 und gp36,
- - p26, p36 und gp140
- - p12, p16 und p26,
- - p16, p26 und gp140....
- Es versteht sich von selbst, daß diese Zusammensetzungen lediglich beispielhaften Charakter haben. Die Anmeldung bezieht sich auch auf die Virusextrakte oder -lysate, die die Gesamtheit dieser Proteine und/oder Glykoproteine oder jegliche Fraktionen, von denen vorab eines oder mehrere der genannten Proteine oder Glykoproteine abgetrennt worden ist bzw. sind, enthalten. Zusammensetzungen, die Proteine und/oder Glykoproteine eines HIV-2 zusammen mit Proteinen und/oder Glykoproteinen eines HIV-1 enthalten, sind beispielsweise:
- - entweder Proteine des Kerns ("core") von HIV-1 und von HIV-2, insbesondere die p25 eines HIV-1 und p26 eines HIV-2, oder ferner entweder p18 eines HIV-1 und p16 eines HIV-2,
- - oder Hüllglykoproteine eines HIV-1 und Hüllglykoproteine eines HIV-2, insbesondere das gp110 von HIV-1 und das gp140 von HIV-2, oder ferner das p42 von HIV-1 und das p36 oder p42-45 von HIV-2,
- - oder natürlich Mischungen von Proteinen und/oder Glykoproteinen eines HIV-1 und von Proteinen und/oder Glykoproteinen eines HIV-2.
- Solche Zusammensetzungen, die für die Diagnose eingesetzt werden, erlauben folglich eine Durchführung einer Diagnose von AIDS oder der Symptome, die damit assoziiert sind, die sich auf ein breiteres Spektrum verantwortlicher ätiologischer Agentien erstreckt. Es versteht sich von selbst, daß die Verwendung von Zusammensetzungen, die lediglich Proteine und/oder Glykoproteine von HIV-2 enthalten, für die Durchführung einer Diagnose weiterhin nicht weniger nützlich ist für selektivere Diagnostiken der Retrovirus-Kategorie, die vielleicht für die Krankheit verantwortlich gemacht werden könnte.
- Die Anmeldung bezieht sich auch auf die DNS oder DNS-Fragmente, insbesondere klonierte DNS und DNS-Fragmente, erhalten ausgehend von der RNS oder von der RNS des HIV-2-Retrovirus abgeleiteten cDNS, oder auf jegliche äquivalenten DNS, insbesondere jede DNS, die Sequenzhomologien mit der DNS des HIV-2, insbesondere mit den die env- und pol- Regionen des HIV-2-Stamms, der bei der C. N. C. M. hinterlegt worden ist, kodierenden Sequenzen von mindestens gleich 50%, vorzugsweise 70% und noch vorteilhafter ferner 90% aufweist, oder jegliche äquivalente DNS (oder RNS), die mit der DNS oder RNS von HIV-2 in der "Spot-Blot"- Technik unter nicht stringenten Bedingungen, wie sie vorstehend definiert wurden, hybridisieren kann. Beim Tier können durch Inokulation/Animpfung von diesem mit HIV-2 Seren erzeugt werden. Es werden insbesondere die polyklonalen Antikörper, die spezifischer gegen jedes der Antigene, insbesondere Proteine oder Glykoproteine des Virus gerichtet sind, oder die monoklonalen Antikörper, die durch klassische Techniken erzeugt werden können, wobei diese monoklonalen Antikörper jeweils spezifischer gegen die verschiedenen Proteine von HIV-2 gerichtet sind, beschrieben.
- Diese polyklonalen oder monoklonalen Antikörper sind in verschiedenen Anwendungen einsetzbar. Es sei in erster Linie deren Verwendung zum Neutralisieren der entsprechenden Proteine, d. h. für die Inhibierung der Infektiosität des gesamten Virus, erwähnt. Sie können gleichfalls verwendet werden, um beispielsweise virale Antigene in den biologischen Präparationen nachzuweisen oder um Prozeduren zur Reinigung der entsprechenden Proteine und/oder Glykoproteine auszuführen, beispielsweise durch deren Verwendung in Affinitätschromatographiesäulen.
