DE4244541A1 - Retrovirus aus der HIV-Gruppe und dessen Verwendung - Google Patents
Retrovirus aus der HIV-Gruppe und dessen VerwendungInfo
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Description
Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Retrovirus aus
der HIV-Gruppe sowie Varianten oder Teile davon, welche die
wesentlichen Eigenschaften des Virus enthalten. Beschrieben
wird ein Verfahren zur Züchtung des Retrovirus. Die
Erfindung betrifft weiterhin die Gewinnung dieses Retrovirus
sowie die Verwendung des Virus, seiner Teile oder Extrakte
für medizinische Zwecke, für die Diagnostik und bei der
Herstellung von Impfstoffen.
Retroviren, die zur sogenannten HIV-Gruppe gehören, führen
bei damit infizierten Menschen zu Krankheitserscheinungen,
die unter dem Sammelbegriff Immunschwäche bzw. AIDS
(Acquired Immune Deficiency Syndrome) zusammengefaßt werden.
Epidemiologische Studien belegen, daß das Humane
Immunschwäche Virus (HIV) das aetiologische Agens für die
überwiegende Mehrheit der AIDS (Acquired Immune Deficiency
Syndrome)-Fälle darstellt. Ein 1983 aus einem Patienten
isoliertes und charakterisiertes Retrovirus erhielt die
Bezeichnung HIV-1 (Barre-Sinoussi, F. et al., Science 220,
868-871 [1983]). Eine Variante von HIV-1 wird in WO 86/02383
beschrieben.
Eine zweite Gruppe von Humanen Immunschwäche Viren wurde
1985 in Westafrika identifiziert (Clavel, F. et al., Science
233, 343-346 [1986]) und als Humanes Immunschwäche Virus Typ
2 (HIV-2) bezeichnet (EP-A 0 239 425). HIV-2 Retroviren
unterscheiden sich deutlich von HIV-1, weisen jedoch auch
eine Verwandtschaft zu Affen Immunschwäche Viren (SIV-2)
auf. Wie HIV-1 führt auch HIV-2 zu einer AIDS-Symptomatik.
Eine weitere Variante eines Immunschwäche Retrovirus wird in
der EP-A 0 345 375 beschrieben und dort als HIV-3 Retrovirus
bezeichnet (ANT 70).
Auch in Lancet Vol. 340, Sept. 1992, S. 681-682 wird die
Isolierung eines weiteren, varianten Immunschwächevirus
beschrieben.
Es ist ein Charakteristikum der Humanen Immunschwäche Viren,
daß sie eine hohe Variabilität aufweisen, die die
Vergleichbarkeit der verschiedenen Isolate deutlich
kompliziert. Beim Vergleich diverser HIV-1-Isolate treten
z. B. in einigen Regionen des Genoms hohe Variabilitäten auf,
während andere Genombereiche vergleichsweise konserviert
vorliegen (Benn, S. et al. Science 230, 949-951 [1985]). Ein
wesentlich größerer Polymorphismus konnte auch für HIV-2
beobachtet werden (Clavel, F. et al., Nature 324, 691-695
[1986]). Die größte genetische Stabilität besitzen Bereiche
in den gag und pol Genen, die für strukturell und
enzymatisch essentielle Proteine codieren; einige Regionen
im env-Gen sowie die Gene (vif, vpr, tat, rev, nef), die für
regulatorische Proteine codieren, zeigen einen hohen Grad an
Variabilität. Es konnte weiterhin gezeigt werden, daß
Antisera gegen HIV-1 auch mit gag und Pol Genprodukten von
HIV-2 kreuzreagieren, obwohl nur geringe Sequenzhomologie
vorlag. Ebenfalls war die Hybridisierung zwischen diesen
beiden Viren wenig signifikant, wenn nicht sehr wenig
stringente Konditionen verwandt wurden (Clavel, F. et al.,
Nature 324, 691-695 [1986]).
Aufgrund der weiten Verbreitung der Retroviren aus der HIV-
Gruppe und der Tatsache, daß zwischen dem Zeitpunkt der
Infektion und dem Zeitpunkt, zu dem eindeutige Symptome für
pathologische Veränderungen erkennbar sind, ein Zeitraum von
einigen bis vielen Jahren (2-20) liegt, ist es
epidemiologisch von großer Bedeutung, die Infektion mit
Retroviren der HIV-Gruppe möglichst frühzeitig und vor allem
zuverlässig zu bestimmen. Dies spielt nicht nur eine Rolle
bei der Diagnose von Patienten, die Zeichen von
Immunschwäche aufweisen, sondern auch bei der Überprüfung
von Blutspendern. Es hat, sich herausgestellt, daß bei der
Verwendung von Retroviren oder Bestandteilen davon des Types
HIV-1 oder HIV-2 in Nachweissystemen bei manchen Seren kein
oder nur ein schwacher Nachweis von Antikörpern geführt
werden kann, obwohl bei den Patienten, von denen die Seren
stammen, Zeichen von Immunschwäche auftreten. Mit Hilfe des
erfindungsgemäßen Retrovirus aus der HIV-Gruppe ist in
bestimmten Fällen ein derartiger Nachweis möglich.
Beschrieben wird die Isolation und Charakterisierung eines
neuen Humanen Immunschwäche Virus, im folgenden als MVP-
5180/91 bezeichnet, das aus peripheren Lymphozyten einer
1991 34-jährigen Patientin aus Kamerun isoliert wurde, die
Zeichen von Immunschwäche aufwies. Geographisch stammt
dieses Retrovirus aus einer Region in Afrika, die zwischen
Westafrika mit endemischer HIV-2 und HIV-1 Virusinfektion
und Ostzentralafrika mit fast ausschließlicher HIV-1-
Verbreitung lokalisiert ist. Gegenstand der vorliegenden
Erfindung ist also ein neues Retrovirus der HIV-Gruppe,
welches als MVP-5180/91 bezeichnet wird und dessen
Varianten. Das Retrovirus MVP-5180/91 wurde bei der European
Collection of Animal Cell Cultures (ECACC) unter der Nummer
V 920 92 318 gemäß den Bedingungen des Budapester Vertrages
hinterlegt.
Ebenso wie HIV-1 und HIV-2 wächst das erfindungsgemäße MVP-
5180/91 in folgenden Zellinien HUT 78, Jurkat-Zellen, C8166-
Zellen und MT-2-Zellen. Die Isolierung und Vermehrung von
Viren wird in dem Buch "Viral Quantitation in HIV Infection,
Editor Jean-Marie Andrieu, John Libbey Eurotext, 1991"
ausführlich beschrieben. Die dort beschriebenen
Arbeitsmethoden werden durch Bezugnahme zum Gegenstand der
Offenbarung der vorliegenden Anmeldung gemacht.
