DK176253B1 - Præparat, fremgangsmåde og kit til påvisning af antistoffer mod et humant retrovirus in vitro - Google Patents

Description

i DK 176253 B1

Opfindelsen angår in vitro diagnose hos mennesker af muligheden for visse former af AIDS og med hensyn til visse af disse antigener præparater og kit til in vitro påvisning.

5

Isoleringen og karakteriseringen af et første retrovirus, betegnet LAV, der anses som ansvarlig for udviklingen af AIDS, er omtalt i en artikel af F. Barre-Sinoussi et al. allerede i 1983 (Science, vol. 220, nr. 45-99, 10 20, p. 868-871). Anvendelsen af visse ekstrakter af det te virus og mere specielt af visse af proteinerne heraf til diagnose af tilstedeværelsen af antistoffer over for viruset er mere specielt beskrevet i europæisk patentansøgning nr. 138 667. Siden da er lignende stammer og 15 visse varianter af LAV blev isoleret. Eksempler, der kan nævnes, er de der betegnes HTLV-III og ARV.

For at anvende de nye regler for nomenklatur publiceret i Nature i maj 1986 kaldes retrovira, der er i stand til 20 hos mennesket at inducere ovennævnte lymphadenopatier og AIDS, den generelle betegnelse "HIV", en forkortelse for udtrykket "humant immunodeficient virus". Undergruppen af retrovira dannet af LAV og dets varianter betegnedes oprindeligt "LAV type I" eller "LAV-I". Sidstnævnte un-25 dergruppe vil i det efterfølgende blive betegnet HIV-1, idet det skal forstås, at udtrykket LAV stadig vil blive bibeholdt for at betegne den stamme, blandt stammer af retrovirus (i specielt LAAV, IDAV-4 og IDAV-2) hørende til HIV-1 virusgruppen, der er beskrevet i ovennævnte 30 europæiske patentansøgning nr. 138 667, der anvendtes til sammenligningsforsøg beskrevet senere, nemlig LAVBRU, der deponeredes i Collection Nationale des Cultures de Micro-organismes (CNCM) (National Collection of Microor- 2 DK 176253 B1 ganism Cultures) i Pasteurinstituttet i Paris, Frankrig den 15. juli 1983 under nr. 1-232.

Det omhandlede hidtil ukendte retrovirus, og virusstam-5 mer, der er i slægt hermed, og som ligesom dette er i stand til at multiplicere i humane lymphocyter, er tidligere betegnet som "LAV type II" eller "LAV-II" og betegnes i det efterfølgende "HIV-2", idet det skal forstås, at betegnelserne for visse HIV-2 isolater beskre-10 vet neden for vil blive efterfulgt af tre bogstaver, der henfører til de patienter, hvorfra de er isoleret.

"HIV-2" gruppen kan defineres som en gruppe vira, der udviser in vitro tropisme over for humane T4 lymphocy-15 ter, og som har en cytopathogen virkning over for disse lymphocyter, når de formerer sig heri, og som derefter enten forårsager generelle og persistente polyadenopa-tier eller en af formerne af AIDS. HIV-2 retrovira har vist sig at være forskellig fra HIV-l type vira under 20 betingelser beskrevet nærmere nedenfor. Ligesom disse sidstnævnte vira er de forskellige fra andre humane retrovira, der allerede er kendt (HTLV-I og HTLV-II).

Skønt der er en forholdsvis vid genetisk variabilitet i 25 viruset, har forskellige HIV-l stammer isoleret indtil nu fra amerikanske, europæiske, afrikanske og patienter fra haiti antigene pladser fælles bevaret på deres vigtigste proteiner dvs. kerneprotein p25, omhyldningsgly-coprotein gpllO og transmembranproteinet gp41-43. Disse 30 forhold gør det muligt f.eks. for prototype LAV stammen at anvendes som en stamme for antigener til at afsløre antistoffer over for alle HIV-l gruppevirus, hos alle mennesker der bærer dem, uafhængig af deres oprindelse.

Derrne stamme er indtil for nylig anvendt til at afsløre 3 DK 176253 B1 anti-HIV-1 antistoffer hos bloddonorer og hos patienter specielt ved hjælp af immunofluorescens og specielt ved hjælp af metoden betegnet som ELISA, "Western Blot" (eller immuno-aftryk) og "RIPA" en forkortelse for radioim-5 munoprecipitationsforsøg.

I en serologisk undersøgelse udført med et HIV-1 lysat på patienter, der stammer fra Vestafrika, er det imidlertid blevet observeret, at visse af dem gav seronega-10 tive eller meget svage positive reaktioner, medens de viste kliniske og immunologiske tegn på AIDS.

Dyrkede lymphocyter fra en af disse patienter var kilden for et første HIV-2 isoleret retrovirus, hvis opbygning 15 i elektronmikrocop og hvis proteinprofil på SDS gele- lektrophorese viste en lighed med egenskaberne hos HIV-1. Dette nyt retrovirus HIV-2 besad imidlertid kun et ringe slægtskab med HIV-1 med hensyn til både antigenho-mologi af dets proteiner og med hensyn til homologien af 20 dets genetiske materiale.

Dette ny retrovirus eller retrovira med ækvivalente antigene og immunologiske egenskaber kan derfor udgøre kilder for antigener til diagnose af infektion med dette 25 virus og varianter heraf, der frembringer en AIDS form af den type, der er observeret i de oprindelige tilfælde hos afrikanske patienter eller hos folk, der har tilbragt en tid i Afrika.

30 Dette virus isoleredes f.eks. fra blod udtaget i nærværelse af heparin fra en 28 årig heteroseksuel patient, der aldrig havde modtaget blodtransfusion og som ikke var narkoman. Siden 1983 havde han haft næsten kronisk diarre og væsentligt vægttab (17 kg) med af og til op 4 DK 176253 B1 dukkende feber. For nylig havde han haft Candida og ser-ratia infektioner, herunder en oseophageal candidiasis typisk for AIDS.

5 Denne patient udviste også anæmi, cutan anergi, lympho-peni og et T4 lymphocyt-/T8 lymphocytforhold på 0,15 med et T4 lymphocytniveau på mindre end 100 pr. mm3 serum.

Hans lymphocyter svarede ved dyrkning ikke på stimulering med phytohæmagglutinin og concanavalin A. Denne 10 patient blev også diagnostiseret som lidende af gentagen bakteriæmi på grund af S. enteriditis, cryptosporidiose, infektioner på grund af Isopora belli og cerebrale to-xoplasmoser.

15 Denne kombination af kliniske tegn var bevis på "komplekse symptomer i forbindelse med AIDS" eller "ARC” (forkortelse for "AIDS-relateret kompleks") af den type, der er forårsaget af HIV-1 virus. Disse forskellige ob-servartioner var også i overensstemmelse med de kriteri-20 er, der anvendes af centeret for sygdomskontrol (CDC) i Atlanta, USA.

Dyrkningen af lymphocyter fra disse patienter og isoleringen af retroviruset udførtes i overensstemmelse med 25 metoder, der allerede er beskrevet for isolering af HIV-1 i artiklen af Barre-Sinoussi et al. og i europæisk patentansøgning nr. 84/401 834 - 0 138 667. De omtales alle kort nedenfor. Lymphocyter stimuleret i 3 dage med phytohæmagglutinin (PHA) dyrkedes i RPMI 1640 dyrknings-30 substrat, hvortil 10% føtalt kalveserum og 105 Μ β- mercaptoethanol, interleukin-2 og anti-(human interferon a) serum var tilsat.

5 DK 176253 B1

Produktionen af virus blev fulgt ved hjælp af dens omvendte transcriptaseaktivitet. I dyrkningssupernatanten forekom den maksimale virale aktivitet mellem dag 14 og dag 22, hvorefter den aftog. Nedgangen og uddøen af cel-5 lekulturen skete herefter. Som med HIV-1 viste sektioner af lymphocyter inficeret med HIV-2 ved elektronmikroskopi virioner, der havde nået modenhed, og virale partikler, der stak ud fra overfladen af de inficerede celler. Cellelinierne anvendt til frembringelse af kulturerne af 10 disse isolerede vira kan, afhængigt af tilfældet, være cellelinier af HUT, CEM eller MOLT typen eller en hvilken som helst immortaliseret lymphocytlinie indeholdende T4 receptorer.

15 Viruset propageredes herefter i kulturer af lymphocyter fra bloddonorer, og derefter i kontinuerete linier af leukæmisk oprindelse som f.eks. HUT 78. Det karakteriseredes herefter ved hjælp af dets antigener og dets nucleinsyre som værende i det væsentlige forskellig fra 20 HIV-1. Viruset rensedes som beskrevet i de allerede nævnte tidligere artikler. Et første isolat af dette virus deponeredes med CNCM den 19. december 1985 under nr. 1-502. Det betegnedes herefter med navnet LAV-II MIR. Et andet isolat deponeredes med CNCM den 21. febru-25 ar 1986 under nummeret 1-532. Dette andet isolat fik referencenavnet LAV-II ROD. Disse isolater vil af og til senere simpelt hen blive omtalt som MIR eller ROD.

Opfindelsen angår generelt et hvilket som helst præparat 30 til in vitro påvisning af den i krav l's indledning an-tivne art, og præparatet er karakteriseret ved det, der er angivet i krav l's kendetegnende del. Præparatet kan anvendes til diagnose af tilstedeværelsen i en biologisk væskeserum, specielt fra mennesker, der har været i kon- 6 DK 176253 B1 takt med HIV-2, af antistoffer over for mindst en af antigenerne fra HIV-2. Præparatet kan anvendes til selektiv diagnose af den tilsvarende varietet af AIDS, idet der anvendes diagnosemetoder som de, der f.eks. er 5 beskrevet i den ovennævnte europæiske patentbeskrivelse, bortset fra at ekstrakter, lysater eller rensede antigener af HIV-2 anvendes i stedet for sådanne af HIV-1. I denne forbindelse angår opfindelsen mere specielt præparater indeholdende mindst en af proteinerne pl2, pl6, 10 p26, der er indre proteiner, eller p36 eller gpl40. Som eksempel kan nævnes præparater, der samtidig indeholder følgende: p26 og gp 36 15 p26, p36 og gp 140, pl2, pl6 og p26, pl6, p26 og gp 140, osv.

Det er klart, at disse præparater kun er eksempler. Spe-20 cielt angår opfindelsen virale ekstrakter eller lysater indeholdende denne gruppe proteiner og/eller glycopro-teiner eller alle fraktioner, fra hvilket en eller flere af ovennævnte proteiner eller glycoproteiner forud er skilt.

25

Opfindelsen angår også præparater indeholdende en kombination af proteiner og/eller glycoproteiner af et HIV-2 med proteiner og/eller glycoproteiner af et HIV-1 som f.eks: 1 30 enten kerneproteiner af HIV-1 og HIV-2, specielt p25 fra et HIV-1 og p26 fra et HIV-2, eller alternativt p!8 fra et HIV-1 og p!6 fra et HIV-2, 7 DK 176253 B1 • eller omhylningsglycoproteiner fra et HIV-1 og om-hylningsproteiner fra et HIV-2, specielt gp lio fra HIV-1 og gp 140 fra HIV-2, eller alternativt p42 fra HIV-1 og p36 eller p42-45 fra HIV-2, 5 • eller naturligvis blandinger af proteiner og/eller glycoproteiner fra et HIV-1 og proteiner og/eller glycoproteiner fra et HIV-2.

10 Disse præparater gør det, når de anvendes ved diagnose muligt at diagnostisere AIDS eller symptomer, der står i forbindelse hermed, idet de strækker sig over et bredere spektrum af de ætiologiske agens, der er ansvarlige herfor. Anvendelsen af præparater til diagnostiske metoder, 15 der kun indeholder proteiner og/eller glycoproteiner af HIV-2, er ikke desto mindre anvendelige til mere selektiv diagnose af den katagori af retrovirus, der er ansvarlig for denne sygdom.

20 Den foreliggende opfindelse angår også en fremgangsmåde af den i krav 11's indledning angivne art til in vitro diagnose, der er karakteriseret ved det, der er angivet i krav 11's kendetegnende del. Eksempler på sådanne præparater er angivet ovenfor.

25

Foretrukne fremgangsmåder indebærer f.eks. immunoenzyma-tiske reaktioner af ELISA eller immunofluorescenstypen. Titreringer kan være målinger ved direkte eller indirekte immunofluorescens, ved direkte eller indirekte immu- 30 noenzymatiske forsøg.

Sådanne titreringer omfatter f.eks.: 8 DK 176253 B1 • anbringelse af afmålte mængder af det omhandlede ekstrakt eller omhandlede præparat i brøndene på en mikrotitreringsplade; 5 · indførsel i disse brønde af stigende fortyndinger af serum principielt indeholdende de antistoffer, hvis tilstedeværelse skal afsløres in vitro; • inkubering af mikrotitreringspladen; 10 • omhyggelig vask af mikrotitreringspladen med en passende puffer; • indførsel i brøndene på en mikrotitreringsplade af 15 mærkede antistoffer specifikke for humane immu- noglobuliner, idet mærkning udføres med et enzym valgt blandt sådanne, der er i stand til at hyro-lysere et substrat på en sådan måde, at sidstnævnte herefter undergår en forandring af dets strå-20 lingsabsorption, i det mindste i et specielt bøl ge længdebånd, og • afsløring, fortrinsvis ved sammenligning med en kontrol, af hydrolysegraden af substratet som et 25 udtryk for den potentielle risiko eller som en egentlig tilstedeværelse af sygdommen.

Den foreliggende opfindelse angår også kits til ovennævnte diagnose af den i krav 13's indledning angivne 30 art, der er karakteriseret ved det, der er angivet i krav 13's kendetegnende del.

Et kit kan omfatte 9 DK 176253 B1 • et ekstrakt eller en mere kraftigt renset fraktion af de ovennævnte virustyper, idet denne ekstrakt eller fraktioner er mærket f.eks, radioaktivt, enzymatisk eller ved immunofluorescens; 5 • anti-(human immunoglobuliner) eller et protein A (fordelagtig bundet på et understøttelseselement, der er uopløseligt i vand, som f.eks. agarose-kugler); 10 • et ekstrakt af lymphocyter opnået fra en rask person; • pufre og eventuelt substrater til visualisering af 15 mærkningen.

Af ovenstående vil det fremgå, at opfindelsen angår diagnosen af HIV-2 virus eller af en variant som et resultat af anvendelsen af de ovennævnte beskrevne prober ved 20 en fremgangsmåde, der anvender forskellige nedenfor anførte trin, idet disse trin er således arrangeret, at de blotlægger de karakteristiske egenskaber ved HIV-2 virus .

25 Generelt involverer opfindelsen en hvilken som helst variant af ovennævnte vira eller et hvilken som helst ækvivalent virus (f.eks. HIV-2-IRMO og HIV-2-EHO deponeret i CNCM den 19. december 1986 under nummrene henholdsvis 1-642 og 1-643), der indeholder strukturelle 30 proteiner, der har sammen immunologiske egenskaber som HIV-2 vira deponeret i CNCM under numrene 1-502 eller I-532. Med hensyn til definitionen af disse kriteriers ækvivalens skal dette nærmere omtales nedenfor.

10 DK 176253 B1 HIV-2 viruset eller varianter af dette i permanente cellelinier stammende fra T4 lymphocyter eller lymphocyter, der indeholder T4 phenotypen, fremstilles ved en metode, som består i at dyrke disse linier, der forud er infice-5 ret med HIV-2 virus, og at man udvinder, specielt når niveauet for omvendt transcriptaseaktivitet har nået en særlig tærskelværdi, visse mængder af viruset frigjort i dyrkningssubstratet.

10 En foretrukken permanent cellelinie til dyrkning af HIV-2 er f.eks. HUT 78 celletypen. En HUT 78 linie inficeret med HIV-2 deponeredes 6. februar 1986 i CNCM under nummeret 1-519. Dyrkning udføres f.eks. på følgende måde: 15 HUT 7 8 celler (106/ml) dyrkes sammen med inficerede normale humane lymphocyter (106/ml) . Dyrkningssubstratet er RPMI 1640 med 10% føtalt kalveserum. Efter 15-21 dage ses en cytopathogen virkning i HUT 78 cellerne. Omvendt transcriptase undersøges 1 uge efter denne observation i 20 den supernatante del af dyrkningsmediet. Det er herefter muligt at begynde at udvinde viruset fra den supernatante del.

En anden foretrukken linie til dyrkning hører til de 25 linier, der er betegnet CEM.

Infektion og herefter dyrkning af de inficerede CEM-celler kan udføres specielt som beskrevet nedenfor.