- Es versteht sich von selbst, daß die verfügbare technische Literatur (insbesondere jene, deren bibliographische Referenzen im Rahmen der vorliegenden Beschreibung angegeben werden), was HIV-1 und das als HTLV-III bezeichnete Virus betrifft, allgemein Techniken beschreibt, die unter ähnlichen Bedingungen für die Isolierung des HIV-2-Virus oder von äquivalenten Viren, für die Gewinnung von deren verschiedenen Bestandteilen (insbesondere Proteine, Glykoproteine, Polypeptide, Nukleinsäuren) ausgehend von diesen Viren angewandt werden können. Es kann gleichfalls auf die Lehren dieser technischen Literatur zurückgegriffen werden, was die Anwendung der verschiedenen betreffenden Bestandteile insbesondere für die Durchführung einer Diagnose der entsprechenden SLA- oder AIDS-Formen betrifft.
- Ein in vitro-AIDS-Diagnoseverfahren, das beispielsweise das Inkontaktbringen eines Serums oder eines anderen biologischen Mediums, das von einer erkrankten Person stammt, die Gegenstand der Diagnose ist, mit einer Zusammensetzung, die mindestens eines der Proteine oder Glykoproteine von HIV-2 enthält, oder ferner mit einem Extrakt oder Lysat des Virus und den Nachweis der immunologischen Reaktion umfaßt. Beispiele derartiger Zusammensetzungen wurden weiter oben angegeben.
- Bevorzugte Methoden bedienen sich beispielsweise immunenzymatischer Reaktionen vom Typ ELISA oder Immunfluoreszenzreaktionen. Die Titrierungen können Messungen durch direkte oder indirekte Immunfluoreszenz oder direkte oder indirekte quantitative immunenzymatische Bestimmungen sein.
- So beschreibt die Patentanmeldung auch Virusextrakte (entweder einen Extrakt von einem oder mehreren HIV-2 allein oder einer Mischung von Extrakten, die von einem oder mehreren HIV-2 einerseits und einem oder mehreren HIV-1 andererseits stammen), wobei diese Extrakte markiert sind. Man kann einen jeglichen Typ von geeignetem Marker verwenden: enzymatisch, fluoreszierend, radioaktiv, u. s. w. Solche Titrierungen umfassen beispielsweise:
- - das Einbringen von bestimmten Mengen des Extrakts oder der erfindungsgemäß in Betracht gezogenen Zusammensetzungen in die Vertiefungen einer Mikrotiterplatte;
- - das Zusetzen von zunehmenden Verdünnungen des Serums, das im wesentlichen die Antikörper enthält, deren Anwesenheit in vitro nachgewiesen werden soll, in diese Vertiefungen;
- die Inkubation der Mikroplatte;
- - das sorgfältige Waschen der Mikroplatte mit einem geeigneten Puffer;
- - das Zusetzen von spezifischen markierten Antikörpern von menschlichen Immunglobulinen in die Vertiefungen der Mikroplatte, wobei die Markierung durch ein Enzym erfolgt, ausgewählt unter jenen, die in der Lage sind, ein Substrat dergestalt zu hydrolysieren, daß dieses letztere dann eine Modifizierung seiner Strahlungsabsorption durchläuft, mindestens hinsichtlich einer bestimmten Wellenlängenbande und
- den Nachweis des Umfangs der Hydrolyse des Substrats als Maß der potentiellen Risiken oder des tatsächlichen Vorliegens der Krankheit, vorzugsweise in vergleichender Form durch Bezugnahme auf eine Vergleichsprobe.
- Die oben beschriebene Diagnose kann auf "Kits" zurückgreifen, die umfassen:
- - einen Extrakt oder eine stärker gereinigte Fraktion der vorstehend angegebenen Virustypen, wobei dieser Extrakt oder diese Fraktion markiert sind, beispielsweise radioaktiv, enzymatisch oder durch Immunfluoreszenz;
- - menschliche anti-Immunglobuline oder ein Protein A (vorteilhafterweise an einen in Wasser unlöslichen Träger, wie Agarosekügelchen, fixiert)
- - einen Lymphozytenextrakt, erhalten ausgehend von einer Person bei guter Gesundheit;
- - Puffer und gegebenenfalls Substrate für die Sichtbarmachung der Markierung.
