-
Gebiet der Erfindung
-
Diese
Erfindung betrifft die komplette Gensequenz des abgeschwächten EIAV
Esel-Leukozyten-Impfstoffstamms sowie die Sequenzen und die möglichen
Verwendungen der funktionellen Gene und ihrer Expressionsprodukte.
-
Hintergrund
-
Das
infektiöse
Pferdeanämie-Virus
(Equine Infectious Anemia Virus, EIAV), das Pathogen der infektiösen Pferdeanämie, war
die erste Virusart, die von Menschen entdeckt wurde. Die infektiöse Pferdeanämie, zuerst
beschrieben in Frankreich im Jahre 1843, hat über ein Jahrhundert lang gewaltige ökonomische
Verluste in der Tierzucht verursacht. Wissenschaftler auf der ganzen
Welt haben sich darum bemüht,
Techniken zu entwickeln, um diese Krankheit unter Kontrolle zu bringen.
Seit den 60er Jahren des vergangenen Jahrhunderts hat die chinesische
Regierung außerordentliche
finanzielle Mittel bereitgestellt, um Studien über die biologischen und immunologischen
Eigenschaften von EIAV zu fördern.
Während
ihrer Untersuchungen haben chinesische Wissenschaftler einen virulenten
Stamm isoliert, der sich von in anderen Ländern isolierten Stämmen grundlegend
unterschied. Durch die viele Generationen andauernde Passage auf
Esel-Leukozyten wurde dieser virulente Stamm erfolgreich abgeschwächt. Durch
den Gebrauch dieses abgeschwächten
Virus' als Impfstamm
entwickelten geimpfte Tiere eine andauernde und starke Immunität gegen
EIAV und waren gegen die infektiöse
Pferdeanämie
geschützt.
Der Impfstoff wird seit 1976 in großem Maßstab hergestellt und seit 1978
landesweit eingesetzt. Mehr als 70 Millionen Pferde, Maultiere und
Esel wurden geimpft, und die infektiöse Pferdeanämie befindet sich in China
erfolgreich unter Kontrolle (Rongxian Shen, et al., Study an immunological
methods of Equine Infectious Anemia, China Agricultural Science,
Band 4, 1-15, 1979).
-
EIAV
ist als Lentivirus der Familie der Retroviren klassifiziert. In
mancherlei Hinsichten, beispielsweise in Bezug auf seine genomische
Organisation, die funktionellen Proteine und die Regulationsweise
der Gen-Expression zeigt EIAV eine große Ähnlichkeit zum menschlichen
Immundefizienz-Virus (HIV), einem anderen Lentivirus, der die Ursache
von AIDS ist (J. M. Coffin, The structure And Classification of
Retroviruses, The Retroviridae, Band 1, Seite 19, herausgegeben
von Jay A. Levy, Plenum Press). Darüber hinaus gibt es umfängliche
Homologien in der Struktur und Funktion der reversen Transkriptase,
der Proteinase, des Hüll-Glycoproteins
und des Nucleoproteins zwischen EIAV und HIV. Mit EIAV infizierte
Pferde zeigen manifeste Symptome, die typisch für eine lentivirale Infektion
sind, einschließlich
periodischem Fieber, Anämie
mit einer Verringerung von Erythrozyten und anhaltender Virämie. EIAV
kann daher als wichtiges Forschungsmodell bei der Untersuchung des
Infektions mechanismus' und
der enzymatischen Funktionen anderer Lentiviren sein (R. C. Montelaro
et al., Equine Retroviruses, in: Band 2, Seite 257).
-
Mit
der Entwicklung und weit verbreiteten Anwendung der Molekularbiologie
seit den 70er Jahren des 20. Jahrhunderts ist die genomische Organisation
von EIAV intensiv studiert worden. In S. L. Payne et al., Journal
of General Virology (1994), 75, 425-429, wird eine Anzahl infektiöser molekularer
Klone von EIAV, gewonnen aus infizierten fötalen Pferdenieren-Zellen (FEK),
auf molekularer Ebene charakterisiert. Vollständige Genom-Sequenzen von EIAV
vom virulenten Standard-Stamm (Referenz-Stamm), der in den USA (Wyoming-Stamm)
isoliert wurde, von einem anderen Isolat in Japan (Goshum-Stamm)
und von verschiedenen zellkulturadaptierten Stämmen sind alle in GenBank registriert.