30 T4 lymphocyter inficeret forud med HIV-2 virus og uinfi-cerede celler af CEM linien dyrkes sammen i et tidsrum, der er nødvendig for infektion af CEM. Dyrkningen fortsættes herefter yderligere i et passende substrat f.eks. det, der er beskrevet nedenfor, og når den omvendte 11 DK 176253 B1 transcriptaseaktivitet i de inficerede celler har nået et tilstrækkeligt niveau, udvindes det frembragte virus fra dyrkningssubstratet.

5 Specielt udføres den samtidige dyrkning under betingelser, der er beskrevet nedenfor for humane T4 lymphocy-ter, der 5 dage forud er inficeret med en stamme af HIV-2 virus, der stammer fra en patient, i det efterfølgende betegnet "ROD" i et tilfælde og CEM i et andet tilfælde.

10

De inficerede T4 lymphocyter aktiveret forud med phyto-hæmagglutinin viste sig at være i besiddelse af en omvendt transcriptaseaktivitet på 5.000 cpm/106 normale T lymphocyter 3 dage efter infektionens begyndelse. Dyrk-15 ningen fortsatte indtil den målte omvendte transcriptaseaktivitet nåede 100.000 cpm i den supernatante del.

Disse T4 lymphocyter anbragtes herefter i kontakt med CEM celler (3 x 10s inficerede normale T lymphocyter) og inkuberedes atter i følgende dyrkningssubstrat: RPMI 20 1640 indeholdende 2,92 mg/ml L-glutamin, 10% dekomple- menteret føtalt kalveserum, 2 μg/ml polybren, 0,05% anti- inteferon-α- serum, 100.000 μg/ml penicillin, 10 μ9/Γη1 streptomycin og 10.000 μg/ml neomycin.

. 25 Dyrkningssubstratet udskiftedes to gange om ugen.

Målingerne af den omvendte transcriptaseaktivitet i den supernatante del var følgende: 30 på dag 0 1.000 (baggrund) på dag 15 20.000 på dag 21 200.000 på dag 35 1.000.000 12 DK 176253 B1

En CEM kultur inficeret med HIV-2 virus deponeredes i Collection Nationale de Cultures de Micro-organismes (CNCM) i Institut Pasteur under nummer 1-537 den 24. marts 1986.

5

Nogle enkelte egenskaber ved antigenerne og nucleinsy-rerne i forbindelse med oplysningen af HIV-2 blev fundet ud fra de eksperimenter, der udførtes under de neden for beskrevne betingelser. De vil i mange tilfælde bedre 10 kunne undersøges ved sammenligning af den samme type egenskaber i forbindelse med andre typer retrovirus specielt HIV-1 og SIV.

Idet der henvises til tegningen viser 15 fig. la, lb og lc krydsede immuno-præcipitationsforsøg mellem sera henholdsvis fra patienter inficeret med HIV-1 og HIV-2 og en resusabe inficeret med STLV-III på den ene side og med virale ekstrakter af HIV-l på den anden 20 side; fig. 2a og 2b viser sammenlignende resultater med hensyn til de elektrophoretiske vandringen af proteinerne fra henholdsvis HIV-l, HIV-2 og STLV-III i SDS-25 polyacrylamidgeler; fig. 3 viser resultaterne af krydset hybridisering mellem genome sekvenser af HIV-l, HIV-2 og STLV-III på den ene side og prober indeholdende forskellige subgenome 30 sekvenser af HIV-l virus på den anden side; fig. 4 er et restriktionskort over cDNA stammende fra RNA af HIV-2 ROD; 13 DK 176253 B1 fig. 5 er et restriktionskort af et E2 fragment af cDNA stammende fra HIV-2, idet dette fragment indeholder en region svarende til 3' LTR regionen af HIV-2; 5 fig. 6 er en nucleotidsekvens af en del af E2, idet denne sekvens svarer til U3/R regionen af HIV-2; fig. 7 viser: 10 · på den ene side og skematisk strukturelle elemen ter af HIV-1 (fig. 7A) og på linie med en region indeholdende HIV-1 3' LTR, sekvensen stammende fra E2 regionen af HIV-2 cDNA og, 15 · på den anden side de fælles nucleotider til stede henholdsvis i sekvensen stammende fra E2 regionen af HIV-2 og den tilsvarende sekvens af HIV-1 placeret på linie på bekostning af et antal deletioner og indskud (fig. 7B); 20 fig. 8 viser skematisk opbygningen af adskillige kloner af en fag modificeret ved adskillige indskud, der stammer fra cDNA stammende fra HIV-2 (klonerne ROD4, ROD27 og ROD35); sekvenserne stammer for deres vedkommende fra 25 R0D4, ROD27 og ROD35 subklonet i et plasmid pUC18, der også er vist skematisk på denne tegning, idet disse sidstnævnte sekvenser er anbragt således at de korresponderer med regionerne fra R0D4, ROD27 og ROD35, som de henholdsvis stammer fra; fig. 9 viser de relative intensiteter af hybridisering mellem 30 14 DK 176253 B1 a/ 11 fragmenter fjernet fra forskellige regioner af det komplette HlV-1-genom (idet fragmenterne er vist skematisk for neden på figuren), på den ene side og HIV-2 cDNA, der findes i R0D4, på den anden side, og 5 b/ fragmenter stammende fra HIV-2 med det samme c DNA.

Generelt stammer HIV-2 antigenerne anvendt i de sammenlignende forsøg, hvor beskrivelsen følger senere, fra 10 HIV-2 MIR stammen deponeret i CNCM under nummer 1-502, og DNA sekvenserne stammer fra det genome DNA af HIV-2, der stammer fra stammen HIV-2 ROD deponeret under nummer 1-532 i CNCM.

15 I - Antigener, specielt proteiner og glycoproteiner

Viruset oprindeligt dyrket i HUT 78 mærkedes metabolisk med [3SS] cystein og [35S] methionin, de inficerede celler inkuberedes i nærvær af disse radioaktive aminosyrer i 20 dyrkningssubstrat uden de tilsvarende umærkede aminosy rer i 14-16 timer specielt således som skrevet i artiklen betegnet med referencenummeret 21 i litteraturlisten, der findes efter selve beskrivelsen, med hensyn til mærkning med [35S] cystein. Den supernatante del kla-25 res herefter, og viruset ultracentrifugeres i 1 time ved 100.000 g på en pude af 20% saccharose. Hovedantigenerne af viruset skilte ved elektrophorese i en polyacryla-midgel (12,5%) under denaturerende betingelser (SDS), eller i en gel bestående af polyacrylamid (10%) + bi-30 sacrylamid (0,13%) med SDS (0,1% slutkoncentration).

Følgende farvede markører anvendtes som molekylvægtsreferencer : 15 DK 176253 B1 myosin 200 kd phosphorylase B 97,4 kd BSA 68 kd ovalbumin 43 kd 5 a-chymotrypsin 25,7 kd β-lactoglobulin 18,4 kd lysozym 14,3 kd

Andre molekylvægtmarkører anvendtes i andre forsøg. Det- 10 te gælder specielt for fig. la, lb og lc, der henviser til andre kendte molekylvægtmarkører (under bogstavet M i disse figurer). Antigenerne kan endnu lettere adskilles efter immunopræcipitation (RIPA) eller ved immu-noaftryk (Western blot) under anvendelse af antistoffer, 15 der forefindes i patientens serum: deres tilsyneladende molekylvægte bestemt ved deres tilsyneladende vandring er meget tæt på HIV-1 antigenerne.

Det skal specielt bemærkes, at i den efterfølgende 20 tekst, svarer tallene, der følger efter betegnelserne "p" og/eller "gp" til de omtrentlige molekylvægte af de tilsvarende proteiner og/eller glycoproteiner divideret med 1000. F.eks. har p36 en molekylvægt af størrelsesordenen 36.000. Det skal imidlertid forstås således, at 25 disse molekylvægtsværdier kan variere inden for et område, der kan nå 5%, 10% eller endog mere afhængig af den metode, der er anvendt til bestemmelse af disse molekylvægte .

30 Gentagelsen af forsøgene muliggjorde at de tilsyneladende molekylvægte af HIV-2 antigenerne kunne bestemmes mere nøjagtigt. Det blev således fundet, at molekylvægtene af de tre kerneproteiner, der oprindeligt var tildelte molekylvægtene af størrelsesordenen henholdsvis 16 DK 176253 B1 13.000, 18.000 og 25.000 faktisk havde tilsyneladende molekylvægte nærmere følgende værdier henholdsvis 12.000, 16.000 og 26.000. Disse proteiner er i det efterfølgende betegnet med forkortelserne pl2, pl6 og p26.

5

De samme betragtninger gælder for eksistensen af protein eller glycoproteinbånd, hvis tilsyneladende molekylvægte blev fastlagt ved værdier, der kunne ligge fra 32.000 til 42.000-45.000. Gentagelse af målingerne muliggør til 10 slut et bånd, der svarede til en molekylvægt på nøjagtigt 36.000. I den efterfølgende tekst er dette bånd betegnet med forkortelsen p36. Et andet bånd ved 42.000- 45.000 (p42} er i overensstemmelse hermed også fastlagt således. Den ene eller den anden af p36 eller p42 udgør 15 sandsynligvis et transmembranglycoprotein af viruset.

Et hovedomhylningsglycoprotein med en molekylvægt af størrelsesordenen 130-140 kd er blevet observeret: dette glycoprotein er i det efterfølgende betegnet gpl40.

20

Det skal bemærkes, at sædvanligvis fastlægges molekylvægtene med en nøjagtighed på ± 5%, idet denne nøjagtighed endog kan være lidt lavere for antigener med høje molekylvægte, således som det er fundet for gpl40 (mole-25 kylvægt på 140 ± 10%). Denne gruppe af antigener, (dersom de er mærket med [35S] cystein) genkendes kun svagt om overhovedet, af patientsera indeholdende anti-HIV-1-antistoffer i de systemer til afsløring, der anvendes i laboratoriet, eller under anvendelsen af tests, der an-30 vender HlV-1-lysater, som f.eks. de, der markedsføres af Diagnostics Pasteur under navnet "ELAVIA". Kun p26 proteinet immunopræcipiteredes svagt med disse sera. Omhyldningsproteinet udfældedes ikke. Serumet fra patienten inficeret med det omhandlede virus (HIV-2) genkender 17 DK 176253 B1 svagt et p34 protein af HIV-1. De anvendte systemer til afsløring genkendtes andre HIV-1 proteiner ikke.

I modsætning hertil er HIV-2 i besiddelse af nogle pro-5 teiner, der viser en vis immunologisk lighed med lignende strukturelle proteiner eller glycoproteiner, der er fraskilt under lignende betingelser fra et retrovirus, der for nylig er isoleret fra tamme macaq-aber af rhesu-sarten, medens dette immunologiske forhold har en ten-10 dens til at blive udvisket for andre proteiner eller glycoproteiner. Dette sidstnævnte retrovirus, der antages at være det ætiologiske agens for AIDS hos aber, betegnedes af forskerne, der isolerede det (litteraturreferencerne 16-18 nedenfor) med navnet "STLV-III^" . Af 15 bekvemmelighedshensyn vil det i det efterfølgende simpelt hen blive betegnet med "STLV-IIIAGM" (eller alternativt med udtrykket SIV, en forkortelse for "Abe immuno-deficient virus").

20 Et andet retrovirus betegnet "STLV-IIIAGM" eller "SIVAGM" isoleredes fra vilde grønne aber. I modsætning til viruset, der fandtes i rhesusaber, synes tilstedeværelsen af "STLV-IIIagh" ikke at inducere en AIDS-type sygdom hos afrikanske grønne aber.

25

Det immunologiske slægtsskab mellem de strukturelle proteiner og glycoproteiner fra HIV-2 på den ene side og STLV - IIImac og STLV - IIIAGM ret rovir a på den anden side og som et konsekvens heraf slægtsskabet mellem deres 30 nucleinsyresekvenser forbliver imidlertid begrænset.

Forsøg har muliggjort en første skelnen mellem de retro-vira, der er i stand til at inficere mennesker eller aber, hvor følgende er blevet klarlagt: 18 DK 176253 B1 HIV-2 virus formerer sig ikke på kronisk måde i lympho-cyter fra rhesusaber, dersom det er blevet injiceret in vivo og under arbejdsbetingelser, der muliggør udvikling af STLV- IIImac vira således som beskrevet af N. L. Letvin 5 et al., Science (1985), vol. 230, 71-75.

Denne manglende evne af HIV-2 til af udvikle sig hos aber under naturlige betingelser muliggør på den anden side at HIV-2 vira og STLV-III virusisolater er biolo-10 gisk differentiel.

Under anvendelse af samme metoder som nævnt ovenfor viste det sig, at det også var muligt at opnå følgende fra STLV-III: 15 • et hoved p27 kerneprotein, der havde en molekylvægt af størrelsesordenen 27 kd, • et hovedomhylningsglycoprotein, gpl40, 20 • et p32 protein, sandsynligvis transmembran, der ikke observeres i RIPA, dersom viruset er forud mærket med [35S] cystein, men som kan ses ved immu-noaftryksforsøg (Western blot) i form af brede 2 5 bånd.

Hovedomhylningsglycoproteinet af HIV-2 har vist sig at være immunologisk nærmere ved hovedomhylningsglycoproteinet af STLV-III end ved hovedomhylningsglycoproteinet 30 af HIV-1.

Disse fund gælder ikke alene med hensyn til molekylvægtene, 130-140 kd for hovedglycoproteinerne af HIV-2 og STLV-III i forhold til omtrent 110 for hovedomhylnings- 19 DK 176253 B1 glycoproteinet af HIV-1, men også med hensyn til de immunologiske egenskaber, da sera udtaget fra patienter inficeret med HIV-2 og mere specielt antistoffer dannet over for HIV-2 gpl40 genkender STLV-III gp!40 medens, i 5 sammenlignende forsøg, de samme sera og de samme antistoffer over for HIV-2 ikke genkender HIV-1 gpllO. Imidlertid genkender anti-HIV-2 ikke HIV-1 gpllO. Anti-Hiv-l-sera, der aldrig har reageret med HIV-2 gpl40, udfælder imidlertid et [35S] cysteinmærket 26 kd protein, der 10 findes i ekstrakter af HIV-2.

Hovedkerneproteinet af Hiv-2 synes at have en gennemsnitsmolekylvægt (omtrent 26.000) midt imellem molekylvægten af HIV-1 p25 og p27 af STLV-III.

15

Disse observationer stammer fra forsøg udført med virale ekstrakter opnået fra HIV-2 isoleret fra en af de ovennævnte patienter. Lignende resultater er opnået med virale ekstrakter af HIV-2 isoleret fra en anden patient.

20

Celler inficeret henholdsvis med HIV-1, HIV-2 og STLV-III inkuberedes i et substrat indeholdende 200 jnCi/ml [35S] cystein i et substrat uden umærket cystein i 16 timer. De klarede supernatante dele centrifugeredes 90 25 minutter ved 60.000 g i 90 min. Pellen lyseredes i en RIPA puffer (1), immunopræcipiteredes med forskellige sera og underkastedes herefter elektrophorese på po-lyacrylamidgel tilsat natriumdodecylsulfat (SDS-PAGE).

30 Resultaterne er angivet i la, lb og lc.

Fig. la viser de observerede resultater af immunopræci-pitation mellem et viral ekstrakt af HIV-1 opnået fra en CEM Cl.13 cellelinie og henholdsvis følgende sera: 20 DK 176253 B1 • anti-HIV-l-positiv serum {bånd 1), • serum opnået fra den først omtalte patient (bånd 5 2) , • serum fra en rask afrikansk bærer af anti-HIV-1-antistoffer (bånd 3), 10 · serum fra en macaq-abe inficeret med STLV-II1 (bånd 4), og • serum fra den anden omtalte patient (bånd 5).

15 I fig. Ib er optegnet de observerede resultater af immu-nopræcipitation mellem HIV-2 antigenerne opnået fra den første patient efter forudgående dyrkning med HUT-78 celler, og forskellige sera, mere specielt serumet fra førstnævnte patient (bånd 1), det anti-HlV-l-positive 20 serum (bånd 2), serumet fra macaq-aben inficeret med STLV-III (bånd 3) og serumet fra ovennævnte anden patient (bånd 4).

Til slut viser fig. lc de observerede resultater for

25 immunopræcipitation mellem antigenerne af et STLV-III

isolat opnået fra en macaq-abe med en abe AIDS. Det anvendte sera, hvortil båndene 1-5 henfører, er de samme som de, der er omtalt i forbindelse med fig. la.

30 M betyder markørerne myosin (200 kd), galactosidase (130 kd), bovint serumalbumin (69 kd), phosphorylase B (93 kd), ovalbumin (46 kd) og carbonsyreanhydrase (30 kd).

21 DK 176253 B1

Fig. 2a og 2b viser lignende resultater for de elek-trophoretiske vandringsegenskaber af proteinerne fra HIV-1, HIV-2 og STLV-III.