- Die Diagnose des HIV-2-Virus oder einer Variante dank des Einsetzens der zuvor beschriebenen Sonden durch ein Verfahren, das auf verschiedene Schritte, die nachfolgend angegeben werden, zurückgreift, kann Schritte einsetzen, die spezifisch vorgesehen sind, um die charakteristischen Eigenschaften des HIV-2-Virus ersichtlich zu machen.
- Die cDNS oder deren Fragmente (oder Rekombinanten, die diese enthalten) können als Sonden für die Diagnose des gegebenenfalls bestehenden Vorhandenseins von HIV-2-Viren in Serumproben oder anderen biologischen Flüssigkeiten oder Geweben, erhalten ausgehend von Patienten, von denen vermutet wird, daß sie Träger des HIV-2-Virus sind, eingesetzt werden. Diese Sonden sind vorzugsweise ebenfalls markiert (radioaktive, enzymatische, fluoreszierende Marker u. s. w.). Besonders interessante Sonden für das Ausführen des Verfahrens zur Diagnose des HIV-2-Virus oder einer Variante von HIV-2 können dadurch gekennzeichnet sein, daß sie die Gesamtheit oder einen Teil der zu dem Genom des HIV-2-Virus komplementären cDNS oder ferner insbesondere die Fragmente, die in den verschiedenen oben identifizierten Klonen enthalten sind, umfassen. Es sei insbesondere eine Fraktion der in dem Klon E2 enthaltenen cDNS von HIV-2, insbesondere die Sequenz des 3'-Endes (LTR) und/oder des 5'- Endes der HIV-Sequenz des vorstehend erwähnten Klons E2, oder ferner die cDNS, die den env-Bereich der cDNS des HIV-2-Virus enthält, erwähnt.
- Die in diesem Verfahren zur Diagnose des HIV-2-Virus und in den Diagnosekits eingesetzten Sonden sind in keiner Weise auf die zuvor beschriebenen Sonden beschränkt. Sie umfassen im Gegenteil sämtliche Nukleotidsequenzen, die aus dem Genom des HIV-2-Virus, von einer Variante von HIV-2 oder einem aufgrund seiner Struktur nahestehenden Virus stammen, sobald sie den Nachweis von gegen ein HIV-2 gerichteten Antikörpern in biologischen Flüssigkeiten von Personen, die AIDS entwickeln können, erlauben. Natürlich ist gleichwohl die Verwendung von Nukleotidsequenzen, die von einem HIV-2, das ursprünglich für den Menschen infektiös ist, stammen, bevorzugt.
- Der Nachweis kann auf jegliche an sich bekannte Weisen erfolgen, insbesondere durch ein Inkontaktbringen dieser Sonden entweder mit den ausgehend von den in diesen Seren oder anderen biologischen Medien, beispielsweise zerebrospinalflüssigkeiten, Speichel u. s. w., enthaltenen Zellen erhaltenen Nukleinsäuren oder mit diesen Medien selbst, sofern deren Nukleinsäuren für die Hybridisierung mit diesen Sonden zugänglich gemacht worden sind, und dies unter Bedingungen, die die Hybridisierung zwischen diesen Sonden und diesen Nukleinsäuren erlauben, und durch einen Nachweis der gegebenenfalls erzeugten Hybridisierung. Die oben erwähnte Diagnose unter Einsatz der Hybridisierungsreaktionen kann gleichfalls mittels Mischungen von Sonden, die jeweils von einem HIV-1 und einem HIV-2 stammen, ausgeführt werden, sofern es nicht erforderlich ist, zwischen den untersuchten HIV-Virus-Typen zu unterscheiden.
- Allgemein umfaßt das Verfahren zur Diagnose der gegebenenfalls vorliegenden Anwesenheit des HIV-2-Virus oder einer Variante in Serumproben oder anderen Flüssigkeiten oder Geweben, die ausgehend von Patienten, von denen vermutet wird, daß sie Träger des HIV-2-Virus sind, erhalten wurden, die folgenden Schritte:
- 1) die Herstellung einer markierten Sonde,
- 2) mindestens einen unter stringenten Bedingungen ausgeführten Hybridisierungsschritt durch Inkontaktbringen der DNS von Zellen der Probe des unter Verdacht stehenden Patienten mit der markierten Sonde auf einer geeigneten Membran,
- 3) das Waschen der Membran mit einer Lösung, die die Aufrechterhaltung dieser stringenten Hybridisierungsbedingungen sicherstellt,
- 4) den Nachweis der gegebenenfalls vorliegenden Anwesenheit des HIV- 2-Virus durch eine Immunnachweismethode.
