DE69028951T2 - Oligonukleotiden-Sequenzen zur Amplifizierung von HIV-2 und SIV Retrovirusgenomen, ihre Verwendung zur In-vitro-Diagnostik von durch diese Viren verursachten Infektionen - Google Patents

Oligonukleotiden-Sequenzen zur Amplifizierung von HIV-2 und SIV Retrovirusgenomen, ihre Verwendung zur In-vitro-Diagnostik von durch diese Viren verursachten Infektionen

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Description

  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Oligonucleotid- Sequenzen, die insbesondere als Oligonucleotid-Primer zur Durchführung von Amplifikationstechniken für Nucleotidsequenzen von Menschen-Immundefekt-Retroviren vom Typ HIV-2 oder von Affen-Immundefekt-Retroviren vom Typ SIV verwendbar sind.
  • Die Erfindung bezieht sich insbesondere auf die Anwendung dieser Sequenzen auf In vitro-Diagnoseverfahren beim Menschen für die Infektion eines Individuums durch einen Retrovirus vom Typ HIV-2.
  • Die Isolierung und die Charakterisierung von Retroviren, die unter der Bezeichnung HIV-2 zusammengefaßt sind, wurden in der Patentanmeldung EP-A-0 239 425 beschrieben. Diese Retroviren wurden bei mehreren afrikanischen Kranken isoliert, welche die Symptome einer Lymphadenopathie oder eines erworbenen Immundefekt-Syndroms (AIDS) aufweisen.
  • Die Retroviren vom Typ HIV-2 sind ebenso wie die Retroviren vom Typ HIV-1 durch einen Tropismus für die T4-Lymphozyten des Menschen und durch einen zytopathogenen Effekt hinsichtlich dieser Lymphozyten, wenn sie sich dort multiplizieren, gekennzeichnet, um entweder allgemeine und dauerhafte Polyadenopathien oder eine Art von AIDS zu verursachen.
  • Ein anderer Retrovirus, als SIV-1 bezeichnet, dessen Bezeichnung die zuvor bekannte Bezeichnung STLV-III ersetzt, wurde beim Rhesus-Makakenaffen isoliert (MD. DANIEL et al., Science, 228, 1201 (1985); M. L. LETWIN et al., Science, 230, 71 (1985) unter der Benennung "STLV-IIImac").
  • Ein anderer als "STLV-IIIAGM" (oder SIVAGM) bezeichneter Retrovirus wurde bei wilden Grünaffen isoliert. Doch scheint im Gegensatz zu den beim Rhesus-Makakenaffen vorliegenden Viren das Vorhandensein von STLV-IIIAGM keine Krankheit vom AIDS-Typ beim Afrika-Grünaffen zu bewirken.
  • Wegen sprachlicher Bequemlichkeit werden diese Viren im folgenden nur durch den Ausdruck SIV bezeichnet (der Ausdruck SIV ist die englische Abkürzung von "Simian Immunodeficency Virus" (Immundefektvirus des Affen), dem ggfs. eine Abkürzung folgt, welche die Affenart bezeichnet, von der sie herrühren, z. B. "mac" für "Makake" oder "AGM" für den Afrika-Grünaffen (Abkürzung von "African Green Monkey")).
  • Ein Stamm des SIV-Retrovirus wurde beim C.N.C.M. am 7. Februar 1986 unter der Nummer I-521 hinterlegt.
  • Studien haben gezeigt, daß der SIV-Retrovirus gewisse Proteine aufweist, welche eine immunologische Verwandtschaft mit Proteinen oder Glykoproteinen besitzen, die ausgehend von HIV-2 unter analogen Bedingungen gewonnen werden können.
  • Die Durchführung der Untersuchung der HIV-2-Retroviren hat auch zur Gewinnung von komplementären DNA-Sequenzen (cDNA) der RNAs ihres Genoms geführt. Die vollständige Nucleotid- Sequenz einer CDNA eines repräsentativen Retrovirus der Klasse HIV-2 (HIV-2 ROD) wurde am 21.02.1986 am C.N.C.M. unter der Nummer I-532 unter dem Referenznamen LAV-2 ROD hinterlegt.
  • Die In vitro-Diagnoseverfahren der Infektionen durch Viren des zur Zeit bestehenden Typs HIV-2 greifen am häufigsten auf die Erfassung von Anti-HIV-2-Antikörpern zurück, die in einer biologischen Flüssigkeit eventuell vorhanden sind, insbesondere in einem Serum, das ausgehend von dem zu untersuchenden Patient gewonnen wird, und zwar durch In-Kontakt-Bringen dieser biologischen Flüssigkeit mit HIV-2-Extrakten oder -Antigenen unter Bedingungen, welche die Erzeugung einer eventuellen immunologischen Reaktion dieser Extrakte oder Antigene mit diesen Antikörpern ermöglichen.
  • Derartige Diagnoseverfahren sind wenig empfindlich, und es besteht die Gefahr, daß sie fälschlicherweise negativ sind, insbesondere im Falle einer neuerlichen Infektion eines Individuums durch das HIV-2-Virus.