Weiterhin besitzt das erfindungsgemäße Virus eine
magnesiumabhängige Reverse Transkriptase, die aber nicht
manganabhängig ist. Dies stellt eine weitere Gemeinsamkeit
zu den Viren HIV-1 und HIV-2 dar.
Zum besseren Verständnis der Unterschiede des
erfindungsgemäßen MVP-5180/91 Virus zu den Retroviren HIV-1
und HIV-2 soll zunächst kurz der Aufbau der Immunschwäche
verursachenden Retroviren erläutert werden. Im Inneren des
Virus befindet sich die RNA in einem kegelförmigen Core, das
aus Proteinuntereinheiten zusammengesetzt ist, die die
Bezeichnung p 24 (p für Protein) tragen. Dieses innere Core
wird von einer Proteinhülle umgeben, die aus dem Protein
p 17 aufgebaut ist (äußeres Core) und von einer
Glykoproteinhülle umgeben ist, die neben Lipiden, die aus
der Wirtszelle stammen, das Transmembranprotein gp 41, und
das Hüllprotein 120 (gp 120) enthält. Dieses gp 120 kann
dann mit den CD-4-Rezeptoren der Wirtszellen eine Bindung
eingehen.
Soweit bekannt, weist die RNA der HIV-Viren - vereinfacht
dargestellt - folgende Genbereiche auf: An den beiden Enden
sogenannte long terminal repeats (LTR), und die folgenden
Genbereiche gag, pol, env und nef. Das Gen gag codiert unter
anderem für die Kern(Core)-Proteine, p 24 und p 17, das Gen
pol codiert u. a. für die Reverse Transkriptase, die RNAse H
und die Integrase und das Gen env codiert für die
Glykoproteine gp 41 und gp 120 der Virushülle. Das Gen nef
codiert für ein Protein mit Regulatorfunktion. Eine
schematische Anordnung des Genomes von Retroviren des HIV-
Typs ist in Fig. 1 gezeigt.
Eine Unterscheidung zwischen den Retroviren HIV-1 und HIV-2
ist u. a. dadurch möglich, daß virales Antigen ausgetestet
wird mit einem monoklonalen Antikörper, der kommerziell als
Testkit von Abbott (HIVAG-1 Monoclonal) erhältlich ist, und
gegen das (HIV-1) p 24 gerichtet ist. Es ist bekannt, daß
der Gehalt an Reverser Transkriptase in den Virustypen HIV-1
und HIV-2 etwa gleich ist. Wenn man deshalb in Verdünnungen
der aufgeschlossenen Viren die Extinktion (E 490 nm),
erhalten durch die Antigen-Antikörper-Reaktion, aufträgt
gegen den Gehalt an Reverser Transkriptase, dann erhält man
eine Graphik, die etwa der Fig. 2 entspricht. Hierbei
stellt man fest, daß im Verhältnis zu dem Gehalt an Reverser
Transkriptase bei HIV-1 eine sehr hohe Bindungsaffinität für
p 24 mit dem eingesetzten monoklonalen Antikörper vorhanden
ist. Für HIV-2 tritt dagegen nur eine sehr geringe
Bindungsaffinität für p 24 bei Einsatz des monoklonalen
Antikörpers wiederum bezogen auf den Gehalt an Reverser
Transkriptase auf. Werden diese Messungen durchgeführt für
MVP-5180/91, dann befindet sich die Kurve ziemlich genau in
der Mitte zwischen der Kurve von HIV-1 und HIV-2, d. h. die
Bindungsaffinität des monoklonalen Antikörpers gegen MVP-
5180/91 p 24 ist gegenüber HIV-1 reduziert. Fig. 2 zeigt
schematisch diesen Sachverhalt, wobei RT Reverse
Transkriptase bedeutet und als Antigen (Ag) das Protein p 24
eingesetzt wird, gegen das der monoklonale Antikörper, der
in dem von Abbott käuflich erwerblichen Testkit vorhanden
ist, gerichtet ist.
Ein sehr vielseitig verwendbares System der Gentechnologie
ist die sogenannte PCR (polymerase chain reaction) geworden,
wobei die zur Durchführung des Verfahrens benötigten
Komponenten käuflich erworben werden können. Mit diesem
Verfahren ist es möglich, DNA-Sequenzen zu amplifizieren,
wenn DNA-Bereiche der zu amplifizierenden Sequenz bekannt
sind. Es müssen dann kurze komplementäre DNA-Fragmente
(Oligonucleotide = Primer) synthetisiert werden, die sich an
einen kurzen Bereich der zu amplifizierenden
Nukleinsäuresequenz anlagern. Für die Testdurchführung
werden HIV-Nukleinsäuren mit den Primern zusammengebracht in
einer Reaktionsmischung, die zusätzlich eine Polymerase und
Nukleotidtriphosphate enthält. Die Polymerisation (DNA-
Synthese) wird für eine bestimmte Zeit durchgeführt und dann
werden die Nukleinsäurestränge durch Erwärmen getrennt. Nach
Abkühlen läuft dann die Polymerisation erneut an. Wenn es
sich also bei dem erfindungsgemäßen Retrovirus um ein HIV-1
oder HIV-2 Virus handelt, dann müßte die Nukleinsäure
amplifiziert werden können, indem Primer verwendet werden,
die konserviert sind innerhalb der bekannten Sequenzen der
Viren HIV-1 und HIV-2. Derartige Primer sind zum Teil
vorbeschrieben (Laure, F. et al., Lancet ii, (1988) 538-541
für pol 3 und pol 4 bzw. Ou C.Y. et al., Science 239 (1988)
295-297 für sk 38/39, sk 68/69).
Es wurde nun herausgefunden, daß bei Verwendung von
bestimmten Primerpaaren, die folgende Sequenz aufweisen:
oder eine Kombination von pol 3 und pol 4 mit
(Donehower L.A. et al. (1990) J. Virol. Methods 28, 33-46)
und mit der PCR mit nested primer Amplifikate der MVP-
5180/91-DNA erhalten wurden.
Keine oder nur schwache Amplifikate im Vergleich zum HIV-1,
die evtl. auf Verunreinigungen zurückzuführen sind, wurden
erhalten mit folgenden Primer-Sequenzen:
Im Vergleich zum HIV-1 schwache Amplifikate, die jedoch die
gleiche Intensität wie das verwendete HIV-2 Isolat
(MVP-11971/87) aufwiesen, wurden erhalten mit
Eine weitverbreitete Methode zum Nachweis von HIV-
Antikörpern ist der sogenannte Western Blot (Immunoblot).