Allerdings handelt es sich bei keinem von diesen um einen Impfstamm.
Gegenwärtig
bleibt der abgeschwächte
EIAV Esel-Leukozyten-Impfstoffstamm,
der in China entwickelt wurde, der einzige Lentivirus-Impfstoffstamm
in der Welt. Er wurde in großem
Maßstab
eingesetzt und hat sich über
einen langen Anwendungszeitraum hinweg als wirksam und sicher erwiesen
(R. C. Montelaro et al. in: Vaccine against Retroviruses, Band 4,
P605; R. C. Montelaro et al., Equine Retroviruses in: Band 2, P257).
C. G. Pan et al. beschreiben in Journal of Equine Veterinary Science
13(3), 163-166 (1993) (Nachdruck) strukturelle Proteine davon und
deren immunologische Eigenschaften.
-
Die
genomische Sequenz und Organisation des EIAV-Impfstoffstamms wurde
bisher nicht charakterisiert. Die Charakterisierung der genomischen
Sequenz und der Struktur des EIAV-Impfstoffstamms sollte nicht nur
die Grundlage für
eine Verfeinerung des Impfstoffs und die Herstellung neuer gentechnisch
erzeugter EIAV-Impfstoffe bilden, sondern kann, noch wichtiger,
ein Modell für
die Entwicklung anderer Lentivirus-Impfstoffe liefern.
-
Deshalb
liegen die Ziele der Erfindung darin, die genomische Sequenz des
EIAV-Impfstoffstamms, adaptiert an Esel-Leukozyten, in voller Länge bereitzustellen,
wie auch die Sequenzen eines jeden der funktionellen Gene und deren
mutmaßliche
Aminosäuresequenzen
sowie die Verwendungen dieser Gene und ihrer Expressionsprodukte.
-
Zusammenfassung der Erfindung
-
Die
vorliegende Erfindung betrifft die genomische Sequenz des abgeschwächten EIAV-Esel-Leukozyten-Impfstoffstamms
in voller Länge,
einschließlich
von Sequenzen der hauptsächlichen
strukturellen Gene (gag, pol, env) und der regulatorischen Gene
(LTR, rev, s2, tat). Die Sequenz dieses Stamms in ihrer gesamten Länge ist
8258 Bp lang. Die Nucleotid-Sequenz ist in SEQ ID NO:1 dargestellt
(siehe unten). In dieser Sequenz über die gesamte Länge hinweg
erstreckt sich die 5'-terminale
LTR-Sequenz von Position 1 bis 325, und die 3'-terminale LTR-Sequenz überspannt
die Positionen 7922 bis 8258. Das gag Gen hat seinen Platz auf der Sequenz
zwischen 466 und 1926; das pol Gen überspannt die Sequenz zwischen
1689 und 5120; und das env Gen erstreckt sich von 5313 bis 7904.
Das regulatorische Gen tat enthält
zwei Exons: das erste Exon liegt zwischen den Positionen 365 und
462, während
das zweite sich von 5138 bis 5276 erstreckt. In ähnlicher Weise enthält auch
das regulatorische Gen rev zwei Exons: das erste Exon findet man
ausgehend von der Position 5454 bis 5546, während sich das zweite von der
Position 7250 bis 7651 erstreckt. Das Gen S2 liegt zwischen den
Positionen 5287 und 5493. Die Sequenzen all dieser funktionellen
Gene und ihrer mutmaßlichen
Aminosäure-Sequenzen
sind in den Sequenz-Nummern SEQ ID NO:2 bis 7 bzw. SEQ ID NO:8 bis
13 aufgeführt.