  • Die Genom-Amplifikationstechniken sind in beachtlicher Weise angepaßt für die Entwicklung von In vitro-Diagnoseverfahren, die für Viruskrankheiten besonders empflindlich sind. Unter diesen Amplifikationstechniken läßt sich die PCR-Technik zitieren (Polymerase Chain Reaction), wie sie in den Patentanmeldungen EP-A-0 200 362 und EP-A-0 229 701 beschrieben ist, oder aber die als "Qβ-Replikase" bezeichnete Technik, die in Biotechnology, Band 6, Seite 1197 (Oktober 1988) beschrieben ist, und diejenige, die mit Hilfe einer RNA-Polymerase (T7- RNA-Polymerase) vorgeht, die in der internationalen Patentanmeldung Nr. WO 89/01050 beschrieben ist. Sie ermöglichen eine Verbesserung der Nachweisempfindlichkeit für die Nucleinsäuren der Viren, erfordern jedoch die Verwendung von spezifischen Syntheseprimern.
  • Für die Suche nach Viren vom Typ HIV-2 ist die Auswahl der Primer problematisch. So kann auf Grund der großen Variationsbreite der Nucleotid-Sequenzen des Virusgenoms ein zu der bekannten Sequenz eines gegebenen HIV-2-Isolats passender Primer bei der Amplifikation gewisser Virusvarianten vom Typ HIV-2 versagen. Selbst wenn ein Primer aus einem Bereich ausgewählt wird, der sowohl im Genom eines ersten als auch eines anderen HIV-2-Virus vorhanden ist, wird sein "richtiges Funktionieren" dennoch nicht gewährleistet und kann zu schlechten Amplifikationsausbeuten führen.
  • Rayfield M. et al. haben in einer Veröffentlichung "The Journal of Infections Diseases", Band 158, Nr. 6, Dezember 1986, Seiten 1170 bis 1176, Primer beschrieben, die zur Amplifikation der DNA von HIV-2 in dem LTR-Teil der HIV-2-Sequenz angeordnet sind.
  • Die vorliegende Erfindung liefert auf präzise Weise Oligonucleotid-Sequenzen (oder -Primer), welche die Amplifikation des Genoms sämtlicher Viren vom Typ HIV-2 für Diagnosezwecke mit guten Ausbeuten ermöglicht.
  • Die Primer der vorliegenden Erfindung sind gleichzeitig spezifisch für die Viren der Gruppe HIV-2 und der Viren vom Typ SIV und sind unempfindlich für Veränderungen des Genoms dieser Viren.
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf einen Oligonucleotidprimer mit ungefähr 15 bis 25 Nucleotiden, der für die Genomamplifikation des Virus HIV-2 oder SIV einsetzbar ist.
  • Ein erfindungsgemäßer Primer ist dadurch gekennzeichnet, daß seine Nucleotid-Sequenz:
  • - (a) entweder aus denjenigen ausgewählt ist, die in einer der Nucleotidsequenzen enthalten sind, die von den Nudeotiden begrenzt sind, die an den Positionen 40 und 61, 9537 und 9558, 240 und 259, 546 und 569, 906 und 927, 612 und 633, 1857 und 1876, 2078 und 2101, 6275 und 6299, 6855 und 6878, 7548 und 7573, 7782 und 7805, 8412 und 8434, 61 und 82, 9558 und 9579 der vom Genom des Virus HIV-2 ROD abgeleiteten CDNA liegen, oder die komplementär zu einer der oben genannten Nucleotidsequenzen sind,
  • - (b) oder aus denjenigen ausgewählt ist, die in einer der Nucleotidsequenzen enthalten sind, die von den Nucleotiden begrenzt sind, die an den Positionen 40 und 61, 9511 und 9532, 240 und 259, 256 und 275, 551 und 574, 911 und 932, 617 und 638, 1868 und 1887, 2035 und 2058, 6227 und 6251, 7550 und 7564, 7776 und 7799, 8406 und 8428, 61 und 82, 9532 und 9553 der vom Genom des Virus SIVmac 142 abgeleiteten cDNA liegen, oder die komplementär zu einer der eben genannten Nucleotidsequenzen sind,
  • - (c) oder (insbesondere für die längsten Primer) eine der oben genannten Nucleotidsequenzen enthält, die aus HIV-2 ROD oder SIVmac 142 stammen, oder eine Nucleotidsequenz enthält, die komplementär zu einer der letzteren Sequenzen ist, wobei sich versteht, daß eventuelle zusätzliche Nucleotide, die vorzugsweise von der Seite des 5'-Endes über besagte Nucleotidsequenz "hinausragen", vorzugsweise mit denjenigen übereinstimmen, die sich diesseits des entsprechenden 5'-Endes innerhalb der vollständigen Sequenz des HIV- 2 ROD oder des SIVmac 142 befinden,
  • - wobei sich ebenso versteht, daß sich die cDNA- Stränge, die unter den Punkten (a), (b) und (c) in Betracht gezogen werden, diejenigen sind, die sich als komplementär zur RNA der Viren HIV-2 ROD und SIV- mac 142 erweisen,
  • - (d) oder, falls die Sequenz dieses Primers nicht identisch mit einer der oben genannten Nucleotidsequenzen oder nicht komplementär zu einer dieser Sequenzen ist, nichtsdestoweniger geeignet ist, mit dieser Nucleotidsequenz, die aus den oben genannten Viren HIV-2 ROD und/oder SIVmac 142 stammt, in einer Lösung, die sich aus 10 mM Tris, 20 mM KCl, 2 mM MgCl&sub2;und 0,01 % Gelatine zusammensetzt, während 1 Minute bei einer Temperatur, die größer oder gleich 50ºC ist, zu hybridisieren.
