ES2288848T3 - Secuencia genetica completa de la cepa de vacuna de leucocitos de asno frente al virus de la anemia infecciosa equina y su aplicacion. - Google Patents
Secuencia genetica completa de la cepa de vacuna de leucocitos de asno frente al virus de la anemia infecciosa equina y su aplicacion. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2288848T3 ES2288848T3 ES00918668T ES00918668T ES2288848T3 ES 2288848 T3 ES2288848 T3 ES 2288848T3 ES 00918668 T ES00918668 T ES 00918668T ES 00918668 T ES00918668 T ES 00918668T ES 2288848 T3 ES2288848 T3 ES 2288848T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- vaie
- seq
- vaccine
- baselineskip
- sequence
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
- C12N2740/15022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Virology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Un ADN aislado que comprende la secuencia genómica del provirus de longitud completa de la cepa de vacuna atenuada de leucocitos de asno frente al VAIE según se depositó en el Centro de la Colección de Cultivos Microbiológicos Generales de China bajo CGMCC 0394, o la secuencia según se expone en SEQ ID No.1.
Description
Secuencia genética completa de la cepa de vacuna
de leucocitos de asno frente al virus de la anemia infecciosa equina
y su aplicación.
Esta invención se refiere a la secuencia
genómica de longitud completa de la cepa de vacuna frente al VAIE
atenuada de leucocitos de asno, así como a las secuencias y a los
posibles usos de los genes funcionales y sus productos de
expresión.
El virus de la anemia infecciosa equina (VAIE),
el patógeno de la anemia infecciosa equina, fue el primer tipo de
virus descubierto por el ser humano. La anemia infecciosa equina,
descrita por primera vez en Francia en 1843, ha producido una
tremenda pérdida económica en la cría de animales durante más de un
siglo. Los científicos de todo el mundo han realizado esfuerzos
para investigar técnicas para controlar esta enfermedad. Desde los
años 1960, el gobierno chino ha facilitado un apoyo financiero
extraordinario para financiar estudios sobre las propiedades
biológicas e inmunológicas del VAIE. Durante sus investigaciones,
los científicos chinos aislaron una cepa virulenta que era bastante
diferente de las cepas aisladas en otros países. A través del pase
sobre leucocitos de asno durante muchas generaciones, esta cepa
virulenta se atenuó satisfactoriamente. Utilizando este virus
atenuado como una cepa de vacuna, los animales inoculados
desarrollaron inmunidad persistente y fuerte frente al VAIE y se
protegieron frente a la anemia infecciosa equina. La vacuna se ha
preparado a gran escala desde 1976 y se ha utilizado en todo el
país desde 1978. Se han vacunado más de 70 millones de caballos,
mulas y asnos y la anemia infecciosa equina se ha controlado
satisfactoriamente en China (Rongxian Shen, et al. Study on
immunological methods of Equine Infectious Anemia, China
Agricultural Science, vol. 4, 1-15, 1979).
Se clasifica el VAIE como un lentivirus de la
familia Retroviridae. En muchos aspectos, tales como su organización
genómica, las proteínas funcionales y el modo regulador de la
expresión génica, el VAIE muestra una gran similitud con el virus
de la inmunodeficiencia humana (VIH), otro lentivirus que es la
causa del SIDA. (J. M. Coffin, The structure And Classification of
Retroviruses, The Retroviridae, Vol. 1, pág. 19, editado por Jay A.
Levy, Plenum Press). Además, existen extensas homologías en la
estructura en la estructura y función de la transcriptasa inversa,
proteinasa, glucoproteína de la envoltura y nucleoproteína entre el
VAIE y el VIH. Los caballos infectados con VAIE manifiestan
síntomas típicos de la infección lentiviral, incluyendo fiebre
periódica, anemia con la disminución de eritrocitos y viremia
persistente. Por tanto, el VAIE puede servir como un importante
modelo de investigación en la investigación de los mecanismos de
infección y las funciones enzimáticas de otros lentivirus (R. C.
Montelaro et al, Equine Retroviruses, en: vol. 2, pág.
257).
Con el desarrollo y la aplicación generalizada
de la biología molecular desde los años 1970, se ha estudiado de
forma intensiva la organización genómica del VAIE. En S.L. Payne
et al., Journal of General Virology (1994), 75,
425-429, se caracterizan una variedad de clones
moleculares infecciosos del VAIE, recuperados de células de riñón
equino fetal (FEK) infectadas, a nivel molecular. Se han registrado
secuencias genómicas de longitud completa del VAIE de la cepa
virulenta habitual (referencia) aislada en EE.UU. (cepa Wyoming),
de otro aislado en Japón (cepa Goshum), y de varias cepas adaptadas
a cultivos celulares registradas todas en GenBank. Sin embargo,
ninguna de ellas, son cepas de vacunas. Actualmente, la cepa de
vacuna atenuada de leucocitos de asno frente al VAIE que se
desarrolló en China sigue siendo la única cepa de vacuna frente a
lentivirus en el mundo. Se ha utilizado a gran escala y se ha
comprobado que es eficaz y segura a lo largo de un periodo de
aplicación largo (R. C. Montelaro, et al. en: Vaccine against
Retroviruses, Vol. 4, pág. 605; R. C. Montelaro, et al.