Ein genomischer Klon der kompletten Gensequenz des abgeschwächten EIAV
Esel-Leukozyten-Impfstoffstamms wurde ursprünglich am 19. April 1999 deponiert,
und zwar beim China General Microbiological Culture Collection Center
(CGMCC); er erhielt die Zugangsnummer CGMCC 0394. Die Hinterlegung
wurde am 19. April 2000 in eine internationale Hinterlegung gemäß Budapester
Vertrag umgewandelt. Wie für
Fachleute ersichtlich, können
die Sequenzen, die in SEQ ID NO:1 bis 7 gezeigt sind, einige Sequenzierungsfehler
aufweisen.
-
Beschreibung der bevorzugten
Ausführungsformen
-
Die
Ziele der Erfindung wurden unter Verwendung der nachstehenden Techniken
realisiert. Weil der an Esel-Leukozyten adaptierte EIAV-Stamm sich
während
seiner replikativen Phase in vitro in der Form eines Provirus befindet
und in die Chromosomen von Esel-Leukozyten integriert ist, wurde
die chromosomale DNA von Esel-Leukozyten, die mit abgeschwächtem EIAV
infiziert worden waren, extrahiert und als Template für die PCR-Amplifikation
eingesetzt. Um es kurz zu sagen, wurden die vorläufigen PCR-Amplifikationen
zuerst unter Verwendung unterschiedlicher Primer durchgeführt, die
basierend auf den genomischen Sequenzen von virulenten EIAV-Referenzstämmen konzipiert
worden waren. Diese PCR-Produkte wurden dann sequenziert. Spezifische
Primer, die auf die fragmentierte Sequenz von abgeschwächtem EIAV
passten, wurden synthetisiert und für eine weitere PCR-Amplifikationsrunde
eingesetzt. Schließlich
wurden die verschiedenen PCR-Produkte, die verschiedene Bereiche
des abgeschwächten
EIAV-Genoms darstellen, jeweils kloniert und sequenziert. Man erhielt
die Sequenz in gesamter Länge
einschließlich
struktureller Gene (gag, pol und env) und regulatorischer Gene (LTR,
rev, S2 und tat) des EIAV-Impfstoffstamms.
-
Der
offene Leserahmen (ORF) der Gesamtlängen-Sequenz wurde mit GCG-Software (Genetic
Computer Group, Inc., Wisconsin, USA) analysiert. Die Nucleotid- und die abgeleiteten
Aminosäure-Sequenzen verschiedener
struktureller und regulatorischer Gene wurden in der Gesamtlängen-Sequenz
identifiziert.
-
Verglichen
mit den Sequenzen der virulenten EIAV-Referenzstämme, die von GenBank freigegeben wurden,
waren die Nucleotidsequenz-Homologien zwischen jedem Gen des Impfstoffstamms
und demjenigen der Referenzstämme
73,46%~90,06%. Die env-, rev- und S2-Gene waren unter denjenigen
mit niedrigeren Sequenzhomologien zwischen dem Impfstoff- und den
Referenzstämmen.
Die Homologien bei den Nucleotidsequenzen zwischen env, rev und
S2 des Impfstoffstamms und diesen Genen der Referenzstämme betrugen 73,46%,
73,54% bzw. 75,76%, und die Homologien bei den Aminosäure-Sequenzen
betrugen 67,41%, 64,85% bzw. 54,51%.
-
Darüber hinaus
wurden die Sekundärstrukturen
der strukturellen und regulatorischen Proteine des EIAV-Impfstoffstamms
unter Verwendung der GCG-Software
vorhergesagt. Ein signifikanter Unterschied zwischen dem Impfstoffstamm
und den Referenzstämmen
zeigte sich bei den Sekundärstrukturen
der env- und tat-Proteine.
Die Häufigkeit
und die Orte von α-Helices, β-Sheets (flächigen Beta-Strukturen) und β-Biegungen (β-turns) waren
in vielen Domänen
sehr unterschiedlich. Es gibt eine hydrophobe Gruppe am C-Terminus
im tat-Protein des Impfstoffstamms, ein β-Sheet in der proximalen Region,
das eine konzentrierte hydrophile Gruppe bildet, und 4 β-Biegungen
am N-Terminus. Im Gegensatz dazu finden sich keine hydrophoben Gruppen
am C-Terminus im tat-Protein aus den Referenz-Stämmen. Stattdessen gibt es lose,
wirre Knäuel
in proximalen Bereichen an Stelle eines β-Sheets, obwohl 2 voneinander
getrennte und sich voneinander unterscheidende hydrophile Gruppen
gefunden werden können.
