CN107893057A - 鸡传染性支气管炎病毒弱毒株及其构建方法和应用 - Google Patents

鸡传染性支气管炎病毒弱毒株及其构建方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了鸡传染性支气管炎病毒弱毒株及其构建方法和应用。本发明以田间分离的QX‑Like基因型的鸡传染性支气管炎强毒株作为母本，经鸡胚连续传代100多代，获得了致弱的毒株，其微生物保藏编号为：CGMCC No.13292，该弱毒株基因组的S1序列为SEQ ID No.1所示。本发明构建的弱毒株免疫鸡后无死亡，并且无明显的组织器官病变和临床症状，说明所构建的弱毒株对鸡安全，安全性良好；该弱毒株对鸡只免疫后的攻毒保护率为80％～100％，具有良好的免疫原性；毒力返强试验证明，该弱毒株的毒力未增强，遗传性稳定，适合作为防控鸡传染性支气管炎的疫苗株或种毒。

Description

鸡传染性支气管炎病毒弱毒株及其构建方法和应用
技术领域
本发明涉及鸡传染性支气管炎病毒(Infectious Bronchitis Virus)弱毒株，进一步涉及该鸡传染性支气管炎病毒弱毒株所制备的活疫苗及其在防治鸡传染性支气管炎疾病中的应用，属于鸡传染性支气管炎的防治领域。
背景技术
鸡传染性支气管炎(Infectious Bronchitis,IB)是由病毒引起的鸡的一种急性、高度接触传染性的呼吸道疾病。它主要侵害呼吸系统、泌尿生殖系统和消化系统，其特征为咳嗽、喷嚏、气管啰音、幼鸡流鼻涕、蛋鸡的产蛋数量和质量下降，并能直接导致雏鸡死亡、肾脏病变和输卵管永久性退化。本病呈世界性分布，对养鸡业的危害极大。
由于IBV存在众多的血清学，抗原变异快，一个变异株产生的抗体对其他血清型没有或仅有部分交叉保护力，因此必须根据当今IBV流行的趋势，采用抗原性一致的弱毒疫苗或多价疫苗联合免疫，争取获得最佳的免疫保护效果。
目前中国市场使用的疫苗主要有H120株、H52株、M41株、LTD3株等。H120株、H52株是中国从荷兰引进的Mass株型疫苗株，对中国大部分血清型的IBV流行毒株有较好的免疫保护效果，主要用于呼吸道型IB的预防，并对某些肾型毒株有一定的交叉免疫保护作用，是中国现在使用最广的两个疫苗株。M41株毒力较强，一般应用于灭活疫苗的制备。LTD3株是中国农业科学院哈尔滨兽医研究所刘胜旺研究员利用中国流行毒株致弱而成，目前在市场上使用较少。
但是近年来不断报道免疫过H120株活疫苗的鸡群爆发鸡传染性支气管炎，而且呈现更高的致病性和致死率，而遗传进化分析发现这些毒株大部分为类QX型。
因此研制一株类QX株的鸡传染性支气管炎病毒弱毒株并进一步将其制备成防治(类QX)鸡传染性支气管炎弱毒疫苗，这对于鸡传染性支气管炎的防治将具有积极的效果。
发明内容
本发明的目的之一是构建一株鸡传染性支气管炎病毒弱毒株；致弱后的IBV弱毒株与现流行的鸡传染性支气管炎病毒基因型匹配，但致病力大大减弱，对1日龄鸡只安全，免疫原性良好，适合做鸡传染性支气管炎活疫苗的毒株。
本发明的目的之二是将所构建的鸡传染性支气管炎病毒弱毒株制备成活疫苗应用于防治鸡传染性支气管炎。
本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：
本发明采用SPF鸡胚为病毒传代载体，以目前流行的QX-Like基因型鸡IBV HC13-91株为致弱母本，连续传代150代，测定其基因序列，并在鸡中连续继代5代，发现毒力未返强，最终获得了鸡传染性支气管炎病毒弱毒株HC13-91株，其S1序列为SEQ ID No.1所示。
本发明将构建的鸡传染性支气管炎病毒弱毒株HC13-91株提交专利认可的机构进行保藏，其微生物保藏编号为：CGMCC No.13292；分类命名为：鸡传染性支气管炎病毒；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏时间是2016年12月24日；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
安全性试验证实，本发明所构建的鸡传染性支气管炎病毒弱毒株弱毒株HC13-91株免疫鸡后无死亡，并且无明显的组织器官病变和临床症状，对鸡是安全的。
本发明所构建的鸡传染性支气管炎病毒弱毒株弱毒株HC13-91株经过毒力返强试验，毒力未增强，遗传性稳定。