Equine Retroviruses, en: Vol. 2, pág. 257). C. G. Pan et al.
en Journal of Equine Veterinary Science, 13(3),
163-166 (1993), (Reimpresión) describen proteínas
estructurales de la misma y sus propiedades inmunológicas.
No se ha caracterizado anteriormente la
secuencia genómica ni la organización de la cepa de vacuna frente
al VAIE. La caracterización de la secuencia genómica y la estructura
de la cepa de vacuna frente al VAIE no sólo establecerá las bases
para perfeccionar la vacuna y preparar nuevas vacunas frente al VAIE
modificado mediante ingeniería genética, sino también, de forma más
importante, puede proporcionar un modelo para desarrollar otras
vacunas frente a lentivirus.
Por tanto, los objetivos de la invención son
proporcionar la secuencia genómica de longitud completa de la cepa
de vacuna frente al VAIE adaptada a leucocitos de asno; las
secuencias de cada gen funcional y sus supuestas secuencias de
aminoácidos; y los usos de estos genes y sus productos de
expresión.
La presente invención se refiere a la secuencia
genómica de longitud completa de la cepa de vacuna frente al VAIE
atenuada de leucocitos de asno, que incluye secuencias de los
principales genes estructurales (gag, pol, env) y los genes
reguladores (LTR, rev, s2, tat). La secuencia de longitud
completa de esta cepa es de 8258 pb de longitud. Se muestra la
secuencia de nucleótidos en SEQ ID NO:1 (véase a continuación). En
esta secuencia de longitud completa, la secuencia LTR del extremo 5'
se extiende desde la posición 1 hasta la 325 y la LTR del extremo
3' abarca desde la posición 7922 hasta la 8258. El gen gag
ocupa la secuencia entre 466 y 1926; el gen pol abarca la
secuencia entre 1689 y 5120; y el gen env se extiende desde
5313 hasta 7904. El gen regulador tat contiene dos exones: el
primer exón se encuentra entre las posiciones 365 y 462 mientras
que el segundo abarca desde 5138 hasta 5276. De forma similar, el
gen regulador rev contiene dos exones: el primer exón se
encuentra desde la posición 5454 hasta la 5546, mientras que el
segundo abarca desde la posición 7250 hasta la 7651. El gen
S2 se encuentra entre las posiciones 5287 y 5493. Se
enumeran las secuencias de todos estos genes funcionales y sus
supuestas secuencias de aminoácidos en las SEQ ID NO: 2 a 7 y las
SEQ ID NO: 8 a 13, respectivamente. Se depositó originariamente un
clon genómico de la secuencia genética de longitud completa de la
cepa de vacuna atenuada de leucocitos de asno frente al VAIE en el
Centro de la Colección de Cultivos Microbiológicos Generales de
China (CGMCC) el 19 de abril de 1999 con un número de acceso de
CGMCC nº 0394. Se transfirió este depósito a un depósito
internacional según el Tratado de Budapest el 19 de abril de 2000.
Tal como saben los expertos, las secuencias mostradas en las SEQ ID
NO: 1 a 7 pueden tener algunos errores de secuenciación.
Se han llevado a cabo los objetivos de la
invención usando las siguientes técnicas. Debido a que la cepa
frente a VAIE adaptada a leucocitos de asno está en la forma de un
provirus durante su fase replicativa in vitro y se integra
en los cromosomas de los leucocitos de asno, se extrajo el ADN
cromosómico de leucocitos de asno infectados con VAIE atenuado y se
usaron como plantillas para la amplificación por PCR. Brevemente, en
primer lugar se llevaron a cabo las amplificaciones por PCR
preliminares usando diferentes cebadores que se diseñaron basándose
en las secuencias genómicas de las cepas virulentas frente al VAIE
de referencia. Se secuenciaron a continuación estos productos de
PCR. Se sintetizaron cebadores específicos que correspondían a la
secuencia de fragmento de VAIE atenuado y se usaron para otra ronda
de amplificación por PCR. Finalmente, se clonaron y secuenciaron
respectivamente los diferentes productos de PCR, que representan
diferentes regiones del genoma de VAIE atenuado. Se obtuvo la
secuencia de longitud completa que incluye genes estructurales
(gag, pol y env) y genes reguladores (LTR, rev,
S2 y tat) de la cepa de vacuna frente al VAIE.
Se analizó el ORF de la secuencia de longitud
completa con software de GCG (Genetic Computer Group, Inc.,
Wisconsin, EE.UU.). Se identificaron las secuencias de nucleótidos y
aminoácidos deducidos de diferentes genes reguladores y
estructurales en la secuencia de longitud completa.
En comparación con las secuencias de las cepas
virulentas frente al VAIE de referencia que se cedieron por
Genbank, las homologías en la secuencia de nucleótidos entre cada
gen de la cepa de vacuna y el de las cepas de referencia fueron del
73,46%\sim90,06%. Los genes env, rev y S2 se
encontraban entre aquellos con homologías de secuencia inferiores
entre las cepas de vacuna y referencia. Las homologías en las
secuencias de nucleótidos entre env, rev y S2 de la
cepa de vacuna y los de las cepas de referencia fueron del 73,46%,
73,54% y 75,76%, respectivamente, y las homologías en las secuencias
de aminoácidos fueron del 67,41%, 64,85% y 54,51%,
respectivamente.
