CN1059701C

CN1059701C - 马传染性贫血病驴白细胞弱毒株及其培育方法

Info

Publication number: CN1059701C
Application number: CN96103323A
Authority: CN
Inventors: 沈荣显; 徐振东; 何云生; 张盛兴; 董君平; 王振漪; 吴文芳; 戴玉坤
Original assignee: Harbin Veterinary Research Institute of CAAS
Current assignee: Harbin Veterinary Research Institute of CAAS
Priority date: 1996-04-03
Filing date: 1996-04-03
Publication date: 2000-12-20
Anticipated expiration: 2016-04-03
Also published as: CN1134458A

Abstract

本发明是一种制造马传贫弱毒株及其培育方法，是把中国辽系马传贫强毒在驴体上多次继代后，从而获得对驴敏感的驴传贫强毒株，再用驴白细胞在体外培养，驯化而成马传贫驴白细胞弱毒疫苗株。利用本方法制造的疫苗能够预防马传染性贫血症，在制造疫苗的过程中，把马传贫毒种接种在驴白细胞上培养，在接种后第5-7天有80%左右发生明显变圆老化、脱落，与对照组差异明显的情况下放入-20～-25℃低温反复冻融二次，即可收获。

Description

马传染性贫血病驴白细胞弱毒株及其培育方法

本发明是一种用于防制马传染性贫血病的弱毒株及其培育方法。

马传贫是由逆转录病毒科慢病毒亚科的马传贫病毒引起的一种马属动物的传染病，它严重危害马、骡、驴等马属动物，主要表现高热稽留或间歇热、贫血、出血、黄疸、心脏衰弱、浮肿和消瘦等症状。病畜终生带毒，传染快，死亡多，世界各国广泛流行此病，给养马业造成了严重的经济损失。目前世界上防制马传贫主要靠检疫后进行扑杀的措施，这种方法达不到控制和消灭此病的目的，必须采用安全有效的疫苗接种马匹来预防。世界各国还没有人工免疫预防马传贫的疫苗。

本发明的目的是研制一种人工免疫预防马传贫的疫苗。并能有效地控制和预防马传染性贫血病。

马传贫弱毒疫苗的种毒培育。在收集和查阅了国内外有关马传贫方面的资料后，在实验室进行了病马的再接毒试验，证明马传贫病马再接毒后，有短期保护作用，取得了马传贫病毒具有较好免疫原性的科学数据，在此基础上，我们用在我国分离到的马传贫强毒，并通过本动物驯化，培育成对马、驴能引起典型发病死亡的马传贫强毒接种到体外培养的驴白细胞上，进行培养继代，改变病毒的生存条件，使之遗传基因发生改变。经过118代-135代的培育、驯化获得了一株毒力弱、免疫原性好、可以用于制造马传贫疫苗的驴白细胞弱毒株。

一种马传贫驴白细胞弱毒疫苗株，其特征在于是把中国辽系马传贫强毒通过驴体多次继代后获得对驴敏感的驴传贫强毒株再用驴白细胞在体外培育，驯化而成马传贫驴白细胞弱毒疫苗株，DLVF₁₂₁、DLVF₁₂₀、DLVF₁₂₃、DLVF₁₂₄、DLVF₁₂₅，这毒株的五代已于1996年1月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物保藏中心，保藏号为CGMCCNo0250。

一种马传贫驴白细胞弱毒疫苗株的培育方法其特征在于由下列步骤实现：

(1)、供试动物：从非马传贫疫区采购马、驴，使用前至少健康观察3个月，经多次血清学和临床检查无传贫病毒感染者。

(2)、驴传贫强毒株的培育：系用中国辽系马传贫强毒通过驴体多次继代而培育出驴传贫强毒株，用发病驴血清毒(毒价10^-6×1毫升)可使驴和马典型发病或死亡。

(3)、驴传贫强毒株通过驴白细胞培养继代

(a)驴白细胞培养：每头驴在采血的同时，用增菌培养进行检查，要求驴血无菌。无菌采血收集在盛有抗凝剂的瓶中，置室温20～30分钟，析出的上层血浆以虹吸方法吸至离心瓶，以每分钟100～1200转离心十分钟，然后收集沉淀于瓶底的细胞并加培养液制成细胞悬液，分装于培养瓶内，置37℃静止培养。具有代表性的药品配方：健康牛无菌血清和赛氏液(氯化钠、氯化钾、醋酸钠、葡萄糖、碳酸氢钠、无离子水以及柠檬酸三钠等)。