5 Fig. 2a angår forsøgene udført med ekstrakter af virus mærket med [3SS] cystein efter immunopræcipitation på SDS-PAGE. De forskellige bånd henfører til følgende virusekstrakter: virus opnået fra patient 1 og immunopræcipi-teret med serum stammende fra samme patient (bånd 1), 10 ekstrakt af det samme virus immunopræcipiteret med et negativt kontrolserum stammende fra en person, der ikke bærer anti-HIV-1 eller anti-HIV-2-antistoffer (bånd 2), ekstrakt af STLV-III virus immunopræcipiteret med et serum, der stammer fra en macaq-abe inficeret med STLV-15 III (bånd 3), immunopræcipitation observeret mellem ekstrakter af det samme virus og et negativt kontrolserum (bånd 4), og ekstrakt af HIV-1 immunopræcipiteret med serumet fra en europæisk patient inficeret med AIDS.

20 Fig. Ib viser resultater opnået ved Western blot (immu-no-aftryk) forsøg. Cellelysater stammende fra uinficere-de eller inficerede HUT-78 celler underkastedes elek-trophorese på SDS-PAGE og overførtes herefter elek-trophoretisk til et nitrocellulosefilter, inden der om-25 sattes med serumet fra ovennævnte første patient (serum fortyndet 1/100). Nitrocellulosefilteret vaskedes herefter og tilstedeværelse af de bundne antistoffer visualiseredes med 125I-mærket gede anti-humant IgG.

30 Pletterne observeret i båndene 1, 2 og 3 angår henholdsvis agglutinationsforsøgene mellem det ovennævnte serum og ekstrakterne af uinficerede HUT-78 celler (bånd 1), ekstrakter af HUT-78 celler inficeret med et HIV-2 virus (bånd 2) og ekstrakter af HUT-78 celler inficeret med 22 DK 176253 B1 STLV-III (bånd 3). Tallene, der forekommer i margenen ved siden af båndene, svarer til de omtrentlige molekylvægte af de mest repræsentative virale proteiner (molekylvægte i kilodalton).

5 II - Nucleinsyrer 1/ RNA fra HIV-2 retrovirus 10 RNA af viruset aflej ret på et filter således som det foretages ved "spot blot" metoden hybridicerede ikke under kraftige betingelser med DNA fra HIV-1.

Ved "kraftige betingelser" skal forstås de betingelser 15 ved hvilke hybridiseringsreaktionen mellem RNA fra HIV-2 og den udvalgte probe, radioaktivt mærket med 32P (eller mærket på anden måde) efterfulgt af vask af prøven udføres. Hybridiseringen, på en membran, udføres ved 42 °C i nærvær af en vandig opløsning specielt af 50% formamid 20 · (rumfang/rumfang) i 0,1% SDS/5X SSC i 18 timer. Membra nen, hvorpå hybridiseringsreaktionen udføres, vaskes herefter ved 65 °C i en puffer indeholdende 0,15% SDS og 0,1 X SSC.

25 Ved "ikke-kraftige betingelser" skal forstås de betingelser ved hvilke hybridiseringen og vasken udføres. Hybridiseringen udføres ved kontakt med den den udvalgte probe, mærket med 32P (eller mærket på anden måde) nemlig ved 42 °C i en 5 x SSC puffer, 0,1% SDS indeholdende 30% 30 formamid i 18 timer. Vask af membranen udføres ved 50 °C med en puffer indeholdende 0,1% SDS og 2 x SSC.

Hybridiseringsforsøgene udførtes også med en hybridise-ringsprobe bestående af et rekombinant plasmid pBTl op 23 DK 176253 B1 nået ved kloning af DNA fra HIV-1 stammende fra X'J19 (Cell 1985, vol. 40, p. 9) i vektoren pUC18. Under ikke-kraftige betingelser observeredes kun meget svag hybri-disering mellem RNA'en fra HIV-2 og det klonede DNA 5 stammende fra HIV-1.

Andre prober indeholdende klonede sekvenser af HIV-1 anvendtes: 10 a/ enkeltstrengede prober fra subgenomt DNA fra HIV-1 produceret fra subkloner af HIV-l-genomet og indført i fag M13. De klonede regioner står i forbindelse med pro-teasegenet eller "endonuclease" genet.

15 Kun en probe fra endonuleaseregionen af HIV-1 (nucleo-tidsekvensen mellem base nr. 3760 og 4130) gav svag hy-bridisering under ikke-kraftige betingelser med HIV-2. "Protease" proben (HIV-1 nucleotidsekvensen mellem baserne nr. 1680 og 1804) hybridiserede ikke selv under 20 ikke-kraftige betingelser med HIV-2.

b/ En probe pRS3 bestående af sekvensen, der koder for "omhylning" regionen af HIV-1 (subkloning i pUC18) hybridiserede ikke under ikke-kraftige betingelser med 25 HIV-2.

"Spot blot" teknikken er også betegnet "dot blot" (overførsel ved hjælp af pletter).

30 Yderligere hybridiseringsresultater mellem genome RNA fra HIV-l, HIV-2 og STLV-III på den ene side og prober indeholdende forskellige subgenome sekvenser af HIV-1 virus på den anden side er vist i fig. 3.

24 DK 176253 B1

De supernatante dele af de forskellige dyrkningssubstrater (i mængder på 0,5 til 1 ml pr. plet) centrifugeredes i 5 minutter ved 45.000 omdrejninger pr. minut; pellen blev genopslæmmet i en NTE puffer indeholdende 0,1% SDS 5 og anbragtes på et nitrocellulosefilter. Dette var forud dyppet i et 2 x SSC substrat (0,3 M NaCl, 0,03 M natriumnitrat) . Efter bagning (i 2 timer ved 80 °C) hybridise-redes filtrene med forskellige prober indeholdende genome subfragmenter af HIV-1 under ikke-kraftige betingel-10 ser (30% formamid, 5 x SSC, 40 °C) , vaskedes ved 50 °C med 2 x SSC opløsning indeholdende 0,1% SDS og autora-diograferedes herefter i 48 timer ved -70 °C med en for-størrelsesskærm.

15 Proberne 1-4 er enkeltstrengede prober opnået ved "prime cut" metoden, således som beskrevet i (25) . Kort fortalt ligeredes de enkeltstrengede fragmenter stammende fra M13 viruset og indeholdende subgenome HIV-1 indskud (30) til oligomere fragmenter (17 nucleotider) stammende fra 20 M13 (Biolabs). Den komplementære streng syntetiseredes herefter med Klenow enzym i en TM puffer (10 mM Tris, pH 7,5, 10 mMMgCl^) i nærværelse af dATP, dGTP, dTTP og dCTB mærket med 32p ved α-stillingen (Amersham, 3000 Ci/mmol). Herefter blev DNA nedbrudt med de passende restriktions-25 enzymer, varmedenatureret og underkastet elektrophorese på en denaturerende polyacrylamidgel (indeholdende 6% acrylamid, 8 M urinstof i en TDE puffer). Herefter auto-radiograferedes gelen i 5 minutter. Proben blev herefter afskåret og elueret i en 300 mmol NaCl, 0,1% SDS puffer.

30 Specifik aktivitet (SA) af de enkeltstrengede prober bestemtes ved 5 x 108-109 henfald pr. minut/mikrogram (dpm/^g).

25 DK 176253 B1

De karakteristiske sekvenser til stede i de forskellige prober var følgende:

Probe 1 : nucleotider 990-1070, 5 Probe 2 : nucleotider 980-1260,

Probe 3 : nucleotider 2170-2240,

Probe 4 : nucleotider 3370-3640.

Numrene på de ovennævnte nucleotider er de, der er an-10 ført under litteraturhenvisningen (30).

Endelig består probe 5 af et plasmid pUC18 der bærer EcoRl-Sacl fragmentet af HIV-klonen i λJ19 (31), der underkastedes nicktranslation til opnåelse af en SA på 15 omtrent 10® dpm/^g.

De relative beliggenheder af de subgenome fragmenter i proberne med hensyn til hele HIV-1 genomet er angivet skematisk i fig. 3. De forskellige pletter svarer hen-20 holdsvis til følgende:

Plet A: et virus er opnået fra en kultur af CEM Cl.13 celler inficeret med HIV-1, 25 Plet B: et virus er opnået fra HUT-78 celler inficeret med STLV-III,

Plet C: og D: isolater opnået henholdsvis fra vira af de ovennævnte to afrikanske patienter,

Plet E: negativ kontrolcelleekstrakt opnået fra uinfice-rede HUT-78 celler, 30 26 DK 176253 B1

Plet F: virus opnået fra en patient fra Zaire der lider af AIDS, der er dyrket i normale T lymphocyter i nærvær af TCGF.

5 Alle pletterne opnåedes med en mængde virus svarende til 25.000 dpm omvendt transcriptaseaktivitet, bortset fra plet C: 15.000 dpm.

Følgende observationer blev foretaget: 10

De genome RNA fra de to HIV-2 isolater opnået fra rensede virale partikler hybridiserede ikke med nogen af pro-berne under de ovenfor beskrevne kraftige betingelser, skønt de virale partikler isoleredes og rensedes fra 15 dyrkningssupernatantdelene af højt inficerede celler, der viste tegn på høj omvendt transcriptaseaktivitet.

Under de ovenfor beskrevne milde betingelser blev følgende observationer gjort: Alle proberne hybridiserede 20 kraftigt med de genome RNA opnået fra kontrol HIV-1 præparaterne og fra et andet isolat opnået fra en patient fra Zaire, der lider af AIDS.

To af de opnåede prober (nucleotider 990-1070 og 990-25 1260, der begge stammede fra gag regionen af HIV-1) hy bridiserede lidt med pletterne fra ekstrakter af HIV-2 retrovira; kun en af disse to prober (nucleotider 990-1260) viste også ringe hybridisering med STLV-III pletten (fig. 3). Hvad angår proben indeholdende et fragment 30 af pol regionen (nucleotiderne 2170-2240) observeredes hybridisering med STLV-III og, skønt betydelig svagere med RNA af HIV-2. Den anden probe af pol regionen (nucleotider 3370-3640) hybridiserede ikke med nogen af HIV-2 og STLV-III pletterne.

27 DK 176253 B1

Endelig hybridiserede proben modificeret ved nicktranslation og indeholdende hele env genet og LTR (nucleotiderne 5290-9130) af HIV-2 ikke hverken med RNA 5 af STLV-III eller med RNA af HIV-2.

Det skal også bemærkes, at en anden probe, der ved 5'-enden af pol aflæsningsrammen af HIV-1 (svarende til proteaseregionen) ikke hybridiserede hverken med RNA af 10 HIV-2 eller med RNA af STLV-III.

Det fremgår således også af det ovenstående, at HIV-2 viruset synes at være fjernere, fra et strukturelt standpunkt, fra HIV-1 viruset, end det er fra STLV-III.

15 HIV-2 er imidlertid signifikant forskellig fra STLV-III, hvilket viser sig i de forskellige resultater opnået med hensyn til de infektiøse evner af HIV-2 vira, der er bogstavelig talt nul i aber, i forhold til de klare infektiøse egenskaber af STLV-III vira i de samme abear-20 ter.

Restriktionsskortene og de genome RNA sekvenser af HIV-2 eller af cDNA opnået fra disse genome RNA'er er tilgængelige for fagmanden, da stammerne af HIV-2 deponeret i 25 CNCM efter passende multiplicering kan udstyre fagmanden med det genetiske udstyr, der er nødvendig for bestemmelsen af disse restriktionskort og nucleotidsekvenser.

De betingelser, under hvilke restriktionskortet af geno-met af den ene af de omhandlede HIV-2 isolater blev 30 fastlagt og betingelserne under hvilke visse dele af cDNA stammende fra disse genomer blev sekvensbedømt, er beskrevet nedenfor.

28 DK 176253 B1

Restriktionskortet af genomet af et retrovirus, der er repræsentativ for HIV-2 retrovira, er angivet i fig. 4. Restriktionskortet af et væsentligt fragment af dette cDNA er vist i fig. 5. Endelig er en del af dette sidst-5 nævnte fragment blevet sekvensbedømt.

Denne sekvens og et antal af restriktionspladserne, som den indeholder, er angivet i fig. 6. Det klonede hele cDNA - eller klonede fragmenter af dette cDNA-, kan i 10 sig selv anvendes som specifikke hybridiseringsprober.

2/ cDNA og fragmenter af dette cDNA stammer fra RNA af HIV-2 15 De betingelser, under hvilket ovenfor beskrevne cDNA blev opnået, er beskrevet nedenfor.

Første trin i fremstillingen af dette cDNA omfattede produktionen af et oligo(dT), der tjener som en primer 20 eller en initiator cDNA streng, ved at udføre en endogen reaktion aktiveret med et detergent, under anvendelse af den omvendte transcriptase af HIV-2 på rensede virioner opnået fra de supernatante dele af inficerede CEM-celler. CEM-cellelinien var en lymphoblastoid CD4 + cel-25 lelinien beskrevet af G. E. Goley et al. i Cancer 18: 522-529 (1965), som der herved henvises til. Disse anvendte CEM celler inficeres med et ROD isolat, der havde vist sig at frembringe væsentlige mængder HIV-2 kontinuert .

30

Efter syntesen af den anden streng (i nærværelse af nucleotider og en bakteriel DNA polymerase) indførtes de dobbelstrengede cDNA i en bakteriel fag vektor M13 TG130. Et fagbibliotek på 104 rekombinante M13 fager op- 29 DK 176253 B1 nåedes og underkastedes en in situ afsøgning med en HIV-1 probe. Denne indeholder et 1,5 kb fragment stammende fra 31-enden af cDNA stammende fra RNA af LAV isolatet (vist i fig. 7A). Omtrent 50 positive plaques afsløre-5 des, rensedes og karakteriseredes ved krydshybridisering af indskuddene og sekvensbedømmelse af enderne.

Denne fremgangsmåde muliggjorde, at forskellige kloner kunne isoleres, indeholdende sekvenser omtrent komple- 10 mentære med 3'-enden af det polyadenylerede RNA af LTR [forkortelse for "long terminal repeat" af HIV-1, beskrevet af S. Wain Hobson et al. i Cell 40: 9-17 (1985)] regionen, som der herved henvises til.

15 Det største af indskuddene af gruppen af de pågældende M13 kloner, der hybridiserer med 3' LTR regionen af HIV-1, er en omtrentlig 2 kb klon betegnet E2. Ligesom 3' LTR regionen af HIV-1 indeholder klonen E2 et AATAAA signal anbragt omtrent 20 nucleotider oven for en po- 20 ly(A) endestilling, og en 3' LTR region svarende til regionen af HIV-2. Efter delvis sekvensbedømmelse viste denne 3' LTR region af HIV-2 sig at være i besiddelse af et svagt slægtsskab med den homologe region af HIV-1.

25 Fig. 5 er et restriktionskort af fragmentet af E2 (aflangt rektangulært areal) indarbejdet i plasmid pSPE2, der indeholder det. Det omfatter en del af R regionen og U3 regionen af HIV-2. Tegningen viser ikke grænserne af R og U3 regionerne.

30

Sekvensen af en del af E2 er vist i fig. 6. Stillingerne for de specifikke restriktionspladser er angivet heri.

Den lille grad af slægtsskab mellem 3’ LTR regionerne af HIV-1 og HIV-2 er angivet i fig. 7. Faktisk kan kun om- 30 DK 176253 B1 trent 50% af nucleotiderne af de to LTR sekvenser anbringes på linie (omtrent 50% sekvenshomologi) på bekostning af visse indskud eller deletioner. Til sammenligning hermed er sekvenshomologien af de tilsvarende 5 områder af de forskellige amerikanske og afrikanske iso-later af HIV-1 større end 95% uden indskud eller deletion.

Klonen E2 anvendtes som en specifik probe for HIV-2, til 10 identificering på et hybridiseringsfilter af sekvenserne stammende fra HIV-2 og til stede i andre kloner.

Denne probe afslører også det genome RNA af HIV-2 under kraftige betingelser. Den muliggør ligeledes afsløring 15 ved hjælp af den såkaldte "Southern blot" metode på DNA fra CEM eller lignende celler inficeret med et ROD iso-lat eller med andre HIV-2 isolater. Intet signal afsløres under de samme belastningsbetingelser i forsøg med hybridisering af denne probe med cDNA stammende fra uin-20 ficerede celler eller fra celler inficeret med HIV-1.

Disse resultater bekræfter den exogene natur af HIV-2 med hensyn til HIV-1. En omtrentlig 10 kb art, sandsynligvis svarende til det ikke-integrerede virale DNA, afsløredes som en principiel bestanddel i det ikke-25 nedbrudte DNA fra celler inficeret med HIV-2. En anden DNA med en omtrentlig størrelse på 6 kb, muligvis svarende den cirkulære form af det virale DNA, afsløredes også.