Además, se predijeron las estructuras
secundarias de las proteínas estructurales y reguladoras de la cepa
de vacuna frente al VAIE usando el software de GCG. Se mostró una
diferencia significativa en las estructuras secundarias de las
proteínas env y tat entre las cepas de vacuna y referencia. Las
cantidades y ubicaciones de las hélices \alpha, láminas \beta y
giros \beta en muchos dominios fueron bastante diferentes. Existe
un grupo hidrófobo en el extremo C-terminal en la
proteína tat de la cepa de vacuna, una lámina \beta en la región
proximal que forma un grupo hidrófilo concentrado, y 4 giros \beta
en el extremo N-terminal. Por el contrario, no se
encuentran grupos no hidrófobos en el extremo
C-terminal en la proteína tat de las cepas de
referencia. En su lugar, existen espirales aleatorias flexibles en
las regiones proximales en vez de una lámina \beta, aunque pueden
encontrarse 2 grupos hidrófilos distintos e independientes. Además,
muchos giros \beta están presentes en los extremos
N-terminales. Estas diferencias entre estructuras
secundarias pueden indicar diferencias funcionales. Basándose en
estas diferencias, pueden modificarse los genes y proteínas
relacionados del VIH y otros lentivirus, e investigar el uso de
estas cepas modificadas como posibles vacunas.
Además, también se encontró mediante el análisis
de la secuencia que existen 19 posibles sitios de glucosilación
unidos a N en el gen env de la cepa de vacuna, mientras que
pueden encontrarse 23 posibles sitios de glucosilación unidos a N en
la misma región de la cepa de referencia.
La presente invención sirve como el primer
informe en China y en el extranjero que caracteriza en detalle la
organización genómica (incluyendo genes reguladores y estructurales
y las proteínas relacionadas) del genoma de longitud completa de la
cepa de vacuna frente al VAIE. Está invención dirigirá los intentos
para desarrollar la vacuna para la inmunoprofilaxis de enfermedades
crónicas producidas por otros lentivirus. Puede usarse la secuencia
de nucleótidos y los reactivos de diagnóstico serológicos derivados
de los genes y proteínas de la cepa de vacuna frente al VAIE en el
diagnóstico de la infección por VAIE, la diferenciación de la
infección por virus de tipo natural y la inoculación de la vacuna
frente al VAIE, y el desarrollo de nuevas vacunas a través de
ingeniería genética. También puede usarse la secuencia genética
notificada en el presente documento para diferenciar caballos
inmunizados con la vacuna frente al VAIE de aquellos infectados por
la cepa americana de VAIE, tal como se describe en el ejemplo 2 a
continuación. Finalmente, puede usarse el genoma de longitud
completa de la cepa de vacuna frente al VAIE para construir el
vector de transferencia de genes que se usa generalmente en la
terapia génica. Puesto que el VAIE no puede producir la enfermedad
en los seres humanos, el vector de transferencia basado en VAIE
puede usarse de forma más amplia y segura que otros vectores, tales
como el vector derivado del virus de la leucemia murina (VLM).
La figura 1 muestra los resultados de la
amplificación por PCR de diferentes plantillas usando el conjunto de
cebadores I, tal como se describe en el ejemplo 2. Los carriles 1 y
2 indican los resultados de la amplificación del ADN total de
leucocitos de asno infectados por la cepa de vacuna frente al VAIE
(\sim200 pb); el carril 3 es el marcador de ADN (pBR322/BstNI); el
carril 4 son los resultados de la amplificación del ADN total de
leucocitos de asno infectados por la cepa de referencia (cepa
Wyoming).
La figura 2 muestra los resultados de la
amplificación por PCR de diferentes plantillas usando el conjunto de
cebadores II, tal como se describe en el ejemplo 2. El carril 1 es
el marcador de ADN (DL2000, TaKaRa); los carriles 2 y 3 son los
resultados de la amplificación del ADN total de leucocitos de asno
infectados por la cepa de vacuna frente al VAIE (\sim190 pb); el
carril 4 indica los resultados de la amplificación del ADN total de
leucocitos de asno; el carril 5 muestra los resultados de la
amplificación del ADN total de leucocitos de asno infectados por la
cepa de referencia (cepa Wyoming).
La figura 3 muestra los resultados de la
amplificación por PCR de diferentes plantillas usando el conjunto de
cebadores III, tal como se describe en el ejemplo 2. El carril 1 es
el marcador de ADN (pBR322/BstNI); el carril 2 muestra los
resultados de la amplificación del ADN total de leucocitos de asno
infectados por la cepa de referencia (cepa Wyoming). Los carriles 3
y 4 son los resultados de la amplificación del ADN total de
leucocitos de asno infectados por la cepa de vacuna frente al VAIE
(\sim380 pb).