(b)接种病毒：在驴白细胞培养24～48小时后，选择生长良好的细胞，吸出旧培养液，换以新培养液，按5％量接种毒，继续培养，逐日观察并登记，凡细胞生长异常、污染的瓶应废弃。

(c)收获：凡接毒的细胞在接毒后第4～5天有80％左右发生明显老化，变圆、脱落，与对照差异明显的培养瓶即可收获，并放-20℃～-25℃低温冻结后放室温融化如此反复冻融两次后收获。以继续作为弱毒株继代的毒种。

(4)、驴白细胞弱毒株对驴白细胞毒力的滴定：用细胞半数感染量(TCID50/ml)等试验方法对驴白细胞进行毒力滴定，其对驴白细胞的TCID50/mL为7.0。

(5)、驴白细胞弱毒株对马属动物的安全稳定性：弱毒株接种马、驴后无任何马传贫反应，剖检也无任何病理学变化，弱毒株免疫马的含毒材料对马进行多次返祖试验不能恢复原来的毒力；不引起健康马的同居感染；接种母马所生幼驹进行生物学试验证明不带毒传染。

(6)、驴白细胞弱毒株对马属动物的免疫性：弱毒株接种马、驴后出现明显的体液与细胞免疫应答。出现血清抗体阳转率一般可达90％以上，在接种后第21天大部分出现补反、琼扩抗体，在2个月达到高峰后阳转率逐渐下降。中和抗体在接种后第60天开始出现，第180天阳转率为100％，能长期持续很少变动。接种马、驴用同源强毒攻击，马可保护80％以上，驴为100％，对异源性强毒攻击，也具有同样的保护力，但免疫产生时间较晚，驴为3个月，马为6个月较好，对马的免疫持续期长达三年以上。

(7)、驴白细胞弱毒疫苗株的保存性：冻干的弱毒株在15℃～20℃可保存3个月，在0～4℃可保存6个月；在-15℃～-20℃可保存2个月。

本发明的优点是利用本发明培育的疫苗注射马属动物后安全性好并能产生良好的免疫效果。能够控制和预防马传染性贫血病。

附图为疫苗的制造和检验图。

以下结合附图对本发明作进一步描述。

1、原材料检测包括以下内容：

(1)胎牛血清的检验

检验项目被检因子检验方法检验结果

牛粘膜病抗体免疫荧光试验阴性地方流行性牛白血病抗体琼脂凝胶免疫扩散试验阴性

布氏杆菌病抗体试管凝集试验阴性

补体结合试验阴性牛传染性鼻气管炎抗体血清中和试验阴性

口蹄疫抗体补体结合试验阴性

牛暂时热抗体免疫荧光试验阴性

补体结合试验阴性

支原体菌体 (1)牛心汤、马丁汤培养阴性

(2)鸡胚接种后转牛心汤、阴性

马丁汤培养

抗体平板凝集试验阴性

(2)、驴白细胞供体驴的检测

检验项目被检因子检验方法检验结果

变态反应阴性

鼻疽

试管凝集试验阴性马副伤寒流产

抗体 (1)琼脂凝胶免疫扩散阴性

马传贫

(2)补体结合试验阴性

(3)ELISA间接法阴性

血液学常规正常

临床常规正常

(3)、驴白细胞组织培养物的检验检验项目检验方法检验结果病毒粒子电子显微镜观察(1)未接毒对照细胞：无病毒粒子

(2)接马传贫弱毒细胞：无非马传贫病毒粒子疱疹病毒免肾细胞培养无疱疹病毒生长

2、种毒：

3、培养细胞：驴白细胞培养，每头驴在采血的同时，用增菌培养进行细菌检查，要求驴血无菌。将驴放倒用水洗净全身，从动脉全放血，将血液放入装有抗凝剂(肝素或柠檬酸钠溶液)的大瓶中，随放随摇动，然后将采血瓶放在室温20-30分钟后，析出的上层血浆，以虹吸方法移至离心瓶中，第一次以原液离心，第二次加赛氏液混合均匀离心，每次约以每分钟300-1000转离心10分钟，然后收集沉淀于瓶底部的细胞，加培养液(赛氏液与牛血清1∶1)制成细胞悬液，分装于培养瓶内37℃静止或转瓶培养。大量制苗时，可将多头驴的细胞混合培养。