Dabei werden die viralen Proteine gelelektrophoretisch
aufgetrennt und dann auf eine Membran überführt. Die mit den
überführten Proteinen versehenen Membranen werden dann mit
Seren der zu untersuchenden Patienten in Verbindung
gebracht. Sofern Antikörper gegen die viralen Proteine
vorhanden sind, binden diese an die Proteine. Nach Waschen
verbleiben lediglich spezifische Antikörper gegen virale
Proteine. Die Antikörper werden dann mit Antiantikörpern
sichtbar gemacht, die regelmäßig mit einem Enzym gekoppelt
sind, das eine Farbreaktion katalysiert. Auf diese Weise
können die Banden der viralen Proteine sichtbar gemacht
werden.
Das erfindungsgemäße Virus MVP-5180/91 weist gegenüber den
Viren HIV-1 und HIV-2 im Western Blot zwei signifikante
wesentliche Unterschiede auf. Das HIV-1 zeigt regelmäßig
eine starke Bande, die dem Protein p 24 zuzuordnen ist und
eine sehr schwache, oft kaum sichtbare Bande, die dem
Protein p 23 zuzuordnen ist. HIV-2 weist eine kräftige Bande
auf, die dem Protein p 25 zuzuordnen ist und manchmal eine
schwache Bande, die dem Protein p 23 zuzuordnen ist. Im
Unterschied dazu weist das erfindungsgemäße MVP-5180/91
Virus zwei etwa gleich starke Banden auf, die den Proteinen
p 24 und p 25 entsprechen.
Ein weiterer signifikanter Unterschied besteht bei den
Banden, die der Reversen Transkriptase zuzuordnen sind. HIV-
1 zeigt eine Bande (p 53), die der Reversen Transkriptase
entspricht und eine Bande (p 66), die der Reversen
Transkriptase verbunden mit der RNAse H entspricht. Bei HIV-
2 entspricht die Reverse Transkriptase dem Protein p 55 und,
wenn sie mit der RNAse H verbunden ist, dem Protein p 68.
Das erfindungsgemäße MPV-5180/91 weist dagegen eine Bande
auf bei dem Protein p 48, die der Reversen Transkriptase
entspricht, und eine Bande, bei dem Protein p 60, die der
Reversen Transkriptase in Verbindung mit RNAse H entspricht.
Aus diesen Ergebnissen kann geschlossen werden, daß die
Reverse Transkriptase des MVP-5180/91 ein Molekulargewicht
hat, das zwischen etwa 3 und etwa 7 Kilodalton kleiner ist
als das der Reversen Transkriptase von HIV-1 bzw. HIV-2. Die
Reverse Transkriptase von MPV-5180 weist also ein
Molekulargewicht auf, das zwischen etwa 4500 Dalton und
etwa 5500 Dalton kleiner ist als die Reverse Transkriptase
von HIV-1 bzw. HIV-2.
Es wurde herausgefunden, daß mit Hilfe des erfindungsgemäßen
Virus MVP-5180/91 anti-env-Antikörper in Seren von deutschen
Patienten, die Zeichen von Immunschwäche zeigen, nur schwach
nachgewiesen werden können, wobei die Seren aber stark
reagieren, wenn anstelle des erfindungsgemäßen Virus ein
HIV-1 Virus verwendet wird. Diese stärkere Nachweisreaktion
wurde vor allem lokalisiert in dem gp 41 Protein. Bei den
Versuchen wurden Serumpanels gegenübergestellt, die einmal
von deutschen Patienten stammen und zum anderen von
afrikanischen Patienten mit Zeichen von Immunschwäche
stammen.
Die oben angegebenen Charakteristika kennzeichnen solche
Virus-Varianten, die dem erfindungsgemäßen MVP-5180/91
entsprechen. Wenn also aus heparinisiertem Spenderblut, das
von Personen stammt, die Immunschwächeanzeichen aufweisen
und vorzugsweise aus Afrika stammen, Immunschwächeviren
isoliert werden, dann kann auf diese Weise das
erfindungsgemäße Virus oder Varianten davon erhalten werden.
Da das Virus isoliert wurde, welches die oben erwähnten
Eigenschaften aufweist, kann die Klonierung einer cDNA auf
folgendem Weg durchgeführt werden: Das Virus wird aus einer
entsprechend großen Kulturmenge (etwa 1 l) präzipitiert und
in phosphatgepufferter Kochsalzlösung aufgenommen. Dann
erfolgt eine Pelletierung durch ein (20%iges) Saccharose-
Kissen. Das Viruspellet kann in 6 M Guanidiniumchlorid in
20 mM Dithiothreitol und 0,5% Nonidet P 40 suspendiert
werden. CsCl wird bis auf eine Konzentration von 2 molar
zugegeben und die das aufgebrochene Virus enthaltende Lösung
wird auf ein Cäsiumchlorid-Kissen aufgebracht. Dann wird die
virale RNA durch Zentrifugation pelletiert, gelöst, mit
Phenol extrahiert und mit Ethanol und Lithiumchlorid
präzipitiert. Mit Hilfe eines Oligo(dT)-Primers wird die
Synthese des ersten cDNA-Stranges an der viralen RNA oder
Teilen davon durchgeführt. Die Synthese unter Zugabe von
Reverser Transkriptase kann durchgeführt werden unter
Verwendung eines käuflich erhältlichen Kits. Für die
Synthese des zweiten Stranges wird der RNA-Strang des
RNA/DNA-Hybrids mit RNase H verdaut und der zweite Strang
unter Einsatz von E.coli DNA Polymerase I synthetisiert. Mit
Hilfe von T4 DNA Polymerase können dann stumpfe Enden
erzeugt werden und diese mit geeigneten Linkern für
Restriktionsschnittstellen verbunden werden. Nach
Restriktionsverdau mit der geeigneten
Restriktionsendonuklease wird das cDNA-Fragment aus einem
Agarosegel isoliert und mit einem vorher in geeigneter Weise
geschnittenen Vektor ligiert. Der Vektor mit dem cDNA-Insert
kann dann zur Transformation von kompetenten E.coli-Zellen
verwendet werden. Die erhaltenen Kolonien werden dann auf
Membranen übertragen, lysiert und denaturiert und
schließlich durch Hybridisierung mit Digoxigenin oder Biotin
markierter Nukleinsäure aufgefunden. Nach gentechnologischer
Herstellung der entsprechenden cDNA ist eine Isolierung der
gewünschten DNA-Fragmente, die aus dem Retrovirus stammen,
möglich. Durch Einbau dieser Fragmente in geeignete
Expressionsvektoren kann dann das gewünschte Protein bzw.
Proteinfragment exprimiert werden und für die diagnostischen
Tests eingesetzt werden.
Alternativ zu der angegebenen Methode kann das
Immunschwächevirus mit Hilfe der PCR-Technologie kloniert
werden, wobei die oben angegebenen Primer Verwendung finden
können.