  • Die Numerierung der oben erwähnten Nudeotide entspricht derjenigen, die in der Fig. 2 des Artikels von GUYADER et. al., Nature, Band 326, Seiten 662-669 (1987) verwendet wird, was die cDNA von HIV-2 ROD anbelangt, und derjenigen, die in der Fig. 1 des Artikels von CHAKRABARTI L. et al., Nature, Band 328, Seite 543-547 (1987) verwendet wird, was die CDNA von Sivmac 142 anbelangt.
  • Die Erfindung bezieht sich insbesondere auf Oligonucleotid Primer, gekennzeichnet durch die folgenden Nucleotid-Ketten (dargestellt in der Richtung 5' T 3'):
  • Die oben erwähnten Primer sind identisch oder komplementär zu den folgenden Nucleinsäure-Sequenzen, die aus der cDNA des Virus HIV-2 ROD oder aus derjenigen des Virus SIVmac 142 hervorgehen:
  • - der Primer LTR1 ist einerseits identisch mit der Nucleotidsequenz, welche die an den Positionen 40 bis 61 angeordneten Nudeotide aufweist, sowie zu derjenigen, welche die Nudeotide aufweist, die an den Positionen 9537 bis 9558 der cDNA von HIV-2 ROD angeordnet sind, und andererseits mit der Nucleotidsequenz, welche die an den Positionen 40 bis 61 angeordneten Nudeotide aufweist, sowie mit derjenigen, welche die Nudeotide aufweist, die sich an den Positionen 9511 bis 9532 der CDNA von SIVmac 142 befinden,
  • - der Primer LTR2 ist einerseits komplementär zu den Nucleotidsequenzen, welche die Nudeotide aufweisen, die sich an den Positionen 240 bis 259 der cDNA von HIV-2 ROD und SIVmac 142 befinden, und andererseits zu der Nucleotidsequenz, welche die Nudeotide aufweist, die sich an den Positionen 256 bis 275 der cDNA von SIVmac 142 befinden,
  • - der Primer GAG1 ist identisch mit der Nucleotidsequenz, welche die Nudeotide 546 bis 569 der cDNA von HIV-2 ROD enthält, und mit der Nucleotidsequenz, welche die Nudeotide enthält, die sich an den Positionen 551 bis 574 der cDNA von SIVmac 142 befinden,
  • - der Primer GAG5 ist komplementär zu den Nucleotidsequenzen, welche die Nudeotide aufweisen, die sich jeweils an den Positionen 906 bis 927 und 911 bis 932 der cDNA von HIV-2 ROD und SIVmac 142 befinden,
  • - der Primer GAG2 ist identisch mit den Nucleotidsequenzen, welche die Nudeotide aufweisen, die sich jeweils an den Positionen 612 bis 633 und 617 bis 638 der CDNA von HIV-2 ROD und SIVmac 142 befinden, - der Primer GAG2B ist komplementär zu den oben erwähnten, mit GAG2 identischen Nucleotidsequenzen,
  • - der Primer POL1 ist identisch mit den Nucleotidsequenzen, welche die Nucleotide aufweisen, die sich jeweils an den Positionen 1857 bis 1876 und 1868 bis 1887 der cDNA von HIV-2 ROD und SIVmac 142 befinden,
  • - der Primer P1 ist identisch mit den Nucleotidsequenzen, welche die Nudeotide aufweisen, die sich jeweils an den Positionen 6275 bis 6299 und 6227 bis 6251 der CDNA von HIV-2 ROD und SIVmac 142 befinden,
  • - der Primer P2 ist komplementär zu der Nucleotidsequenz, welche die Nudeotide aufweist, die sich an den Positionen 6855 bis 6878 der cDNA von HIV-2 ROD befinden,
  • - der Primer P2B ist komplementär zu der oben erwähnten, mit P2 identischen Nucleotidsequenz,
  • - der Primer P4 ist komplementär zu der Nucleotidsequenz, welche die Nudeotide aufweist, die sich an den Positionen 7548 bis 7573 der cDNA von HIV-2 ROD befinden, und partiell komplementär zu der Nucleotidsequenz, welche die Nudeotide aufweist, die sich an den Positionen 7550 bis 7564 der cDNA von SIVmac 142 befinden,
  • - der Primer P6 ist identisch mit den Nucleotidsequenzen, welche die Nudeotide aufweisen, die sich jeweils an den Positionen 7782 bis 7805 und 7776 bis 7799 der cDNA von HIV-2 ROD und SIVmac 142 befinden,
  • - der Primer P7 ist identisch mit den Nucleotidsequenzen, welche die Nudeotide aufweisen, die sich jeweils an den Positionen 8412 bis 8434 und 8406 bis 8428 der cDNA von HIV-2 ROD und SIVmac 142 befinden,
  • - der Primer P7B ist komplementär zu den Nucleotidsequenzen, die mit dem oben erwähnten Primer P7 identisch sind,
  • - der Primer P8 ist komplementär einerseits zu der Nucleotidsequenz, welche die Nudeotide aufweist, die sich an den Positionen 61 bis 82 befinden, sowie zu derjenigen, welche diejenigen aufweist, die sich an den Positionen 9558 bis 9579 der cDNA von HIV-2 ROD befinden, und andererseits zu der Nucleotidsequenz, welche die Nudeotide aufweist, die sich an den Positionen 69 bis 82 befinden, sowie zu derjenigen, welche die Nucleotide aufweist, die sich an den Positionen 9532 bis 9553 der CDNA von SIVmac 142 befinden.
