CN101708332A

CN101708332A - 兔三联灭活疫苗及其制备方法和应用

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Publication number: CN101708332A
Application number: CN200910224025A
Authority: CN
Inventors: 姜力; 吴金; 丁国杰; 白同臣; 马世华; 曲河; 甘一迪; 藏玉婷; 杨万秋; 胡瑛瑛; 崔艳丽
Original assignee: HARBIN PHARMACEUTICAL GROUP BIOLOGICAL VACCINE CO Ltd
Current assignee: HARBIN PHARMACEUTICAL GROUP BIOLOGICAL VACCINE CO Ltd
Priority date: 2009-11-30
Filing date: 2009-11-30
Publication date: 2010-05-19

Abstract

本发明公开了兔三联灭活疫苗及其制备方法和应用。本发明兔三联灭活疫苗主要由灭活脱毒后的兔病毒性出血症病毒液、兔多杀性巴氏杆菌苗菌液和兔A型产气荚膜梭菌苗菌液按照1∶1∶2的体积比所组成。本发明通过优化培养工艺、浓缩工艺及免疫剂量等手段，获得一种具有良好免疫效力和安全性的兔三联灭活疫苗，可有效控制兔病毒性出血症、多杀性巴氏杆菌病、产气荚膜梭菌病(A型)的发生，减少养殖户注射疫苗的次数，从而降低动物的应激反应，提高生产性能。临床应用证实，本发明兔三联灭活疫苗免疫效果理想，家兔接种疫苗2ml/只，免疫后5-7天即可产生免疫力，免疫期至少持续180天，免疫安全性良好，无毒副作用。

Description

兔三联灭活疫苗及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种动物灭活疫苗，尤其涉及一种兔三联灭活疫苗及其制备方法，本发明还涉及该兔三联灭活疫苗在预防兔病毒性出血症、多杀性巴氏杆菌病或/和产气荚膜梭菌病(A型)中的应用，属于动物灭活疫苗领域。

背景技术

兔病毒性出血症是由杯状病毒引起的一种急性、致死性传染病，本病发病急、病程短、传播快、流行广，2月龄以上家兔均易感，无明显季节性，其发病率和死亡率可高达100％。该病一旦爆发，将给养兔业造成巨大经济损失。兔多杀性巴氏杆菌病是一种多型性疾病，以A型兔多杀性巴氏杆菌病为主，急性病例的发病率和死亡率均很高，慢性病例虽然死亡率不高，但因治愈困难而经济损失巨大。由于本病尤其是慢性病例的药物治疗效果不明显，一旦巴氏杆菌病在兔场发生就很难清除本病，因此，使用疫苗控制本病便成为一种行之有效的办法。兔A型产气荚膜梭菌病是一种急性消化道传染病，是我国家兔急性腹泻的主要病源，通过消化道或损伤黏膜进入动物体内。发病诱因包括饲养不当，青饲料短缺，粗纤维含量低，长途运输，气温骤变等。除哺乳仔兔外，不同年龄、品种、性别的家兔对本病均易感。以1-3周龄仔兔发病率最高，本病一年四季均可发生，以冬春两季常见。近年来在我国不少地区均有发生，该病以急性剧烈腹泻和迅速死亡为主要特征，其发病率可高达90％，死亡率高达100％，由于使用药物很难治疗本病，造成的经济损失不容低估，因而该病应使用疫苗控制。由于这三种疾病是目前养兔业危害最为严重的疾病，因此，有关兔病毒性出血症、兔多杀性巴氏杆菌病和兔A型产气荚膜梭菌病疫苗的研究工作一直备受国内外学者关注。

纵观国内外有关兔病毒性出血症、兔巴氏杆菌病和兔产气荚膜梭菌病疫苗的研究现状，其防制疫苗均为灭活疫苗，其中兔病毒性出血症疫苗均为组织灭活疫苗。值得关注的是国内家兔疫苗多为单苗，要防几种疾病，必须分几次进行注射，增加了动物的应激反应，降低生产性能。针对该问题，现已有少量联苗，但多为二联苗，如：兔病毒性出血症、巴氏杆菌病二联灭活疫苗，兔巴氏杆菌病、产气荚膜梭菌病二联灭活疫苗等。目前国内仍没有兔病毒性出血症、多杀性巴氏杆菌病、产气荚膜梭菌病(A型)三联灭活疫苗产品。从佐剂类型上看，主要有普通水剂疫苗、铝胶佐剂疫苗和蜂胶佐剂疫苗，油佐剂疫苗较少见，在实际应用中这些疫苗均取得了较为理想的防制效果。