免疫保护效力试验证明，本发明所构建的鸡传染性支气管炎病毒弱毒株弱毒株HC13-91株对鸡只免疫后的攻毒保护率为80％～100％。
本发明进一步公开了所述的鸡传染性支气管炎病毒弱毒株HC13-91株在制备防治鸡传染性支气管炎活疫苗中的应用。
本发明还公开了一种防治鸡传染性支气管炎的疫苗组合物，包括：预防上有效量的所述和药学上可接受的佐剂。
本发明还公开了一种防治鸡传染性支气管炎活疫苗的制备方法，包括以下步骤：
(1)将所述的鸡传染性支气管炎病毒弱毒株HC13-91株在鸡胚中进行扩大培养；
(2)收获扩大培养病毒液并加入冻干保护剂，真空冻干得到活疫苗；
本发明是以田间分离的QX-Like基因型的鸡传染性支气管炎强毒株作为母本，经鸡胚连续传代100多代，获得了经证实为已致弱的毒株；安全性试验证实，该鸡传染性支气管炎病毒弱毒株弱毒株HC13-91株免疫鸡后无死亡，并且无明显的组织器官病变和临床症状，对鸡是安全的；免疫保护效力试验证明，本发明所构建的鸡传染性支气管炎病毒弱毒株弱毒株HC13-91株对鸡只免疫后的攻毒保护率为80％～100％，具有良好的免疫原性；毒力返强试验证明，该弱毒株的毒力未增强，遗传性稳定，适合作为防控鸡传染性支气管炎的疫苗株。
附图说明
图1本发明所构建的鸡传染性支气管炎病毒弱毒株HC13-91株S1基因序列的遗传进化树。
具体实施方式
以下结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1鸡传染性支气管炎病毒弱毒株弱毒株HC13-91株的构建和鉴定
(1)病毒鉴定
以目前流行的QX-Like基因型鸡IBV HC13株为致弱母本，使用有限稀释法对HC13株进行纯化，将最高稀释度出现卷曲、体重变小的鸡胚尿囊液作为下次接种的毒种，依次进行3次纯化(P1～P3)。3次纯化完成后，将纯化后的尿囊液接种10日龄SPF鸡胚进行传代(P4)，并用分子生物学测定其S1基因和血清学的方法对尿囊液进行鉴定。
血清学与分子生物学基因遗传进化分析结果均显示，HC13株以及致弱后的HC13-91株均为QX-Like基因型的毒株，与现流行的毒株类型匹配。如图1所示。
(2)连续传代
使用9～11日龄SPF鸡胚对HC13毒株进行连续传代致弱。将病毒用PBS进行10-3稀释后用0.22μm滤膜进行过滤，通过尿囊腔接种5～6枚鸡胚，每胚接种200μL，置37℃电热恒温培养箱中孵育，P4-P50代，观察72h(弃去24h内非特异性死胚)，每日观察鸡胚2次，如果鸡胚在24～72h内死亡，则取出置4℃冰箱保存；P51-P70代，观察40-48h(弃去24h内非特异性死胚)，如果鸡胚在24～48h内死亡，则取出置4℃冰箱保存；P71-P100代观察20-24h(弃去24h内非特异性死胚)。观察记录鸡胚病变情况，无菌收集鸡胚尿囊液进行下一次传代。每胚收集2ml，同时每胚收集200μL进行混合，选择混合液进行传代。将收集病毒保存于-70℃冰箱备用。
(3)病毒纯化
在病毒连续传代过程中，每隔9-11代纯化一次。当传至91～96代时，测定其EID50。取8个无菌的试管,依次标记，先向每个管内加入4.5ml的灭菌PBS；然后取0.5ml的传代毒混合液加入1号管内、混匀，依次作10倍倍比稀释；选择5个稀释倍数(104～108)的病毒悬液接种9～11日龄的SPF鸡胚,每枚鸡胚接种100μl,每个稀释度接种5～6枚鸡胚；将鸡胚置37℃温箱内孵育6d，每天照胚2次，如果鸡胚在24h～144h内死亡，则取出置4℃冰箱保存。144h将所有鸡胚取出置4℃1h，无菌收集鸡胚尿囊液，每胚收集2ml，观察记录鸡胚病变情况，对所有鸡胚进行称重，选择144h未死，但病变典型，体重较低、尿囊液清亮的鸡胚进行传代，该鸡胚所收集的尿囊液即为纯化毒。统计144h内鸡胚的感染数，按Reed-Muench法计算EID50。表1为91～96代次的EID50。
表1 HC13-91株91～96代次的EID50
本发明将鸡传染性支气管炎病毒株HC13-91株传代至P91代次所获得的致弱毒株提交专利认可的机构进行保藏，其微生物保藏编号为：CGMCC No.13292。
试验例1鸡传染性支气管炎病毒弱毒株弱毒株HC13-91株的安全性试验