Zwischen verschiedenen Virusisolaten kann die Ähnlichkeit
ausgedrückt werden durch den Grad der Homologie der
Nucleinsäure- oder Proteinsequenzen. Eine 50%ige Homologie
bedeutet beispielsweise, daß 50 von 100 Nucleotid- oder
Aminosäure-Positionen in den Sequenzen übereinstimmen. Die
Homologie von Proteinen wird durch Sequenzanalyse bestimmt.
Homologe DNA-Sequenzen lassen sich auch durch die
Hybridisierungs-Technik ermitteln.
Erfindungsgemäß wurde zunächst ein Teil aus dem Hüllprotein
sequenziert und festgestellt, daß diese Sequenz nur eine
verhältnismäßig geringe Homologie zu den entsprechenden
Sequenzen von Viren vom HIV-Typ aufweist. Insbesondere
bezogen auf den gp 41-Bereich wurde durch einen Vergleich
mit HIV-Sequenzen, der mit Hilfe von Datenbanken
durchgeführt wurde, eine Homologie von höchstens 66%
(Nucleotidsequenz) ermittelt.
Es wurde weiterhin der Bereich sequenziert, der für gp 41
kodiert. Diese Sequenz ist in Tabelle 5 dargestellt.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind daher solche
Viren, die eine Homologie von mehr als 66%, bevorzugt 75%
und besonders bevorzugt 85% aufweisen zu dem
erfindungsgemäßen HIV-Virus, MVP 5180/91, bezogen auf die
Nucleotidsequenz der Tabelle 1 und/oder der Tabelle 5.
Weiterhin sind Gegenstand der vorliegenden Erfindung solche
Viren, die eine Homologie von mehr als 66%, bevorzugt 75%
und besonders bevorzugt 85% aufweisen zu Partialsequenzen
der in Tabelle 5 dargestellten Nucleotidsequenz, die
wenigstens 50, bevorzugt 100 Nucleotide lang sind.
Anhand der isolierten Sequenz können immundominante Epitope
(Peptide) konfektioniert und synthetisiert werden.
Bei den diagnostischen Tests wird eine Serumprobe der zu
untersuchenden Person zusammengebracht mit den Proteinketten
von einem oder mehreren Proteinen oder Glykoproteinen (die
in eukaryontischen Zellinien exprimiert werden können) oder
Teilen davon, die von MVP-5180/91 stammen. Bevorzugte
Testverfahren schließen die Immunfluoreszenz oder
immunenzymatische Testverfahren (z. B. Elisa, Immunoblot)
ein.
Bei den immunenzymatischen Tests (ELISA) kann beispielsweise
Antigen, das von MVP-5180/91 oder einer Variante davon
stammt, an den Wänden von Mikrotiterplatten gebunden werden.
Die dabei verwendete Dosierung hängt von dem Testsystem und
der Behandlung der Mikrotiterplatten wesentlich ab. Dann
wird Serum bzw. Serumverdünnungen, die von der zu
untersuchenden Person stammen, in die Löcher der
Mikrotiterplatten gegeben. Nach einer bestimmten
Inkubationszeit wird die Platte gewaschen und spezifische
Immunkomplexe werden nachgewiesen durch Antikörper, die
spezifisch an menschliche Immunglobuline binden und die
vorher mit einem Enzym, beispielsweise
Meerrettichperoxidase, alkalischer Phosphatase usw.
verbunden wurden oder mit enzymmarkiertem Antigen. Diese
Enzyme können ein farbloses Substrat in ein stark gefärbtes
Produkt umwandeln und an der Stärke der Färbung kann dann
das Vorhandensein von spezifischen Anti-HIV-Antikörpern
abgelesen werden. Eine weitere Möglichkeit der Verwendung
des erfindungsgemäßen Virus in Testsystemen ist die
Verwendung in Western Blots.
Auch wenn die Herstellung von Impfstoffen gegen
Immunschwächeerkrankungen sich als äußerst schwierig
erweist, kann doch auch dieses Virus bzw. Teile davon, d. h.
immundominante Epitope und Induktoren der zellulären
Immunität, oder gentechnologisch hergestellte Antigene zur
Entwicklung und Herstellung von Impfstoffen verwendet
werden.
Das erfindungsgemäße Immunschwäche-Virus MVP-5180/91 wurde
aus dem Blut einer Patientin mit Zeichen von Immunschwäche
isoliert. Hierzu wurden periphere mononukleäre Zellen
(peripheral blood lymphocytes, PBL) und periphere
Lymphozyten aus dem Blut (PBL) eines nicht HIV-infizierten
Spenders mit Phytohämaglutinin stimuliert und in Kultur
gehalten. Verwendet wurde hierzu das übliche Medium RPMI
1640 mit 10% fötalem Kälberserum. Die Kulturbedingungen
sind beschrieben in Landay A. et al., J. Inf. Dis., 161
(1990) S. 706-710. Beobachtet wurde dann die Bildung von
Riesenzellen unter dem Mikroskop. Die Produktion von HIV-
Viren wurde über die Bestimmung des p 24-Antigens mit Hilfe
des käuflich erwerbbaren Tests von Abbot bestimmt. Ein
weiterer Test zur Bestimmung des Wachstums der Viren war der
Test unter Verwendung von partikelgebundener Reverser
Transkriptase (Eberle J., Seibl R., J. Virol. Methods in
press). Das Wachstum der Viren wurde also anhand der
enzymatischen Aktivitäten im Kulturüberstand ein- bis
zweimal pro Woche bestimmt, um die Virusproduktion zu
überwachen. Wöchentlich einmal wurden neue
Spenderlymphozyten zugegeben.
Nachdem eine HIV-Virenvermehrung festgestellt werden konnte,
wurden frische periphere Lymphozyten aus dem Blut (PBL)
nicht HIV-infizierter, gesunder Spender mit dem Überstand
der ersten Kultur infiziert. Dieser Schritt wurde wiederholt
und dann wurden mit dem Überstand H 9 bzw. HUT 78 Zellen
infiziert. Auf diese Weise war eine permanente Produktion
des Immunschwäche-Virus möglich. Das Virus wurde bei der
ECACC unter der Nr. V 920 92 318 hinterlegt.