La figura 4 muestra los resultados de la
amplificación por PCR de diferentes plantillas usando el conjunto de
cebadores IV, tal como se describe en el ejemplo 2. Los carriles 1 y
2 son los resultados de la amplificación del ADN total de leucocitos
de asno infectados por la cepa de vacuna frente al VAIE (\sim220
pb); El carril 3 es el marcador de ADN (pBR322/BstNI); el carril 4
son los resultados de la amplificación del ADN total de leucocitos
de asno infectados por la cepa de referencia (cepa Wyoming).
Se ilustrará la invención con referencia a los
dibujos y los siguientes ejemplos.
Se inoculó la vacuna atenuada de leucocitos de
asno frente al virus de la anemia infecciosa equina (VAIE)
(Instituto de Investigación Veterinaria de Harbin, Harbin, China) en
un cultivo de leucocitos de asno sanos a 37ºC con suero bovino al
100% (1 ml/10^{7} células). Cuando apareció el efecto patológico
celular, se desechó el sobrenadante, y se extrajo el ADN genómico
celular usando un kit de ADN genómico de Qiagen (Qiagen,
EE.UU.).
En primer lugar, se amplificaron los genes de
LTR en 5' y gp90 de la invención usando cebadores diseñados según
las secuencias publicadas de las cepas Wyoming. Después, se
diseñaron los cebadores según las secuencias cedidas para
amplificar los otros intervalos del genoma. Se subclonaron los
productos de PCR en el vector pGEM®-T Easy (Promega) según el
protocolo del fabricante. Se usó la endonucleasa de restricción
EcoRI para identificar la recombinación y el secuenciador de ADN
ABI 377 para secuenciar. Se organizaron los fragmentos solapantes
de la secuencia dentro de un genoma completo y se identificó cada
gen mediante software de GCG. Se enumera la secuencia del genoma
completo en la SEQ ID NO. 1. Los genes identificados están presentes
en las SEQ ID NO. 2-7. Lo siguiente es el
rendimiento concreto de los diferentes fragmentos:
(1) Fragmento
A(FA):
Intervalo amplificado: LTR en 5'
(1-320)
Cebadores y procedimiento:
\vskip1.000000\baselineskip
Primer círculo:
| Cebador directo: LTR-F1 | 5'-GCGCGCGAATTCTGTGGGGTTTTTATAQG-3' |
| Cebador inverso: GR11 | 5'-AACCTTGCTGCTATGGGAAT-3' |
Sistema de reacción: 5 \mul de tampón 10 x
(Mg^{2+} 2 mM), 1 \mul de dNTP (10 mM), 1 \mul de
LTR-F1 (20 \muM), 1 \mul de GR11 (20 \muM), 1
\mul (1 u) de polimerasa de Taq (Promega), 1 \mul de plantilla
(200 ng), 41 \mul de H_{2}O.
Programa de reacción: 95ºC, 5 min.; después
94ºC, 1 min., 52ºC, 1 min., 72ºC, 1,5 min., durante 30 ciclos
seguido de 72ºC, 10 min..
\vskip1.000000\baselineskip
Segundo círculo:
| Cebador directo: LTR-F1 | 5'-GCGCGCGAATTCTGTGGGGTTTTTATAQG-3' |
| Cebador inverso: LTR-R1 | 5'-CCCCCTCTAQATCTAQGATCTGGAACAGAC-3' |
El sistema de reacción fue el mismo que en el
primer círculo excepto que el cebador y la plantilla se sustituyeron
por 5 \mul del producto del primer ciclo.
Condiciones de reacción: 95ºC, 5 min.; después
94ºC, 1 min., 55ºC, 1 min. 72ºC, 1 min., durante 30 ciclos seguido
de 72ºC, 10 min..
Procedimiento de secuenciación: Se usó cebador
universal T7.
\vskip1.000000\baselineskip
(2) Fragmento B
(FB):
Intervalo amplificado:
115-1188
Cebadores y procedimiento:
| Cebador directo: 732 | 5'-ACCGCAATAACCGCATTTGTGACG-3' |
| Cebador inverso: GR11 | 5'-AACCTTGCTGCTATGGGAAT-3' |
El sistema de reacción es el mismo que en el
primer ciclo de amplificación de FA (anteriormente) excepto que se
usaron los cebadores 732 y GR11. Las condiciones de reacción fueron
las mismas que el primer ciclo de amplificación de FA.
Procedimiento de secuenciación:
Se usaron los cebadores universales T7 y
SP6.
\vskip1.000000\baselineskip
(3) Fragmento C
(FC):
Intervalo amplificado:
460-5254
Cebadores usados en el primer ciclo:
| Cebador directo: P13 | 5'-GTAAGATGGGAGACCCTTTG-3' |
| Cebador inverso: EVENR1 | 5'-ATGCTGACCATGTTACCCCTT-3' |
\vskip1.000000\baselineskip
Cebadores usados en el segundo ciclo:
| Cebador directo: P13 | 5'-GTAAGATGGGAGACCCTTTG-3' |
| Cebador inverso: EVENR2 | 5'-CAGATACTGAGGTTGTCTTCCT-3' |
Sistema y condiciones de reacción:
Se usó el sistema de PCR de plantilla larga
Expend^{TM} (Boehringer Mannheim) según el protocolo (el tampón es
tampón 3); se subclonó el producto de PCR en un vector en los sitios
de restricción comunes y se secuenció con los cebadores universales
T7 y SP6 y el RLR10.