- Gemäß einer Variante des oben erwähnten Verfahrens wird die oben erwähnte Hybridisierung unter nichtstringenten Bedingungen ausgeführt und das Waschen der Membran wird unter Bedingungen, die an jene der Hybridisierung angepaßt sind, ausgeführt. Die HIV-2-Viren sind dadurch gekennzeichnet, daß deren virale RNS mit einer cDNS übereinstimmt, deren Bereiche, die die Gene gag und env enthalten, jeweils die folgenden Nukleotidsequenzen (GAGRODN und ENVRN) umfassen. Sie resultieren aus der Sequenzierung der entsprechenden Bereiche der cDNS, die dem Genom von HIV-2 ROD entspricht. Sie sind mit den Aminosäuren, die sie kodieren, in Übereinstimmung gebracht worden.
- Die HIV-2 gemäß der vorliegenden Anmeldung sind dergestalt, daß deren RNS ähnliche Eigenschaften insbesondere der gag- und env- Bereiche, die Sequenzen mit Nukleotidsequenzhomologien von mindestens 50%, vorzugsweise 70% und noch vorteilhafter ferner 90% mit den Qag- und env-Sequenzen von HIV-2-ROD umfassen, aufweisen.
- Die Anmeldung bezieht sich insbesondere auf die cDNS-Fragmente, die jeweils die Proteine p16, p26 und p12 kodieren und die gleichfalls in GAGRODN enthalten sind. Insbesondere beschreibt sie die Sequenzen die sich erstrecken:
- - ausgehend von Nukleotid 1 bis zu Nukleotid 405 (kodiert p16);
- - ausgehend von Nukleotid 406 bis zu Nukleotid 1155 (kodiert p26) und
- - ausgehend von Nukleotid 1156 bis zu Nukleotid 1566 (kodiert p12) Das cDNS-Fragment, das das in ENVRN enthaltene gp140 kodiert, und erstreckt sich ausgehend von Nukleotid 1 bis zu Nukleotid 2574.
- Die Anmeldung beschreibt auch die Nukleotidsequenzen, die sich von den Vorangegangenen durch Substitutionen von Nukleotiden unterscheiden unter Ausnutzung der Degeneration des genetischen Codes, sofern diese Substitutionen keine Modifizierung der Aminosäuresequenzen, die die Nukleotidsequenzen kodieren, zur Folge haben.
- Die Anmeldung beschreibt ebenfalls die Proteine oder Glykoproteine, deren Aminosäuresequenzen jenen entsprechen, die sich aus den vorangegangenen Seiten ergeben, wie auch die äquivalenten Peptide, nämlich Peptide, die sich von jenen, die sich aus den vorangegangenen Seiten ergeben, unterscheiden durch Hinzufügung, Substitution oder Deletion von Aminosäuren, die die insgesamt vorhandenen immunologischen Eigenschaften dieser Peptide nicht beeinflussen.
- Das Hüllglykoprotein weist die Aminosäuresequenz, die sich aus ENVRN ergibt, auf.
- Die Anmeldung bezieht sich ebenfalls auf eine immunogene Zusammensetzung, die dadurch gekennzeichnet ist, daß sie an Antigen, wie dem gp140 des HIV-2-Virus, dergestalt dosiert ist, daß sie die Verabreichung von Einzeldosen von 10 bis 500, insbesondere von 50 bis 100 mg pro kg Körpergewicht erlaubt.
- Die in der am 18. Oktober 1985 eingereichten Europäischen Patentanmeldung 85.905.513 9 beschriebenen Techniken hinsichtlich der Produktion von Peptiden oder Proteinen, die aus Expressionsprodukten von von dem Genom von HIV-1 abgeleiteten Nukleinsäuresequenzen beste hen, sind gleichfalls für die Erzeugung der oben erwähnten Peptide oder Proteine, die von HIV-2 abgeleitet sind, anwendbar.
- Zur Unterrichtung werden die theoretischen Molekulargewichte (MG) der HIV-2-Proteine im Vergleich zu jenen von HIV-1 angegeben.