Darüber
hinaus sind viele β-Biegungen
an den N-Termini vorhanden. Diese Unterschiede zwischen den Sekundärstrukturen
können
auf funktionelle Unterschiede hinweisen. Basierend auf diesen Unterschieden
können
wir die verwandten Gene und Proteine von HIV und anderen Lentiviren
modifizieren und die Verwendung dieser modifizierten Stämme als
mögliche
Impfstoffe untersuchen.
-
Darüber hinaus
wurde bei der Sequenzanalyse gefunden, dass es im env-Gen des Impfstoffstamms 19
potenzielle N-verknüpfte
Glycosylierungsstellen gibt, während
im vergleichbaren Bereich des Referenzstamms 23 potenzielle N-verknüpfte Glycosylierungsstellen
gefunden werden können.
-
Die
vorliegende Erfindung dient als erster Bericht in China und im Ausland,
der im Detail die genomische Organisation (einschließlich struktureller
und regulatorischer Gene und der zugehörigen Proteine) des Gesamtlängen-Genoms
des EIAV-Impfstoffstamms
charakterisiert. Diese Erfindung dient als Leitfaden für Versuche,
den Impfstoff für
die Immunprophylaxe chronischer Krankheiten, die von anderen Lentiviren verursacht werden,
zu entwickeln. Die Nucleotidsequenz und die serologischen Diagnostika,
die sich aus den Genen und Proteinen des EIAV-Impfstoffstamms ableiten
lassen, können
für die
Diagnose von EIAV-Infektionen, für
die Differentialdiagnose zwischen einer Infektion durch Viren vom
Wildtyp und einer Impfung mit EIAV-Impfstoff und für die Entwicklung
neuer Impfstoffe durch Gentechnik genutzt werden. Die Gensequenz, über die
hier berichtet wird, kann auch für
die Differentialdiagnose von Pferden, die mit EIAV-Impfstoff immunisiert
wurden, im Vergleich zu solchen, die mit dem amerikanischen EIAV-Stamm
infiziert wurden, eingesetzt werden, wie in Beispiel 2 unten beschrieben.
Schließlich
kann das komplette Genom des EIAV-Impfstoffstamms verwendet werden,
um den Gentransfer-Vektor zu konstruieren, der im allgemeinen für die Gentherapie
eingesetzt wird. Da EIAV Menschen nicht krank machen kann, kann
der EIAV-basierte Transfer-Vektor in größerem Umfang und sicherer als
andere Vektoren verwendet werden, beispielsweise als der Vektor,
der sich vom Mäuse-Leukämievirus
(MLV) ableitet.
-
Kurze Beschreibung der Abbildungen
-
1 zeigt
die Ergebnisse der PCR-Amplifikation verschiedener Templates unter
Verwendung des Primer-Satzes I, wie in Beispiel 2 beschrieben. Die
Spuren 1 und 2 zeigen die Amplifikationsergebnisse für die Gesamt-DNA
aus Esel-Leukozyten, die mit dem EIAV-Impfstoffstamm infiziert worden
waren (~200 Bp); Spur 3 ist der DNA-Marker (pBR322/BstNI); Spur 4 zeigt
die Amplifikationsergebnisse der Gesamt-DNA aus Esel-Leukozyten,
die mit dem Referenzstamm (Wyoming-Stamm) infiziert worden waren.
-
2 zeigt
die Ergebnisse der PCR-Amplifikationen verschiedener Templates unter
Verwendung des Primer-Satzes II, wie in Beispiel 2 beschrieben.