  • Die Erfindung bezieht sich auch auf Primer, die eine Nucleotid-Struktur haben, die komplementär zu denen der oben definierten Primer LTR1, LTR2, GAG1, GAG5, POL1, POL2, P1, P4 und P8 ist.
  • Sie bezieht sich auch auf Primer, welche gewisse Mutationen in bezug auf die nachstehend definierten haben, ohne daß die nachstehend definierten Hybridisierungseigenschaften dieser Primer modifiziert sind. Der Prozentsatz an Nucleotiden, die von denjenigen unterschiedlich sind, welche die oben beschriebenen Primer bilden, ohne daß sie dabei die Hybridisierungseigenschaften der Primer der Erfindung beeinflussen, liegt im allgemeinen zwischen 0 % und 10 % und übersteigt vorzugsweise nicht 20 %.
  • Im allgemeinen wird eine größere Anzahl von Mutationen auf der 5'-Seite als auf der 3'-Seite des Primers toleriert, wobei die 3'-Seite mit einem bestimmten Strang einer Nucleotidsequenz perfekt hybridisieren muß, um die Amplifikation dieser Sequenz zu gestatten.
  • Die Erfindung bezieht sich auch auf Primer, wie weiter oben beschrieben, die auf der Höhe ihres 5'-Endes mit einem Promoter zur Durchführung eines Genom-Amplifikationsverfahrens durch Synthese von RNA-Mehrfachkopien verbunden sind, wie in der Patentanmeldung EP-A-0 310 229 beschrieben.
  • Die Erfindung bezieht sich insbesondere auf ein Verfahren zur in vitro-Diagnose der Infektion eines Individuums mit einem Virus des Typs HIV-2.
  • Dieses in vitro-Diagnoseverfahren der Erfindung wird ausgehend von einer biologischen Probe (insbesondere einer biologischen Flüssigkeit wie einem Serum), die diesem Individuum entnommen wurde, realisiert und umfaßt im wesentlichen folgende Schritte:
  • -einen Schritt, bei dem die zu detektierende Nucleinsäure, die zu dem Genom des Virus des Typs HIV-2 gehört und die möglicherweise in der oben genannten biologischen Probe vorhanden ist, extrahiert wird und ggf. einen Schritt, bei dem mit Hilfe einer reversen Transkriptase besagte Nucleinsäure behandelt wird, wenn letztere in Form einer RNA vorliegt, um eine doppelsträngige Nucleinsäure zu erhalten,
  • - einen Zyklus, der folgende Schritte umfaßt:
  • . Denaturierung der zu erfassenden, doppelsträngigen Nucleinsäure, was zur Bildung einzelsträngiger Nudeinsäure führt,
  • . Hybridisierung jedes der Nucleinsäurestränge, die während des vorangegangenen Denaturierungsschritts erhalten wurden, mit wenigstens einem erfindungsgemäßen Primer, wobei die Stränge mit wenigstens einem erfindungsgemäßen Primerpaar unter den weiter oben definierten Hybridisierungsbedingungen in Kontakt gebracht werden,
  • . ausgehend von den Primern Bildung von DNAs, die zu den Strängen komplementär sind, an die sie in Gegenwart eines Polymerisationsmittels und von vier unterschiedlichen Nucleosidtriphosphaten hybridisiert werden (Elongationsschritt), was zur Bildung einer größeren Anzahl zu erfassender doppelsträngiger Nucleinsäuren führt als bei dem vorhergehenden Denaturierungsschritt, wobei dieser Schritt ausreichend oft wiederholt wird, um die eventuell in der biologischen Probe vorhandene zu erfassende Nucleotidsequenz in einer für ihre Detektion ausreichenden Menge zu gewinnen,
  • - einen Schritt zum Detektieren des eventuellen Vorhandenseins der Nucleinsäure, die dem Genom des Virus vom Typ HIV-2 in der biologischen Probe angehört.
  • Das In vitro-Diagnoseverfahren der Erfindung kann entweder ausgehend von der RNA oder ausgehend von Virus-DNA realisiert werden.
  • So treten die Genome der HIV-2-Viren in Form von RNA oder DNA in Abhängigkeit vom Ort des Virus im Organismus auf.
  • Wenn sich der Virus im Innern der Zellen des Organismus befindet, insbesondere im Innern der Blutzellen, wird seine RNA durch eine inverse Transkriptase zu DNA zurückkopiert. Hingegen verbleibt das Genom des Virus von HIV-2 im extrazellularen Medium, insbesondere im Blut, in der Form von RNA.
  • Der Schritt zur Extraktion von Virus-DNA, die in den Zellen der biologischen Probe enthalten ist, wird in dem in Lancet, Seiten 538 bis 540 (1988) erschienenen Artikel von LAURE F. et al. besonders ausführlich beschrieben.
  • Beispielhaft werden die Lymphozyten von den anderen Blutbestandteilen durch Zentrifugieren in einem Ficoll-Gradienten getrennt. Die so gewonnenen Lymphozyten werden daraufhin mit einem Lysepuffer, der aus 10 mM Tris pH 8, 10 mM EDTA, 10 mM NaCl, aus 0,5 % SDS (Natriumdodecylsulfat) und aus 100 µg/ml Proteinase K besteht, während zwei Stunden bei 60 ºC behandelt. Die DNA wird daraufhin mit Phenol extrahiert und mit Ethanol gefällt.
