CN105169380A - 一种兔病毒性出血症和多杀性巴氏杆菌病二联蜂胶灭活疫苗及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于动物疫苗制备技术领域，具体的说，是关于一种兔病毒性出血症和多杀性巴氏杆菌病二联蜂胶灭活疫苗及其制备方法，其采用兔病毒性出血症病理组织悬液和兔多杀性巴氏杆菌菌液抗原，经兔病毒性出血症生产用毒种制备、兔病毒性出血症病理组织悬液的制备、兔多杀性巴氏杆菌生产用种子制备、兔多杀性巴氏杆菌制苗菌液的制备、蜂胶乙醇浸出液的制备、二联蜂胶灭活疫苗的配制，从而完成二联蜂胶灭活疫苗的制备。本发明的二联蜂胶灭活疫苗对兔病毒性出血症的免疫保护率为100％，对多杀性巴氏杆菌病的免疫保护率为90％，疫苗保存期长，同时联合配苗有效的简化免疫程序、节省劳动力，降低免疫成本。

Description

一种兔病毒性出血症和多杀性巴氏杆菌病二联蜂胶灭活疫苗及其制备方法

技术领域

本发明属于动物疫苗制备技术领域，具体的说，是关于一种兔病毒性出血症和多杀性巴氏杆菌病二联蜂胶灭活疫苗及其制备方法。

背景技术

兔病毒性出血症又称兔瘟，是由兔病毒性出血症病毒引起家兔的一种急性高度接触性传染病，以呼吸系统出血，实质器官水肿、淤血、出血变化为特征。本病1984年春首次发现于我国江苏省，迅速蔓延至全国，之后世界各地均有发生。本病常呈暴发性流行，发病率及死亡率极高，给世界养兔业带来了巨大危害，是目前规模化兔场的主要传染病之一。

兔多杀性巴氏杆菌病是由兔多杀性巴氏杆菌引起兔的一种接触性、急性传染病，由于病原感染部位不同而呈现败血症、传染性鼻炎、地方流行性肺炎、中耳炎、结膜炎、子宫积脓、睾丸炎和脓肿等病症。我国大部分地区都有对该病的报道，证明兔多杀性巴氏杆菌病在我国已经存在和流行，随着养兔业的迅速发展，本病的发生呈上升趋势。急性发病时常引起家兔大批量死亡，造成兔生长缓慢、饲料报酬降低或大批死亡及药物防治费用增加等，给养兔业造成了严重的直接或间接经济损失，是目前规模化养兔场的主要细菌性传染病之一。

蜂胶作为中国新型绿色免疫佐剂，具有产生免疫保护快速、坚实、高效，免疫保护期长等优点，对食品安全性高，与其他种类疫苗相比，具有一定的优势。由于蜂胶本身具有良好的防腐抑菌效果，因此在疫苗中不添加硫柳汞等防腐剂，减少疫苗中外源物质的引入，增加疫苗的安全性。蜂胶疫苗的特殊超微结构使得其结构稳定，耐热抗冷，提前中和抗体的产生，延长免疫保护期等一系列优点。其中专利文献CN101732704A公开一种兔病毒性出血症、多杀性巴氏杆菌病二联灭活疫苗的制法，此发明专利中加入防腐剂硫柳汞，造成了多杀性巴氏杆菌病免疫保护率稍低。综上所述，需要开发一种有效的疫苗以解决上述问题。

发明内容

本发明的目的提供一种兔病毒性出血症和多杀性巴氏杆菌病二联蜂胶灭活疫苗，该疫苗免疫保护率高，疫苗保存期长，同时有效的简化免疫程序、节省劳动力，降低免疫成本。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种兔病毒性出血症和多杀性巴氏杆菌病二联蜂胶灭活疫苗，包括抗原和佐剂，其特征在于，所述的抗原为兔病毒性出血症病理组织悬液和兔多杀性巴氏杆菌菌液，配苗时每毫升疫苗中含灭活的兔病毒性出血症病理组织≥0.05g，兔多杀性巴氏杆菌菌数≥2.0×10⁹CFU/mL，所述佐剂为蜂胶乙醇浸出液，配苗时每毫升疫苗中蜂胶干物质含量为8～15mg。