Procedimiento de secuenciación:
Inicialmente, se usaron los cebadores
universales T7 y SP6 y se decidió la dirección de inserción génica.
Después se diseñaron los cebadores denominados RTF1, RTR20, RTR40 y
GF40 y se sintetizaron según la secuencia cedida, de modo que se
prolongó la secuenciación. Mediante estos medios, se obtuvo la
secuencia de longitud completa de un fragmento de ADN
subclonado.
Las secuencias de ADN de los cebadores son tal
como siguen:
| T7 | 5'-TAA TC GAC TCA CTA TAG GGA GA-3' |
| SP6 | 5'-CAT ACG ATT TAG GTG ACA CTA TAG-3' |
| RTF1 | 5'-CCT CGA GGG AGA TGC ATA TTT C-3' |
| RTR20 | 5'-CCC TCA TCT CAT CCA TGT T-3' |
| RTR40 | 5'-GGT ATA GTG AAA TAT GCA TCT CC-3' |
| GF40 | 5'-AAG TGA GGG ACA TCC GGC T-3' |
| RLR10 | 5'-CTG TCC TCC CAT ACT TTC-3' |
\vskip1.000000\baselineskip
(4) Fragmento D
(FD):
Intervalo amplificado:
(5222-6715)
Cebadores y procedimiento:
| Cebador directo: F70 | 5'-CCAACAAGGAAGGACAACCTC-3' |
| Cebador inverso: R51 | 5'-AGACATAQEAQCGCTAQCAG-3' |
El sistema de reacción es el mismo que en el
primer ciclo de amplificación de FA, excepto que se usaron los
cebadores F70 y R51. Las condiciones de reacción fueron 95ºC, 5
min.; después 94ºC, 1 min., 52ºC, 1 min., 72ºC, 2 min., durante 30
ciclos seguido de 72ºC, 10 min..
Procedimiento de secuencia:
Se usaron en primer lugar los cebadores T7 y SP6
para secuenciar, y se diseñó el cebador LTR20 a partir de la
secuencia resultante
(5'-GCCTTAATGCAACAGTC-3'). Se obtuvo
la secuencia completa a partir de LTR 20.
\vskip1.000000\baselineskip
(5) Fragmento E
(FE):
Intervalo amplificado:
(6680-8174)
Cebadores:
| Cebador directo: EF51 | 5'-GCTACTGCTATTGCTGCTAQ-3' |
| Cebador inverso: LR3 | 5'-CTCAGACCGCAGAATCTGAGT-3' |
Sistema y condiciones de reacción:
Se realizó la amplificación según el protocolo
del sistema de PCR de plantilla larga Expend^{TM} (Boehringer
Mannheim) (se usó tampón 3);
Procedimiento de secuencia:
Se usaron los cebadores universales T7 y SP6
\vskip1.000000\baselineskip
(6) Fragmento F
(FF):
Intervalo amplificado: LTR en 3'
(7937-8251)
Cebadores usados en el primer ciclo:
| Cebador directo: EF51 | 5'-GCTACTGCTATTGCTGCTAQ-3' |
| Cebador inverso: LTR-R1 | 5'-CCCCCTCTAQATCTAQGATCTGGAACAGAC-3' |
\vskip1.000000\baselineskip
Cebadores usados en el segundo ciclo:
| Cebador directo: LTR-F1 | 5'-GCGCGCGAATTCTGTGGGGTTTTTATAQG-3' |
| Cebador inverso: LTR-R1 | 5'-CCCCCTCTAQATCTAQGATCTGGAACAGAC-3' |
El sistema de reacción del primer ciclo fue
similar al del primer ciclo de la amplificación del fragmento A,
excepto que se usaron los cebadores EF51 y LTR-R1.
Las condiciones de reacción son: 95ºC, 5 min.; después 94ºC, 1 min.,
52ºC, 1 min., 72ºC, 1,5 min., durante 30 ciclos seguido de 72ºC, 10
min..
El sistema de reacción del segundo ciclo fue
similar al del primer ciclo mencionado anteriormente, excepto que
se usaron los cebadores LTR-F1 y
LTR-R1 y se usaron 5 \mul de producto amplificado
del primer ciclo como plantilla. Las condiciones de reacción son:
95ºC, 5 min.; después 94ºC, 1 min., 55ºC, 1 min., 72ºC, 1 min.,
durante 30 ciclos seguido de 72ºC, 10 min..
Procedimiento de secuenciación:
Se usó cebador universal T7.
\vskip1.000000\baselineskip
Este ejemplo demuestra el uso de las secuencias
genéticas de la invención para detectar características del
patógeno del VAIE. Es útil para diagnosticar caballos inmunizados
por la cepa de vacuna atenuada frente al VAIE de los infectados por
las cepas de VAIE epidémicas americanas.
Usando la secuencia genómica de la cepa de
vacuna atenuada de leucocitos de asno frente al VAIE de esta
invención y la secuencia de la cepa Wyoming habitual internacional
(número de acceso de Genebank AF028232), se diseñaron y
sintetizaron los siguientes cebadores específicos para la cepa de
vacuna atenuada de leucocitos de asno frente al VAIE.