发明内容

本发明首先所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种安全性好、可同时有效预防兔病毒性出血症、兔多杀性巴氏杆菌病和兔产气荚膜梭菌病(A型)的兔三联灭活疫苗。

本发明首先所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：

一种兔三联灭活疫苗，主要由灭活脱毒的兔病毒性出血症病毒液、灭活脱毒的兔多杀性巴氏杆菌苗菌液和灭活脱毒的兔A型产气荚膜梭菌苗菌液按照1∶1∶2的体积比所组成。

为了达到更好的免疫或保护效果，优选的，每只份疫苗中含A型产气荚膜梭菌数不低于2×10⁷CFU/ml；每只份疫苗中含兔多杀性巴氏杆菌数不低于5.0×10⁹CFU/ml。

更优选的，所述的灭活脱毒后的兔病毒性出血症病毒液是将所制备的兔病毒性出血症病毒原液稀释50倍后的稀释液。

本发明所要解决的另一个技术问题是提供一种制备上述兔三联灭活疫苗的方法；

本发明所要解决的另一个技术问题是通过以下技术方案来实现的：

一种制备上述兔三联灭活疫苗的方法，包括：

(1)分别制备兔病毒性出血症病毒液、兔多杀性巴氏杆菌苗菌液和兔A型产气荚膜梭菌苗菌液；将兔病毒性出血症病毒液灭活脱毒后的原液稀释50倍，备用；将兔多杀性巴氏杆菌苗菌液灭活脱毒后的原液浓缩2倍，备用；将兔A型产气荚膜梭菌苗菌液灭活脱毒后的原液浓缩4倍，备用；

(2)将上述步骤所制备的兔病毒性出血症病毒液、兔多杀性巴氏杆菌苗菌液和兔A型产气荚膜梭菌苗菌液按照1∶1∶2的体积进行配苗，加入硫柳汞至混合物总体积的0.005％，充分混匀，即得；

优选的，所述兔病毒性出血症病毒液可参考以下方法制备得到：

一、生产用毒种制备

将兔病毒性出血症病毒毒种(例如可以是兔病毒性出血症病毒AV33株)稀释后接种健康易感的家兔；无菌采集接种后24-72h濒死或刚死亡且有典型病理变化家兔的肝、脾经检验合格后，保存作为生产用毒种备用；

二、制苗用病毒液的制备

取生产用毒种稀释，每只家兔皮下注射(优选为2ml)；接种后24-96h内濒死或刚死亡家兔，无菌采取肝、脾、肾、心、肺作为制苗材料；无菌剔除各脏器的脂肪与结缔组织，称重，加pH 7.2的磷酸盐缓冲液或生理盐水进行捣碎或研磨，过滤，离心取上清液，即得。

所述兔多杀性巴氏杆菌苗菌液可优选按照以下方法制备得到：

一、生产用种子制备

1、一级种子繁殖

(1)取A型多杀性巴氏杆菌冻干菌种(例如，可以是A型多杀性巴氏杆菌C51-2株)接种含0.1％裂解血球全血的马丁肉汤，置36-37℃培养18-24h；优选的，按培养基总量的3％-7％的接种量，将兔A型多杀性巴氏杆菌C51-2株接种于含0.1％裂解全血的改良马丁肉汤中，于37℃通气培养10-24h；更优选的，按培养基总量的5％的接种量，将兔A型多杀性巴氏杆菌C51-2株接种于含0.1％裂解全血的改良马丁肉汤中，于37℃通气培养12-16h；

(2)取样划线接种含0.1％裂解血球全血及4％健康动物血清的改良马丁琼脂平板，选取5个以上典型菌落，接种鲜血琼脂斜面若干支，置36～37℃培养18-24h，作为一级种子备用；

二、二级种子繁殖

取一级种子接种含0.1％裂解血球全血的马丁肉汤中，置36-37℃培养18～24h，经纯粹检验合格后，置2-8℃保存，备用；

三、制苗用菌液的制备

用培养罐或玻璃瓶通气培养，按培养容器容积装入培养基及消泡剂，灭菌后按培养基总量的3-5％接种二级种子液，并加入0.1％裂解血球全血，采用逐渐增大通气量的方法，于36-37℃通气培养12-16h，即得；