进一步地，所述的二联蜂胶灭活疫苗中不含有硫柳汞。

一种兔病毒性出血症和多杀性巴氏杆菌病二联蜂胶灭活疫苗的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)兔病毒性出血症生产用毒种制备：将毒种稀释后接种健康易感染的家兔，无菌采集接种后24～72h濒死或刚死亡的且具有典型病理变化的肝脏组织经检验合格后，保存作为生产用毒种备用；

(2)兔病毒性出血症病理组织悬液的制备：取生产用毒种进行接种采毒后，无菌条件下称量采毒的肝脏组织，加适量的pH7.2磷酸盐缓冲液或生理盐水进行捣碎或研磨、过滤后得组织悬液。按组织悬液总量的0.1％～0.5％加入甲醛溶液，充分混合后装入无菌容器中，密封后置37℃灭活48h，得到兔病毒性出血症病理组织悬液，并进行灭活检验、血凝价检验及病毒含量测定；

(3)兔多杀性巴氏杆菌生产用种子制备：取冻干菌种依次进行一级种子和二级种子繁殖，经纯粹检验合格后，置于2～8℃保存，备用；

(4)兔多杀性巴氏杆菌制苗菌液的制备：按发酵罐容积总量的70％装入培养基，同时按培养基总量的0.01％～0.02％加入消泡剂，培养基经蒸汽高压灭菌后，待其温度降至37℃左右时，按培养基总量的2％～3％接入二级种子液，并加入0.1％裂解血球全血，混合均匀后置37℃进行培养14～16h，得到的菌液进行纯粹检验及活菌计数合格后，按菌液总量的0.1％～0.5％加入甲醛溶液，充分混匀，37℃灭活48h，间隔4～6h搅拌1次，得兔多杀性巴氏杆菌制苗用菌液；

(5)蜂胶乙醇浸出液的制备：将蜂胶置-15℃冷冻24h以上，再用冷冻粉碎机磨碎过筛，按1:4(W/V)的比例加入95％乙醇，37℃浸提48～72h，冷却、过滤，即得纯净蜂胶乙醇浸出液；

(6)二联蜂胶疫苗的配制：先将注射用水置配苗乳化罐中，然后加入兔病毒性出血症病理组织悬液和兔多杀性巴氏杆菌菌液，1500～3000rpm搅拌5～10min，然后缓慢加入蜂胶乙醇浸出液，1500～3000rpm搅拌15～20min，使其充分混合乳化，即得二联蜂胶灭活疫苗。

进一步地，所述的步骤(1)中毒种为兔病毒性出血症病毒BZ株，所述的步骤(3)中冻干菌种为兔多杀性巴氏杆菌JN株。

进一步地，所述的步骤(2)中组织与磷酸盐缓冲液或生理盐水的比例为1:9(W/V)。

进一步地，所述的步骤(2)中兔病毒性出血症病毒血凝价检验结果HA≥1:128，且兔病毒性出血症病毒含量≥10^6.67LD₅₀时才可用于配苗。

进一步地，所述的步骤(4)中的培养条件为开始小气量通气，逐渐增大通气量，pH为7.2～7.6，通气量为5～6L/min，搅拌速度控制在100～150转/分。。

进一步地，所述的步骤(4)中每毫升菌液中活菌数≥6.0×10⁹CFU/mL。

进一步地，所述的步骤(5)中蜂胶浸出液的蜂胶含量＞50％。

进一步地，所述的步骤(6)中兔多杀性巴氏杆菌菌液、兔病毒性出血症病理组织悬液、蜂胶乙醇浸出液及注射用水的用量是根据预配苗的总量、菌液浓度结果、兔病毒性出血症病理组织量以及蜂胶乙醇浸出液的浓度计算所得。

关于疫苗的免疫持续期，用实验室制备疫苗在兔场进行免疫期试验，结果表明该疫苗的免疫持续期：二联蜂胶灭活疫苗和单苗免疫试验兔6个月后，进行攻毒保护试验，结果均能对实验动物提供良好的免疫保护。