Zum Nachweis von HIV-Infektionen ist derzeit der sogenannte
Western Blot oder Immunoblot ein Standardverfahren. Gemäß
der in J. Virol. Meth. 15 (1987) S. 11-23 von Gürtler et al.
beschriebenen Vorgehensweise wurden verschiedene Seren
untersucht. Hierbei wurden Seren von deutschen Patienten
solchen Seren gegenübergestellt, die von afrikanischen
Patienten erhalten wurden. Es wurden hierbei folgende
Ergebnisse erhalten:
Die oben dargestellten Ergebnisse zeigen, daß ein aus
deutschen Patienten isoliertes Virus vom HIV-1 Typ, wenn es
zum Nachweis von HIV-Infektionen verwendet wird,
möglicherweise keine eindeutigen Ergebnisse liefert, wenn
der Patient infiziert wurde mit einem Virus, das dem
erfindungsgemäßen MVP-5180/91 entspricht. Es wird dabei
davon ausgegangen, daß mit Hilfe des erfindungsgemäßen Virus
solche Viren nachgewiesen werden können, die wenigstens etwa
85% Homologie, bezogen auf das Gesamtgenom, zu dem
erfindungsgemäßen Virus aufweisen.
Gemäß der in Beispiel 2 angegebenen Vorgehensweise wurden
weitere Western Blots durchgeführt. Die Ergebnisse sind in
der anliegenden Fig. 3 dargestellt. Bei diesem Test wurde
einmal das virale Protein des erfindungsgemäßen
Immunschwäche-Virus MVP-5180/91 und einmal das virale
Protein eines HIV-1-Typ Virus (MVP-899) gelelektrophoretisch
aufgetrennt und dann auf Zellulosefilter transferiert. Diese
Filterstreifen wurden mit den Seren von verschiedenen
Patienten inkubiert und dann wurden die spezifischen
Antikörper durch eine Farbreaktion sichtbar gemacht. Die
linke Hälfte der Figur mit der Überschrift MVP-5180 zeigt
das erfindungsgemäße Immunschwäche-Virus. Die rechte Hälfte
der Figur zeigt ein aus deutschem Spender isoliertes Virus
(MVP-899), bei dem es sich um ein HIV-1-Virus handelt.
Die einzelnen Filterstreifen wurden nun mit den Seren von
verschiedenen Patienten inkubiert. Betrachtet man die
Fig. 3, so wurden jeweils dieselben Seren (von deutschen
Patienten) umgesetzt mit je zwei Filterstreifen, wobei die
Nummern 8 und 26; 9 und 27; 10 und 28; 11 und 29; 12 und 30;
13 und 31; 14 und 32; 15 und 33 sowie 16 und 34 die gleichen
Seren bezeichnen. Bei den Western Blots mit den Nummern 17
und 18 wurden Seren von afrikanischen Patienten eingesetzt.
Die Zahlen an den rechten Seitenrändern geben die
annähernden Molekulargewichte in Tausend (KD) an.
Die Fig. 3 zeigt deutlich, daß Seren von deutschen
Patienten mit dem erfindungsgemäßen Immunschwäche-Virus im
Western Blot mit dem gp 41 nur sehr schwach reagieren. Seren
von afrikanischen Patienten dagegen reagieren mit dem
erfindungsgemäßen Immunschwäche-Virus sehr stark. Fig. 3
macht daher deutlich, daß unter Verwendung des
erfindungsgemäßen Immunschwäche-Virus solche Immunschwäche-
Infektionen nachgewiesen werden können, die bei Verwendung
eines HIV-1 oder HIV-2-Virus nur fragliche, also nicht
eindeutig positive Ergebnisse liefern. Diese
Nachweismöglichkeit kann weitreichende diagnostische
Bedeutung haben, da in den Fällen, in denen nur fragliche
Ergebnisse im Western Blot erzielt werden, nicht mit
eindeutiger Sicherheit festgestellt werden kann, ob es sich
um eine Infektion mit einem Immunschwäche-Virus handelt.
Wenn aber mit Hilfe des erfindungsgemäßen Immunschwäche-
Virus derartige fragliche Ergebnisse einer Infektion mit
einem Virus des erfindungsgemäßen Typs zugeordnet werden
können, dann stellt dies einen erheblichen diagnostischen
Fortschritt dar.
Genomische DNA aus MVP-5180/91-infizierten HUT 78-Zellen
wurden nach Standardmethoden isoliert.
Zur Charakterisierung von Genombereichen des Isolates
MVP-5180/91 wurden PCR (Polymerase Chain Reaction)-
Experimente mit einem Primerpaar aus dem Hüllproteinbereich
gp 41 durchgeführt. Die Durchführung der PCR-Experimente
erfolgte nach der Methode von Saiki et al. (Saiki et al.,
Science 239: 487-491, 1988) mit folgenden Modifikationen:
Für die Amplifikation HIV-spezifischer DNA-Bereiche wurden
5 µl genomische DNA aus MVP-5180/91-infizierten HUT 78-
Zellen in einem 100 µl Reaktionsansatz (0,25 mM dNTP, je
1 µM Primer 1 und Primer 2, 10 mM Tris HCl pH 8,3, 50 mM
KCl, 1,5 mM MgCl2, 0,001% Gelatine, 2,5 units Taq
Polymerase (Perkin Elmer) pipettiert und nach folgendem
Temperatur-Programm amplifiziert: 1. Initiale Denaturierung:
3′ 95°C, 2. Amplifikation: 90′′ 94°C, 60′′ 56°C, 90′′ 72°C
(30 Cyclen).
Die für die PCR und die Nucleotidsequenzierung verwendeten
Primer wurden auf dem Oligonucletidsynthesizer 8750 der
Firma Biosearch synthetisiert.
Die amplifizierte DNA wurde über ein 3% "Nusieve"-
Agarosegel (Fa. Biozyme) aufgetrennt, das amplifizierte
Fragment ausgeschnitten und mit dem gleichen Volumen an
Puffer (1×TBE (0,09 M TrisBorat, 0,002 M EDTA pH8,0)
versetzt. Nach Inkubation des DNA-Agarosegemisches für
10 Minuten bei 70°C und nachfolgender Phenolextraktion wurde
die DNA aus der wäßrigen Phase durch Zugabe von 1/10 Vol 3M
NaAc pH 5,5 und 2 Vol Ethanol bei -20°C 15′ gefällt und
anschließend in einer Zentrifuge (Eppendorf) pelletiert
(13000 rpm, 10′, 4°C). Die pelletierte DNA wurde getrocknet,
in Wasser aufgenommen und nach der photometrischen
Bestimmung der DNA-Konzentration bei 260 nm im
Spektralphotometer (Beckman) nach der Methode von Sanger
(F. Sanger, Proc. "Natl.Adac.Sci., 74: 5463, 1977)
sequenziert. Anstelle der Sequenzierung mit Klenow DNA
Polymerase, wurde die Sequenzierungsreaktion mit einem Kit
von Applied Biosystems ("Taq Dye Deoxy Terminator Cycle
Sequencing", Best.-Nr.: 401150) durchgeführt. Als Primer
wurden in getrennten Sequenzierungsreaktionen Primer 1 oder
Primer 2 (jeweils 1 µM) eingesetzt. Die Analyse der
Sequenzierungsreaktion erfolgte auf dem DNA-Sequenziergerät
373A (Applied Biosystems) nach den Vorgaben des
Geräteherstellers.