Se realizó PCR en diferentes plantillas
incluyendo ADN total de leucocitos de asno inoculados con la vacuna
atenuada frente al VAIE y de leucocitos de asno inoculados con la
cepa Wyoming habitual internacional. Se adquirió ADN polimerasa de
Taq de PROMEGA Corp. El sistema de PCR incluye 5 \mul de tampón 10
x, 1 \mul de MgCl_{2} 2,5 mM, 1 \mul de dNTP (2,5 mM), 1
\mul de cebador 1 (20 \muM), 1 \mul de cebador 2 (20 \muM),
1 \mul (2u) de polimerasa de Taq (Promega), 34,6 \mul de
H_{2}O, 2 \mul de plantilla.
Se combinaron el cebador 1 y el cebador 2 según
el grupo siguiente:
Grupo I: CHF1369 + CHR1567 (el producto es de
aproximadamente 200 pb de longitud)
Grupo II: CHF1369 + CHR1553 (el producto es de
aproximadamente 190 pb de longitud)
Grupo III: CHF5129 + CHR5610 (el producto es de
aproximadamente 380 pb de longitud)
Grupo IV: CHF1338 + CHR1572 (el producto es de
aproximadamente 220 pb de longitud)
Condiciones de reacción: 95ºC, 5 min.; después
94ºC, 40 s, 50ºC, 30 s, 72ºC, 30 s, durante 30 ciclos seguido de
72ºC, 10 min.
Se analizaron los resultados mediante
electroforesis en gel de agarosa. Se demuestra que el uso de
diferentes grupos de cebadores conduce a productos de amplificación
específicos del ADN total de los leucocitos de asno inoculados con
la vacuna atenuada frente al VAIE pero no del ADN de leucocitos de
asno inoculados con la cepa Wyoming habitual internacional en las
mismas condiciones. Véanse las figuras 1-4.
<110> CENTRO NACIONAL PARA LA PREVENCIÓN Y
CONTROL DEL SIDA, INSTITUTO DE INVESTIGACIÓN VETERINARIA DE HARBIN,
ACADEMIA DE CIENCIAS AGRÍCOLAS DE CHINA.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Secuencia genómica de longitud
completa de la cepa de vacuna frente al VAIE atenuada de leucocitos
de asno y usos de la misma.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> P2000121C
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140> Documento PCT/CN00/00096
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
21-04-2000
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> Documento CN99105852.6
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
21-04-1999
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8258
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de la anemia infecciosa equina
(VAIE)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1461
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> VAIE
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3432
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> VAIE
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2592
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> VAIE
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 495
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> VAIE
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 237
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> VAIE
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 207
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> VAIE
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 486
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> VAIE
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1143
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> VAIE
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 863
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> VAIE
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 164
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> VAIE
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 78
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> VAIE
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 68
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> VAIE
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (17)
1. Un ADN aislado que comprende la secuencia
genómica del provirus de longitud completa de la cepa de vacuna
atenuada de leucocitos de asno frente al VAIE según se depositó en
el Centro de la Colección de Cultivos Microbiológicos Generales de
China bajo CGMCC 0394, o la secuencia según se expone en SEQ ID
No.1.
2. Un ADN aislado que comprende los nucleótidos
1 a 325 del genoma del provirus de longitud completa de la cepa de
vacuna atenuada de leucocitos de asno frente al VAIE según se
depositó en el Centro de la Colección de Cultivos Microbiológicos
Generales de China bajo CGMCC 0394 o de SEQ ID No.1.
3. Un ADN aislado que comprende los nucleótidos
7922 a 8258 del genoma del provirus de longitud completa de la cepa
de vacuna atenuada de leucocitos de asno frente al VAIE según se
depositó en el Centro de la Colección de Cultivos Microbiológicos
Generales de China bajo CGMCC 0394 o de SEQ ID No.1.
4. Un ADN aislado que comprende los nucleótidos
466 a 1926 del genoma del provirus de longitud completa de la cepa
de vacuna atenuada de leucocitos de asno frente al VAIE según se
depositó en el Centro de la Colección de Cultivos Microbiológicos
Generales de China bajo CGMCC 0394 o de SEQ ID No. 1.
5. Un ADN aislado que comprende los nucleótidos
1689 a 5120 del genoma del provirus de longitud completa de la cepa
de vacuna atenuada de leucocitos de asno frente al VAIE según se
depositó en el Centro de la Colección de Cultivos Microbiológicos
Generales de China bajo CGMCC 0394 o de SEQ ID No.1.
6. Un ADN aislado que comprende los nucleótidos
5313 a 7904 del genoma del provirus de longitud completa de la cepa
de vacuna atenuada de leucocitos de asno frente al VAIE según se
depositó en el Centro de la Colección de Cultivos Microbiológicos
Generales de China bajo CGMCC 0394 o de SEQ ID No.1.