30 De andre dele af HIV-2 genomet identificeredes også. Til dette formål opbyggedes et genombibliotek i fag xl47.

Fag XL47.1 er beskrevet af W.A.M. Loenen et al. i Gene 10 249-259 (1980), som der herved henvises til.

31 DK 176253 B1

Det genome bibliotek opbygges med fragmenter opnået ved nedbrydning af DNA stammende fra CEM cellelinien inficeret med HIV-2 ROD efter nedbrydning med enzymet Sau3AI.

5 Omtrent 2 x 10s rekombinante plaques blev af søgt in si tu med en klon indeholdende det mærkede E2 indskud fra HIV-2 cDNA. 10 rekombinante fager afsløredes på plaques og rensedes. Restriktionskortene over tre af disse fager, karakteriseret ved hjælp af deres evne til "Southern 10 blot" hybridisering med E2 indskud under kraftige betingelser såvel som med subgenome prober fra HIV-1 linder milde betingelser er angivet.

En klone indeholdende et 9,5 kb indskud og stammende fra 15 hele det cirkulære virale DNA indeholdende det komplette HIV-2 genom .identificeredes. Den betegnedes "XROD 4". De andre to kloner XR0D27 og XROD35 stammende fra integrerede provira bærer LTR sekvenser af de virale kodende sekvenser og nabostillede celle DNA sekvenser. De for-20 skellige sekvenser er angivet i fig. 8.

Fragmenter af λ-klonerne subklonedes i plasmid vektor pUC18. Fragmenterne stammende -fra XROD4, XROD27 og XROD35 og respektive subkloner i ovennævnte plasmidvek-25 tor ses også i fig. 8. Følgende subkloner blev opnået: pROD 27-5, stammende fra XROD27, indeholder en 5,2 kb region af HIV-2 genomet og nabostillede cellesekvenser (5' LTR og 5' kodende viralsekvens omkring en EcoRI 30 plads); pROD 4.8, stammende fra XROD4, indeholdende et omtrentligt 5 kb Hindlll fragment. Dette fragment svarer til den centrale del af HIV-2 genomet; 32 DK 176253 B1 pROD 27-5' og pROD 4.8 indeholder HIV-2 indskud, der overlapper hinanden; 5 pROD 4.7 indeholder et 1,8 kb Hindlll fragment af XROD4; dette fragment er anbragt i 3-retningen med hensyn til det subklonede fragment i pROD 4.8 og indeholder omtrent 0,8 kb kodende virale sekvenser og en del beliggende mellem BamHI og Hindlll kloningspladserne af den venstre 10 arm af fag λ (XL47.1).

pROD 35 indeholder alle HIV-2 kodesekvenserne i 3-retningen i forhold til EcoRI pladsen, 3' LTR enden og omtrent 4 kb nabostillede nucleotidsekvenser af cellulær 15 oprindelse; pROD 27-5' og pROD 35 til stede i E. coli HB 101 deponeredes den 21. november 1986 hos CNCM under betegnelsen 1-626 og 1-633; 20

Det komplette HIV-2 ROD genom, hvis restriktionskort er angivet i fig. 4, blev genopbygget fra pROD 35, forud lineariseret med EcoRI og pROD 27-5'. EcoRI indskuddet af pROD 27-5 ligeredes i den tilsvarende retning i EcoRI 25 pladsen af pROD 35.

Graden af slægtskab mellem HIV-2 og de andre humane eller aberetrovira blev undersøgt ved gensidige hybridise-ringsforsøg. Den relative homologi mellem de forskellige 30 områder af HIV-1 og HIV-2 genomerne bestemtes ved hybri-diseringsforsøg af fragmenter stammende henholdsvis fra klonet HIV-1 genom og fra radioaktivitetsmærket χROD4.

De relative beliggenheder af disse fragmenter (nummere- 33 DK 176253 B1 ret fra l-ll) i forhold til Hiv-1 genomet er angivet forneden på fig. 9.

Selv under meget milde betingelser (Tm 42 °C) hybridise-5 rer HIV-1 og HIV-2 genomerne kun på niveauet i forhold til deres respektive gag gener (plet 1 og 2), omvendte transcriptaseregioner i pol {plet 3) og regioner af pol, Q (eller sor) gener (plet 5) og F (eller 3' orf) gener og 3' LTR (plet 11). HIV-1 fragmentet anvendt til afslø-10 ring af de første cDNA kloner af HIV-2 svarer til sub-klonen fra plet 11, der hybridiserer forholdsvis godt med HIV-2 under milde betingelser. Et signal stammende fra plet 5 er det eneste, der bliver tilbage efter kraftig afvaskning. Omhylningsgenet, tat området og en del 15 af pol viser sig at være højt divergent. Disse resultater såvel som sekvensen opnået med LTR (fig. 33) viser at HIV-2 ikke er (under alle omstændigheder med hensyn til dens omhylning) en variant af HIV-1.

20 Det blev observeret, at HIV-2 er nærmere beslægtet med SIV [beskrevet af M. D. Daniel et al. i Science 228: 1201-1204 (1985)], som der herved henvises til, end den er med HIV-1.

25 Alle proteinerne fra SIV, herunder også omhylningsprote-inet, immunopræcipiteres af sera fra patienter inficeret med HIV-2, medens den serologiske krydsreaktivitet af HIV-1 og HIV-2 er begrænset til kerneproteinerne. Imidlertid kan SIV og HIV-2 skelnes på grund af de nævnte 30 forskelle med hensyn til molekylvægten af deres proteiner.

Med hensyn til nucleotidsekvenserne skal det også bemærkes, at HIV-2 er beslægtet med SIV.

34 DK 176253 B1

Herudover gør karakteriseringen af HIV-2 det også muligt at afmærke regionen for omhylningsglycoproteinet, der er ansvarlig for at binde viruset til overfladen af target 5 cellerne og den efterfølgende internalisering af virus et. Den gensidige indvirkning sker via selve CD4 molekylet, og det synes, at HIV-1 og HIV-2 anvender den samme receptor.

10 Skønt der således er store forskelle mellem env generne af HIV-1 og 2, kan de afgrænsede homologe regioner af omhylningerne af de to former af HIV betragtes som værende bestanddele af binding til en fælles receptor fra T4 lymphocyter. Disse pladser er nødvendige for at danne 15 epitoper, der bærer immunogenisiteten af peptider, der kan anvendes til hos mennesker at fremkalde et beskyttende immunrespons over for HIV-vira.

Fordelagtige sekvenser til at dannelse af prober ved 20 hybridiseringsreaktioner med det genetiske materiale fra patienter, der bærer vira eller provira, specielt til afsløring af tilstedeværelsen af HIV-2 virus RNA i deres lymphocyter, indeholder en nucleotidsekvens, der er et resultat af kombinationen af 5 kb Hindlll fragmenter af 25 ROD4 og E2 cDNA. Forsøgene kan udføres ved alle metoder, specielt ved hjælp af "Northern blot", "Southern blot" og "dot blot" teknikker.

Yderligere beskrivelser af opfindelsen vil fremgå af de 30 efterfølgende eksempler til identifikation af visse dele af det retrovirale genom og af fremstillingen af et antal rekombinante DNA, der indeholder forskellige dele af et cDNA, der stammer fra det retrovirale genom af HIV-2.

35 DK 176253 B1

EKSEMPLER

EKSEMPEL I

5 DNA probe til anvendelse i diagnoseudstyr for HIV-2

Et cDNA komplementært til det genome RNA opnået fra rensede virioner fremstilledes på følgende måde: 10 Den supernatante del opnået efter 48 timers dyrkning af CEM celler inficeret med et HIV-2 ROD isolat af HIV-2 ultracentrifugeredes. Centrifugepellen indeholdende vi-rionen centrifugeredes på en saccharosegradient til dannelse af en ny centrifugepelle, i det væsentlige således 15 som beskrevet i europæisk patentansøgning nr. 84/401.234 - 0 138 667, der allerede er omtalt.

Det rensede HIV-2 præparat anvendtes til syntese af cDNA, idet man anvendte en endogen reaktion aktiveret 20 med et detergent.

Kort fortalt sattes virionpræparatet til en reaktions-blanding indeholdende 50 mM Tris-HCl, 5 mM MgCl2, 10 mM DTT, 0,025% af detergentet markedsført under navnet 25 "Triton" og 50 μΜ af hver af de 4 deoxynucleo- sidtriphosphater og en oligo(dT) initiator. Omsætningen udførtes ved 37 °C i 90 minutter.

Efter ekstraktion med phenol af de tilstedeværende pro-30 teiner i det første reaktionsmedium syntetiseredes den anden cDNA kæde i nærværelse af RNAse, E. coli DNA polymerase 1 og de 4 deoxynucleotider i 1 time ved 15 °C og 1 time ved 22 °C. Der frembragtes stumpe ender på dette dobbeltstrengede cDNA ved indvirkning af T4 DNA polyme- 36 DK 176253 B1 rase. Alle reagenser ved denne metode er kommercielt tilgængelige (Amersham cDNA kit) og anvendtes ifølge fabrikantens anbefalinger.

5 Efter (1) ligation af adaptorer flinkere) indeholdende en EcoRI plads (leveret af Pharmacia) til de stumpe ender af cDNA i tilstedeværelse af en T4 DNA ligase (markedsført af Biolabs), (2), nedbrydning af disse linkere med restriktionsendonucleasen EcoRI, og (3) fjernelse af 10 linkerfragmenterne ved gelfiltrering (gelsøjle markedsført under navnet "Ultrogel") på AcA 34 (LKB-IBF) indføres cDNA i en M 13 TG 130 vektor spaltet med EcoRI. Et cDNA-bibliotek opnåedes efter transformation af E. coli stamme TGI. Der opnåedes omtrent 104 rekombinante M13 15 plaques.

For i cDNA-biblioteket at selektere de rekombinante M13 kloner, der indeholder HIV-2 cDNA, anvendtes plaque shybridi seringsmetoden. DNA fra M13 plaquene overfør-20 tes til nitrocellulosefiltre og hybridiserdes med subge-nome HIV-l-prober stammende fra VXJ19" klonen af et LAV (eller HIV) virus beskrevet i den europæiske patentansøgning. Denne probe indeholdt et indskud bestående af en del med en omtrentlig længde på 1500 basepar (bp) 25 HIV-1 DNA. Dette indskud blev bundet ved hjælp af 2 Hin-dlll restriktionspladser henholdsvis inden for den åbne aflæsningsramme af "env" genet og i R-segmentet af 3' LTR enden af HIV-1. Denne probe indeholdt 3' enden af env genet, hele F-genet, U3-segmentet og en del af R-30 segmentet af LTR med en omtrentlig længde på 1500 basepar (bp) .

Proben indeholdende 1,5 kg Hindlll indskudet mærkedes med [32P] -dCTP og -dTTP (32000 Ci x 10"3 mol) ved at inku- 37 DK 176253 B1 bere proben i nærværelse af initiatorer og Klenow DNA polymerase 1x4 timer ved 15 °C (under anvendelse af et Amersham kit). Hybridiseringsforsøgene over cDNA klonerne fra biblioteket udførtes natten over under milde be-5 tingelser i en opløsning af et hybridiseringssubstrat indeholdende 5 x SSC, 5 x Denhart, 25% formamid, 100 ^g/ml denatureret laksesperma DNA og en mærket probe (2 x 107 cpm med en specificitet på 109 cpm/Vg) ved 37 °C.

Trinnene underkastedes tre vaskebehandlinger efter hin-10 anden i tilstedeværelse af tre opløsninger, hvis sammensætning er angivet nedenfor:

Vask nr. 1: 5 x SSC, 0,1% SDS, ved 25 °C i 4 x 15 min.

15 Vask nr. 2: 2 x SSC, 0,1% SDS, ved 42 °C i 2 x 30 min.

Vask nr. 3: 0,1 x SSC, 0,1% SDS, ved 65 °C i 2 x 30 min.

Hver vask blev efterfulgt af autoradiografi af filtrene.

20

Adskillige positive kloner afsløredes efter vask nr. 1 og kunne stadig ses efter vask nr. 2. Imidlertid forsvandt alle signalerne efter vask nr. 3. Dette indicerer, at de positive kloner kun havde svagt slægtskab med 25 HIV-1 genomet, der ikke desto mindre var tilstrækkelig til at udføre ovennævnte selektion. De positive kloner dyrkedes videre, anbragtes atter på plaques og hybridi-seredes med den samme probe under betingelser, der svarende til vask nr. 1. De fleste af dem var stadig posi-30 tive.

Klonerne anvendtes også til at udvælge en total human DNA probe under moderate betingelser og ved hybridise-ring i 5 x SSC, 5 x Denhart og 40% formamid efterfulgt 38 DK 176253 B1 af vask i 1 x SSC, 0,1% SDS ved 50 °C. Ingen af de tidligere positive kloner afsløredes og som en konsekvens heraf svarer ikke til specifik gentaget DNA eller til cDNA fra det ribosomale RNA.

5

De positive M13 rekombinantkIoner dyrkedes i et flydende substrat og karakteriseredes på følgende måde: (1) Størrelse af deres indskud: 10

En Ml3 enkeltstrenget type DNA opnåedes fra hver enkelt klon, og syntese af den anden streng udførtes med en M13 17-mer initiatorsekvens og Klenow enzymet. Indskuddene blev udskåret under anvendelse af EcoRI (Boehringer) og 15 analyseret ved hjælp af agarosegelelektrophorese. Hoveddelen af indskuddene indeholdt fra 200 til 600 og 200 bp bortset fra klonen betegnet E2.1, der havde en omtrentlig længde på 2 kbp.

20 (2) Analyse af nucleotidsekvensen:

Adskillige kloner blev delvis sekvensbedømt under anvendelse af dideoxymetoden beskrevet af Sanger et al., i Proc. Natl. Acad. Sci. 74:5463-7 (1977), som der herved 25 henvises til. Forskellige uafhængige kloner indeholdt lignende nucleotidsekvenser bortset fra poly(A) kæderne ved deres 3' ender, hvis længde var forskellig. Disse resultater viser, at disse cDNA kloner stammede fra RNA skabelonen. Detaljeret sekvensanalyse af disse cDNA klo-30 ner, herunder 3' enden af HIV-2 genomet,. viste et begrænset slægtsskab med HIV-1.

39 DK 176253 B1 (3) Hybridisering med det genome RNA og DNA af HIV-2: (a) Produktion af det genome RNA og HIV-2: 5 En inficeret supernatant del centrifugeredes (50.000 omdrejninger, 3 0 minutter). Det aflej rede bundfald gen-opslæmmedes i 10 mm Tris pH 7,5, 1 mM EDTA, 0,1% SDS. En af indskudsklonerne, Fl.l, mærkedes og anvendtes som en probe til hybridisering med det genome RNA fra forskel-10 lige virale isolater, i overensstemmelse med "dot-blot" metoden.

"Dot-blot" metoden omfattedes følgende trin: 15 (i) Anbringelse af prøven (HIV-2 lysat) i pletter på en nitrocellulosemembran forud vædet i 20 x SSC (3 M NaCl, 0,3 M natriumcitrat) og lufttørret, (ii) bagning af membranen i 2 timer ved 80 °C og (iii) udførsel af hybridi-seringen.

20

Hybridiseringen udførtes under kraftige betingelser (5 x SSC, 5 x Denhart, 50% formamid ved 42 °C) . Den efterfulgtes af vask i 0,1 x SSc, 0,1% SDS ved 65 °C. Under disse betingelser hybridiseredes proben kraftigt til pletter-25 ne, der stammede fra to uafhængige isolater af HIV-2, herunder LAV-III ROD, hvorfra det klonede cDNA stammede.

Et svagt hybridiseringssignal afsløredes med pletten dannet af STLV-III mac [abe T-lymphotropi virus (også betegnet "SIV"), type III macaque-abe] og ingen hybridi-30 sering afsløredes med HIV-1 isolater.

"Southern blot" forsøgene under anvendelse af klonen E2.1 indeholdende 2 kb indskuddet som en 32P-mærket probe afslørede ikke nogen som helst hybridisering med DNA fra 40 DK 176253 B1 uinficerede celler, men afslørede bånd i frigjorte celler inficeret med HIV-2 under kraftige betingelser. HIV-2 udviste polymorphisme på det sted af restriktionskortet, der er ækvivalent med restriktionskortet over HIV-5 1. Med det komplette cellulære DNA fra inficerede cel ler, afsløres to typer signal ved hjælp af "Southern blot" metoden: (1) i DNA fraktioner med molekylvægte på omtrent 20 kb og mere i det tilfælde det drejer sig om integrerede former af viruset, og (2) i fraktioner med 10 lavere molekylvægt (9, 10 kb) når det drejer sig om viruset ikke integreret i genomet.