Spur 1 ist der DNA-Marker
(DL2000, TaKaRa); die Spuren 2 und 3 sind die Amplifikationsergebnisse
der Gesamt-DNA aus Esel-Leukozyten, die mit dem EIAV-Impfstoffstamm
(~190 Bp) infiziert worden waren; Spur 4 zeigt die Amplifikationsergebnisse
der Gesamt-DNA aus Esel-Leukozyten; Spur 5 zeigt die Amplifikationsergebnisse
der Gesamt-DNA aus Esel-Leukozyten,
die mit dem Referenzstamm (Wyoming-Stamm) infiziert worden waren.
-
3 zeigt
die Ergebnisse der PCR-Amplifikation verschiedener Templates unter
Verwendung des Primer-Satzes III, wie im Beispiel 2 gezeigt. Spur
1 ist der DNA-Marker
(pBR322/BstNI); Spur 2 zeigt die Ergebnisse der Amplifikation der
Gesamt-DNA aus Esel-Leukozyten, die mit dem Referenzstamm (Wyoming-Stamm)
infiziert worden waren. Die Spuren 3 und 4 sind die Amplifikations-Ergebnisse
der Gesamt-DNA aus Esel-Leukozyten, die mit dem EIAV-Impfstoffstamm
(~380 Bp) infiziert worden waren.
-
4 zeigt
die Ergebnisse der PCR-Amplifikation verschiedener Templates unter
Verwendung des Primer-Satzes IV, wie in Beispiel 2 beschrieben.
Die Spuren 1 und 2 sind die Amplifikationsergebnisse der Gesamt-DNA
aus Esel-Leukozyten, die mit dem EIAV-Impfstoffstamm (~220 Bp) infiziert
worden waren. Spur 3 ist der DNA-Marker (pBR322/BstNI); Spur 4 ist
das Amplifikationsergebnis der Gesamt-DNA aus Esel-Leukozyten, die mit
dem Referenzstamm (Wyoming-Stamm) infiziert worden waren.
-
Die
Erfindung wird nun unter Bezug auf die Abbildungen und die nachstehenden
Beispiele erläutert.
-
Beispiel 1
-
Sequenzierung
des gesamten Genoms des abgeschwächten
Esel-Leukozyten-Impfstoffstamms
für das
infektiöse
Pferdeanämie-Virus
(EIAV).
-
A. Viruskultur und Extrakt von Zellgenom-DNA
-
Eine
Kultur von gesunden Esel-Leukozyten mit 100% Rinderserum (1 ml/107 Zellen) wurde bei 37°C mit dem abgeschwächten Esel-Leukozyten-Impfstoff
für das
infektiöse
Pferdeanämie-Virus
(EIAV) (Harbin Veterinary Research Institute, Harbin, China) beimpft.
Sobald ein pathologischer Effekt auf die Zellen offensichtlich wurde,
wurde der Überstand
verworfen, und die Zellgenom-DNA wurde mit Hilfe des Qiagen Genomic DNA-Kits
(Qiagen, USA) extrahiert.
-
B. Amplifizierung, Klonierung und Sequenzierung
verschiedener Fragmente des Gesamt-Genoms von EIAV
-
Das
gp90- und das 5' LTR-Gen
der Erfindung wurden zuerst unter Verwendung von Primern amplifiziert,
die in Übereinstimmung
mit den veröffentlichten
Sequenzen der Wyoming-Stämme
konstruiert worden waren. Dann wurden Primer in Übereinstimmung mit den ermittelten
Sequenzen entworfen, um die anderen Bereiche des Genoms zu amplifizieren.