4、疫苗制造：培养24-48小时后，吸出旧培养液，换以新鲜培养液。选择细胞生长良好者按3％量接种病毒，然后加牛血清放回原处，继续培养。逐日观察并登记，凡细胞生长异常、污染的瓶应废弃。

凡接毒组的细胞，在接种后第5-7天有80％左右发生明显变圆老化、脱落，与对照组差异明显的培养瓶放入-20～-25℃低温条件下，反复冻融二次，即可收获。

为了防止大批疫苗混入杂菌，先按每10～20瓶混合一组进行无菌检验，无菌者再将同一代次，同一培养条件的疫苗充分混合组成一批(20,000-30,000毫升)。

5、分装：混合的疫苗在无菌条件下分装小瓶，装置40-100毫升。放-20～-25℃冻结保存。每瓶疫苗应贴标签，注明名称、批准文号、批号、装量、用法、制造日期、保存方法、有效期、检验号码及厂名。

6、检验：每批疫苗按1％瓶数抽检(不够100瓶抽检3瓶)。以改良沙氏培养基或不滴定pH普通琼脂2管，每管接种原苗0.2ml，放20-30℃培养。另以马丁肉汤及厌气肉肝汤各1瓶，分别接种原苗0.5-1ml，放37℃培养3日后，自厌气肉肝汤小瓶中吸取0.1-0.3ml培养物，移植于血琼脂斜面和厌气肉肝汤各1管；自马丁肉汤小瓶中吸取0.1-0.3ml培养物，移植于血琼脂斜面和马丁肉汤各1管，共培养观察7-10日应无菌生长。每批混合苗均需做补反抗原性检查，其效价应不低于2.0。每批疫苗需用培养的驴白细胞进行毒力测定，其毒价应不低于10⁵TCID/ml。

7、冷冻干燥：-40℃冻结，慢升温至28℃，保温16小时。

8、安全效力检查：检验用马须来自非传贫疫区，经3个月的定时测温，3次以上血清学检查阴性，无传贫临床症状，营养良好的2-3岁健康马。疫苗混批20,000毫升以上的用4匹马，20,000毫升以下的用3匹马，每匹马一律皮下注射5毫升。在接种后观察3个月，每天测温2次，每20天做血清学检查一次，当体温升温高达39℃以上或出现临床异常症状时做血清学检查。被检马无传贫症状或其它疫病者，认为疫苗安检合格，血清学阳转达2/3～3/4者，认为效价合格。在被检马中如个别马匹出现传贫发病或其他疫病，难以判定者，对同批疫苗可做重检，再有同样结果，则该批疫苗废弃。

马匹患马传染性贫血病后，传染快、死亡率高，给养马业造成了严重的经济损失。利用本发明的疫苗免疫马匹，能够预防马传染性贫血病，安全有效，减少了经济损失。

马传贫毒种的特性：用该毒种制造的疫苗注射马属动物的反应特性为：

1.一般无任何临床反应，过敏反应为百万分之5～7；

2.无任何病理组织学变化；

3.十四天后出现沉淀抗体反应，2个月达到高峰，此后下降。一年后仅有10～20％的马匹保持抗体阳性。注苗马产生的抗体与病马的不同，可以鉴别开。

4.疫苗弱毒在动物体内可持续6个月，6个月后动物脏器和外周血内均无弱毒存在；

5.注苗后3个月开始对强毒的攻击保护作用，6个月后达到最佳状态；

6.对马的保护率达85％，对驴的保护率100％；

7.马的保护性免疫持续期测到3年零9个月，仍不降低。

8.在马传贫流行区的健康马注苗后，经三年观察无马传贫病发生。疫苗的保存性为：-20℃～50℃暗处保存一年，0～4℃暗处保存不超过两周。本疫苗的使用时间选在非蚊虻活动季，用稀释液将疫苗稀释后立即使用，在颈部皮下注射2ml，注苗动物在监视下观察4小时后无过敏反应可即进行使疫或比赛。