Disse egenskaber er højt specifikke for et retrovirus.

15 Visse forsøg udført med STLV-III (SIV-3) fra inficerede celler muliggjorde at påvise, at abe-retroviruset er relativt langt fra HIV-2 (signalet afsløres udelukkende under milde betingelser). Disse forsøg viser, at ovennævnte prober muliggør specifik afsløring af HIV-2.

20 (4) Subkloning af cDNA'et af HIV-2 i en bakteriel plasmidvektor

Den positive M13 klon, E2.1, selekteredes og subklonedes 25 i en plasmidvektor. DNA fra den rekombinante M13 (TG130) fag E2 rensedes i form af enkeltstrenget DNA (M-13-ROD-E2) indeholdende 2 kb indskuddet indeholdende 3' delen af HIV-2 genomet (opnået fra HIV-2 ROD). Dette indskud overførtes til et plasmid pSP65 beskrevet af Melton, 30 D.A., i 357 Nucleic Acid Res. 12:035-8056 (1984).

En anden kæde opbyggedes in vitro i nærværelse af den 17-mer initiatorsekvens (Amersham), de fire nucleotider A, C, T, G og DNA polymerase I (Klenow). EcoRI indskud- 41 DK 176253 B1 det blev udskåret ved hjælp af EcoRI kløvning og renset på agarosegel og herefter ligeret til pSP65, der for sit vedkommende forud var kløvet med EcoRI. Ligationsblandingen anvendtes til at transformere E. coli stammen 5 DH1, og rekombinanter selekteredes på basis af deres evne til resistens over for ampicillin. De identificerede rekombinanter dyrkedes på LB substrat (Luria substrat) indeholdende 50 ^g/ml ampicillin. Disse rekombi-nante plasmider rensedes og undersøgtes for tilstedevæ-10 reisen af det korrekte indskudte fragment.

En af de opnåede kloner, betegnet med referencen pSPE2, deponeredes i CNCM i Paris, Frankrig under registreringsnummeret 1-595 den 5. september 1986.

15

Indskuddene stammende fra cDNA af HIV-2, og som fore-fandtes indført i ovennævnte probe, indeholdt nucleotidsekvensen, der er beskrevet ovenfor, i overensstemmelse med en del af E2.

20

EKSEMPEL II

Kloning af et cDNA komplementært med DNA'et komplementært med det genome RNA fra HIV-2 vir ioner 25 HIV-2 virioner rensedes fra 5 liter af en dyrkningssu-pernatant del fra en CEM linie inficeret med et ROD iso-lat. En første strenget cDNA syntetiseredes i kontakt med sedimenteret renset virus i nærværelse af en oligo 30 (dT) initiator og under anvendelse af en endogen reaktion aktiveret med en detergent således som beskrevet af Alizon et al., Nature 312, 757-760 (1984). RNA/cDNA hybriderne rensedes ved ekstraktion med en phenol/chlo-roformblanding og ved udfældning med ethanol. Den anden 42 DK 176253 B1 streng af .cDNA frembragtes i nærværelse af DNA polymerase I/RNAse H, således som beskrevet af Gubier og Hoffman ( ). Der henvises herved til denne artikel.

5 Det dobbeltstrengede cDNA blev udstyret med stumpe ender i nærværelse af DNA polymease T4 under anvendelse af bestanddele fra et cDNA synteseudstyr markedsført af Amersham.

10 EcoRl adaptorer (linkere) markedsført af Pharmacia, blev fastgjort til enden af cDNA; det på denne måde modificerede cDNA blev efter kløvning i nærværelse af EcoRl indført i en dephosphoryleret fag vektor M13tgl3Q, der for sit vedkommende var kløvet med EcoRl, også markedsført 15 af Amersham. Der opnåedes et cDNA bånd efter transformation af E. coli stamme TGI. Rekombinante plaques (104) afsøgtes in situ på filtre, hvilket muliggjorde aftryk ved hybridisering med klonen J19 indeholdende 1,5 kb Hindlll fragmentet nævnt oven for stammende fra HIV-1.

20

Filtrene præhybridiseredes i nærværelse af et substrat indeholdende 5 x SSC, 5 x Denhart opløsning, 25% formaldehyd og denatureret laksesperma DNA (100 μg/ml) ved 37 °C i 4 timer og herefter hybridiseredes 16 timer i samme 25 puffer (Tm-42 °C) i nærvær af en yderligere mærket probe (4 x 107 cpm) til opnåelse af en sluthybridiseringspufferopløsning indeholdende 10s cpm/ml.

Vask udførtes med en 5 x SSC, 0,1% SDS opløsning ved 25 30 °C i 2 timer (idet det skal bemærkes, at 20 x SSC svarer til en 3 M NaCl og 0,3 M natriumcitratopløsning). Plaques, der svarede positivt, rensedes, og de M13 enkeltstrengede DNA blev fremstillet og deres ender sekvensbe-dømt således som beskrevet af Sanger et al.

43 DK 176253 B1

Hybridisering af et DNA fra celler inficeret med henholdsvis HIV-1 og HIV-2 og med RNA fra HIV-1, HIV-2 og fra SIV virioner med en probe stammende fra et klonet 5 cDNA af HIV-2 DNA blev ekstraheret fra inficerede CEM celler, der kontinuert frembragte henholdsvis HIV-1 og HIV-2. DNA prøver af disse to retrovira, kløvet i visse tilfælde med 10 20 μg PstI og ikke kløvet i andre tilfælde, underkaste des elektrophorese på 0,8% agarosegel og overførtes ved hjælp af "Southern" metoden til en nylonmembran. Smårum-fang inficeret supernatantdel optaget i en NTE puffer indeholdende 0,1% SDS og med den samme omvendte tran-15 scriptaseaktivitet anbragtes på nitrocellulose, der forud var vædet i en 2 x SSC opløsning.

En præhybridisering udførtes i en opløsning indeholdende 50% formamid, 5 x SSC, 5 x Denhart og 100 tng/ml denatu-2 0 reret laksesperma DNA i 4 timer ved 42 °C. En hybridise-ring udførtes i den samme puffer, hvortil 10% dextran-sulfat og 106 cpm/ml E2 mærket indskud (specifik aktivitet 109 cpm/^g) var tilsat i 16 timer ved 42 °C. To vask blev herefter udført med 0,1 x SSC, 0,1% SDS opløsning i 25 30 minutter hver. Efter eksponering i 16 timer for en forstørrelsesskærm dehybridiseredes Southern pletten i 0,4 N NaOH, neutraliseredes og hybridiseredes atter under de samme betingelser med HIV-1 proben mærket med 109cpm/^g.

30 44 DK 176253 B1

EKSEMPEL III

Kloning i fag λ af det komplette DNA fra HIV-2 proviru-set 5 DNA fra CEM celler inficeret med HIV-2 ROD (fig. 2, bånd a og c) spaltes delvist med Sau3AI. 9-15 kb fraktionen selekteredes på en 5-40% saccharosegradient og ligeredes til BamHI armen af XL47.1 vektoren. Plaques (2 x 106) 10 opnået efter in vitro pakning og anbringelse på E. coli stammen LA 101 afsøgtes in situ ved hybridisering med indskuddet fra E2 klonet cDNA. Omtrent 10 positive kloner rensedes på plaques og propageredes i E. coli C600 recBC. Klonerne λ ROD 4, ROD 27 og ROD 35 blev opforme-15 ret, og deres DNA karakteriseredes ved at optegne deres restriktionskort og ved hybridisering ved hjælp af Southern metoden med cDNA klonen af HIV-2 lander kraftige betingelser og med gag-pol proberne fra HIV-1 under milde betingelser.

20

Fig. 8 viser skematisk opbygningerne af 3 af de rekombi-nante opnåede fager ROD 4, ROD 27 og ROD 35.

De aflange rektangulære dele af disse diagrammer svarer 25 til provirale sekvenser, der stammer fra DNA fra de oprindelige inficerede CEM celler, idet de klare dele svarer til de retrovirale sekvenser, de afskyggede dele til delene af cellulære DNA og de sorte dele til LTR i de virale sekvenser.

30

De tynde linier betegnet med bogstaverne L og R svarer til armene stammende fra XL4 7.1 fag vektoren, der anvendtes til kloningen.

45 DK 176253 B1

Visse af restriktionspladserne er også angivet: disse er mere specielt følgende pladser: B: BamHI; E: EcoRI; H:

HindiII; K: Kpnl; Ps: PstI; Pv: PvuII; S: Sagl; X: Xbal.

5 Disse virale sekvenser har dele fælles med E2 sekvensen.

De relative beliggenheder af disse dele bestemt ved hy-bridisering med E2 er også angivet i figurerne.

ROD 4 stammer fra et cirkulært viralt DNA. ROD 27 og ROD 10 35 stammer fra provira integreret i en cellulær DNA op bygning .

Til sidst subklonedes indskuddene under ovennævnte betingelser, og deres relative positioner i forhold til de 15 tilsvarende ROD 4, ROD 27 og ROD 35 sekvenser er angivet i disse figurer.

Disse er mere specielt indskuddene af plasmiderne pROD 21-3', pROD 35-3', pROD 4.6, pROD 4.8 og pROD 4.7.

20

Fig. 9 er en afbildning af de relative intensiteter af hybridiseringspletterne, der blev frembragt mellem ROD-4 og subfragmenterne 1-11, der stammer henholdsvis fra de forskellige dele af det enkeltstrengede DNA, der stammer 25 fra en M13 subklon indeholdende en nucleinsyre, der stammer fra hele LAV genomet. De relative beliggenheder af disse forskellige fragmenter i forhold til hele LAV genomet (bestemt ved sekvensbedømmelse) er angivet for neden på tegningen. Punkt 12 svarer til en kontrolplet 30 frembragt under anvendelse af et kontrol DNA fra fag λ .

Hybridiseringsforsøgene i pletoverførsel (dot blot) metoden udførtes under de milde betingelser fra eksempel II under anvendelse med hensyn til en probe, af λ ROD 4 46 DK 176253 B1 rekombinanten indeholdende det totale cDNA fra HIV-2. Afvaskningerne udførtes herefter efter hinanden under følgende betingelser: 2 x SSC, 0,1% SDS ved 25 °C (Tm 42 °C) , 1 x SSC, 0,1% SDS ved 60 °C {Tm-20 °C) og 0,1% x 5 SSC, 0,1% SDS ved 60 °C (Tm-3 °C) .

De angivne pletter opnåedes efter radiografisk eksponering natten over.

10 EKSEMPEL IV

In vitro diagnostisk undersøgelse for tilstedeværelsen af HIV-2 virus i et biologisk medium 15 Materialer og metoder

Patienter HIV-2 inficerede patienter udvalgtes blandt personer, 20 der besøgte Egas Moniz hospitalet i Lissabon enten for indlæggelse eller til konsultation mellem september 1985 og september 1986. Dette udvalg, der alle var personer af afrikansk oprindelse eller havde levet i Afrika, fik foretaget serumprøve for antistoffer over for bånde HIV-25 1 (immunofluorescenc -IFA- og/eller ELISA) og HIV-2 {IFA). Kun de patienter, der viste sig serologisk at være inficeret med HIV-2, blev taget med i undersøgelsen.

30 Isolering af virus På 12 patienter var HIV isolering forsøgt således som tidligere beskrevet. Kort fortalt stimuleredes patienternes perifere blodlymphocyter (PBL) med PHA, dyrkedes 47 DK 176253 B1 med normale humane PHA-stimulerede PBL1 er og vedligeholdtes i tilstedeværelse af interleukin-2 (IL-2). Kulturerne kontrolleredes for tilstedeværelsen af cytopa-tisk virkning (CPE) og for omvendt transcriptase (RT) 5 aktivitet i den supernatante del.

Immunofluorescensforsøg (IFA) IFA objektglas fremstilledes på følgende måde: HIV-2-10 inficeret MOLT-4 celler vaskedes 2 gange i PBS og anbragtes på IFA glasplader (104 celler/brønd), lufttørredes og fikseredes med kold acetone. For undersøgelse for IFA omsattes disse celler med 1/10 fortynding af forsøgs serumet i 45 minutter ved 37 °C, vaskedes, tørredes 15 og omsattes med et fluorescein-konjugeret gede- antihumant IgG, A, M (l/l00 fortyndet) i 30 minutter ved 37 °C. Efter vask modfarvedes cellerne i 0,006% Evans blåt, anbragtes i 90% glycerol, 10% PBS og undersøgtes under fluorescens mikroskop.

20

ELISA

Visse patienters sera undersøgtes for antistoffer over for HIV-1 under anvendelse af de kommercielt tilgængeli-25 ge serumforsøg ELAVIA (Pasteur Diagnostics) eller Abbott .

Radioimmunopræcipitationsforsøg (RIPA) 30 HIV-1 eller HIV-2 inficerede CEM celler dyrkedes i tilstedeværelsen af 35s cystein (200 ptCi/ml) i 16 timer. Den supernatante del opsamledes, virale partikler pelletere-des og lyseredes i RIPA puffer (Tris-HCL 50 mM, pH 7,5,

NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, 1% Triton x 100, natriumdeoxy- 48 DK 176253 B1 cholat 0,1%, SDS 0,1%). Til hver reaktion omsattes 50 μΐ af en fortynding af lysat svarende til 10s cpm med 5 μΐ forsøgsserum i 18 timer ved 4 °C. Immunkomplekser blev bundet til sepharose-protein A (Pharmacia), vasket og 5 elueret ved kogning i 2 minutter. Eluerede antigener analyseredes herefter ved hjælp af SDS-polyacrylamidgel-elektrophorese og autoradiografi.

Pot-blot hybridisering 10

Virus isoleret fra patienters PBL pelleteredes og lyseredes i Tris-HCL 10 mM pH 7,5, NaCl 10 mM, EDTA 1 mM, SDS 0,5%. En mikroliter af hvert lysat svarende til 50.000 spm RT-aktivitet anbragtes på nitrocellulose.

15 Hybridisering og vask udførtes under kraftige betingelser: hybridisering i 6 x SSC, 5 x Denhart, 50 % formamid i 18 timer ved 42 °C; og vask i 0,1 x SSC, 0,1% SDS ved 65 °C. Der anvendtes HIV-1 og HIV-2 prober, 32P mærket til en specifik aktivitet på 108 cpm/^g. HIV-1 proben svarer 2 0 til det komplette genom af LAVBRU isolatet, og HIV-2 proben stammede fra en 2 kilobase cDNA klon fra LAV-2ROD iso-lat.

Resultater 25

Fordeling af patienter 30 patienter med serologisk og/eller virologisk tegn påHIV-2 infektion undersøgtes. Det var 12 mænd og 18 30 kvinder. Gennemsnitsalderen var 35, strækkende fra 11-55 år. Alle patienter bortset fra en havde boet adskillige år i Vestafrika; 26 var født og havde levet i Guniea-Bissau og 2 stammede fra Cape Verde øerne. En patient var en 11 år gammel dreng fra Angola, der havde boet på 49 DK 176253 B1

Cape Verde i adskillige år. Den eneste europæer i undersøgelsen var en 40 år gammel portugiser, der havde levet 8 år i Zaire og som nægtede at have boet i Vestafrika.

5 Kliniske kendetegn

Blandt de 30 patienter havde 17 AIDS i overensstemmelse med CDC kriterierne. Hovedsymptomet hos disse patienter var kronisk diarre sammen med i de fleste tilfælde vægt-10 tab på mere end 10 kg i løbet af 1 år. Hos 10 af patienterne viste diarreen sig at være i forbindelse med tilstedeværelsen af en tarm opportunistisk infektion; de 7 tilfælde var pathogenen Isosporabelli alene, en patient havde Cryptosporidium alene og 2 havde begge pathogener.

15 13 tilfælde fandtes ingen opportunistisk tarmpathogen.

Blandt alle 17 AIDS tilfælde diagnostiseredes hos 8 oseophageal candidiasis. 6 AIDS patienter havde respirationssymptomer. Pulmonær tuberculose diagnostiseredes hos 2 og en anden uidentificeret mycobakterium fandtes 20 hos en patient. To patienter havde pulmonær aspergillosis, en efter en tuberculose. To andre AIDS patienter havde gentagne anfald af pneumonier uden identificerede pathogener, og en patient havde Pneumocystis carinii pneumonia, der først diagnostiseredes post-mortem. Fire 25 af de 17 AIDS patienter havde Kaposis sarcom: i 3 tilfælde var sygdommen begrænset til huden, og hos en patient afslørede post-mortem undersøgelse udbredte viscera-le angreb. Centralnervesystemsygdomme fandtes hos to AIDS patienter: en havde cerebral lymphoma, og den anden 30 havde subakut encephalitis af ukendt oprindelse.