  • Die Extraktion kann auch auf eine Weise, die zu der zuvor beschriebenen identisch ist, an dem konzentrierten Serum durchgeführt werden. Man erhält in diesem Fall RNA, und ein zusätzlicher Schritt zur Transformation der einzelsträngigen RNA in doppelsträngige DNA muß notwendigerweise durchgeführt werden, wenn die In vitro-Diagnose der Erfindung ausgehend von biologischen Proben durchgeführt wird, welche die Viren vom Typ HIV-2 enthalten, deren Genome in Form von RNA vorliegen.
  • Diese Transformation von RNA zu DNA wird durchgeführt, indem man RNA, die nach der Extraktion der biologischen Probe, insbesondere von Serum, gewonnen wurde, in einem geeigneten Medium mit Hilfe des inversen Transkriptase-Enzyms unter den vom Zulieferer (zum Beispiel Amersham) angegebenen Bedingungen behandelt.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Diagnoseverfahrens wird der Denaturierungsschritt des Zyklus während einer Minute bei 94 ºC durchgeführt.
  • Der Hybridisierungsschritt des Zyklus des In vitro-Diagnoseverfahrens der Erfindung wird vorzugsweise dadurch realisiert, daß die während des Denaturierungsschrittes erhaltenen Nucleinsäurestränge mit wenigstens einem Paar von Primern der Erfindung in Kontakt gebracht werden, wobei diese Primer so ausgesucht sind, daß einer dieser beiden Primer mit einer Nucleotidsequenz hybridisiert, die auf einem der beiden Stränge angeordnet ist, während der andere mit einer Nucleotidsequenz hybridisiert, die auf einem zu letzterem komplementären Strang angeordnet ist, wobei die Nucleotidsequenzen (mit denen die Primer hybridisieren können), wenn man die beiden komplementären Stränge wieder als in einer doppelsträngigen Nucleinsäure angeordnet betrachtet, durch eine Anzahl von Basenpaaren getrennt sind, die zwischen 50 und 10.000, vorzugsweise zwischen 100 und 2.000 liegt.
  • Die Verwendung mehrerer unterschiedlicher Primerpaare der Erfindung ermöglicht die Amplifikation und die Erfassung unterschiedlicher Nucleinsäuren des Genoms von HIV-2.
  • Als Beispiel für bevorzugte Primerpaare, die im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, lassen sich die Primer LTR1 und GAG2 nennen. Es lassen sich auch die Paare P1 und P2, P2 und P7, P7 und P8, sowie P8 und LTR2 nennen. Vorteilhafterweise werden die verwendeten Primerpaare derart ausgewählt, daß die synthetisierten DNA-Fragmente die Bereiche P1 bis P2, LTR1 bis Pol2, P2 bis P7, P7 bis P8 sowie P8 bis LTR2 abdecken.
  • Das in dem Elongationsschritt des Zyklus verwendete Polymerisationsmittel ist eine Polymerase-DNA, insbesondere Taq- Polymerase, oder aber jegliche geeignete Polymerase zur Durchführung eines erfindungsgemäßen In vitro-Diagnoseverfahrens gemäß dem Prinzip der "Qβ-Replikase"-Technik oder der in der oben erwähnten internationalen Patentanmeldung beschriebenen Technik.
  • Im allgemeinen wird der Zyklus des erfindungsgemäßen In vitro-Diagnoseverfahrens zwischen 10 und 60 mal, vorzugsweise 40 mal, wiederholt.
  • Vorteilhafterweise wird der Elongationsschritt des Zyklus des oben erwähnten erfindungsgemäßen Verfahrens während einer Minute bei 72 ºC durchgeführt.
  • So verwendet man z. B. zum Nachweis von 1 µg Retrovirus-DNA 10 pmol von jedem Primer, 10 nmol von jedem Nucleotid- Triphosphat (dTNP), 1 U von Taq-Polymerase in einem Endvolumen von 100 µl des Puffers:
  • 10 mM Tris pH 8,3 (gemessen bei 23 ºC)
  • 20 mM KCl
  • 2 mM MgCl&sub2;
  • 0,01 % Gelatine
  • und zwar 40 mal dem folgenden thermischen Zyklus ausgesetzt:
  • 1 min bei 94 ºC (Denaturierung)
  • 1 min bei etwa 55 bis 60 ºC (Hybridisierung)
  • 1 min bei 72 ºC (Elongation)
  • Bei einer bevorzugten Ausführungsform des In vitro-Diagnose verfahrens der vorliegenden Erfindung wird der Schritt, bei dem das mögliche Vorhandensein von Nucleinsäuren des Virus des Typs HIV-2 in der biologischen Probe ermittelt wird, mit Hilfe einer (oder mehrerer) markierten Nucleotidsonde(n) realisiert, die in der Lage ist (sind), mit der (oder den) amplifizierten Nucleotidsequenz(en) zu hybridisieren, wobei man die möglichen Hybridisierungskomplexe, die sich zwischen der (oder den) Sonde(n) und der (oder den) zu erfassenden, amplifizierten Nucleotidsequenz(en) gebildet haben, detektiert.
  • Die Erfindung bezieht sich auch auf Primer, wie oben definiert, die insbesondere radioaktiv oder enzymatisch markiert sind, sowie auf ihre Verwendung als Nucleotid-Sonden, insbesondere im Rahmen des In vitro-Diagnoseverfahrens, wie oben beschrieben.
  • Die Primer der Erfindung sind ebenfalls verwendbar für die Durchführung eines In vitro-Diagnoseverfahrens der Infektion von Affen (Makaken, Mangabey-Affe oder Grünaffe) durch den Virus vom Typ SIV, wobei dieses Verfahren die hauptsächlichen Merkmale des oben beschriebenen aufgreift.