优选的，所述的兔A型产气荚膜梭菌菌液按照以下方法制备得到：

一、生产用种子制备

1、一级种子繁殖

(1)取兔A型产气荚膜梭菌冻干菌种(例如，可以是兔A型产气荚膜梭菌C57-1株)接种肉肝胃酶或胃膜消化汤，置36-37℃培养18-20h；

优选的，按培养基总体积的1％-5％的接种量，将A型产气荚膜梭菌C57-1株接种于肉肝胃酶消化汤中，培养前对培养基进行驱氧，降低培养基的氧化还原电位，于35℃-39℃下培养6h-10h；更优选的，按培养基总体积1％的接种量，将A型产气荚膜梭菌C57-1株接种于肉肝胃酶消化汤中，于37℃下培养7h；

(2)取样接种于普通琼脂斜面、普通肉汤、厌气肉肝汤或石蕊牛奶，培养48h，作为一级种子备用；

二、二级种子繁殖

取一级种子接种肉肝胃酶或胃膜消化汤，置36-37℃培养7h，置2-8℃保存；

三、制苗用菌液的制备

按培养基总体积的1％加入10％硫乙醇酸钠溶液，并按总体积的5％加入7.5％碳酸氢钠溶液，调pH至7.8-8.0；再按培养基总体积的2％-3％接入二级种子，置36-37℃培养7h，即得。

本发明兔病毒性出血症、多杀性巴氏杆菌病、产气荚膜梭菌病(A型)三联灭活疫苗为浓缩油佐剂灭活疫苗，通过采用优化培养工艺、浓缩工艺及免疫剂量等手段，获得一种具有良好免疫效力和安全性的兔三联灭活疫苗，可有效控制兔病毒性出血症、多杀性巴氏杆菌病、产气荚膜梭菌病(A型)的发生。

本发明以三个兔场作为实验基地，应用兔病毒性出血症、多杀性巴氏杆菌病、产气荚膜梭菌病(A型)三联灭活疫苗，对不同生产阶段的健康兔4000只/场进行免疫效力试验及安全性试验。临床应用证实，该疫苗免疫效果理想，家兔接种疫苗2ml/只，免疫后5-7天即可产生免疫力，免疫期至少持续180天，免疫安全性良好，无毒副作用，应用该疫苗具有较好的免疫效力和安全性，可有效控制兔病毒性出血症、多杀性巴氏杆菌病、产气荚膜梭菌病(A型)的发生。

本发明疫苗可以实现一次注射防治兔三种疾病的功效，减少了养殖户注射疫苗的次数，降低动物的应激反应，提高生产性能。

附图说明

图1本发明兔三联灭活疫苗的工艺流程图。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实验材料

1.菌种

兔病毒性出血症病毒AV33株、兔A型多杀性巴氏杆菌C51-2株和兔A型产气荚膜梭菌C57-1株均购自中国兽医药品监察所。

2.制苗用动物

体重1.5kg以上的健康易感家兔，来源于哈药集团生物疫苗有限公司实验动物场。

3.制苗用培养基

(1)改良马丁肉汤培养基配方

牛肉汤 500ml

猪胃消化液 500ml

氯化钠 2.5g

(2)肉肝胃膜消化汤

牛肉 100g

牛肝(或猪、羊肝) 50-70g

猪胃(或猪、羊肝) 100g

盐酸 10-12ml

蒸馏水(或去离子水) 1000ml

(3)肉肝胃酶消化汤

牛肉 200g

牛肝(或猪、羊肝) 100g

盐酸 12-15ml

胃蛋白酶(1∶3000) 3.6g

蒸馏水(或去离子水) 1200ml

实施例1本发明兔三联灭活疫苗的制备

1.兔病毒性出血症病毒AV33株病毒液的制备

1.1生产用毒种制备

将毒种用pH 7.2磷酸盐缓冲液或生理盐水作10倍稀释，接种健康易感体重1.5kg以上的家兔，每只皮下注射1ml。无菌采集接种后24-72h濒死或刚死亡，且有典型病理变化家兔的肝、脾经检验合格后，保存作为生产用毒种备用。毒种继代不超过3代。