Die Nucleotidsequenz des amplifizierten DNA-Bereichs und die
davon abgeleitete Aminosäuresequenz ist in der Tabelle 1
dargestellt.
Die gefundene Nucleotidsequenz aus Tabelle 1 wurde auf
homologe Sequenzen in der GENEBANK-Datenbank (Release 72,
Juni 1992) mit Hilfe des GCG-Computerprogramms (Genetic
Computer Group, Inc., Wisconsin USA, Version 7.1, März 1992)
untersucht. In dieser Datenbank sind die meisten der bis
Juli 1992 bekannten Nucleotidsequenzen von
Immundefizienzviren humanen Ursprungs und von Isolaten aus
Primaten enthalten.
Die Nucleotidsequenz aus Tabelle 1 weist im besten Fall eine
66%ige Homologie zu einem Schimpansen-Isolat auf
(Tabelle 2a). Zu HIV 1-Isolaten ist MVP 5180/91 in der
untersuchten DNA-Sequenz im besten Fall zu 64% homolog
(Tabelle 2b). Zu HIV 2-Isolaten ist die DNA aus Tabelle 1 zu
56% homolog (Tabelle 2c). Außer der Sequenz des
Schimpansenisolates (Tabelle 2a) besteht die beste Homologie
zwischen der Nucleotidsequenz aus Tabelle 1 und DNA-
Abschnitten aus Primatenisolaten (SIV: Simian
Immunodeficiency Virus) in einer DNA-Sequenz, die für einen
Teilbereich des Hüllproteins des Isolates SIV (Afrikanische
Meerkatze) TYO-1 kodiert., Die Homologie beträgt 61,5%
(Tabelle 2d).
Die gefundene Aminosäuresequenz aus Tabelle 1 wurde auf
homologe Sequenzen in der SWISSPROT Protein-Datenbank
(Release 22, Juni 1992) mit Hilfe des GCG-Computerprogramms
untersucht. In dieser Datenbank sind die meisten der bis
Juni 1992 bekannten Proteinsequenzen von Immundefizienz-
Viren humanen Ursprungs und von Isolaten aus Primaten
enthalten.
Die Aminosäuresequenz aus Tabelle 1 ist im besten Fall mit
62,5% zu einem Hüllproteinabschnitt des oben genannten
Schimpansenisolates homolog (Tabelle 3a). Unter HIV 1-
Hüllproteinen findet man die beste Homologie mit der
Aminosäuresequenz aus Tabelle 1, in dem Isolat HIV 1 Mal.
Die Homologie beträgt 59% (Tabelle 3b). Zu HIV 2-
Hüllproteinen beträgt die Homologie mit der
Aminosäuresequenz aus Tabelle 1 im besten Fall 52%
(Tabelle 3c, Isolat HIV 2 Rod). Da auch HIV 1 und HIV 2-
Isolate im besten Fall im korrespondierenden
Proteinabschnitt nur zu 64% identisch sind, scheint es sich
bei dem Isolat MVP-5180/91 um eine HIV-Variante zu handeln,
die sich deutlich von HIV 1 und von HIV 2 strukturell
abgrenzt und somit einen Vertreter einer davon unabhängigen
Gruppe von HIV-Viren repräsentiert.
Die Aminosäuresequenz des amplifizierten DNA-Bereiches
(Tabelle 1) des HIV-Isolates MVP 5180/91 überlappt mit einem
immundiagnostisch wichtigen Bereich aus dem Hüllprotein
gp 41 von HIV 1 (Aminosäure 584-618*) (Tabelle 4) (Gnann et
al., J. Inf. Dis. 156: 261-267, 1987; Norrby et al., Nature,
329: 248-250, 1987).
Korrespondierende Aminosäurebereiche aus den Hüllproteinen
von HIV 2 und SIV sind ebenfalls immundiagnostisch
konserviert (Gnann et al., Science, S. 1346-1349, 1987). So
werden Peptide aus diesem Hüllproteinbereich von HIV 1 und
HIV 2 in vielen kommerziell erhältlichen HIV 1/2 Antikörper-
Screeningtests als Festphasenantigene eingesetzt. Ungefähr
99% der anti HIV 1 und anti HIV 2 positiven Seren können
damit erfaßt werden.
Der Aminosäurebereich des MVP-5180/91-Hüllproteins
(Tabelle 1) könnte aufgrund der Überlappung mit dem
immundiagnostisch wichtigen Bereich aus gp 41
serodiagnostisch von Bedeutung sein. Dies wäre insbesondere
dann der Fall, wenn Antiseren von HIV-infizierten Patienten
mit keinem der kommerziell erhältlichen Antikörper-
Screeningtests positiv reagieren würden. In diesen Fällen
könnte eine Infektion mit einem MVP-5180/91 eng verwandten
Virus vorliegen.
DNA Isolierung, Amplifizierung und strukturelle
Charakterisierung von Genomabschnitten des HIV Isolates MVP-
5180/91 (kodierend für gp 41)
Genomische DNA aus MVP-5180/91-infizierten HUT 78-Zellen
wurden wie beschrieben isoliert.
Zur Charakterisierung von Genombereichen des Isolates MVP-
5180/91 wurden PCR (Polymerase Chain Reaction)-Experimente
mit Primerpaaren aus dem Hüllproteinbereich gp 41
durchgeführt. Die PCR (Saiki et al., Science 239: 487-491,
1988) und inverse PCR (Triglia et ai., Nucl. Asids, Res. 16:
8186, 1988) wurden mit folgenden Modifikationen
durchgeführt:
Für die Amplifikation HIV-spezifischer DNA Bereiche wurden
5 µl (218 pg/ml) genomische DNA aus MVP-5180/91 infizierten
HUT78 Zellen in einem 100 µl Reaktionsansatz (0,25 mM dNTP,
je 1 µM Primer 163env und Primer envend, 10 mM Tris HCl
pH 8.3, 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 0,001% Gelatine, 2,5 units
Taq Polymerase (Perkin Elmer)) pipettiert und nach folgendem
Temperaturprogramm amplifiziert: 1. Initiale Denaturierung:
3 min. 95°C, 2. Amplifikation: 90 sec. 94°C, 60 sec. 56°C,
90 sec. 72°C (30 Cyclen).