  • Die Erfindung bezieht sich auch auf Diagnose-Kits für die Durchführung der oben erwähnten In vitro-Diagnoseverfahren. Ein Diagnose-Kit der vorliegenden Erfindung umfaßt z. B.:
  • - mindestens ein erfindungsgemäßes Oligonucleotid- Primerpaar, wobei jedes Paar einen Primer aufweist, der mit einem der Stränge der zu erfassenden Nucleinsäure-Sequenz hybridisiert, sowie einen Primer, der mit dem komplementären Strang dieser letzteren unter den oben definierten Bedingungen hybridisiert,
  • - Reagenzien, die zur Durchführung des Amplifikationszyklusses geeignet sind, insbesondere DNA-Polymerase und vier unterschiedliche Nucleosidtriphosphate,
  • - eine (oder mehrere) markierte Sonde(n), die in der Lage ist (sind), mit der (oder den) zu erfassenden, amplifizierten Nucleotidsequenz(en) zu hybridisieren.
  • Die Erfindung bezieht sich auch auf ein Syntheseverfahren der oben beschriebenen Primer.
  • Die Erfindung bezieht sich auch auf ein Verfahren zum Herstellen eines (oder mehrerer) Peptids (oder Polypeptids), welches aufweist:
  • - einen Schritt, bei dem die Nucleotidsequenz, die das Polypeptid codiert (und vorteilhafterweise einen Promoter für die Translation dieser Sequenz enthält), mit Hilfe eines Paars von Primern der Erfindung amplifiziert wird,
  • - Einbringen der so amplifizierten Nucleotidsequenz in einen geeigneten Vektor,
  • - Transformation von geeigneten Wirtszellen mit Hilfe des Vektors,
  • - Anlegen einer Kultur der durch den Vektor transformierten Wirtszellen und Gewinnung des Peptids, das durch letztere produziert wird.
  • Die Polypeptide, welche gemäß dem universellen genetischen Code den oben beschriebenen Nucleotid-Sequenzen (oder - Primern) entsprechen, können ebenfalls als immunogene Mittel, insbesondere im Zusammenhang mit einem pharmazeutisch akzeptablem Träger, in einer pharmazeutischen Zusammensetzung verwendet werden.
  • Die Erfindung bezieht sich auch auf ein Verfahren zum Herstellen der oben erwähnten Polypeptide, insbesondere diejenigen, welche gemäß dem universellen genetischen Code den oben beschriebenene Nucleotid-Sequenzen (oder -Primern) entsprechen, wobei dieses Verfahren dadurch gekennzeichnet ist, daß man vorzugsweise ausgehend von der C-terminalen Aminosäure sukzessive in Zweierpaaren die aufeinanderfolgenden Aminosäuren in der erforderlichen Reihenfolge, oder Aminosäuren und vorab gebildete Fragmente, die schon mehrere Aminosäuren- Reste in der geeigneten Reihenfolge enthalten, oder aber mehrere auf diese Weise vorab hergestellte Fragmente enthalten, kondensiert, wobei man davon ausgeht, daß darauf geachtet wird, vorab sämtliche von diesen Aminosäuren oder Fragmenten getragenen reaktiven Funktionen mit Ausnahme der Aminofunktion der einen und der Carboxyfunktion der anderen oder umgekehrt zu schützen, die normalerweise bei der Bildung der Peptidbindungen, insbesondere nach der Aktivierung der Carboxyfunktion, bei den in der Peptidsynthese bekannten Verfahren Schritt für Schritt bis zu der N-terminalen Aminosäure eingreifen müssen.
  • So setzt man z. B. die Technik der Peptidsynthese in homogener Lösung ein, die durch Houbenweyl in "Methode der Organischen Chemie", verlegt von E. Wunsch, Band 15-I und II, THIE- ME, STUTTGART, 1974 beschrieben wird, oder die der Peptidsynthese in der festen Phase, die durch R.D. Merrifield "Solid Phase Peptide Synthesis" (J. AM. CHEM. SOC., 45, 2149-2154) beschrieben wird.
  • Die Erfindung bezieht sich auch auf ein Verfahren zum Herstellen der oben beschriebenen Nucleotid-Sequenzen (oder - Primer) wobei dieses Verfahren die folgenden Schritte aufweist:
  • - Inkubation der Genom-DNA, die aus einem der Viren vom Typ HIV-2 oder SIV isoliert wurde, mit DNAase I, nachfolgendes Hinzufügen von EDTA und Reinigung durch Extraktion mit einer Mischung aus Phenol/Chloroform/ Isoamylalkohol (25/24/1), anschließend durch Ether,
  • - Behandlung der so extrahierten DNA mit Eco R1 Methylase in Anwesenheit von DTT und Reinigung durch Extraktion, wie oben beschrieben,
  • - Inkubation der so gereinigten DNA mit den vier Desoxynucleotidtriphospaten dATP, dCTP, dGTP und dTTP in Anwesenheit von T4 DNA-Polymerase und DNA-Ligase von E. coli, dann Reinigung, wie oben beschrieben, und
  • - Klonen der so erhaltenen Nucleinsäuren in einem geeigneten Vektor und Gewinnung der gesuchten Nucleinsäure durch Hybridisierung mit einer geeigneten Sonde.