- HIV-2 MIR und HIV-2 ROD wurden gleichfalls am 09. Januar 1987 bei der "National Collection of Animal Cell Cultures" (ECACC) in SALISBURY (Großbritannien) unter den Aufnahmenummern 87.01.1001 bzw. 87.01.1002 hinterlegt.
- Außerdem wurden die Plasmide pROD35 und pROD27,5 am 09. Januar 1987 bei der "National Collection of Industrial Bacteria" (NCIB) in ABERDEEN (Großbritannien) unter den Aufnahmenummern 12.398 bzw. 12.399 hinterlegt.
- 1 - F. Barre-Sinoussi et al., Science 220, 868 (1983).
- 2 - L. Montagnier et al., In. Human Tcell leukemia Orlymphoma viruses (Gallo, R. C., Essex, M. E., Gross, L., eds.) Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 363 (1984).
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- 8 - A. Ellrodt et al., Lancet i, 1383 (1984).
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- 10 - F. Brun-Vezinet et al., Science 226, 453 (1984).
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- 14 - M. Alizon, Manuskript in Vorbereitung
- 15 - F. Brun-Vezinet, Unveröffentlichte Daten
- 16 - M. D. Daniel et al., Science 228, 1201 (1985).
- 17 - P. J. Kanki et al., Science 228, 1199 (1985).
- 18 - N. L. Letwin et al., Science 230, 71 (1985).
- 19 - A. Gatzar et al., Hlood 55, 409 (1980).
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- 21 - L. Montagnier et al., Virology 144, 283 (1985).
- 22 - J. S. Allan et al., Science 228, 1091 (1985).
- 23 - F. CAIVel, Manuskript in Vorbereitung
- 24 - F. diMarzo Veronese et al., Science 229, 1402 (1985).
- 25 - V. S. Ralyanaraman et al., Science 218, 571 (1982).
- 26 - I. S. Y. Chen, J. McLaughlin, J. C. Gasson, S. C. Clark und D. W. Golde, Nature 305, 502 (1983).
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- 28 - P. J. Ranki, J. Alroy, M. Essex, Science 230, 951 (1985).
- 29 - H. Towbin et all, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 4350 (1979).
- 30 - S. Wain-Hobson, P. Sonigo, O. Danos, S. Cole und M. Alizon, Cell 40, 9 (1985).
- 31 - M. Alizon et al., Nature 312, 757 (1984).
Claims (21)
1. Verfahren zur Herstellung eines Proteins oder eines
Glykoproteins oder eines Protein- oder Glykoproteinteils, bestehend
aus dem Expressionsprodukt einer Nukleinsäuresequenz, welche von
dem Genom eines Retrovirus abgeleitet ist, gekennzeichnet durch
- die Insertion der genannten Nukleinsäuresequenz, die von
einem menschlichen HIV-2-Retrovirus abgeleitet ist, das in der
Lage ist, menschliche T4-Lymphozyten zu infizieren, und eine
AIDS-Erkrankung beim Menschen auszulösen vermag, oder die
Insertion der genannten Nukleinsäuresequenz, die von einer
Variante dieses Retrovirus, dessen Haupthüllglykoprotein von
gegen das Haupthüllglykoprotein gp140 eines HIV-2-Retrovirus
gebildeten Antikörpern erkannt wird, abgeleitet ist, in
einen Vektor, der in der Lage ist, einen ausgewählten
zellulären Wirt zu transformieren und die Expression eines in
diesem Vektor enthaltenen Inserts in diesem Wirt zu erlauben,
wobei das HIV-2-Retrovirus durch die bei der CNCM unter den
Nummern I-502, I-532, I-642 und I-643 oder bei der ECACC
unter den Nummern 87.01.1001 und 87.01.1002 hinterlegten
Isolate repräsentiert wird,
das Einschleusen des Vektors, der die genannte
Nukleinsäuresequenz enthält, in den ausgewählten Wirt,
- die Kultur des transformierten zellulären Wirts und
- das Gewinnen und die Reinigung des durch die genannte
Nukleinsäuresequenz exprimierten Proteins oder Proteinteils,
wobei das Protein oder der Proteinteil in der Lage sind,
eine spezifische immunologische Reaktion mit gegen das HIV-2-
Retrovirus gerichteten Antikörpern zu erzeugen.