Claims

1、一种马传贫驴白细胞弱毒疫苗株，其特征在于是把中国辽系马传贫强毒通过驴体多次继代后获得对驴敏感的驴传贫强毒株再用驴白细胞在体外培育，驯化而成马传贫驴白细胞弱毒疫苗株，DLVF₁₂₁DLVF₁₂₀DLVF₁₂₃DLVF₁₂₄DLVF₁₂₅，这毒株的五代已于1996年1月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物保藏中心，保藏号为CGMCCNo 0250。

2、一种马传贫驴白细胞弱毒疫苗株的培育方法，其特征在于由下列步骤实现：

(1)供试动物：从非马传贫疫区采购马、驴，使用前至少健康观察3个月，经多次血清学和临床检查无传贫病毒感染者；

(2)驴传贫强毒株的培育：系用中国辽系马传贫强毒通过驴体多次继代而培育出驴传贫强毒株，用发病驴血清毒(毒介10^-6×1毫升)可使驴和马典型发病或死亡；

(3)驴传贫强毒株通过驴白细胞培养继代

(a)驴白细胞培养：每头驴在采血的同时，用增菌培养进行检查，要求驴血无菌；无菌采血收集在盛有抗凝剂的瓶中，置室温20-30分钟，析出的上层血浆以虹吸方法吸至离心瓶，以每分钟1000-1200转离心十分钟，然后收集沉淀于瓶底的细胞并加培养液制成细胞悬液，分装于培养瓶内，置37℃静止培养；具有代表性的药品配方：健康牛无菌血清和赛氏液(氯化钠、氯化钾、醋酸钠、葡萄糖、碳酸氢钠、无离子水以及柠檬酸三钠等)；

(b)接种病毒：在驴白细胞培养24-48小时后，选择生长良好的细胞，吸出旧培养液，换以新培养液，按5％量接种毒，继续培养，逐日观察并登记，凡细胞生长异常、污染的瓶应废弃；

(c)收获：凡接毒的细胞在接毒后第4-5天有80％左右发生明显老化，变圆、脱落，与对照差异明显的培养瓶即可收获，并放-20℃-25℃低温冻结后放室温融化如此反复冻融两次后收获，以继续作为弱毒株继代的毒种；

(4)驴白细胞弱毒株DLVF₁₂₁DLVF₁₂₀DLVF₁₂₃DLVF₁₂₄DLVF₁₂₅保藏号为CGMCC No 0250对驴白细胞毒力的滴定，用细胞半数感染量(TCID50/ml)等试验方法对驴白细胞进行毒力滴定，其对驴白细胞的TCID50/ml为7.0；

(5)驴白细胞弱毒株对马属动物的安全稳定性：弱毒株接种马、驴后无任何马传贫反应，剖检也无任何病理学变化，弱毒株免疫马的含毒材料对马进行多次返祖试验不能恢复原来的毒力；不引起健康马的同居感染，接种母马所生幼驹进行生物学试验证明不带毒传染；

(6)驴白细胞弱毒株对马属动物的免疫性：弱毒株接种马、驴后出现明显的体液与细胞免疫应答，出现血清抗体阳转率一般可达90％以上，在接种后第21天大部分出现补反、琼扩抗体，在2个月达到高峰后阳转率逐渐下降，中和抗体在接种后第60天开始出现，第180天阳转率为100％，能长期持续很少变动；接种马、驴用同源强毒攻击，马可保护80％以上，驴为100％，对异源性强毒攻击，也具有同样的保护力，但免疫产生时间较晚，驴为3个月，马为6个月较好，对马的免疫持续期长达三年以上；

(7)驴白细胞弱毒疫苗株的保存性：冻干的弱毒株在15℃-28℃可保存3个月，在0℃-4℃可保存6个月；在-15℃-20℃可保存2个月。