关于疫苗的保存期，将采用本发明方法制备而成的疫苗存放在2-8℃和室温下保存15个月。以1个使用剂量存放15个月后免疫试验兔，进行攻毒保护试验，均得到保护，这充分证明在上述保存条件和保护期内，疫苗质量没有发生变化。

关于疫苗的最小免疫剂量，发明人在研制过程中进行了疫苗对家兔的最小免疫剂量的测定，同时设相应非免疫兔作为对照。免疫后14天进行攻毒保护试验，结果证实该疫苗最小免疫剂量为0.5mL。考虑临床注射的方便及生产成本、免疫效果保证，将该免疫使用量定为1mL。

本发明的有益效果是：二联蜂胶灭活疫苗能减少免疫注射产生的应激性，省时省力，且能获得优良的免疫保护率，结合实际生产带来很大的便利。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明的兔病毒性出血症和多杀性巴氏杆菌病二联蜂胶灭活疫苗及其制备方法作进一步详细说明。

毒种与菌种来源：①毒种：兔病毒性出血症病毒BZ株，由山东华宏生物工程有限公司实验室王晓丽、王永明分离提供；②菌种：兔多杀性巴氏杆菌JN株，由山东华宏生物工程有限公司实验室王晓丽、王永明分离提供。

培养基：10％绵羊鲜血琼脂平板及斜面，含0.1％裂解血球和4％胎牛血清的马丁琼脂平板，马丁肉汤等培养基，由实验室自制。

试验动物：2月龄以上对兔病毒性出血症和兔多杀性巴氏杆菌病易感健康兔由实验动物房提供。

主要试剂：氯化钠(分析纯)、甲醛溶液、蜂胶乙醇提取液由山东华宏生物工程有限公司提供。

实施例1二联蜂胶疫苗的制备

1、兔病毒性出血症制苗用组织悬液的制备

接种取生产用毒种，用灭活生理盐水10倍稀释后，每只生产用试验兔颈部皮下注射1mL。无菌条件下收获接种后24～96h濒死或刚死亡兔的肝脏组织，逐只进行病理检查，若有异常病变的肝脏应予废弃。采毒后应立即用于配苗或迅速冻结。在-10℃保存，不超过15d；-20℃以下保存，不超过50d。无菌条件下，称取收获的肝脏组织，加适量生理盐水进行捣碎，然后经胶体磨研磨，组织与稀释液的最终比例为1:4。按照乳剂总量的0.1～0.5％加入甲醛溶液，充分混合后装入无菌容器中,密封后置37℃灭活48h，间隔4～6h搅拌1次。

2、兔多杀性巴氏杆菌制苗用菌液的制备

①一级种子的繁殖与鉴定：将生产用冻干菌种接入含0.1％裂解血球全血的马丁肉汤中，37℃培养24h，然后划线接种于含10％裂解血球全血及4％健康动物血清的改良马丁琼脂平板上，37℃培养24h，挑取5～10个典型菌落，接种10％裂解血球全血琼脂斜面若干支，置37℃培养18～24h，作为一级种子。在2～8℃保存，使用期限不超过14d，在培养基上传代，不超过5代。

②二级种子的繁殖：取一级种子接种于含0.1％裂解血球全血马丁肉汤中，置37℃培养24h，经纯粹检验合格后，置2～8℃保存，使用期限不超过4d。

③菌液培养：采用微生物发酵罐通气培养。按发酵罐容积总量的70％加入适量培养基及消泡剂，按培养基量的2％～3％接入二级种子液，以逐渐增大通气量的方法进行培养，培养条件控制在pH值为7.2～7.6，通气量为5～6L/min，培养期间搅拌2～3次，搅拌速度控制在100～200r/min，置37℃培养18～24h，收获菌液，置2～8℃保存备用。