2. Verfahren zur Herstellung eines Proteins oder eines
Proteinteils nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man das
Expressionsprodukt der Gesamtheit oder eines Teils der folgenden
Nukleinsäuresequenz, die die Nukleotide 1 bis 1566 entsprechend
der gag-Sequenz der genomischen RNS des HIV-2-Retrovirus
enthält, gewinnt und reinigt:
3. Verfahren zur Herstellung eines Proteins oder eines
Glykoproteins oder eines Protein- oder Glykoproteinteils nach
Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man das Expressionsprodukt
der Gesamtheit oder eines Teils der folgenden
Nukleinsäuresequenz, die die Nukleotide 1 bis 2574 entsprechend der folgenden
env-Sequenz der genomischen RNS des HIV-2-Retrovirus enthält,
gewinnt und reinigt:
4. Verfahren zur Herstellung eines Proteins oder eines
Proteinteils nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man ein
Protein oder einen Proteinteil, welches bzw. welcher der Gesamtheit
oder einem Teil der folgenden Aminosäuresequenz entspricht,
gewinnt und reinigt:
5. Verfahren zur Herstellung eines Proteins oder eines
Proteinteils nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man ein
Protein oder einen Proteinteil, welches bzw. welcher der Gesamtheit
oder einem Teil der folgenden Aminosäuresequenz entspricht,
gewinnt und reinigt:
6. Verfahren zur Herstellung eines Proteins nach Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet, daß man ein Protein mit den
immunologischen Eigenschaften des Proteins p12 von HIV-2 gewinnt und
reinigt, das immunologisch durch gegen ein menschliches HIV-2-
Retrovirus gebildete Antikörper erkannt wird und ein durch
Elektrophorese in einem Polyacrylamidgel unter denaturierenden
Bedingungen bestimmtes Molekulargewicht von 12000 Dalton aufweist.
7. Verfahren zur Herstellung eines Proteins nach Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet, daß man ein Protein mit den
immunologischen Eigenschaften des Proteins p16 von HIV-2 gewinnt und
reinigt, das immunologisch durch gegen ein menschliches HIV-2-
Retrovirus gebildete Antikörper erkannt wird und ein durch
Elektrophorese in einem Polyacrylamidgel unter denaturierenden
Bedingungen bestimmtes Molekulargewicht von 16000 Dalton aufweist.
8. Verfahren zur Herstellung eines Proteins nach Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet, daß man ein Protein mit den
immunologischen Eigenschaften des Proteins p26 von HIV-2 gewinnt und
reinigt, das immunologisch durch gegen ein menschliches HIV-2-
Retrovirus gebildete Antikörper erkannt wird und ein durch
Elektrophorese in einem Polyacrylamidgel unter denaturierenden
Bedingungen bestimmtes Molekulargewicht von 26000 Dalton aufweist.
9. Verfahren zur Herstellung eines Proteins nach Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet, daß man ein Protein mit den
immunologischen Eigenschaften des Proteins p36 von HIV-2 gewinnt und
reinigt, das immunologisch durch gegen ein menschliches HIV-2-
Retrovirus gebildete Antikörper erkannt wird und ein durch
Elektrophorese in einem Polyacrylamidgel unter denaturierenden
Bedingungen bestimmtes Molekulargewicht von 36000 Dalton aufweist.
10. Verfahren zur Herstellung eines Proteins nach Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet, daß man ein Protein mit den
immunologischen Eigenschaften des Proteins p42 von HIV-2 gewinnt und
rei
nigt, das immunologisch durch gegen ein menschliches HIV-2-
Retrovirus gebildete Antikörper erkannt wird und ein durch
Elektrophorese in einem Polyacrylamidgel unter denaturierenden
Bedingungen bestimmtes Molekulargewicht von 42000 - 45000 Dalton
aufweist.
11. Verfahren zur Herstellung eines Proteins nach Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet, daß man ein Protein mit den
immunologischen Eigenschaften des Hüllglykoproteins gp140 von HIV-2
gewinnt und reinigt, das immunologisch durch gegen ein
menschliches HIV-2-Retrovirus gebildete Antikörper erkannt wird und ein
durch Elektrophorese in einem Polyacrylamidgel unter
denaturierenden Bedingungen bestimmtes Molekulargewicht von 130000-140000
Dalton aufweist.