  • Ein besonders vorteilhaftes Verfahren zum Herstellen der erfindungsgemäßen Nucleotid-Sequenzen umfaßt die folgenden Schritte:
  • - DNA-Synthese unter Verwendung des automatisierten Verfahrens von β-Cyanethyl-Phosphoramidit, das in Bioorganic Chemistry 4; 274-325 (1986) beschrieben ist,
  • - Klonierung der so gewonnenen Nucleinsäuren in einem geeigneten Vektor und Gewinnung der Nucleinsäure durch Hybridisierung mit einer geeigneten Sonde.
  • Ein weiteres Verfahren zum Herstellen der Nucleotid-Sequenzen der Erfindung umfaßt die folgenden Schritte:
  • - Zusammenfügen chemisch synthetisierter Oligonucleotide, die an ihren Enden mit unterschiedlichen Restriktionstellen versehen sind, deren Sequenzen mit der Kettenbildung der Aminosäuren des natürlichen Polypeptids kompatibel sind, gemäß dem in Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80; 7461-7465, (1983) beschriebenen Prinzip,
  • - Klonieren der so gewonnenen Nucleinsäuren in einem geeigneten Vektor und Gewinnung der gesuchten Nucleinsäure durch Hybridisierung mit einer geeigneten Sonde.

Claims (10)

1. Oligonucleotidprimer mit ungefähr 15 bis 25 Nucleotiden, der für die Genomamplifikation des Virus HIV-2 oder SIV- mac einsetzbar ist, dadurch gekennzeichnet, daß seine Nucleotidsequenz:
- (a) entweder aus denjenigen ausgewählt ist, die in einer der Nucleotidsequenzen enthalten sind, die von den Nucleotiden begrenzt sind, die an den Positionen 40 und 61, 9537 und 9558, 240 und 259, 546 und 569, 906 und 927, 612 und 633, 1857 und 1876, 2078 und 2101, 6275 und 6299, 6855 und 6878, 7548 und 7573, 7782 und 7805, 8412 und 8434, 61 und 82, 9558 und 9579 der vom Genom des Virus HIV-2 ROD abgeleiteten cDNA liegen, oder die komplementär zu einer der oben genannten Nucleotidsequenzen sind,
- (b) oder aus denjenigen ausgewählt ist, die in einer der Nucleotidsequenzen enthalten sind, die von den Nudeotiden begrenzt sind, die an den Positionen 40 und 61, 9511 und 9532, 240 und 259, 256 und 275, 551 und 574, 911 und 932, 617 und 638, 1868 und 1887, 2035 und 2058, 6227 und 6251, 7550 und 7564, 7776 und 7799, 8406 und 8428, 61 und 82, 9532 und 9553 der vom Genom des Virus SIVmac 142 abgeleiteten cDNA liegen, oder die komplementär zu einer der eben genannten Nucleotidsequenzen sind,
- (c) oder (insbesondere für die längsten Primer) eine der oben genannten Nucleotidsequenzen enthält, die aus HIV-2 ROD oder SIVmac 142 stammen, oder eine Nucleotidsequenz enthält, die komplementär zu einer der letzteren Sequenzen ist, wobei sich versteht, daß eventuelle zusätzliche Nudeotide, die vorzugsweise 5 von der Seite des 5'-Endes über besagte Nucleotidsequenz "hinausragen", vorzugsweise mit denjenigen übereinstimmen, die sich diesseits des entsprechenden 5'-Endes innerhalb der vollständigen Sequenz des HIV- 2 ROD oder des SIVmac 142 befinden,
- wobei sich ebenso versteht, daß sich die cDNA- Stränge, die unter den Punkten (a), (b) und (c) in Betracht gezogen werden, diejenigen sind, die sich als komplementär zur RNA der Viren HIV-2 ROD und SIV- mac 142 erweisen,
- (d) oder, falls die Sequenz dieses Primers nicht identisch mit einer der oben genannten Nucleotidsequenzen oder nicht komplementär zu einer dieser Sequenzen ist, nichtsdestoweniger geeignet ist, mit dieser Nucleotidsequenz, die aus den oben genannten Viren HIV-2 ROD und/oder SIVmac 142 stammt, in einer Lösung, die sich aus 10 mM Tris, 20 mM KCl, 2 mM MgCl&sub2;und 0,01 % Gelatine zusammensetzt, während 1 Minute bei einer Temperatur, die größer oder gleich 50ºC ist, zu hybridisieren.
2. Oligonucleotidprimer nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch folgende Nucleotidsequenzen:
oder deren Komplementärsequenzen
3. Oligonucleotidprimer nach Anspruch 2, die Mutationen aufweisen, ohne daß jedoch die Hybridisierungseigenschaften dieser Primer, wie sie in Anspruch 1 definiert sind, verändert sind.