1.2制苗用病毒液的制备

取生产用毒种，用无菌生理盐水作10倍稀释，每只家兔皮下注射2ml。接种后24-96h内濒死或刚死亡家兔，无菌采取肝、脾、肾、心、肺作为制苗材料，并逐只进行病理检查，如有异常病变组织，应废弃。无菌剔除各脏器的脂肪与结缔组织，称重，加适量的磷酸盐缓冲液(pH 7.2)或生理盐水进行捣碎或研磨，用5号筛过滤。组织与稀释液的最终比例为1∶9，经离心取上清液。

1.3灭活

按组织悬液重量的0.4％加入甲醛溶液，充分混合后，置37℃灭活48h，间隔4-6h振摇1次。灭活后取样，用健康易感体重1.5kg以上的家兔2只，每只皮下注射4ml，观察3日，应全部健活。将检验合格病毒液置2-8℃保存备用。

2.兔A型多杀性巴氏杆菌C51-2株菌液的制备

2.1生产用种子制备

(1)一级种子繁殖

取A型多杀性巴氏杆菌冻干菌种，接种含0.1％裂解血球全血的马丁肉汤，置36-37℃培养18-24h，然后划线接种含0.1％裂解血球全血及4％健康动物血清的改良马丁琼脂平板，选取5个以上典型菌落，接种鲜血琼脂斜面若干支，置36～37℃培养18-24h，作为一级种子备用。菌种继代不超过5代。

(2)二级种子繁殖

取一级种子接种含0.1％裂解血球全血的马丁肉汤中，置36-37℃培养18～24h，经纯粹检验合格后，置2-8℃保存，使用期不超过4日。

2.2制苗用菌液的制备

用培养罐或玻璃瓶通气培养，按培养容器容积装入适量培养基(70％左右)及消泡剂，灭菌后按培养基总量的3-5％接种二级种子液，并加入0.1％裂解血球全血，以逐渐增大通气量的方法，于36-37℃通气培养12-16h。

2.3灭活

按菌液总量的0.4％加入甲醛溶液，经37℃灭活10-12h。其间搅拌数次。然后用马丁琼脂做灭活检验，应无菌生长。

2.4菌液浓缩

将合格菌液以无菌的7.5％氢氧化钠溶液调pH值至6.8-7.2，然后按菌液9份加灭菌氢氧化铝胶1份，置2-8℃，静置2-3日，弃全量1/2的上清液，剩余菌液置2-8℃保存备用。

3.兔A型产气荚膜梭菌(C57-1株)菌液的制备

3.1生产用种子制备

(1)一级种子繁殖

取冻干菌种接种肉肝胃酶(或胃膜)消化汤，置36-37℃培养18-20h，然后分别取样，接种普通琼脂斜面、普通肉汤、厌气肉肝汤和石蕊牛奶各2管，每管0.2ml，培养48h，作为一级种子备用。在培养基上继代，不超过5代。

(2)二级种子繁殖

取一级种子接种肉肝胃酶(或胃膜)消化汤，置36-37℃培养7h，置2-8℃保存，使用期不超过5日。

3.2制苗用菌液的制备

按培养基总量的1％加入10％硫乙醇酸钠溶液，并按总量的5％加入7.5％碳酸氢钠溶液，调pH至7.8-8.0(灭菌后)。再按培养基总量的2％-3％接入二级种子，置36-37℃培养7h。

3.3灭活与脱毒

取样后，按菌液总量0.8％加入甲醛溶液，充分振摇后，置36-37℃灭活脱毒5日。每日早、中、晚各振摇1次。

3.4菌液浓缩

将检验合格菌液按12份菌液加灭菌氢氧化铝胶1份的比例充分混合，置2～8℃静置10日，弃全量3/4的上清液，剩余菌液置2-8℃保存备用。

4.配苗

将检验合格的兔病毒性出血症病毒液、多杀性巴氏杆菌浓缩菌液和产气荚膜梭菌浓缩菌液按1∶1∶2的体积比例混合，并按总体积的0.005％加入硫柳汞，充分混匀。

5.分装

经无菌检验合格后，混合组批，定量分装。分装时应随时搅拌，使其混合均匀。

试验例1A型产气荚膜梭菌培养工艺优化试验

按培养基总重量的1％、3％和5％的接种量，将A型产气荚膜梭菌C57-1株接种于肉肝胃酶消化汤中，培养前要对培养基进行驱氧，尽量降低培养基的氧化还原电位，分别于35℃，37℃，39℃下培养6h，7h，8h，10h，之后提取每组的毒素，分别测定小白鼠的最小致死量，以确定最佳产毒条件。