Fire patienter blev fundet med symptomer på det AIDS-relaterede kompleks (ARC): to udvise diffus lymphadeno-pati med vedvarende feber, en havde kronisk diarre med 50 DK 176253 B1 vægttab, og en havde gentagne anfald af broncopneumoni og multiple lymphadenopatier.

Blandt de øvrige 9 patienter havde 6 ingen symptomer, 5 der kunne betragtes som relateret med HIV infektion, en havde udelukkende pulmonær tuberculose, en havde udelukkende persistens diffus lymphadenopati, og en udviste neurologisk syphillis. I løbet af den 12 måneders observationsperiode døde 7 patienter, der alle udviste AIDS.

10

Serologisk undersøgelse

Hver patient undersøgtes mindst en gang for serumindhold af antistoffer over for både HIV-1 og HIV-2. Alle pati-15 enters sera undersøgtes ved hjælp af IFA for antistoffer over for HIV-2, og alle var positive. Blandt disse undersøgtes 21 også for antistoffer over for HIV-2 ved hjælp af RIPA: alle udfældede klart det højmolekylære omhylningsglycoprotein af viruset betegnet gp 140, og 16 20 af disse reagerede også med hovedkerneproteinet p26, mens kun en reagerede med det andet virale kerneprotein, betegnet pl6.

Sera undersøgtes for tilstedeværelsen af krydsreagerende 25 antistoffer over for Hiv-l under anvendelse af en anden undersøgelsesmetode. En IFA undersøgelse anvendtes til 24 sera: 12 var negative, 10 var svagt reaktive og 2 var positive. Med ELISA undersøgtes 21: 16 var negative og 5 var positive. Til slut undersøgtes 11 sera for antistof-30 fer over for HIV-1 proteiner ved hjælp RIPA. Tre var ikke i stand til at reagere med noget som helst viralt protein, 2 udfældede kun pol gen produktet p34 og 5 reagerede med hovedkerneproteinet p25. To sera reagerede kun svagt med ophylningsglycoproteinet gp 110 af HIV-1.

51 DK 176253 B1

Disse to sera, og alle sera med positive IFA eller ELISA forsøg for antistoffer over for HIV-1, udviste stærk reaktivitet med gp 140 fra HIV-2 ved RIPA, hvilket snarere indicerede infektion med HIV-2 end med HIV-1. Kun 5 en patient, som ikke deltog i undersøgelsen, viste sig serologisk at være inficeret med HIV-1 og ikke med HIV-2. Denne patient var en 21 årig kvinde fra Centralafrika (Sao Tome Islands) med AIDS.

10 Isolering af virus

Isolering af retrovira fra perifere blodlymphocyter for-- søgtes hos 12 patienter. HIV isoleredes hos 11 i over ensstemmelse med tilstedeværelsen af en typisk cytopa-15 tisk virkning og af en top i form af partikelassociseret omvendt transcriptaseaktivitet i de supernatante dele fra dyrkningen.

Alle 11 isolater identificeredes som HIV-2 under anven-20 delse af en dot-blot hybridiseringsteknik. Virale pletter fra 10 isolater viste sig at hybridisere kraftigt under stærke hybridiseringsbetingelser og vask med en HIV-2 probe stammende fra et klonet HIV-2 cDNA, medens ingen af disse hybridiserede med en HIV-1 probe under 25 samme betingelser. Et isolat hybridiserede kun svagt med HIV-2 proben, men var ikke i stand til at hybridisere med HIV-1 proben.

Immunologisk bedømmelse 30 13 patienter undersøgtes for antallet af cirkulerende lymphocyter identificeret som hjælper T celler (CD4+) og for forholdet mellem hjælper:supressor T celler. Blandt disse patienter havde 11 AIDS: deres gennemsnitlige ab 52 DK 176253 B1 solutte hjælper T celletal var 243 + 300/μ1 og deres gennemsnitlige hjælper: supressorforhold var 0,25 + 0,15. En af patienterne, der klinisk udviste ARC, havde et hjælper T lymphocyttal på 240/μ1 og et forhold på 5 0,18. En anden patient med neurologisk syphillis og in tet tegn på HIV-relaterede symptomer havde et hjælper T lymphocyttal på 690/μ1 og et forhold på 0,82.

I denne undersøgelse er påvist HIV-2 infektion hos 30 10 vestafrikanske patienter, der udviste enten AIDS, ARC

eller som ikke havde nogen åbenlyse HIV-relaterede symptomer. Resultaterne muliggør imidlertid den konklusion, at HIV-2 må betragtes som værende et hovedætiologisk agens for AIDS hos vestafrikanske patienter. De serolo-15 giske og virologiske profiler man fandt, indicerer, at HIV-2 infektion ikke ofte fandtes i forbindelse med HIV-1 infektion hos de pågældende patienter. På trods af vigtige antige og genetiske forskelle udviser HIV-1 og HIV-2 ens tropisme over for CD4+ T lymphocyter, ens cy-20 topatiske virkninger, ens morphologi og deler fælles immunoreaktive epitoper i visse af deres konstitutive proteiner. Da alle vestafrikanske patienter med HIV infektion i den nærværende undersøgelse viste sig at være inficeret med HIV-2 og ingen af dem med HIV-1, må dette 25 hidtil ukendte virus HIV-2 være hovedgrunden til AIDS i Vestafrika.

Symptomerne på HIV-2-relateret AIDS var ikke forskellige fra symptomerne på HIV-1-relateret AIDS i Centralafrika: 30 det mest almindelige symptom var kronisk diarre med kraftig vægttab, for det meste på grund af Isospora belli og/eller Crytopsporidium. Hyppigheden af andre opportunistiske infektioner som f.eks. candidiasis, mycobac-terier (herunder M. tuberculosis) og toxoplasmose var 53 DK 176253 B1 som for HIV-1-relateret afrikansk AIDS. Pneumocystis carinii pneumonia, en meget almindelig komplikation i forbindelse med AIDS i USA og Europa, fandtes kun en enkelt gang i denne undersøgelse, og der sås ikke cryp-5 tococcal meningitis.

Ikke desto mindre er de immunologiske abnormaliteter fundet hos HIV-2-inficerede AIDS patienter identiske med de, der findes og er beskrevet i forbindelse med HIV-Ι-ΙΟ relateret AIDS,

Blandt de 30 patienter, der alle havde serumantistoffer reaktive med HIV-2 antigener, havde kun 7 HIV-1 specifikke antistoffer, der kunne afsløres under anvendelse 15 af IFA eller ELISA, Ved RIPA havde alle disse 7 patienter antistoffer reaktive med de andre hovedkerneprotei-ner p25 (HIV-1) eller p26 (HIV-2), der har stærk immuno-reaktive epitoper til fælles. 5 patienter manglede disse antistoffer: alle 5 havde en negativ HIV-1 ELISA. IFA 20 var på grænsen hos 3 og negative hos 2. Skønt visse af disse ikke var fuldstændig bedømt, fandt man imidlertid 9 patienter med serumantistoffer over for det virale kerneprotein p26 af HIV-2, der udviste en svag reaktiv eller negativ HIV-l-specifik IFA og/eller ELISA. Disse 25 fund peger på vigtigheden af at indbefatte HIV-2 antigener i HIV serumundersøgelserne, der anvendes i afrika, og måske også i andre områder.

Et retrovirus isoleredes fra de perifere lymphocyter hos 30 11 patienter. I alle tilfælde opåedes viral vækst i lø bet af 2 uger, der var karakteriseret ved tilstedeværelsen af omvendt transcriptaseaktivitet i dyrkningens su-pernatante del og cytopatisk virkning. Denne cytopatiske virkning synes imidlertid at variere fra det ene isolat 54 DK 176253 B1 til det andet: visse isolater gav adskillige store syn-cytier sammen med kraftig cellelyse, medens andre kun udviste få syncytier af begrænset størrelse, og bevirkende nedsat levedygtighed af kulturen.

5 RNA fra alle bortset fra et isolat viste sig klart at hybridisere under meget kraftige betingelser med en probe stammende fra en HIV-2 cDNA klon, der repræsenterer 3' enden af genomet. Ingen hybridiserede med en HIV-1 10 probe under samme betingelser. Dette viser, at isolater-ne, der inficerer disse patienter, alle hører til samme type virus. Kun et isolat hybridiserede dårligt med HIV-1. Dette virus var imidlertid isoleret fra en patient med serumantistoffer, der reagerede med alle antigenerne 15 fra HIV-2 ved RIPA.

Opfindelsen involverer generelt udover HIV-2-virus varianter heraf, et hvilket som helst ækvivalent virus, der kan inficere et menneske, og som er i besiddelse af im-20 munologiske egenskaber, der er specifikke for HIV-2.

Opfindelsen involverer generelt et vilkårligt virus der ud over egenskaberne, der findes i forbindelse med HIV-2 vira deponeret i CNCM, også er i besiddelse af neden for beskrevne egenskaber.

25

Det foretrukne mål for HIV-2 viruset er humane Leu 3 celler (eller T4 lymphocyter) og "immortaliserede” celler stammende fra disse T4 lymphocyter som f.eks. celler af HUT 78 linierne, der er omtalt i forbindelse med nær-30 værende patentansøgning. Med andre ord det har specifik tropisme for disse celler. Det kan dyrkes i permanente linier af HUT, CEM, MOLT eller lignende type, der udtrykker T4 proteinet. Det er ikke infektiøst for T8 lymphocyter. Det er cytotoxisk over for humane T4 55 DK 176253 B1 lymphocyter. Den cytopathogene natur af HIV-2 vira med hensyn til T4 lymphocyter manifesterer sig specielt ved tilstedeværelsen af multinucleare celler. Det udviser omvendt transcriptaseaktivitet, der kræver tilstedevæ-5 reisen af Mg2+ ioner og har en stærk affinitet over for polyadenylat oligodeoxythymidylat (poly(A)-oligo(dT) 12-18). Det har en massefylde på omtrent 1,16 i en saccha-rosegradient. Det har en gennemsnitsdiameter på 140 nanometer og en kerne med en gennemsnitsdiameter på 41 10 nanometer. Lysaterne af dette virus indeholder et p26 protein, der ikke krydser immunologisk med p24 proteinet fra HTLV-1 virus eller HTLV-II virus. Disse p26 proteiner har derfor en molekylvægt, der er lidt højere (omtrent 1000) end de tilsvarende p25 proteiner fra HIV-1 15 og lidt lavere (igen af størrelsesordenen 1000 lavere) end de tilsvarende p27 proteiner fra SIV. Lysaterne af HIV-2 indeholder herudover et pi6 protein, der ikke genkendes immunologisk af pl9 proteinet fra HTLV-l eller fra HTLV-II i RIPA (forkortelse for radioimmunopræcipi-20 tationsforsøget). De indeholder herudover et omhylnings-glycoprotein med en molekylvægt af størrelsesordenen 130.000-140.000, der ikke krydser immunologisk med gpllO fra HIV-1, men som, på den anden side, krydser immunologisk med gpl40 omhylningsglycoproteinet fra STLV-III.

25 Disse lysater indeholder også proteiner eller glycopro-teiner, der kan mærkes med (35S)cystein med molekylvægte henholdsvis af størrelsesordenen 36.000 og 42.000- 45.000. Det genome RNA fra HIV-2 hybridiserer ikke med det genome RNA fra HIV-1 under kraftige betingelser.

30 Under milde betingelser hybridiserer det ikke med nucleotidsekvensen stammende på HIV-1 og indeholdende env genet og LTR nabostillet hertil. Specielt hybridiserer det ikke med nucleotidsekvensen 5290-9130 fra HIV-1, heller ikke med sekvenserne fra pol regionen af HIV-1 56 DK 176253 B1 genomet, specielt med nucleotidsekvensen 2170-2240. Under milde betingelser hybridiserer det svagt med nucleo-tidsekvenser fra HIV-1 regionen, specielt nucleotidse-kvenserne i 990-1070 og 990-1260.

5

Det skal bemærkes, at et hvilket som helst retrovirus, der er infektiøs for mennesker, der er i stand til at fremkalde en af formerne for AIDS, der udviser ovennævnte væsentlige egenskaber, og hvis genome RNA er i stand 10 til at hybridisere under kraftige betingelser med de HIV-2 virale stammer deponeret i CNCM (eller med et cDNA eller et cDNA fragment stammende fra disse genome RNA-forbindelser) skal bestragtes som værende ækvivalente med HIV-2.

15

Opfindelsen involverer også enhver af de antigener, specielt proteiner og glycoproteiner i renset tilstand, der kan opnås fra HIV-2. Omtale af "rensede" proteiner eller glycoproteiner betyder, at disse proteiner eller gly-20 coproteiner fører til henholdsvis kun enkelte bånd ved polyacrylamidgelelektrophorese, specielt under de forsøgsbetingelser, der er beskrevet ovenfor. En hvilken som helst velegnet metode til adskillelse og/eller rensning til at opnå disse kan anvendes. F.eks. kan de meto-25 der anvendes, der er beskrevet af R. C. Montelaro et al., J. of Virology, Juni 1982, p. 1029-1038.

Opfindelsen involverer generelt alle antigener, specielt proteiner, glycoproteiner eller polypeptider, der stam-30 mer fra en HIV-2, og som udviser immunologiske egenskaber svarende til egenskaberne fra de antigene forbindelser HIV-2. To antigener betegnes som værende "ækvivalente" i den forstand, at de genkendes af de samme antistoffer, specielt af antistoffer, der kan isoleres fra 57 DK 176253 B1 et serum fra en patient, der er inficeret med en HIV-2, eller sålænge som de tilfredsstiller betingelserne for "immunologisk ækvivalens" som beskrevet ovenfor.

5 Blandt ækvivalente polypeptider, proteiner eller gly-coproteiner skal indbefattes fragmenter af ovennævnte antigener (eller peptider opbygget ved kemisk syntese) så længe som de forårsager immunologiske krydsreaktioner med antigenerne, hvorfra de stammer. Med andre ord op-10 findelsen angår et hvilket som helst polypeptid, der fælles med ovennævnte antigener har identiske eller lignende epitoper, der er i stand til at genkendes af de samme antistoffer. Hørende til denne sidstnævnte type polypeptider er udtrykkelsesprodukterne af tilsvarende 15 sekvenser af DNA-forbindelser, der koder for de tilsvarende polypeptidsekvenser.

HIV-2 viruset har vist sig at kunne anvendes som en kilde for antigener til afsløring af antistoffer hos alle 20 personer, der har været i kontakt med HIV-2 viruset.

Det skal bemærkes, at generel tilgængelige teknisk litteratur (specielt den, der er angivet som litteraturliste i forbindelse med nærværende beskrivelse) med hensyn 25 til HIV-1 og virus betegnet HTLV-III skal betragtes som værende en del af opfindelsen, idet der henvises til disse, idet metoder beskrevet i disse artikler anvendes under lignende betingelser til isolering af HIV-2 virus eller af ækvivalente vira, og angår produktionen ud fra 30 disse vira af deres forskellige bestanddele (specielt proteiner, glycoproteiner, polypeptider og nucleinsy-rer). Man kan også anvende, hvad der er beskrevet i den tekniske litteratur med hensyn til anvendelse af for- 58 DK 176253 B1 skellige bestanddele specielt med hensyn til diagnoseme-toder for de tilsvarende former af LAS eller AIDS.

Opfindelsen involverer også anvendelsen af cDNA-5 forbindelser eller deres fragmenter (eller rekombinanter indeholdende disse) som prober ved diagnosen for tilstedeværelsen eller mangel på tilstedeværelse af HIV-2 virus i serumprøver eller andre biologiske væsker eller væv opnået fra patienter, der er mistænkte for at være 10 bærere af HIV-2 virus. Sådanne prober er fortrinsvis også mærkede (radioaktive, enzymatiske, fluorescensmærket og lignende). Særligt velegnede prober til udførsel af fremgangsmåden til diagnostisering af HIV-2 virus eller en variant af HIV-2 kan karakteriseres ved, at de 15 omfatter alt eller en fraktion af cDNA’en komplementært til genomet af HIV-2 viruset, eller alternativt, specielt fragmenter, der findes i de forskellige ovenfor beskrevne kloner. Mere specielt skal nævnes en fraktion af cDNA af HIV-2, der findes i klonen E2, mere specielt 20 sekvensen af 3' enden (LTR) og/eller af 5' enden af HIV-sekvensen af ovennævnte klon E2, eller alternativt cDNA indeholdende env regionen af cDNA fra HIV-2 viruset.