Die PCR-Produkte wurden gemäß den Vorschriften
des Herstellers in den pGEM®-T Easy Vector (Promega)
subkloniert. Die Restriktions-Endonuclease
EcoRI wurde verwendet, um die Rekombination zu identifizieren, und
eine ABI 377 DNA Sequenzmaschine wurde für die Sequenzierung eingesetzt. Überlappende
Fragmente der Sequenz wurden in ein komplettes Genom eingeordnet,
und jedes Gen wurde mit Hilfe von GCG Software identifiziert. Die
vollständige
Genom-Sequenz ist
in SEQ ID NO.1 aufgelistet. Identifizierte Gene sind in den Sequenzen
SEQ ID NO. 2-7 dargestellt. Nachstehend folgt die konkretisierte
Darstellung verschiedener Fragmente:
-
(1) Fragment A(FA):
-
- Amplifizierter Bereich: 5'LTR(1-320)
-
Primer und Verfahren:
-
Erster
Zyklus:
| Primer
in Vorwärtsrichtrung:
LTR-F1 | 5'-GCGCGCGAATTCTGTGGGGTTTTTATAQG-3' |
| Primer
in Rückwärtsrichtung:
GR11 | 5'-AACCTTGCTGCTATGGGAAT-3' |
- Reaktionssystem: 10 × Puffer (Mg2+ 2mM)
5μl, dNTP(10mM)
1μl, LTR-F1
(20μM) 1μl, GR11(20μM) 1μl, Taq Polymerase
(Promega) 1μl(1μ), Template
1μl(200ng),
H2O 41μl.
- Reaktionsprogramm: 95°C
5 Min.; dann 94°C
1 Min., 52°C
1 Min., 72°C
1,5 Min. für
30 Zyklen, gefolgt von 72°C
10 Min.
Zweiter
Zyklus: | Primer
in Vorwärtsrichtung:
LTR-F1 | 5'-GCGCGCGAATTCTGTGGGGTTTTTATAQG-3' |
| Primer
in Rückwärtsrichtung:
LTR-R1 | 5'-CCCCCTCTAQATCTAQGATCTGGAACAGAC-3' |
-
Das
Reaktionssystem war dasselbe wie bei dem ersten Zyklus, mit der
Ausnahme, dass der Primer und das Template durch 5μl des Produkts
aus dem ersten Zyklus ersetzt wurden.
-
- Reaktionsbedingung: 95°C
5 Min.; dann 94°C
1 Min., 55°C
1 Min., 72°C
1 Min. für
30 Zyklen, gefolgt von 72°C 10
Min.
- Sequenzierungsmethode: Universalprimer T7 wurde eingesetzt.
-
(2) Fragment B(FB):
-
- Amplifizierungsbereich: 115-1188
-
Primer
und Verfahren:
| Primer in Vorwärtsrichtung:
732 | 5'-ACCGCAATAACCGCATTTGTGACG-3' |
| Primer in Rückwärtsrichtung:
GR11 | 5'-AACCTTGCTGCTATGGGAAT-3' |
-
Das
Reaktionssystem ist das gleiche wie beim ersten Amplifizierungszyklus
von FA (oben), mit der Ausnahme, dass die Primer 732 und GR11 eingesetzt
wurden. Die Reaktionsbedingungen waren dieselben wie beim ersten
Amplifizierungszyklus von FA.
-
Sequenzierungsmethode:
-
Die
Universalprimer T7 und SP6 wurden eingesetzt.
-
(3) Fragment C (FC):
-
- Amplfizierungsbereich: 460-5254
-
Im
ersten Zyklus eingesetzte Primer:
| Primer
in Vorwärtsrichtung:
P13 | 5'-GTAAGATGGGAGACCCTTTG-3' |
| Primer
in Rückwärtsrichtung:
EVENR1 | 5'-ATGCTGACCATGTTACCCCTT-3' |
Im
zweiten Zyklus eingesetzte Primer:
| Primer
in Vorwärtsrichtung:
P13 | 5'-GTAAGATGGGAGACCCTTTG-3' |
| Primer
in Rückwärtsrichtung:
EVENR2 | 5'-CAGATACTGAGGTTGTCTTCCT-3' |
-
Reaktionssystem und Bedingungen:
-
Das
ExpendTM Long Template PCR System (Boehringer
Mannheim) wurde vorschriftsgemäß eingesetzt
(der Puffer ist Puffer 3); das PCR-Produkt wurde an üblichen
Restriktionsschnittstellen in einen Vektor subkloniert und mit den
Universalprimern T7, SP6 und RLR10 sequenziert.
-
Sequenzierungsmethode:
-
Zuerst
wurden die Universalprimer T7 und SP6 verwendet, und die Entscheidung über die
Richtung der Geninsertion wurde getroffen. Dann wurden die Primer
mit den Namen RTF1, RTR20, RTR40 und GF40 gemäß der ermittelten Sequenz entworfen
und synthetisiert, so dass sich die Sequenzierung verlängerte.