试验结果发现：37℃培养7h，1％的接种量制备兔A型产气荚膜梭菌苗菌液，培养条件最佳。

试验例2A型产气荚膜梭菌菌液浓缩工艺实验及免疫剂量的优化试验

对A型产气荚膜梭菌菌液灭活后，用铝胶吸附浓缩原倍、2倍和4倍后制备疫苗，以0.25ml/只、0.5ml/只、1.0ml/只、1.5ml/只、2.0ml/只5个不同免疫剂量免疫健康易感1.5-2kg家兔，免疫后21天进行攻毒试验，确定最佳的免疫剂量及浓缩倍数。

试验结果发现：当A型产气荚膜梭菌菌液原液进行4倍浓缩时，每只份疫苗中含A型产气荚膜梭菌数不低于2×10⁷CFU/ml，此时，免疫动物可以100％的达到保护，因此原液进行4倍浓缩用于配苗最为理想。

试验例3兔多杀性巴氏杆菌培养工艺优化试验

按培养基总重量的3％、5％和7％的接种量，将兔A型多杀性巴氏杆菌C51-2株接种于含0.1％裂解全血的改良马丁肉汤中，培养添加为逐渐增大通气量的方法，于37℃通气培养10h，14h，18h，20h，22h和24h，活菌涂布法进行活菌计数，测定菌液中细菌数量，以确定最佳培养条件。

试验结果发现：37℃培养12-16h，5％的接种量制备兔多杀性巴氏杆菌苗菌液，培养条件最佳。

试验例4兔多杀性巴氏杆菌菌液铝胶浓缩生产工艺及免疫剂量筛选试验

对兔多杀性巴氏杆菌菌液灭活后，用铝胶吸附浓缩原倍、2倍和4倍后制备疫苗，以0.2ml/只、0.3ml/只、0.4ml/只、0.5ml/只、1.0ml/只5个不同免疫剂量免疫健康易感1.5-2kg家兔，免疫后21天进行攻毒试验，确定最佳的免疫剂量及浓缩倍数。

试验结果发现：当兔多杀性巴氏杆菌菌液原液进行2倍浓缩时，每只份疫苗中含兔多杀性巴氏杆菌数不低于5.0×10⁹CFU/ml时，此时，免疫动物可以100％的保护动物，因此原液进行2倍浓缩用于配苗最为合理。

试验例5兔病毒性出血症病毒免疫剂量优化试验

将兔病毒性出血症病毒生产用毒种2倍系列稀释，应用凝集试验方法测定毒种的血凝价。将毒种作10倍系列稀释，取10^-2、10^-3、10^-4、10^-5和10^-6稀释度，分别接种体重1.5-2kg家兔，每个稀释度接种4只，每只1ml，然后观察接种各稀释度家兔的死亡情况，并计算病毒半数致死量。

试验结果发现：兔病毒性出血症病毒生产用毒种凝集价为1∶2048，最小致死量LD50为4.75，毒力为10^-4稀释种毒1ml/只，成年家兔接种50倍稀释的病毒灭活悬液1ml，可获得100％保护。

试验例6本发明兔三联灭活疫苗的免疫效力、与单苗的免疫效力比较试验及安全性试验

选择三个兔场作为试验基地，选取不同生长阶段的健康兔4000只/场做试验兔，分别采用实施例1的制备方法分多个批次所制备的兔三联灭活疫苗进行了免疫效力、与单苗的免疫效力比较试验及安全性试验。

1.免疫效力试验

在三个兔场随机选取不同生长阶段的健康非免疫兔3500只/场，同时随机选取同条件的非免疫兔100只作对照，分别对三批疫苗进行免疫效力试验，接种疫苗2ml/只。在免疫后30天、120天、180天，从每批疫苗免疫的试验兔中，分别随机抽取90只免疫兔，平均分成三组，同时选择相应条件的非免疫兔10只做对照兔，用兔病毒性出血症病毒、多杀性巴氏杆菌、产气荚膜梭菌(A型)攻击致死量强毒，试验结果见表1：