Der 5′ Bereich von gp 41 (N-Terminus) und die 3′ Sequenz von
gp 120 wurden "inverser PCR" amplifiziert. Hierzu
wurden 100 µl einer genomischen DNA Präparation (218 µg/ml)
aus MVP-5180/91-infizierten HUT 78-Zeilen in einem Endvolumen
von 200 µl mit 10 units der Restriktionsendonuklease Sau3a
1 Stunde bei 37°C verdaut. Die DNA wurde anschließend
phenolisiert und mit Natriumazetat (Endkonzentration 300 mM)
und 2.5 Volumen Ethanol 10 min bei -70°C gefällt, in der
Eppendorfzentrifuge abzentrifugiert und das Pellet
getrocknet und in 890 µl Aqua dest. resuspendiert. Nach
Zugabe von 100 µl Ligasepuffer (50 mM Tris HCl, pH 7,8,
10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 1 mM ATP, 25 µg/ml Rinder
serumalbumin) und 10 µl T4 DNA-Ligase (Fa. Boehringer,
Mannheim) wurden die DNA-Fragmente 3 Stunden bei
Raumtemperatur ligiert, erneut phenolisiert und mit
Natriumazetat und Ethanol wie oben gefällt. Nach dem
Abzentrifugieren und Trocknen wurde die DNA in 40 µl Aqua
dest. resuspendiert und mit 10 units der
Restriktionsendonuklease SacI (Fa. Boehringer, Mannheim) für
1 Stunde verdaut. Anschließend wurden 5 µl dieses Ansatzes
in einem PCR-Experiment wie unter "1. PCR" dargestellt,
eingesetzt. Anstelle der Primer 163env und envend wurden für
die inverse PCR die Primer 168i und 169i verwendet.
Die Primer 163env, 168i und 169i wurden aus der bereits
ermittelten Teilsequenz des HIV-Isolates MVP-5180 ausgewählt
(Beispiel 4).
Die für die PCR/inverse PCR und die Nucleotidsequenzierung
verwendeten Primer wurden auf dem Oligonucleotidsynthesizer
8750 der Firma Biosearch synthetisiert, wobei die Primer
folgende Sequenzen aufwiesen:
Die amplifizierte DNA wurde über ein 3% "Nusieve"-Agarose
gel (Fa. Biozyme) aufgetrennt, das amplifizierte Fragment
ausgeschnitten und mit dem gleichen Volumen an Puffer (1×TBE
(0.09 M TrisBorat, 0.002 M EDTA, pH 8.0)) versetzt. Nach
Inkubation des DNA-Agarosegemisches für 10 Minuten bei 70°C
und nachfolgender Phenolextraktion wurde die DNA aus der
wäßrigen Phase durch Zugabe von 1/10 Vol 3M NaAc, pH 5,5
und 2 Vol Ethanol bei -20°C 15′ gefällt und anschließend in
einer Eppendorfzentrifuge pelletiert (13000rpm, 10′, 4°C).
Die pelletierte DNA wurde getrocknet, in Wasser aufgenommen
und nach der photometrischen Bestimmung der DNA-
Konzentration bei 260 nm im Spektralphotometer (Fa. Beckman)
nach der Methode von Sanger (F. Sanger, Proc. Natl. Acad.
Sci., 74 : 5463, 1977) sequenziert. Anstelle der Sequenzierung
mit Klenow DNA Polymerase wurde die Sequenzierungsreaktion
mit einem Kit der Fa. Applied Biosystems ("Taq Dye Deoxy
Terminator Cycle Sequencing", Best. Nr.: 401150)
durchgeführt. Als Primer wurden in getrennten
Sequenzierungsreaktionen Primer 163env oder Primer envend
(jeweils 1µM) eingesetzt. Die amplifizierte DNA aus dem
inversen PCR-Experiment wurde mit den Primern 168i und 169i
sequenziert. Die Analyse der Sequenzierungsreaktion erfolgte
auf dem DNA-Sequenziergerät 373A (Applied Biosystems) nach
den Vorgaben des Geräteherstellers.
Die Nucleotidsequenz des amplifizierten DNA-Bereichs und die
davon abgeleitete Aminosäuresequenz sind in der Tabelle 5
dargestellt.
Die gefundene Nucleotidsequenz aus Tabelle 5 wurde auf
homologe Sequenzen in der GENEBANK-Datenbank (Release 72,
Juni 1992) mit Hilfe des GCG-Computerprogramms (Genetic
Computer Group, Inc. Wisconsin USA, Version 7.1, März 1992)
untersucht. In dieser Datenbank sind die meisten der bis
Juli 1992 bekannten Nucleotidsequenzen von
Immundefizienzviren humanen Ursprungs und von Isolaten aus
Primaten enthalten.
Die Nucleotidsequenz aus Tabelle 5 weist im besten Fall eine
62%ige Homologie zu einem HIV 1-Isolat auf. Zu HIV 2-
Isolaten ist die DNA aus Tabelle 5 zu 50% homolog.
Die aus der Nucleotidsequenz aus Tabelle 5 abgeleitete
Aminosäuresequenz wurde auf homologe Sequenzen in der
SWISSPROT Protein-Datenbank (Release 22, Juni 1992) mit
Hilfe des GCG-Computerprogramms untersucht. In dieser
Datenbank sind die meisten der bis Juni 1992 bekannten
Proteinsequenzen von Immundefizienzviren humanen Ursprungs
und von Isolaten aus Primaten enthalten.
Die Aminosäuresequenz aus Tabelle 5 ist im besten Fall mit
54% zu dem korrespondierenden Hüllproteinabschnitt eines
Schimpansen-Isolates CIV homolog und zu 54,5% zu dem HIV 1-
Isolat Mal. Zu HIV 2′-Hüllproteinen beträgt die Homologie mit
der Aminosäuresequenz aus Tabelle 5 im besten Fall 34%
(Isolat HIV 2 d194).
Vergleicht man demgegenüber die gp 41-Aminosäuresequenz von
HIV 1 mit den in der SWISSPROT-Datenbank vorhandenen HIV 1
gp 41-Sequenz, ergeben sich wie erwartet im besten Fall eine
fast 100%ige Homologie und im schlechtesten Fall eine
78%ige Homologie.
Aufgrund dieser deutlichen strukturellen Unterschiede
zwischen dem Sequenzbereich aus Tabelle 5 und dem
korrespondierenden Abschnitt aus HIV 1 und HIV 2 scheint es
sich bei dem Isolat MVP-5170/91 um eine HIV-Variante zu
handeln, die sich von HIV 1 und HIV 2 deutlich strukturell
abgrenzt. Möglicherweise ist MVP-5180/1 einer eigenen, von
HIV 1 und HIV 2 sich abgrenzenden Gruppe von HIV-Viren
zuzuordnen.
Das Peptid von Aminosäure 584-618 des HIV 1-
Hüllproteinbereichs ist von besonderem serodiagnostischem
Interesse (Numerierung nach Wain Hobson et al., Cell 40 : 9-
17, 1985; Tabelle 2) (Gnann et al., J. Inf. Dis. 156 : 261-
267, 1987; Norrby et al., Nature, 329: 248-250, 1987).