1日龄SPF鸡分别用HC13毒株的P91-P96代鸡胚毒进行滴鼻点眼途径接种。自接种之日起，每天观察、记录接种鸡群的发病情况、死亡情况，对死亡鸡进行剖检，观察IBV靶器官、组织的病理变化。结果表明，P91～P96代次对1日龄SPF鸡都是安全的。
表2 IBV HC13-91株P91-P96次毒株安全性试验结果汇总
试验例2鸡传染性支气管炎病毒弱毒株弱毒株HC13-91株的免疫原性试验
为了研究IBV HC13株致弱后代次的免疫原性，将致弱后的毒株代次P91和P96代滴鼻点眼SPF鸡只，在接种后第21日，所有鸡只用HC13株P4代尿囊液滴鼻点眼攻毒。攻毒后第5日，做气管环纤毛摆动试验，并剖检所有鸡只。
表3 IBV HC13-91株P91和P96代纤毛摆动试验结果汇总
结果表明，致弱后的P91和P96代具有良好的免疫原性。
试验例3鸡传染性支气管炎病毒弱毒株弱毒株HC13-91株的毒力返强试验
取1日龄SPF雏鸡10只，通过点眼方式接种IBV HC13株高代次P91的10倍稀释的含毒尿囊液，每只0.1ml(含有105.0EID50以上)，同时另取10只不免疫作为对照组。接种后第5天，通过放血的方式处死(防止损伤气管等组织)，采集接种组所有鸡只的气管和肾脏，将全部采样组织加入5ml PBS，研磨后，冻融三次，离心取上清，过滤后分装三管(分别用于继代、病毒含量检测及备用)，-80℃下冷冻保存。将组织上清液依据以上方法，进行第2次、第3次和第4次继代。第5次继代和安全性比较实验：取1日龄SPF雏鸡35只，传代组15只，接种IBVHC13株高代次P91第4代继代的组织上清液；参比每组10只，通过点眼方式分别接种P91代10倍稀释的含毒尿囊液，接种后5天，对传代组各取5只鸡，剖杀采集气管和肾脏组织。试验组所有剩余鸡只，连同对照组10只鸡，观察临床症状至接种后21日，对所有鸡剖检观察病变。
第5次传代和安全性比较试验结果显示，传代组和参比组在观察期内，鸡只都未发生死亡，剖检未出现明显病变，证明IBV HC13株P91代在宿主间连续五代直接传染，病毒毒力未发生变化。
对致弱后的HC13-91株P91～P96代进行外源病毒、细菌和支原体等检测，结果显示均合格。
以上实验结果说明，HC13-91株的P91-P96代经致弱后，对鸡只安全，免疫原性良好，无外源病毒，无支原体，无细菌，在鸡体上连续传代5代未发生毒力返强，能够作为活疫苗的毒种。
SEQUENCE LISTING
<110> 北京华都诗华生物制品有限公司
<120> 鸡传染性支气管炎病毒弱毒株及其构建方法和应用
<130> BJ-3002-170609A
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1665
<212> DNA
<213> Infectious Bronchitis Virus
<400> 1
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Claims (8)

1.一株鸡传染性支气管炎病毒(Infectious Bronchitis Virus)弱毒株，其特征在于：其微生物保藏编号为：CGMCC No.13292。
2.按照权利要求1所述的鸡传染性支气管炎病毒弱毒株，其特征在于：其基因组的S1序列为SEQ ID No.1所示。
3.权利要求1所述的鸡传染性支气管炎病毒弱毒株在制备防治鸡传染性支气管炎疫苗中的用途。
4.按照权利要求3所述的用途，其特征在于：所述的疫苗是活疫苗。
5.一种防治鸡传染性支气管炎的疫苗组合物，其特征在于：含有防治上有效量的权利要求1所述的鸡传染性支气管炎病毒弱毒株和药学上可接受的佐剂或辅料。
6.按照权利要求5所述的疫苗组合物，其特征在于：所述的辅料是冻干保护剂。
7.一种制备防治鸡传染性支气管炎活疫苗疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将权利要求1所述的鸡传染性支气管炎病毒弱毒株进行扩大培养；
(2)收获扩大培养病毒液并加入冻干保护剂混合均匀，冻干得到活疫苗。
8.按照权利要求7所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)中将权利要求1所述的鸡传染性支气管炎病毒弱毒株在鸡胚中进行扩大培养。
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