表1

注：保护只数/攻毒只数

试验结果表明：

免疫后30天，攻击兔病毒性出血强毒，对照兔全部死亡，免疫兔100％获得保护；攻击多杀性巴氏杆菌，对照兔97％死亡，免疫兔99％获得保护；攻击产气荚膜梭菌菌素，对照兔97％死亡，免疫兔96％获得保护。免疫后120天，攻击兔病毒性出血强毒，对照兔全部死亡，免疫兔100％获得保护；攻击多杀性巴氏杆菌，对照兔95％死亡，免疫兔100％获得保护；攻击产气荚膜梭菌菌素，对照兔全部死亡，免疫兔93％获得保护。免疫后180天，攻击兔病毒性出血强毒，对照兔94％死亡，免疫兔99％获得保护；攻击多杀性巴氏杆菌，对照兔97％死亡，免疫兔97％获得保护；攻击产气荚膜梭菌菌素，对照兔全部死亡，免疫兔95％获得保护。

2.兔三联灭活疫苗与单苗的免疫效力比较试验

选择体重1.5-2kg非免疫健康易感家兔210只，随机分为5组，分别免疫接种3批兔三联灭活疫苗(本发明实施例1所制备)和三批兔病毒性出血症灭活疫苗、多杀性巴氏杆菌灭活疫苗、产气荚膜梭菌(A型)灭活疫苗(按照兔三联灭活疫苗制备的单联灭活疫苗，分别与三批兔三联灭活疫苗用同一批号抗原)，同时在同条件的健康兔作为非免疫对照。在免疫后14天，攻击致死量的兔病毒性出血症强毒1ml，免疫后21天攻击1个致死量的多杀性巴氏杆菌，免疫后21天静脉注射致死量的A型产气荚膜梭菌毒素，试验结果见下表：

表2兔病毒性出血症灭活疫苗免疫效力比较试验结果

注：表中未存活数/攻毒数

表3巴氏杆菌病灭活疫苗免疫效力比较试验结果

注：表中未存活数/攻毒数

表4产气英膜杆菌病灭活疫苗免疫效力比较试验结果

注：表中未存活数/攻毒数

试验结果表明：本发明兔三联灭活疫苗与单联的兔病毒性出血症灭活疫苗、多杀性巴氏杆菌灭活疫苗、产气荚膜梭菌(A型)灭活疫苗相比较，均具有良好的免疫效力，免疫兔可获得有效保护；对于产气荚膜杆菌病以及兔病毒性出血症等免疫效力方面，还要明显优于单联产气荚膜杆菌病灭活疫苗和兔病毒性出血症灭活疫苗。同时，兔三联灭活疫苗可显著减少养殖户注射疫苗的次数，从而降低动物的应激反应，提高生产性能，替代目前市场上的单联灭活疫苗。

3.安全性试验

在三个兔场随机选取不同生长阶段的健康非免疫兔360只/场进行了安全性试验。同时设有不同生产阶段试验兔90只作为对照，三批疫苗安全免疫兔，没有异常的临床症状，注苗部位无炎性变化，生产性能正常，免疫兔和对照兔平均日增重没有显著的差异(P＞0.05)，剖检无病理变化。

临床应用证实，本发明兔三联疫苗免疫效果理想，家兔接种疫苗2ml/只，免疫后5-7天即可产生免疫力，免疫期至少持续180天，免疫安全性良好，无毒副作用，应用该疫苗可有效控制兔病毒性出血症、多杀性巴氏杆菌病、产气荚膜梭菌病(A型)的发生。从临床试验的结果可以确认本发明兔三联灭活疫苗对兔具有免疫力和安全性。

Claims

1.一种兔三联灭活疫苗，其特征在于：主要由灭活脱毒后的兔病毒性出血症病毒液、兔多杀性巴氏杆菌苗菌液和兔A型产气荚膜梭菌苗菌液按照1∶1∶2的体积比所组成。

2.按照权利要求1所述的兔三联灭活疫苗，其特征在于：每只份疫苗中含A型产气荚膜梭菌数不低于2×10⁷CFU/ml；每只份疫苗中含兔多杀性巴氏杆菌数不低于5.0×10⁹CFU/ml。