De anvendte prober ved denne diagnosemetode for HIV-2 25 virus og i de diagnostiske kits er ikke på nogen måde begrænset til de oven for beskrevne prober. De omfatter tværtimod alle nucleotidsekvenser, der stammer fra genomet af HIV-2 viruset, af en variant af HIV-2 eller af strukturel beslægtet virus, så længe som de muliggør at 30 antistoffer rettet mod HIV-2, kan afsløres i biologiske væsker hos personer, der kan udvikle en af formerne for AIDS. Naturligvis er anvendelsen af nucleotidsekvenser stammende fra et HIV-2, der oprindeligt er infektiøs for mennesket, ikke desto mindre at foretrække.

59 DK 176253 B1

Afsløringen kan udføres på alle i og for sig kendte måder specielt ved at bringe disse prober i kontakt enten med nucleinsyrerne opnået fra celler til stede i disse 5 sera eller andre biologiske medier f.eks. cerebrospinal-væsker, spyt og lignende, eller med disse medier som sådan, så længe som deres nucleinsyrer er blevet gjort tilgængelige for hybridisering med disse prober, idet dette skal være under betingelser, der muliggør hybridi-10 sering mellem disse prober og disse nucleinsyrer, og ved afsløring af hybridiseringen, som frembringes. Ovennævnte diagnose, der indebærer hybridiseringsreaktioner, kan også udføres under anvendelse af blandinger af prober stammende henholdsvis fra en HIV-1 og en HIV-2, al den 15 stund det er unødvendigt at differentiere mellem den søgte type HIV virus.

Sædvanligvis indebærer diagnosemetoden for tilstedeværelsen eller mangel på tilstedeværelse af HIV-viruset 20 eller variant heraf i serumprøver eller andre vævs- eller væskeprøver opnået fra patienter, der mistænktes for at være bærere af HIV-2 viruset, følgende trin: 1) fremstilling af en mærket probe, 25 2) mindst et hybridiseringstrin udført under kraftige betingelser, ved at bringe DNA fra celler i prøven fra den mistænkte patient i kontakt med den mærkede probe på en passende membran, 30 3) vask af membranen med en opløsning, der medfører bibeholdelse af disse kraftige betingelser for hybridisering, og 60 DK 176253 B1 4) afsløring af tilstedeværelsen eller mangel på tilstedeværelsen af HIV-2 viruset ved en immunoafsløringsmetode .

5 I en anden foretrukken udførelsesform for den omhandlede fremgangsmåde udføres nævnte hybridisering under milde betingelser, og vask af membranen udføres under betingelser passende for sådan hybridisering.

10 Opfindelsen involverer specielt HIV-2 vira, der er ejendommelige ved at deres virale RNA svarer til et cDNA, hvis GAG og ENV gener henholdsvis omfatter de efterfølgende nucleotidsekvenser.

15 De fremkommer ved sekvensbedømmelse af de tilsvarende regioner af cDNA svarende til genomet HIV-2 ROD. De er i overensstemmelse med de aminosyrer, som de koder.

DK 176253 B1

Modtaget 61 $2 FEB. 2007

PVS

CACaODil

HetGlyAlaArgAsnSerVa 1 LeuA rgGlyLysLysAlaAspGlu ATGGGCGCGACAAACTCCGTCTrGAGAGGGAAAAAAGCAGATGAA

^ % * * ' ' · *

LeuGluArglleArgleuArgProG 1 jG lyLysLysLysTyrArg TXA GAAAGAATCACGTTACGGCC C GGCGGAAAGAAAAAGTACAGG .

« * * · * LeuLysHisIleValTrpAlaAlaAs nXy sLeuAspArgPheGly CTAAAACArATTGTGTCGGCACCCAATAAATTGGACAGATTCGGA 100 . . -LeuAlaCluSerLeuLeuGluSeTLysGluGlyCysGlnLysIle 10 TTAGCAGA GAGCC TGTT GGAGJ CAAAAGA GGGXTGTCAAAA AATT

* * * · LeuThrValLeuAspProKetValProXhrGlySerGluAsnLeu CTTACAGTTTTACATCCAATGGTACCGACAGGTTCAGAAAATTTA

200 . .

LysSerLeiiPheAsnThrValCysVallleTrpCysIleEisAla AAAAGTCTTTTTAATACTGTCTG CGTCATTTGGTGCATACACGCA

15 * * * * G lu GIuLy sValLysAspXhrGluGlyAlaLysGlnlleValArg GAAGAGAAAGTCAAAGATACTGAAGCAGCAAAACAAATAGTGCGG ' . . 300

ArgHisLeuValAlaGluThrGlyTarAlaGluLysMetProSer agacatctagtggcagaaacaggaactgcagagaaaatgccaagc * » · ·

Th rSe rArgP roThrA laProSerSerGluLysGlyGl yAs aTyr 20 ACAAGIAGACCAACAGCACCAX C ΓΑ GCGAGAAGGGAGG AA ATTAC

. . . 400

ProVa IGlnHisValGlyGlyAsaTyrThrHisIleProLeuSer ccagtgcaacaxgtåggcggcaaciacacccatataccgctgagt • · · ‘ » ·

ProArgThrLeuAsnAlaTrpValLysLeuValCluCluLysLys C CCCGAACCCTAAATGCCTGGG ΤΑΑΑΑ TTAGTAGAGGAAAAAAAG 25 · * - ·

PheGlyAlaGluValValProGlyPheGlDAlaLeuSerGluGly

TICGGGGCAGAAGTAGTGCCAGGATTTCACGCACTCTCAGAAGGC

300 I * B #

CysThrProTyrAspIleAsrGlnMetLeuAsnCysValGlyA&p TGCACGCCCTATGATATCAACCAAATGCTTAAXTGTGTGGGCGAC » · -.··-· ~· .

2q HisGlnAlaAlaHetGlnllelleArgGluIlelleAsnGluGlu

CATCAAGCAGCCATGCAGATAAXCAGGGAGAtXATCAAXGAGGAA Bp 600 . B B

AlaAlaGIuTr-pAsp Va lGlnH i. sProIleProGlyProLeuPro "" GCAGCAGAATGGGATGTGCAAC ATCCAATACCAGGCCCCTTACCA

·» b . * *-♦ · A1 aG1 yGlnLeuArgGluPro A r g G ly SerAs p 11 eAl aG lyXhr GCGGGGCAGCTTAGAGAGCCAAGGGGAXCTGACAXAGCAGGGACA 35 . . 700 . ...

ThrSe rThrValGluGluG lnlieGlnTrplletPheArgProGln acaagcacagtagaagaacagatccagtggatgttiaggccacaa 62 DK 176253 B1

AsnProValProValGlyAsnlleTyrArgArgTrpIleGlnlle

AATCCTGTACCAGTAGCAAACAT C T ATAG A AG AT G GAT CCAGATA . ' . . SOO

ClyLeuGlnLysCysValArgHe tTyrAsnProTh.rAsnlleLeu ggattgcagaagtgtgtcaggatgtacaacccga'ccaacatccta c * · · ·

AspIleLysGlnGlyProLysGluProFheGlnSerTyrValAsp

GACATAAAACAGGGACCAAAGGAGCCGTTCCAAAGCTATGTAGAT

900

ArgPheTyrLysSerLeuArgAlaGluGlnThrAspProAlaVal AG ATT C TACAA AAGCT7 GAGGG C A C AACAAACAGAT CCAGCAGTG • · · · ·

LysAsnTrplTe tTbrGlnThrLeuLeuValGlnAsnAlaAenPro 10 AAGAATTGGATGACCCAAACACTGCTAGTACAAAATGCCAACCCA

• * · * ^

AspCysLysLeuValLeuLysGlyLeuGlyMetAsnProThrLea GACTGTAAATTAGTGCTAAAAGGA C TAGGGATG AACCCTACCTTA 1000 . . .

GluGluHetLeuThrAlaCysG lnGlyValGlyGlyProGlyGla G AA GAGAT GC TGACCGCCTG TCAG GGGGTAGGTGGGCCAGGCCAG

15 · ’ * · · *

LysAlaArgLe ulle tAlaGluAlaLeuLysGluVallleClyPro AAAGCTACATTAATGGCAGAGG CC CTGAAAGAGGTCATAGGACCT . 1100 . .

AlaProIleProPheAlaAlaAlaGlnG InAr g Ly s Al aPb eLy· GCCCCTATCCCATTCGCAGCAGCC C AGCAGAGAAAGGCATTTAAA • . · * · ·

CysTrpAsnCysGlyLysGluGlyHisSerAIaArgGlaCysArg U TGC TGG AAC TGTGGAAAGGAAGGG CACTCGGC AAGACAATGCCGA

1200

AlaProArgArgGlnClyCysTrpLysCysGlyLysProGlyHis GCACCTAGAAGGCAGGGCTG CTG G AAGTGTGGTAAGCCAGGACAC • » ' · * IlelTetThrAsnCysProAspArgGinAl a G lyP beLeuGlyLeu. ATCATGACAAACTGCCCAGATAG ACAGG CAGGTTTTTTAGGACTG 25 . ... 1300

GlyProTrpGlyLysLysProArgAsnPheProValAlaGlnVal GGCCCTTGGGGAAAGAAGCCCCG CAACTTCCCCGTGGCCCAAGTT • * » ♦ · ProGlnGlyLeuThrProThrAlaProPro7alAspProAla7a'i C CGCAGGGGCTGACACCAACAG C ACCCCCAGTGG AT CCAGCAGTG • · · · 30 As pLeuLeuG luLysTyrlletGlnGlnGlylysArgGlnArgGlu GATCTACTGGAGAAATATATGCAGCAAGGGAAAAGACAGAGAGAG 1400 * · * · · G InArgG luArgP r o Tyr Ly s G 1 uVa IThrGI u A s pLe uLeuHis cagagagagagaccatacaaggaagtgacagaggacttactgcac » · · ·

LeuGluG InG lyG luTbrProTy rAr g G luPr oP r oThrGluAs p CTCGAGCAGGGGGAGACACCATA CAGGGAGCC ACCAACAGAGGAC 35 . 1500

LeuLeuHisLeuAsnSerLeuPheGlyLysAspGla TTGCTGCACCTCAATTCTCTCTTTGGAAAAGACCAG * · · 63 DK 176253 B1

EN VRN

HetMetAsnGlnLeuLeuIleAlalleLeuLeuAiaSerAlaCys ATGAXGAATCAGCTGCTTATTGC CATXTTATTACCTAGTGCTTGC

• · · , »

LeuValTyrCysXhrGlnTyrV'alThrValPheTyrGlyValPro 5 TTAGTATATTGCACCCAAIAXGX AACTCTTTTCTATGGCGTACCC

• . · · f *

XhrTrpLysAsnAlaThrl1 eP r oLeuFheCysAlaThrArgAsa ACGTGGAAAAATGCAACCATTCCCCTCTTTXGTGCAACCAGAAAT 100 .

ArgAspXbrTrpGlyThrlleGlnCysLeuProAspAsnAspAsp AGGGATACTXGGGGAACCATACAGTGCTTGCCTGACAATCATCAT A 0 · * · * ·

TyrGlnGluIleThrLeuAsnValThrGluAlaPbeAspAlaTrp TATCAGGAAATAACTITGAATCTAACAGAGGCTTTTGATGCATGG . 200

AsnAsaThrValTbrGlviG InAl alleGluAspValTrpHisLeu AATAATACAGTAACAGAACAAGCAATAGAAGATGTCTGGCATCTA

• · ft * , c- PheGluXbrSerrieLysProCysValLysLeuXhrProLeuCys ttcgagacatcaataaaaccaxgxgtcaaacxaacacctxxaxgt . . 300

ValAlaMeCLysCysSerSerThrGluSerSerXbrG1yAs nA s a GTA GCAAX GAAATGCAGCAGCACACAGAGCAGC ACAGGGAACAAC

• ft · · ft

ThrThrSerLysSerTh r Se rThr Thr TbrTbr XhrPr oXhr As p ACAACCTCAAAGAGCACAAGCACAACCACAACCACACCCACAGAC 20 ... . 400

ClnGluGlnGluIleSerGluAspThrProCysAlaArgAlaAsp

CAGGAGCAAGAGATåAGXGAGGATACTCCAXGCGCACGCGCAGAC

« t · · ·

AsnCysSerGlyLeuG1yGluGluGluXhrlleAsnCysGlaPhe AACTGCICAGGATXGGGAGAGGAAGAAACGATCAATXGCCAGXTC

• · · ft 25 A3nMetXhrGlyJ.euGluArgAspLysLysLysGlnXyrAsnGlu AAXATGACAGGAXTAGAAAGAGAXAAGAAAAAACAGXATAATGAA 500 .

ThrTrpXyrSeTLysAspValValCysGluXhrAsnAsnSerThr

ACAICGXACXCAAAAGAXGXGGTXTGXGAGACAAATAATAGCACA

ft ft

AsnGlnXbrGlnCysXyrHetAsnEisCysAsnTbrSerVallle AAICAGACCCAGXGIXACAXGAACCAXTGCAACACAXCÅCTCATC . * 600

XhrGluSerCysAspLysSisXyrTrpAspAl alleArgPheArg ACåGAAXCAXGXGACAAGCACXATTGGGAXGCXATAAGGTXXAGA % . * · ·

TyrCysAlaProProG lyXy r Al aXeuLe uArgCy s As nAspThr XACTG XGCACC ACCGGGXXAXGCCC XATTAAGATGTAATGAT ACC — 700 35 AsnTyrSerClyPheAlaProAsnCysSerLysValValAlaSer AAXTAXXCACGCXTTGCACCCAACXGXTCXAAAGXAGTAGCXTCX ^ ^ · DK 176253 B1 64

TbrCysTbrArgMetMetGluThrG InThrSerThrTrpPheG ly ACATGCACC AGGATGATCGAAA CGCAA ACTTCCA CATGG TTTG GC . . . 800 ' .

PheAsnGlyThrArgAlaGluAsnArgThrTyrlleTyrTrpHis tttaatggcactagagcagagaatagaacatatatctattggcat 5 . » · .

GlyArgAspAsnArgThrllelleSerLeuAsnLysTyrTyrAso GGCAGAGATAATACAACTATCA TCAGCTTAAACAAATATTATAAT

* . . . 900

LeuSerLeuHisCysLysArgProGlyAsnLysThrValLysGla CTCAGTTTGCATTGTAAGAGGC C AG G G AAT AA G A CAGTGAAACAA

♦ ♦ * * ^0 IleMetLeuMetSerGlyBiEValPheBisSerBisTyrGlnPro ATAATGCTTATGTCAGGACAXGTGTTTCACTCCCACTACCAGCCG » « · * · lleAsnLysArgProArgGlnAlaTrpCysTrpPheLysGlyLys A TCAATAAAA GACCCAGAC AA G C ATGGTGC TGGTT C AAAGG CAAA 1000 . . -

Tr p Ly s A s pA 1 aM eCGlnGluValLysThrLeuAlaLysBisPro

TGGAAAGACGCCATGCAGGAGG'TGAAGACCCTTGCAAAACATCCC

15 *' • · * · ·

AxgTy r Ar gG lyThr AsnA spThrArgAsnlleSerPbeAlaAla AGGTATAGAGGAACCAATGAC ACAAGGAATArTAGCTTTGCAGCG . 1100 ; .

Ft-o G1 yLysG lySerAspProG luValAlaTyrHetTrpTlirAsu CCAGG AAAAGGC TC AGACC C A G AAGTAGCATACATGTGGACTAAC • . » » · * 20 CysArgGlyGluPbeLeuTyrCysAsnHetThrTrpPheLeuAsn

IGCAGAGGAGAGTTTCTCTACTCCAACATGACTTGCTTCCTCAAT

1200

TrpIleGluAsnLysThrHisArgAsnTyrAlaProCysHisIle TGCAT ACAGAATAAGACACAC C CCAATTATCCACCGTGCCATATA • · · . · · LysGlnllell e As nThrTrp H isLysValGlyArgAsnValTyr 25 AAGCAAATAATTAACACATGG CATAAGGTACGGAGAAATGTATAT

. . 1300

LeuProProArgGluClyGluL.euSerCysAsnSerThrValThr TTGCC TCC CAGGGAAGGGGAG C TGTCC TGC AACTCAACAGTAACC

/ · * · » #

SerllelleAlaAsnlleAspTrpG InAsnAs cAsnC lnThrAs n AGCATAATTGCTAACATTGACTGGCAAAACAATAAICAGACAAAC ♦ * · · 30 XleTbrPheSerAlaGluValAlaGluLeuTyrArgLeuGluLeu ATTACCTTTAGTGCAGAGGTGGCAGAACTATACACATTGGAGTTG 1400 . .. .

ClyAepTyrLysLeuValGluIleThrProIleGlyPheAlaPro GGAG ATTATAAATTCGTAGAAATAACACCAATTGGCTT CGCåCC T

35 65 DK 176253 B1

ThrLysGluLysArgTyrSerSerAlaHisGlyArgHisThrArg ACAAAAGAAAAAAGATACTCC TCTGCTCACCGGAGACATACAAGA . 1500 .