Mit dieser Maßnahme
wurde die Sequenz eines subklonierten DNA-Fragments in voller Länge erhalten. Die
DNA-Sequenzen der Primer sind die Folgenden:
-
(4) Fragment D (FD):
-
- Amplifizierungsbereich: (5222-6715)
-
Primer
und Methode:
| Primer
in Vorwärtsrichtung:
F70 | 5'-CCAACAAGGAAGGACAACCTC-3' |
| Primer
in Rückwärtsrichtung:
R51 | 5'-AGACATAQEAQCGCTAQCAG-3' |
-
Das
Reaktionssystem war dasselbe wie beim ersten Amplifizierungszyklus
von FA, mit der Ausnahme, dass die Primer F70 und R51 eingesetzt
wurden. Die Reaktionsbedingungen waren 95°C 5 Min.; dann 94°C 1 Min,
52°C 1 Min.,
72°C 2 Min.
für 30
Zyklen, gefolgt von 72°C
10 Min.
-
Sequenzierungsmethode:
-
Für das Sequenzieren
wurden zuerst die Primer T7 und SP6 eingesetzt, und der Primer LTR20
wurde ausgehend von der resultierenden Sequenz konzipiert (5'-GCCTTAATGCAACAGTC-3'). Die vollständige Sequenz wurde mit Hilfe
von LTR20 erhalten.
-
(5) Fragment E (FE):
-
- Amplifizierungsbereich: (6680-8174)
-
Primer:
| Primer
in Vorwärtsrichtung:
EF51 | 5'-GCTACTGCTATTGCTGCTAQ-3' |
| Primer
in Rückwärtsrichtung:
LR3 | 5'-CTCAGACCGCAGAATCTGAGT-3' |
-
Reaktionssystem und Bedingungen:
-
Die
Amplifizierung wurde nach den Vorschriften des ExpendTM Long
Template PCR System (Boehringer Mannheim) durchgeführt (Puffer
3 wurde eingesetzt);
-
Sequenzierungsmethode:
-
Die
Universalprimer T7 und SP6 wurden eingesetzt.
-
(6) Fragment F (FF):
-
- Amplifizierungsbereich: 3'LTR (7937-8251)
-
Die
im ersten Zyklus eingesetzten Primer:
| Primer
in Vorwärtsrichtung:
EF51 | 5'-GCTACTGCTATTGCTGCTAQ-3' |
| Primer
in Rückwärtsrichtung:
LTR-R1 | 5'-CCCCCTCTAQATCTAQGATCTGGAACAGAC-3' |
Die
im zweiten Zyklus eingesetzten Primer:
| Primer
in Vorwärtsrichtung:
LTR-F1 | 5'-GCGCGCGAATTCTGTGGGGTTTTTATAQG-3' |
| Primer
in Rückwärtsrichtung:
LTR-R1 | 5'-CCCCCTCTAQATCTAQGATCTGGAACAGAC-3' |
-
Das
Reaktionssystem des ersten Zyklus' war demjenigen des ersten Zyklus' der Amplifikation
von Fragment A vergleichbar, mit der Ausnahme, dass die Primer EF51
und LTR-R1 eingesetzt wurden. Die Reaktionsbedingungen sind: 95°C 5 Min.;
dann 94°C
1 Min., 52°C
1 Min., 72°C
1,5 Min. über
30 Zyklen, gefolgt von 72°C über 10 Min.
-
Das
Reaktionssystem des zweiten Zyklus' war demjenigen des oben genannten ersten
Zyklus' vergleichbar,
mit der Ausnahme, dass die Primer LTR-F1 und LTR-R1 verwendet würden und
5μl des
amplifizierten Produkts des ersten Zyklus als Template eingesetzt
wurden. Die Reaktionsbedingungen sind: 95°C 5 Min.; dann 94°C 1 Min.,
55°C 1 Min.,
72°C 1 Min.
für 30
Zyklen, gefolgt von 71°C
10 Min.
-
Sequenzierungsmethode:
-
Der
Universalprimer T7 wurde verwendet
-
Beispiel 2
-
Untersuchungsmethoden,
um den abgeschwächten
EIAV-Impfstoffstamm von den amerikanischen ansteckenden EIAV-Stämmen zu
unterscheiden.