7. Un ADN aislado que comprende los nucleótidos
365 a 462 y 5138 a 5276 del genoma del provirus de longitud completa
de la cepa de vacuna atenuada de leucocitos de asno frente al VAIE
según se depositó en el Centro de la Colección de Cultivos
Microbiológicos Generales de China bajo CGMCC 0394 o de SEQ ID
No.1.
8. Un ADN aislado que comprende los nucleótidos
5454 a 5546 y 7250 a 7651 del genoma del provirus de longitud
completa de la cepa de vacuna atenuada de leucocitos de asno frente
al VAIE según se depositó en el Centro de la Colección de Cultivos
Microbiológicos Generales de China bajo CGMCC 0394 o de SEQ ID
No.1.
9. Un ADN aislado que comprende los nucleótidos
5287 a 5493 del genoma del provirus de longitud completa de la cepa
de vacuna atenuada de leucocitos de asno frente al VAIE según se
depositó en el Centro de la Colección de Cultivos Microbiológicos
Generales de China bajo CGMCC 0394 o de SEQ ID No.1.
10. Un polipéptido codificado por el ADN aislado
según la reivindicación 4, preferiblemente codificado por el gen
gag de la cepa de vacuna atenuada de leucocitos de asno
frente al virus de la anemia infecciosa equina y que comprende la
secuencia según se expone en SEQ ID NO:8.
11. Un polipéptido codificado por el ADN aislado
según la reivindicación 5, preferiblemente codificado por el gen
pol de la cepa de vacuna atenuada de leucocitos de asno
frente al virus de la anemia infecciosa equina y que comprende la
secuencia según se expone en SEQ ID NO:9.
12. Un polipéptido codificado por el ADN aislado
según la reivindicación 6, preferiblemente codificado por el gen
env de la cepa de vacuna atenuada de leucocitos de asno
frente al virus de la anemia infecciosa equina y que comprende la
secuencia según se expone en SEQ ID NO:10.
13. Un polipéptido codificado por el ADN aislado
según la reivindicación 8, preferiblemente codificado por el gen
rev de la cepa de vacuna atenuada de leucocitos de asno
frente al virus de la anemia infecciosa equina y que comprende la
secuencia según se expone en SEQ ID NO:11.
14. Un polipéptido codificado por el ADN aislado
según la reivindicación 7, preferiblemente codificado por el gen
tat de la cepa de vacuna atenuada de leucocitos de asno
frente al virus de la anemia infecciosa equina y que comprende la
secuencia según se expone en SEQ ID NO:12.
15. Un polipéptido codificado por el ADN aislado
según la reivindicación 9, preferiblemente codificado por el gen
s2 de la cepa de vacuna atenuada de leucocitos de asno frente
al virus de la anemia infecciosa equina y que comprende la secuencia
según se expone en SEQ ID NO:13.
16. Uso de un ADN según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 9, en la preparación de vacunas de subunidades
modificadas mediante ingeniería genética, vacunas con genes mutados,
vacunas deficientes en genes, vacunas de ADN o agentes de
diagnóstico.
\newpage
17. Secuencia de cebador, que comprende una
secuencia seleccionada del grupo constituido por:
- (a)
- GGACATCCGGCTGATATAAC,
- (b)
- GACCAGCTAATCCTGCTTGA,
- (c)
- GCTTGAAGTGCCTTGGCTAA,
- (d)
- TCAGGAATCACCACCAGTCAG,
- (e)
- GTTGTTGCCTCTCATACCAC,
- (f)
- AGACAGATTGCTGTCTC, y
- (g)
- CATAGGACCAGCTATC.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CNB991058526A CN1173036C (zh) | 1999-04-21 | 1999-04-21 | 马传染性贫血病毒驴白细胞弱毒疫苗株的全长基因序列 |
| CN99105852 | 1999-04-21 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2288848T3 true ES2288848T3 (es) | 2008-02-01 |
Family
ID=5272155
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES00918668T Expired - Lifetime ES2288848T3 (es) | 1999-04-21 | 2000-04-21 | Secuencia genetica completa de la cepa de vacuna de leucocitos de asno frente al virus de la anemia infecciosa equina y su aplicacion. |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6987020B1 (es) |
| EP (1) | EP1174507B1 (es) |
| CN (1) | CN1173036C (es) |
| AT (1) | ATE368117T1 (es) |
| AU (1) | AU3955400A (es) |
| DE (1) | DE60035680T2 (es) |
| ES (1) | ES2288848T3 (es) |
| WO (1) | WO2000063387A1 (es) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU8710301A (en) * | 2000-09-09 | 2002-03-22 | Akzo Nobel Nv | Eiav chimeric vaccine and diagnostic |
| US6461616B1 (en) * | 2000-09-09 | 2002-10-08 | Akzo Nobel Nv | EIAV p26 deletion vaccine and diagnostic |
| CN101705246B (zh) * | 2007-04-29 | 2012-06-27 | 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 | 慢病毒基因转移载体、其制备方法和应用 |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0491930B1 (en) | 1990-07-12 | 1997-01-15 | The President And Fellows Of Harvard College | Primate lentivirus vaccines |