GlyValPheValLeuGlyPheLeuGlyPheLeuAlaThrAlaGly . CGTGTGTTCGTGCTAGGGTTCTTGCGTTTTCTCGCAACAGCACGT

r · · * * S e r A1 alle tGlyAlnArgAlaSerLeuThrValSerAlaGlnSer TCTGCAATGGGCGCTCGAGCGTCCCTGACCGTGTCGGCTCAGTCC . . 1600

ArgTbrLeuLeuAlaGlylleValGlnGlnGlnGlnGlnLeuLeu CGGACTTTACTGGCCGGGATAGTGCACCAACAGCAACAGCTGTTG • · * ·

Αε gValValLysArgGlnGIdG luLeuLeuArgLeuThrPalTrp 10 cacgtggtcaagagacaacaag AACTGTTGCGACTGACCGTCTGG

. . . 1700

GlyThrLysAanLeuGlnAlaArgVaIThrAlalleGluLysTyr CGAACGAAAAACCTCCAGGCAAGAGTCACTGCTATAGAGAAGTAC * - · » »

Le u G1nAs pGlnAlaArgLeuA s c S e rX rpG1yCysAlaPheArg CTACAGGACCAGGCGCGGCTAAATTCATGGGGAXGTGCGTTTAGA 15 . * · . 1800

GloValCysHisThrThrVaLProTrpValAsnAspSerLeuAla CAAGTCTGCCACACTACTGTA CC ATGGGTTAAIGATTCCTTÅGCA • · * · ProAspTrpAspAsnHetXbrTrp GInGluXrpGluLysClnVal CCTGA CTGGGACAATATGACGTGG CAGGAATGGGAAAAACAAGTC

• « Φ · %

ArgTyrLeuGluAlaAsnlleSe rLy sSerLeuGluGlnÅlaGln 20 CGCTACCTGGAGGCAAATATCAGTAAAAGTTTAGAACACGCACAA

1900

IleGlnGlnGluLysAsnHetTyrGluLeuGlnLysLeuAsnSer

ATTCAGCAAGAGAAAAATATGTATGAACTACAAAAATTAAATAGC

» · · m * %

TrpAspIlePbeGlyAsnTrpPheAspLeuXhrSerTrpValLys TGGGATATXTTTGGCAATTGG TTTGAC TTAACCXCCTGGGTCAAG 25 . 2000

TyrlleGlnTyrGlyVaiLeullelleValAlaVal'IleAlaLeu IATAITCAAXATGGAGTGCTX AT AAXAGTAGCAGTAAXAGCTXTA • · · · *

Argil eVallleTyrValValGlnlletLeuSerArgLeuArgLys AGAATAGIGATATATGTAGXA C A AATGTTAAGTAGG CTTAGAAAG

2100

CLLytyrArgProValPheSer SerProProGlyTyrlleGlnGln &GCTATA GGCCTGTTTTCTCTT CCCCCCCCGGTTATAXCCAACAG

35 DK 176253 B1 66

IleELsIleKisLysAspArgGlyGlnProAlaAstiGluGluTbr ATCCATAXCCACAAGGACCGGGGACAGCCAGCCAACGAAGAAACA . . . 2200 GluGluAspGlyGlySerAsrxGlyGlyAspArgTyrTrpProTrp GAAGAA GACGG TGGAAGCAAC GG TCCAGACAGATAC TCGCCCTCG

5 · * * · *

ProIleAlaTyrlleKisPheLeuIleArgGlnLeuIleArgLeu CCCATAGCATATATACATTTCCTGATCCCCCAGCTCATTCGCCTC * · * ♦

LeuThrArgLeutyrSerlleCysArgAspLeuLeuSerArgSer TTCACCAGACTATACAGCATCXGCAGGGACTTACTATCCAGGAGC 2300 ....

PheLeuThrLeuGlnLeuIleTyrGlnAsnLeuArgAspT rpLeu 10 TICCTGACC C TCCAACVCAT C TAGCAGAATCTCAGAGACTGG CTG

• · * »

ArgLeuArgThrAlaPheLeuGlnTyrGlyCysGluTrpIleGln AGACTTAGAACAGCCTTCTTGCAATATCGGTGCGAGTCGATCCAA . 2400 GLuAlaPheGlnAlaAlaAlaArgAlaThrArgGluThrLeuAla

GAACCATTCCACGCCGCCGCGAGGGCTACAAGAGAGACTCTTGCG

15 · * * ·

GlyAlaCysArgGlyLeuTrpArgVaH.euGluArgIleGl.yArg

GGCGCGTGCAGGGGCTTGTGGAGGGTATTGGAACGAATCGGGAGG

2500

GlylleLeuAlaValProArgArglleArgGlnGlyAlaGluI1e GGAATACTCGCGGTTCCAAGAAGGATCACACAGGGAGCAGAAATC * · · . * ·

AlaLeuLeu***GlyThrAlaValSerAlaGlyArgLeuTyrClu U GCCCTCCTGTGAGGGACGGCAGTATCAGCAGGGAGACTTTATGAA

. . 2600 .

TyrSerMetGluGIyProSerSerArgLysGlyGluLysPheVal TACTCCATGGAAGGACCCAGCAGCAGAAAGGGAGAAAAATTTGTA * · · *

GlnAlaThrLysTyrGly C AG G C AA C AA AAT AT GG A 25 .

30 35 67 DK 176253 B1

Som allerede angivet oven for involverer opfindelsen naturligvis alle HIV-2 vira, hvis RNA er i besiddelse af lignende egenskaber, specielt GAG og ENV regionerne, der omfatter sekvenser med nucleotidsekvenshomologi på 5 mindst 50%, fortrinsvis 70% og foretrukkent 90% med de tilsvarende GAG og ENV sekvenser af HIV-2 ROD.

Specielt involverer opfindelsen cDNA fragmenter der koder henholdsvis for pl6, p26 og pl2, hvis opbygninger 10 også er inkluderet i GAGRODN. Specielt angår den sekvenserne, der strækker sig: • fra nucleotid 1 til nucleotid 405 (kodende for pl6) ; 15 • fra nucleotid 406 til nucleotid 1155 (kodende for p2 6) ; og • fra nucleotid 1156 til nucleotid 1566 (kodende for 20 pl2).

Specielt involverer opfindelsen også cDNA fragmentet, der koder for gpl40 indbefattet i ENVR, og som strækker fra nucleotid 1 til nucleotid 2574.

25

Opfindelsen involverer ligeledes nucleotidsekvenser, der adskiller sig fra de foregående ved nucleotidsubstitu-tioner, idet der drages fordel af degenerationen af den genetiske kode, så længe som substitutionerne ikke inde-30 bærer en modifikation af aminosyresekvenserne kodet af disse nucleotidsekvenser.

Herudover involverer opfindelsen proteiner eller gly-coproteiner, hvis aminosyresekvenser svarer til de, der 68 DK 176253 B1 er angivet på de foranstående sider, samt ækvivalent peptider dvs. peptider, der fremkommer fra de foregående sider ved addition, substitution eller fjernelse af aminosyrer, som ikke påvirker de totale immunologiske egen-5 skaber ved nævnte peptider.

Specielt involverer opfindelse omhylningsglycoproteinet, der udviser aminosyresekvensen kodet af ENVRN.

10 Et vilkårligt af ovennævnte angivne proteiner {pl2, pl6 eller p26) eller af proteinet, der udviser opbygningen gpl40 eller en hvilken som helst forud bestemt del af disse proteiner, kan fremstilles ved en fremgangsmåde, som omfatter indførsel af den tilsvarende nucleinsyrese-15 kvens i en vektor, der er i stand til at transformere en passende udvalgt værtscelle og at muliggøre udtrykkelse af det indførte i denne vektor, at den udvalgte vært transformeres af vektoren, der indeholder nucleinsyren, at den transformerede cellevært med den modificerede 20 vektor dyrkes, og at man udvinder og renset det udtrykte protein.

Metoder omhandlet i europæisk patentansøgning nr.

85 905513.9 indleveret 18. oktober 1985 til fremstilling 25 af peptider eller proteiner bestående af ekspressions -produkter af nucleinsyresekvenser stammende fra genomet af HIV-1 er også velegnede til produktion af nævnte peptider eller proteiner stammende fra HIV-2. Der henvises herved til denne europæiske patentansøgning som en spe-30 ciel metode.

Nedenfor er angivet molekylvægte af HIV-2 proteiner i forhold til molekylvægte af HIV-1.

69 DK 176253 B1

Molekylvægt af Molekylvægt af HIV-2 proteiner HIV-1 proteiner kd kd 5 hele gag 58,3 hele gag 55,8 p 16 15 p 18 14,9 p 26 27,6 p 12 15,8 env 98,6 env 97,4 10 ydre env 57,4

Transmem-bran env 41,2 HIV-2 Mir og HIV-2 ROD er også deponeret i "National 15 Collection of Animal Cell Cultures" (ECACC) i Salisbury (England) den 9. januar 1987 henholdsvis under registreringsnumrene 87 011001 og 87 011002.

Yderligere er plasmiderne pROD35 og pROD27.5 deponeret i 20 "National Collection of Industrial Bacteria (NCIB) i

Aberdeen (England) den 9. januar 1987 henholdsvis under registreringsnumrene 12 398 og 12 399.

Der henvises herved til de i denne ansøgning angivne 25 litteratursteder.

70 DK 176253 B1

LITTERATURLISTE

1. F. Barre-Sinoussi et al., Science 220, 868 (1983).

5 2. L. Montagnier et al., Human Tcell leukemia Orlym- phoma viruses (Gallo, R.C., Essex, M.E., Gross, L., eds.) Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 363 (1984).

10 3. M. Popovic, M. G. Sarngadharan, E. Read, R. C. Gallo,

Science 224, 497 (1984).

4. J. Levy et al., Science 225, 840 (1984).

15 5. P. Sonigo et al., Cell 42, 369 (1985).

7. J.W. Curran et al., Science 229, 1352 (1985).

8. A. Ellrodt et al., Lancet i, 1383 (1984).

20 9. P. Piot et al., Lancet ii, 65 (1984).

10. F. Brun-Vezinet et al., Science 226·, 453 (1984).

25 11. N. Clumeck et al., N. Engl. J. Med. 313, 182 (1985).

12. A. B. Rabson og Μ. A. Martin, Cell 40, 477 (1985).

13. S. Benn et al., Science 230, 949 (1985).

30 14. M. Alizon, Manuskript under udarbejdelse.

15. F. Brun-Vezinet, ikke publiceret.

71 DK 176253 B1 16. M.D. Daniel et al., Science 228, 1201 (1985).

17. P. J. Kanki et al., Science 228, 1199 (1985).

5 18. N. L. Letwin et al., Science 230, 71 (1985).

19. A. Gatzar et al., Blood 55, 409 (1980).

20. D. Klatzmann et al., Science 225, 59 (1984).

10 21. L. Montagnier et al., Virology 144, 283 (1985).

22. J. S. Allan et al., Science 228, 1091 (1985).

15 23. F. CHIVel, manuskript under udarbejdelse.

24. F. diMarzo Veronese et al., Science 229, 1402 (1985) .

20 25. V. S. Kalyanaraman et al., Science 218, 571 (1982).

26. I.S.Y. Chen, J. McLaughlin, J. C. Gasson, S.C. Clark og D.W. Golde, Nature 305, 502 (1983) .

25 27. F. Barin et al., Lancet ii, 1387 (1985).

28. P. J. Kanki, J. Alroy, M. Essex, Science 230, 951 (1985).

30 29. H. Towbin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 4350 (1979).

30. S. Wain-Hobson, P. Sonigo, O. Danos, S. Cole og M.

Alizon, Cell 40, 9 (1985).

72 DK 176253 B1 31. M. Alizon et al., Nature 312, 757 (1984).

5

Claims (13)

73 DK 176253 B1

1. Præparat til in vitro påvisning af tilstedeværelsen i en biologisk prøve af antistoffer mod et humant retrovi- 5 rus, der er i stand til at have cytopatogen virkning på humane T4 lymfocytter, omfattende mindst et HIV-1 antigen, kendetegnet ved, at det yderligere omfatter mindst et HIV-2 antigen, der genkendes af antistofferne, der fremkaldes mod de tilsvarende antigener 10 af et vilkårligt af de i CNCM deponerede HIV-2 retrovirus med numrene 1-502, 1-532, 1-642 og 1-643 eller i ECACC deponerede HIV-2 retrovirus med numrene 87.011001 og 87.011002 (svarende til henholdsvis 1-502 og 1-532) eller en variant af en af disse HIV-2 retrovirus. 15

2. Præparat ifølge krav 1, kendetegnet ved, . at det omfatter et glycoprotein af HIV-2 retrovirus.

3. Præparat ifølge krav 1, kendetegnet ved, 20 at det omfatter et HIV-2 pl2 protein, der genkendes immunologisk af antistoffer fremkaldt mod de deponerede HIV-2 retrovira og har en molekylvægt i størrelsesordenen 12.000 daltons.

4. Præparat ifølge ethvert af kravene 1 til 3, kend etegnet ved, at det omfatter kerneproteiner fra HIV-1 og fra HIV-2.

5. Præparat ifølge krav 4, kendetegnet ved, 30 at det omfatter p25 fra HIV-1 og p26 fra HIV-2.

6. Præparat ifølge krav 4, kendetegnet ved, at det omfatter pl8 fra HIV-1 og pi6 fra HIV-2. 74 DK 176253 B1

7. Præparat ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det omfatter omhylningsglycoproteiner fra HIV-1 og omhylningsglycoproteiner fra HIV-2.

8. Præparat ifølge krav 7, kendetegnet ved, at det omfatter gpllO fra HIV-1 og gp!40 fra HIV-2.

9. Præparat ifølge krav 7 eller 8, kendetegnet ved, at det omfatter p42 fra HIV-1 og p36 fra

10. Præparat ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det indeholder blandinger af antigeniske proteiner og/eller glycoproteiner fra HIV-1, og/eller blandinger 15 af proteiner og/eller glycoproteiner fra HIV-2

10 HIV-2.

11. Fremgangsmåde til in vitro påvisning i en human biologisk prøve, f.eks. et serum, af tilstedeværelsen af antistoffer, der genkender antigener fra et humant re- 2. trovirus, der er i stand til at have cytopatogen virkning på de humane T4 lymfocyter, og specielt til in vitro diagnose af en potentiel eller eksisterende LAS eller AIDS, der er forårsaget af et humant retrovirus, kendetegnet ved, at man bringer den biologi-25 ske prøve fra den person, der skal diagnosticeres, i kontakt med en blanding af antigener, der er i stand til at give en specifik immunologisk reaktion med antistofferne mod et humant HIV-1 retrovirus, eller mod et humant HIV-2 retrovirus, der er i stand til at have en 30 cytopatogen virkning, og som genkendes af antistofferne, 75 DK 176253 B1 der fremkaldes mod de tilsvarende antigener af et vilkårligt af de i CNCM deponerede HIV-2 retrovirus med numrene 1-502, 1-532, 1-642 og 1-643 eller i ECACC depo nerede HIV-2 retrovirus med numrene 87.011001 og 5 87.011002 {svarende til henholdsvis 1-502 og 1-532), eller en variant af en af disse HIV-2 retrovira, og at man påviser et muligt dannet immunologisk konjugat mellem mindst et af disse antigener og antistofferne.

12. Fremgangsmåde ifølge krav 11, kendetegnet ved, at man bringer den biologiske prøve fra den person, som skal diagnosticeres, i kontakt med en blanding af antigener fra både et HIV-l og et HIV-2 retrovirus, hvilket antigen fra HIV-2 genkendes af antistofferne, 15 der fremkaldes mod de tilsvarende antigener af et vilkårligt af de i CNCM deponerede HIV-2 retrovirus med numrene 1-502, 1-532, 1-642 og 1-643 eller i ECACC deponerede HIV-2 retrovirus med numrene 87.011001 og 87.011002 {svarende til henholdsvis 1-502 og 1-532) el-20 ler en variant af en af disse HIV-2 retrovirus, specielt med et præparat ifølge et vilkårligt af kravene 1-8, og at man påviser det muligt dannede immunologiske konjugat mellem mindst et af disse antigener og antistofferne.

13. Kit til in vitro påvisning af tilstedeværelse af antistoffer mod et retrovirus, der er cytopatogent for humane T4 lymfocyter, specielt hos en person, der muligvis bærer disse antistoffer, kendetegnet ved, at det omfatter en blanding af mindst et HIV-l an-30 tigen og mindst et HIV-2 antigen, specielt et præparat 76 DK 176253 B1 som defineret i et vilkårligt af kravene 1-8; midler til påvisning af et immunologisk konjugat, der resulterer af den immunologiske reaktion mellem antigenerne og antistofferne i den biologiske væske. 5