3、蜂胶乙醇提取液的制备

生产用蜂胶在低温中贮存，应用时先将蜂胶在-15℃冷冻24h以上，再用冷冻粉碎机磨碎过筛，按1:4(W/V)的比例加入95％乙醇，37℃浸提48～72h，冷却、过滤，即得纯净蜂胶乙醇浸出液(透明栗色溶液)，蜂胶含量＞50％即可使用。

4、二联苗的配制与分装

按每毫升疫苗中含灭活的兔多杀性巴氏杆菌菌数≥2.0×10⁹CFU/mL，兔病毒性出血症病理组织≥0.05g，蜂胶干物质含量为8～15mg标准，根据预配苗的总量、菌液浓度结果、兔病毒性出血症病理组织量以及蜂胶乙醇浸出液的浓度，分别计算出所需兔多杀性巴氏杆菌菌液、兔病毒性出血症病理组织悬液、蜂胶乙醇浸出液及注射用水的量。先将所需量的注射用水置配苗乳化罐中，然后加入所需量的兔病毒性出血症病理组织悬液和兔多杀性巴氏杆菌菌液，1500～3000rpm搅拌5～10分钟，然后缓慢加入蜂胶乙醇浸出液，1500～3000rpm搅拌15～20分钟，使其充分混合乳化，检验合格后分装、加塞、压盖。

实施例2二联蜂胶疫苗的无菌检验

分别在分装前、中、后随机取各批二联疫苗5瓶样品，按照《中华人民共和国兽用生物制品规程》附录448页进行无菌检验，结果均无菌生长。

实施例3二联蜂胶疫苗的安全检验

随机抽取各批次疫苗5瓶样品，各批次样品混匀后取样分别皮下注射1.5kg左右的试验用兔4只，每只皮下注射4.0mL，观察10d，全部健活。

实施例4二联蜂胶疫苗的效力检验

取5批二联疫苗检样，每批注射20只健康易感试验兔，每只皮下注射1.0mL，另取20只健康易感兔作为对照。免疫后14d取每批10只免疫兔和同等饲养条件下的10只对照兔，分别皮下注射病毒含量为10^5.0LD₅₀BZ株强毒1mL及一个致死量的兔多杀性巴氏杆菌JN株强度菌液(2～5CFU)，各观察14d后，5批疫苗分别免疫试验兔，对兔病毒性出血症的保护率为100％，对照组死亡率为100％。兔巴氏杆菌组平均保护率≥90％，对照组死亡率为100％(见表1、表2)。

表1兔病毒性出血症组免疫后14日攻击病毒含量10^5.0LD₅₀BZ株(1mL)

表2兔多杀性巴氏杆菌组免疫后14日攻击菌数含量3CFUJN株(1mL)

实施例5二联蜂胶灭活疫苗的区间试验

将5批疫苗分派山东多家兔场进行免疫注射，观察结果。根据兔场反馈信息得知，注射疫苗后，兔群精神状态良好，食欲正常，无不良反应，且兔场在免疫后6个月内没有暴发兔病毒性出血症和兔多杀性巴氏杆菌病，同时鼻炎和结膜炎症状也明显减少。

实施例6二联蜂胶灭活疫苗的最小免疫剂量试验

以200903001批疫苗进行二联蜂胶灭活疫苗的最小免疫剂量试验。

取60只试验兔，随机分为A、B、C，3组，每组20只；另取对照组20只，分为2组，每组10只；A组免疫注射疫苗0.25mL/只，B组免疫注射疫苗0.5mL/只，C组免疫注射疫苗1.0mL/只，每个剂量组各注射20只，对照组D组20只不接种疫苗。免疫14天后，分别进行攻毒试验，结果为兔病毒性出血症、多杀性巴氏杆菌病二联蜂胶灭活疫苗的最小免疫剂量为0.5mL/只(见表3、表4)。考虑到疫苗的运输和保存、临床注射时的方便以及确保临床免疫效果，将该疫苗的临床使用剂量确定为1.0mL/只。

表3200903001批疫苗对兔病毒性出血症病毒BZ株的最小免疫剂量试验结果

表4200903001批疫苗对兔多杀性巴氏杆菌JN株的最小免疫剂量试验结果

Claims (9)