-
Dieses
Beispiel zeigt den Einsatz der Gensequenzen der Erfindung beim Auffinden
von pathogenen Eigenschaften von EIAV. Es ist nützlich bei der Differentialdiagnose
von Pferden, die mit dem abgeschwächten EIAV-Impfstoffstamm immunisiert
wurden, im Vergleich zu solchen, die durch die amerikanischen, ansteckenden
EIAV-Stämme
infiziert wurden.
-
Unter
Einsatz der genomischen Sequenz des abgeschwächten EIAV Esel-Leukozyten-Impfstoffstamms
dieser Erfindung und der Sequenz des internationalen Standardstamms
Wyoming (Genebank Accession No. AF028232) wurden die nachfolgenden
Primer, die spezifisch für
den abgeschwächten
EIAV Esel-Leukozyten-Impfstoffstamm
sind, entworfen und synthetisiert.
| Primer-Name | Position | Sequenz
(5'-3') | Richtung |
| CHF1369 | 1369 | GGACATCCGGCTGATATAAC | Vorwärts |
| CHR1567 | 1567 | GACCAGCTAATCCTGCTTGA | Rückwärts |
| CHR1553 | 1553 | GCTTGAAGTGCCTTGGCTAA | Rückwärts |
| CHF5129 | 5129 | TCAGGAATCACCACCAGTCAG | Vorwärts |
| CHR5610 | 5610 | GTTGTTGCCTCTCATACCAC | Rückwärts |
| CHF1338 | 1338 | AGACAGATTGCTGTCTC | Vorwärts |
| CHR1572 | 1572 | CATAGGACCAGCTATC | Rückwärts |
-
Eine
PCR wurde mit verschiedenen Templates einschließlich der Gesamt-DNA aus mit
dem abgeschwächten
EIAV-Impfstoff beimpften Esel-Leukozyten und aus Esel-Leukozyten, die mit
dem internationalen Standardstamm Wyoming beimpft worden waren,
durchgeführt.
Taq DNA Polymerase wurde von PROMEGA Corp. erworben.
-
Das
PCR-System umfasst 10 × Puffer
5μl, 2.5mM
MgCl2 1μl,
dNTP (2,5mM) 1μl,
Primer1 (20μM)
1μl, Primer2
(20μM) 1μl, Taq Polymerase
(Promega) 1μl(2μ), H2O 34,6μl,
Template 2μl.
-
Primer
1 und Primer 2 wurden als nachfolgende Gruppe kombiniert:
Gruppe
I: CHF1369+CHR1567 (das Produkt besitzt eine Länge von ca. 200Bp)
Gruppe
II: CHF1369+CHR1553 (das Produkt besitzt eine Länge von ca. 190Bp)
Grupp
III: CHF5129+CHR5610 (das Produkt besitzt eine Länge von ca. 380Bp)
Gruppe
IV: CHF1338+CHR1572 (das Produkt besitzt eine Länge von ca. 220Bp)
- Reaktionsbedingungen:
95°C 5 Min.;
dann 94°C
40s, 50°C
30s, 72°C
30s für
30 Zyklen, gefolgt von 72°C
10 Min.
-
Die
Ergebnisse wurden mit Hilfe von Agarose-Gelelektrophorese analysiert.
Es lässt
sich zeigen, dass die Verwendung verschiedener Primergruppen spezifische
Amplifikationsproduke der Gesamt-DNA der Esel-Leukozyten liefert,
die mit dem abgeschwächten
EIAV-Impfstoff beimpft worden waren, nicht aber solche der DNA aus
Esel-Leukozyten, die unter den denselben Bedingungen mit dem internationalen
Standardstamm Wyoming beimpft worden waren. Siehe die
1-
4. SEQUENZLISTE