12. Zellkultur, dadurch gekennzeichnet, daß sie durch eine
rekombinante DNS, die eine zumindest von einem Teil der RNS des
menschlichen Retrovirus HIV-2 oder von einem seiner Varianten
abgeleitete Nukleinsäure enthält, unter Bedingungen, die die
Produktion eines Proteins oder eines Proteinteils nach dem
Verfahren des Anspruchs 1 erlauben, transformiert ist, wobei die
Nukleinsäure die Fähigkeit hat, mit der RNS des menschlichen
HIV-2-Retrovirus zu hybridisieren, und unter den stringenten
Bedingungen mit den Sonden 1 bis 4, die jeweils die Nukleotide
990-1070, 990-1260, 2170-2240, 3370-3640 der von dem Genom von
HIV-1 abgeleiteten DNS umfassen, nicht hybridisiert.
13. Zellkultur nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß es
sich um eine Kultur von Mikroorganismen, insbesondere von E.
coli, handelt.
14. Zellkultur nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß es
sich um eine Kultur eukaryotischer Zellen, insbesondere von
Hefen, handelt.
15. Zellkultur nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß es
sich um höhere eukaryotische Zellen, wie Säugetierzellen,
handelt.
16. Zellkultur nach einem der Ansprüche 12 bis 15, dadurch
gekennzeichnet, daß sie durch eine Nukleinsäure transformiert ist,
die eine Sequenz von Nukleotiden enthält, die die folgende
Sequenz von Aminosäuren GAGRODN oder einen Teil dieser Sequenz
kodiert, die bzw. der die Fähigkeit hat, eine immunologische
Reaktion mit gegen ein HIV-2-Retrovirus gerichteten Antikörpern zu
ergeben, wenn die Sequenz mit einem Serum eines durch das
genannte HIV-2-Retrovirus infizierten Patienten in Berührung
gebracht wird.
17. Zellkultur nach einem der Ansprüche 12 bis 15, dadurch
gekennzeichnet, daß sie durch eine Nukleinsäure transformiert ist,
die die nachfolgende Sequenz von Aminosäuren oder einen Teil
dieser Sequenz kodiert, wobei diese Sequenz oder der Teil dieser
Sequenz die Fähigkeit hat, eine immunologische Reaktion mit
Antikörpern gegen ein HIV-2-Retrovirus zu ergeben, wenn die
Sequenz mit einem Serum eines durch das genannte HIV-2-Retrovirus
infizierten Patienten in Berührung gebracht wird.
18. Zellkultur nach einem der Ansprüche 12 bis 15, dadurch
gekennzeichnet, daß sie durch eine Nukleinsäure transformiert ist,
die eine Nukleotidsequenz enthält, die die Gesamtheit oder einen
Teil der nachfolgenden Sequenz von Aminosäuren kodiert, wobei
diese Sequenz bzw. der Teil dieser Sequenz die Fähigkeit hat,
eine immunologische Reaktion mit Antikörpern gegen ein HIV-2-
Retrovirus zu ergeben, wenn die Sequenz mit einem Serum eines
durch das genannte HIV-2-Retrovirus infizierten Patienten in
Berührung gebracht wird.
19. Zellkultur nach einem der Ansprüche 12 bis 15, dadurch
gekennzeichnet, daß sie durch eine Nukleinsäure transformiert ist,
die eine Nukleotidsequenz enthält, die die Gesamtheit oder einen
Teil der nachfolgenden Sequenz von Aminosäuren kodiert, wobei
diese Sequenz bzw. der Teil dieser Sequenz die Fähigkeit hat,
eine immunologische Reaktion mit Antikörpern gegen ein HIV-2-
Retrovirus zu ergeben, wenn die Sequenz mit einem Serum eines
durch das genannte HIV-2-Retrovirus infizierten Patienten in
Berührung gebracht wird.
20. Anwendung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 11
zur Herstellung von Proteinen oder Teilen von Proteinen, die bei
Reaktionen zum Nachweis von gegen das HIV-2-Retrovirus
gerichteten Antikörpern eingesetzt werden können.
21. Anwendung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 11
zur Herstellung von immunogenen Proteinen oder Teilen von
Proteinen.
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