| CN1059701C (zh) * | 1996-04-03 | 2000-12-20 | 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 | 马传染性贫血病驴白细胞弱毒株及其培育方法 |
| EP0914422B1 (en) * | 1996-04-15 | 2009-11-18 | Vanderbilt University | Mammalian genes involved in viral infection |
| CA2288328A1 (en) | 1997-05-13 | 1998-11-19 | University Of North Carolina At Chapel Hill | Lentivirus-based gene transfer vectors |
| DE69738969D1 (de) * | 1997-12-30 | 2008-10-16 | Univ Minas Gerais | Verfahren zur expression und herstellung des rekombinanten proteins gp90 der glykoproteinhülle des infektiösen pferdeanämievirus eiav |
-
1999
- 1999-04-21 CN CNB991058526A patent/CN1173036C/zh not_active Expired - Lifetime
-
2000
- 2000-04-21 AU AU39554/00A patent/AU3955400A/en not_active Abandoned
- 2000-04-21 ES ES00918668T patent/ES2288848T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2000-04-21 WO PCT/CN2000/000096 patent/WO2000063387A1/zh active IP Right Grant
- 2000-04-21 US US09/959,120 patent/US6987020B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-04-21 DE DE60035680T patent/DE60035680T2/de not_active Expired - Lifetime
- 2000-04-21 AT AT00918668T patent/ATE368117T1/de active
- 2000-04-21 EP EP00918668A patent/EP1174507B1/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ATE368117T1 (de) | 2007-08-15 |
| EP1174507B1 (en) | 2007-07-25 |
| DE60035680D1 (de) | 2007-09-06 |
| CN1173036C (zh) | 2004-10-27 |
| AU3955400A (en) | 2000-11-02 |
| US6987020B1 (en) | 2006-01-17 |
| WO2000063387A1 (fr) | 2000-10-26 |
| CN1271015A (zh) | 2000-10-25 |
| EP1174507A1 (en) | 2002-01-23 |
| DE60035680T2 (de) | 2008-04-30 |
| EP1174507A4 (en) | 2004-03-24 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Lew et al. | Molecular characterization of Hawaii virus and other Norwalk-like viruses: evidence for genetic polymorphism among human caliciviruses | |
| Glass et al. | Nucleotide sequence of the structural glycoprotein VP7 gene of Nebraska calf diarrhea virus rotavirus: comparison with homologous genes from four strains of human and animal rotaviruses | |
| Vakharia et al. | Molecular basis of antigenic variation in infectious bursal disease virus | |
| ES2293645T3 (es) | Material virico y fragmentos nucleotidicos asociados con la enclerosis en placas, con fines de diagnostico, profilacticos y terapeuticos. | |
| JP4749481B2 (ja) | 弱毒化された非機能性ｖｉｆタンパク質による免疫応答性誘導 | |
| Gottschalck et al. | Nucleotide sequence analysis of Aleutian mink disease parvovirus shows that multiple virus types are present in infected mink | |
| CN111349179B (zh) | 禽呼肠孤病毒基因工程疫苗 | |
| Zemba et al. | Construction of infectious feline foamy virus genomes: cat antisera do not cross-neutralize feline foamy virus chimera with serotype-specific Env sequences | |
| Arias et al. | Primary structure of the neutralization antigen of simian rotavirus SA11 as deduced from cDNA sequence | |
| Kantharidis et al. | Marked sequence variation between segment 4 genes of human RV-5 and simian SA 11 rotaviruses | |
| ES2288848T3 (es) | Secuencia genetica completa de la cepa de vacuna de leucocitos de asno frente al virus de la anemia infecciosa equina y su aplicacion. | |
| EP0651806B1 (en) | Anti-feline immunodeficiency virus (fiv) vaccines | |
| CA2099069C (en) | Recombinant feline herpesvirus vaccine | |
| CN109999191B (zh) | 一种鸡毒支原体新型基因工程亚单位疫苗 | |
| Kyaw-Tanner et al. | The induction of in vivo superinfection and recombination using feline immunodeficiency virus as the model | |
| EP0606452B1 (en) | Vector vaccines of recombinant feline herpesvirus | |
| Jiang et al. | Nucleotide sequence of gene 5 encoding the inner capsid protein (VP6) of bovine group C rotavirus: comparison with corresponding genes of group C, A, and B rotaviruses | |
| ES2264128T3 (es) | Vacuna para la peritonitis infecciosa felina. | |
| WO1996001116A9 (en) | Chicken infectious anemia virus vaccine | |
| Chang et al. | Comparative sequence analysis of the VP7 genes of G6, G8 and G10 bovine group A rotaviruses and further characterization of G6 subtypes | |
| WO1994002613A1 (en) | Anti-feline immunodeficiency virus (fiv) vaccines | |
| ES2252918T3 (es) | Cepa fiv-141 del virus de la inmunodeficiencia felina y sus usos. | |
| CN115197969B (zh) | 一种治疗乙型肝炎的慢病毒载体、慢病毒颗粒及其制备方法和应用 | |
| CN111729078B (zh) | 鸡传染性贫血病毒基因工程疫苗 | |
| JP3531880B2 (ja) | 新規ネコ免疫不全ウイルス株及びその外被膜蛋白質遺伝子ｒｎａに対応するｄｎａ並びにネコ免疫不全ウイルスワクチン |