3.按照权利要求1所述的兔三联灭活疫苗，其特征在于：所述的灭活脱毒后的兔病毒性出血症病毒液是将所制备的兔病毒性出血症病毒原液稀释50倍后所得到的稀释液。

4.一种制备权利要求1-3任何一项所述兔三联灭活疫苗的方法，包括：

(2)将上述步骤所制备的兔病毒性出血症病毒液、兔多杀性巴氏杆菌苗菌液和兔A型产气荚膜梭菌苗菌液按照1∶1∶2的体积进行配苗，加入硫柳汞至混合物总体积的0.005％，充分混匀，即得。

5.按照权利要求4所述的方法，其特征在于，所述兔病毒性出血症病毒液按照以下方法制备得到：

一、生产用毒种制备

将兔病毒性出血症病毒毒种稀释后接种健康易感的家兔；无菌采集接种后濒死或刚死亡且有典型病理变化家兔的肝、脾经检验合格后，保存作为生产用毒种备用；

二、制苗用病毒液的制备

取生产用毒种稀释，每只家兔皮下注射；接种后24-96h内濒死或刚死亡家兔，无菌采取肝、脾、肾、心、肺作为制苗材料；无菌剔除各脏器的脂肪与结缔组织，称重，加磷酸盐缓冲液或生理盐水进行捣碎或研磨，过滤，离心取上清液，即得。

6.按照权利要求4所述的方法，其特征在于，所述兔多杀性巴氏杆菌苗菌液按照以下方法制备得到：

一、生产用种子制备

1、一级种子繁殖

(1)取A型多杀性巴氏杆菌菌株冻干菌种接种含0.1％裂解血球全血的马丁肉汤，置36-37℃培养18-24h；

(2)取样划线接种含0.1％裂解血球全血及4％健康动物血清的改良马丁琼脂平板，选取典型菌落，接种鲜血琼脂斜面，置36～37℃培养18-24h，作为一级种子备用；

二、二级种子繁殖

三、制苗用菌液的制备

用培养罐或玻璃瓶通气培养，按培养容器容积装入培养基及消泡剂，灭菌后按培养基总量的3-5％接种二级种子液，并加入0.1％裂解血球全血，采用逐渐增大通气量的方法，于36-37℃通气培养12-16h，即得。

7.按照权利要求6所述的方法，其特征在于：在一级种子繁殖的步骤(1)中按培养基总重量的3％-7％的接种量，将兔A型多杀性巴氏杆菌菌株接种于含0.1％裂解全血的改良马丁肉汤中，于37℃通气培养10-24h；优选的，按培养基总重量的5％的接种量，将兔A型多杀性巴氏杆菌菌株接种于含0.1％裂解全血的改良马丁肉汤中，于37℃通气培养12-16h。

8.按照权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的兔A型产气荚膜梭菌菌液按照以下方法制备得到：

一、生产用种子制备

1、一级种子繁殖

(1)取兔A型产气荚膜梭菌菌株冻干菌种接种肉肝胃酶或胃膜消化汤，置36-37℃培养18-20h；

(2)取样接种于普通琼脂斜面、普通肉汤、厌气肉肝汤或石蕊牛奶，培养，作为一级种子备用；

二、二级种子繁殖

取一级种子接种肉肝胃酶或胃膜消化汤，置36-37℃培养，置2-8℃保存；

三、制苗用菌液的制备

按培养基总体积的1％加入10％硫乙醇酸钠溶液，并按总体积的5％加入7.5％碳酸氢钠溶液，调pH至7.8-8.0；再按培养基总体积的2％-3％接入二级种子，置36-37℃培养，即得。

9.按照权利要求8所述的方法，其特征在于，在一级种子繁殖的步骤(1)中按培养基总体积的1％-5％的接种量，将A型产气荚膜梭菌菌株接种于肉肝胃酶消化汤中，培养前对培养基进行驱氧，降低培养基的氧化还原电位，于35℃-39℃下培养6h-10h；优选的，按培养基总体积1％的接种量，将A型产气荚膜梭菌菌株接种于肉肝胃酶消化汤中，于37℃下培养7h。

10.权利要求1-3任何一项所述兔三联灭活疫苗在制备预防或治疗兔病毒性出血症、兔多杀性巴氏杆菌病或/和兔A型产气荚膜梭菌病药物中的用途。