4. Verfahren zur in vitro-Diagnose der Infektion eines Individuums mit einem Virus des Typs HIV-2, wobei diese Methode ausgehend von einer biologischen Probe, insbesonde re einem Serum, die diesem Individuum entnommen wurde, realisiert wird und im wesentlichen folgende Schritte umfaßt:
- einen Schritt, bei dem die zu detektierende Nucleinsäure, die zu dem Genom des Virus des Typs HIV-2 gehört und die möglicherweise in der oben genannten biologischen Probe vorhanden ist, extrahiert wird und
- ggf. einen Schritt, bei dem mit Hilfe einer reversen Transkriptase besagte Nucleinsäure behandelt wird, wenn letztere in Form einer RNA vorliegt, um eine doppelsträngige Nucleinsäure zu erhalten,
- einen Zyklus, der folgende Schritte umfaßt:
. Denaturierung der zu erfassenden, doppelsträngigen Nucleinsäure, insbesondere durch Behandlung der Nucleinsäure während 1 Minute bei 94ºC, was zur Bildung einzelsträngiger Nucleinsäure führt,
. Hybridisierung jedes der Nucleinsäurestränge, die während des vorangegangenen Denaturierungsschritts erhalten wurden, mit wenigstens einen der Primer gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Stränge mit wenigstens einem Primerpaar gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 unter den Hybridisierungsbedingungen, die in Anspruch 1 definiert sind, in Kontakt gebracht werden,
. Verlängerung der Primer entlang der Stränge, an denen sie hybridisiert sind, unter Anwesenheit eines Polymerisationswirkstoffs, wie der Taq- Polymerase, und von vier unterschiedlichen Nucleosidtriphosphaten, was zur Bildung einer größeren Anzahl der zu ermittelnden doppelsträngigen Nucleinsäure führt, als bei dem vorangegangenen Denaturierungsschritt,
wobei dieser Zyklus vorzugsweise 10- bis 60mal wiederholt wird,
- ein Schritt, bei dem das mögliche Vorhandensein von Nucleinsäure, die zum Genom des Virus des Typs HIV-2 gehört, in der biologischen Probe detektiert wird.
5. Diagnoseverfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Hybridisierungsschritt des Zyklus dadurch realisiert wird, daß die während des vorangegangenen Denaturierungsschrittes erhaltenen Nucleinsäurestränge mit wenigstens einem Paar von Primern nach einem der Ansprüche 1 bis 3 in Kontakt gebracht werden, wobei diese Primer so ausgesucht sind, daß einer dieser beiden Primer mit einer Nucleotidsequenz hybridisiert, die auf einem der beiden Stränge angeordnet ist, während der andere mit einer Nucleotidsequenz hybridisiert, die auf einem zu letzterem komplementären Strang angeordnet ist, wobei die Nucleotidsequenzen (mit denen die Primer hybridisieren können), wenn man die beiden komplementären Stränge wieder als in einer doppelsträngigen Nucleinsäure angeordnet betrachtet, durch eine Anzahl von Basenpaaren getrennt sind, die zwischen 50 und 10.000, vorzugsweise zwischen 100 und 2.000 liegt.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die verwendeten Primerpaare wie die Nucleinsäurefragmente synthetisiert sind und die Bereiche LTR1 bis Pol2, P1 bis P2, P2 bis P7, P7 bis P8, P8 bis LTR2 abdecken.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß der Schritt, bei dem das mögliche Vorhandensein von Nucleinsäuren des Virus des Typs HIV-2 in der biologischen Probe ermittelt wird, mit Hilfe einer (oder mehreren) markierten Nucleotidsonde realisiert wird, die in der Lage ist, mit der (oder den) amplifizierten Nucleotidsequenz zu hybridisieren, wobei man die möglichen Hybridisierungskomplexe, die sich zwischen der (oder den) Sonde und der (oder den) zu erfassenden, amplifizierten Nucleotidsequenz gebildet haben, detektiert.
8. Diagnosekit zur Durchführung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 4 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß er aufweist:
- wenigstens ein Paar von Primern nach einem der Ansprüche 1 bis 3,
- Reagenzien, die zur Durchführung des Amplifikationszyklusses geeignet sind, insbesondere DNA-Polymerase und vier unterschiedliche Nucleosidtriphosphate,
- eine (oder mehrere) markierte Sonde, die in der Lage ist, mit der (oder den) zu erfassenden, amplifizierten Nucleotidsequenz zu hybridisieren.
9. Verfahren zur Herstellung eines bestimmten Polypeptids, das folgende Schritte umfaßt:
- einen Schritt, bei dem die Nucleotidsequenz, die das Polypeptid codiert, mit Hilfe eines Paars von Primern nach einem der Ansprüche 1 bis 3 amplifiziert wird,
- Einbringen der so amplifizierten Nucleotidsequenz in einen geeigneten Vektor,
- Transformation von Wirtszellen mit Hilfe des Vektors,
- Anlegen einer Kultur der durch den Vektor transformierten Wirtszellen und Gewinnung des Polypeptids, das durch letztere produziert wird.
10. Verfahren zur Herstellung von Nucleotidsequenzen (oder Primern) nach einem der Ansprüche 1 bis 3, das die folgenden Schritte umfaßt:
- Inkubation der Genom-DNA, die aus einem der Viren HIV-2 ROD und SIVmac 142 isoliert wurde, mit DNAase I, nachfolgendes Hinzufügen von EDTA und Reinigung durch Extraktion mit einer Mischung aus Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (25/24/1), anschließend durch Ether,
- Behandlung der so extrahierten DNA mit Eco R1 Methylase unter Anwesenheit von DTT und Reinigung durch Extraktion mit einer Mischung aus Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (25/24/1), anschließend durch Ether,
- Inkubation der so gereinigten DNA mit den vier Desoxynucleotidtriphospaten dATP, dCTP, dGTP und dTTP unter Anwesenheit von T4 DNA-Polymerase und DNA- Ligase von E. coli, dann Reinigung durch Extraktion mit einer Mischung aus Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (25/24/1), anschließend durch Ether, und
- Klonen der so erhaltenen Nucleinsäuren in einem geeigneten Vektor und Gewinnung der gesuchten Nucleinsäure mit Hilfe einer geeigneten Sonde.
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