Korrespondierende Aminosäurebereiche aus den Hüllproteinen
von HIV 2 und SIV sind ebenfalls immundiagnostisch
konserviert (Gnann et al., Science, S. 1346-1349, 1987). So
werden Peptide aus diesem Hüllproteinbereich von HIV 1 und
HIV 2 in vielen kommerziell erhältlichen HIV 1/2 Antikörper-
Screeningtests als Festphasenantigene eingesetzt. Ungefähr
99% der Anti-HIV 1 und Anti-HIV 2 positiven Seren können
damit erfaßt werden.
Der korrespondierende Aminosäurebereich des MVP-5180/91-
Hüllproteins (Tabelle 6) als auch das gesamte gp 41 dieses
Isolates könnten serodiagnostisch insbesondere dann von
Bedeutung sein, wenn Antiseren von HIV-infizierten Patienten
in kommerziell erhältlichen Antikörper-Screening-Tests nur
schwach oder überhaupt nicht reagieren würden. In diesen
Fällen könnte eine Infektion mit einem MVP-5180/91 eng
verwandten Virus vorliegen.
Claims (16)
1. Immunschwäche-Virus der HIV-Gruppe oder Varianten dieses
Virus, das die wesentlichen morphologischen und
immunologischen Eigenschaften des bei der European
Collection of Animal Cell Cultures (ECACC) unter der
Nr. V 920 92 318 hinterlegten Retrovirus mit der
Bezeichnung MVP-5180/91 aufweist.
2. Immunschwäche-Virus nach Anspruch 1, dadurch
gekennzeichnet, daß es eine der Reversen Transkriptase
entsprechende Proteinbande im Western Blot aufweist, die 3-7
Kilodalton kleiner ist als die entsprechende Bande der Viren
HIV 1 und/oder HIV 2.
3. Immunschwäche-Virus nach einem der Ansprüche 1 oder 2,
dadurch gekennzeichnet, daß dieses Retrovirus mit einem
gegen das Protein p 24 gerichteten monoklonalen Antikörper
weniger Reaktivität aufweist, bezogen auf die Reverse
Transkriptase-Aktivität, als das Virus HIV 1 und mehr
Aktivität, bezogen auf die Aktivität der Reversen
Transkriptase, als HIV 2.
4. Immunschwäche-Virus nach einem der vorhergehenden
Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß mit seinem
Transmembranprotein gp 41 Antigen-Antikörperreaktionen gut
nachweisbar sind mit Seren von aus Afrika stammenden
Patienten und, daß mit dem gp 41 nur eine geringere oder
keine Antigen-Antikörperreaktion mit Seren von aus
Deutschland stammenden Patienten nachgewiesen werden kann.
5. Immunschwäche-Virus nach einem der obengenannten
Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es eine RNA-Sequenz
aufweist, die mit der RNA des hinterlegten Virus zu etwa
75% oder mehr, bezogen auf das Gesamtgenom, homolog ist.
6. Immunschwäche-Virus nach einem der oben genannten
Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es eine RNA-Sequenz
aufweist, die zu der RNA-Sequenz von Tabelle 1 zu wenigstens
75% homolog ist.
7. Immunschwäche-Virus nach einem der Ansprüche 1 bis 5,
dadurch gekennzeichnet, daß es eine Nucleotid-Sequenz
aufweist, die zu der Sequenz von Tabelle 5 oder Teilen davon
zu wenigstens 75% homolog ist.
8. Immunschwäche-Virus nach Anspruch 7, dadurch
gekennzeichnet, daß das Teil der Sequenz wenigstens 50
Nucleotide lang ist.
9. cDNA, die komplementär ist zu der RNA oder Teilen davon,
des bei der European Collection of Animal Cell Cultures
(ECACC) unter der Nr. V 920 92 318 hinterlegten
Immunschwäche-Virus MVP-5180/91 oder eines Virus gemäß einem
der Ansprüche 1-8.
10. Antigen, das unter Verwendung der cDNA gemäß Anspruch 9
hergestellt wurde oder unter Verwendung der
Aminosäurenstruktur, die aus seiner cDNA abgeleitet werden
kann.
11. Antigen, das aus dem Immunschwäche-Virus gemäß
Anspruch 1 hergestellt wurde.
12. Testkit zum Nachweis von Antikörpern gegen
Immunschwäche verursachende Viren, dadurch gekennzeichnet,
daß Antigen gemäß Anspruch 10 oder 11 eingesetzt wird.
13. Testkit gemäß Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß
es ein Western Blot ist.
14. Testkit gemäß Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß
es ein Elisa-Test ist oder ein Fluoreszenz-Antikörper
Nachweistest ist.
15. Verwendung des Immunschwäche-Virus gemäß einem der
Ansprüche 1 bis 8, der cDNA gemäß Anspruch 9 und/oder des
Antigens gemäß Anspruch 10 oder 11 zum Nachweis von
Retroviren, die Immunschwäche verursachen.
16. Verwendung des Retrovirus nach einem der Ansprüche 1
bis 8, der cDNA gemäß Anspruch 9 und/oder des Antigens gemäß
Anspruch 10 oder 11 zur Herstellung von Impfstoffen.
Priority Applications (25)
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---|---|---|---|
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EP98114623A EP0890642A3 (de) | 1992-10-06 | 1993-10-05 | Retrovirus aus der HIV-Gruppe und dessen Verwendung |
CA002107732A CA2107732C (en) | 1992-10-06 | 1993-10-05 | Retrovirus from the hiv group and its use |
ES93116058T ES2126620T5 (es) | 1992-10-06 | 1993-10-05 | Retrovirus del grupo de los vih y su utilizacion. |
JP24960593A JP3277045B2 (ja) | 1992-10-06 | 1993-10-05 | Hiv−グループのレトロウイルスおよびその使用 |
DE59309207T DE59309207D1 (de) | 1992-10-06 | 1993-10-05 | Retrovirus aus der HIV-Gruppe und dessen Verwendung |
EP93116058A EP0591914B2 (de) | 1992-10-06 | 1993-10-05 | Retrovirus aus der HIV-Gruppe und dessen Verwendung |
AT93116058T ATE174382T1 (de) | 1992-10-06 | 1993-10-05 | Retrovirus aus der hiv-gruppe und dessen verwendung |
DK93116058.4T DK0591914T4 (da) | 1992-10-06 | 1993-10-05 | Retrovirus fra HIV-gruppen og dets anvendelse |
AU48800/93A AU677225B2 (en) | 1992-10-06 | 1993-10-05 | Retrovirus from the HIV group and its use |
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