1.一种兔病毒性出血症和多杀性巴氏杆菌病二联蜂胶灭活疫苗，包括抗原和佐剂，其特征在于，所述的抗原为兔病毒性出血症病理组织悬液和兔多杀性巴氏杆菌菌液，配苗时每毫升疫苗中含灭活的兔病毒性出血症病理组织≥0.05g，兔多杀性巴氏杆菌菌数≥2.0×10⁹CFU/mL，所述佐剂为蜂胶乙醇浸出液，配苗时每毫升疫苗中蜂胶干物质含量为8～15mg。

2.根据权利要求1所述的二联蜂胶灭活疫苗，其特征在于，所述的二联蜂胶灭活疫苗中不含有硫柳汞。

3.一种兔病毒性出血症和多杀性巴氏杆菌病二联蜂胶灭活疫苗的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)兔病毒性出血症生产用毒种制备：将毒种稀释后接种健康易感染的家兔，无菌采集接种后24～72h濒死或刚死亡的且具有典型病理变化的肝脏组织经检验合格后，保存作为生产用毒种备用；

(2)兔病毒性出血症病理组织悬液的制备：取生产用毒种进行接种采毒后，无菌条件下称量采毒的肝脏组织，加适量的pH7.2磷酸盐缓冲液或生理盐水进行捣碎或研磨、过滤后得组织悬液。按组织悬液总量的0.1％～0.5％加入甲醛溶液，充分混合后装入无菌容器中，密封后置37℃灭活48h，得到兔病毒性出血症病理组织悬液，并进行灭活检验、血凝价检验及病毒含量测定；

(3)兔多杀性巴氏杆菌生产用种子制备：取冻干菌种依次进行一级种子和二级种子繁殖，经纯粹检验合格后，置于2～8℃保存，备用；

(4)兔多杀性巴氏杆菌制苗菌液的制备：按发酵罐容积总量的70％装入培养基，同时按培养基总量的0.01％～0.02％加入消泡剂，培养基经蒸汽高压灭菌后，待其温度降至37℃左右时，按培养基总量的2％～3％接入二级种子液，并加入0.1％裂解血球全血，混合均匀后置37℃进行培养14～16h，得到的菌液进行纯粹检验及活菌计数合格后，按菌液总量的0.1％～0.5％加入甲醛溶液，充分混匀，37℃灭活48h，间隔4～6h搅拌1次，得兔多杀性巴氏杆菌制苗用菌液；

(5)蜂胶乙醇浸出液的制备：将蜂胶置-15℃冷冻24h以上，再用冷冻粉碎机磨碎过筛，按1:4(W/V)的比例加入95％乙醇，37℃浸提48～72h，冷却、过滤，即得纯净蜂胶乙醇浸出液；

(6)二联蜂胶疫苗的配制：先将注射用水置配苗乳化罐中，然后加入兔病毒性出血症病理组织悬液和兔多杀性巴氏杆菌制苗菌液，1500～3000rpm搅拌5～10min，然后缓慢加入蜂胶乙醇浸出液，1500～3000rpm搅拌15～20min，使其充分混合乳化，即得二联蜂胶灭活疫苗。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤(2)中组织与磷酸盐缓冲液或生理盐水的比例为1:9(W/V)。

5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤(2)中兔病毒性出血症病毒血凝价检验结果HA≥1:128,且兔病毒性出血症病毒含量≥10^6.67LD₅₀时才可用于配苗。

6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤(4)中的培养条件为开始小气量通气，逐渐增大通气量，pH为7.2～7.6，通气量为5～6L/min，搅拌速度控制在100～150转/分。

7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤(4)中每毫升菌液中活菌数≥6.0×10⁹CFU/mL。

8.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤(5)中蜂胶浸出液的蜂胶含量＞50％。

9.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤(6)中兔多杀性巴氏杆菌制苗用菌液、兔病毒性出血症病理组织悬液、蜂胶乙醇浸出液及注射用水的用量是根据预配苗的总量、菌液浓度结果、兔病毒性出血症病理组织量以及蜂胶乙醇浸出液的浓度计算所得。