CN102600463A

CN102600463A - 鸭传染性浆膜炎三价灭活疫苗的生产方法

Info

Publication number: CN102600463A
Application number: CN2011104310817A
Authority: CN
Inventors: 程增青; 范根成; 郭玉广; 马爽; 申洪银; 刘�东; 胡潇; 孙健
Original assignee: Qingdao Yebio Bioengineering Co Ltd
Current assignee: Qingdao Yebio Bioengineering Co Ltd
Priority date: 2011-12-21
Filing date: 2011-12-21
Publication date: 2012-07-25

Abstract

本发明涉及一种鸭传染性浆膜炎三价灭活疫苗的生产方法。本发明所涉及的疫苗是采用免疫原性良好的鸭疫里默氏杆菌1型YBYN株、2型YBSD株和4型YBRA04株分别接种于适宜培养基，收获培养物，经甲醛溶液灭活后，加入油佐剂混合乳化制成。用于预防由1型、2型和4型鸭疫里默氏杆菌引起的鸭传染性浆膜炎。此疫苗具有安全性好、免疫效力高且免疫期长等优点。

Description

鸭传染性浆膜炎三价灭活疫苗的生产方法

技术领域

本发明涉及一种用于预防由1、2、4型鸭疫里默氏杆菌引起的鸭传染性浆膜炎的油乳剂疫苗制备方法，属于兽用生物制品领域。

背景技术

鸭传染性浆膜炎是由鸭疫里默氏杆菌(Riemerella anatipestifer，RA)引起鸭的一种呼吸系统重要传染病。鸭传染性浆膜炎(Infectious serositis)是由鸭疫里默氏杆菌引起的鸭的一种慢性或急性败血性接触性传染性疾病，又称鸭疫里默氏杆菌病、新鸭病、鸭败血症、鸭疫综合症。主要侵害雏鸭、雏鹅、以及雏火鸡等多种雏禽，以2～7周龄鸭最易感，主要表现为浆膜炎、纤维素性心包炎、肝周炎、气囊炎、脑膜炎等。由于本病的高死亡率和高淘汰率目前已经成为严重危害养鸭业的疾病之一。

对鸭疫里默氏杆菌的血清型分类始于1969年，Harry采用试管凝集试验鉴定出16个血清型(A～P)，几年后美国国立动物疾病中心采用沉淀试验鉴定出7个血清型，以阿拉伯数字命名为1～7型，考虑到命名的标准化以及将来新型的增加，1982年Bisgarrd建议用阿拉伯数字对血清型进行命名，将已有的血清型命名为1～13型。在此基础上Sandhu和Leister对血清型重新进行整理，加上新发现的血清型取名为1～17型，加上后来Lon等报道的18、19型和Pathansophon等报道的20、21型，至此世界上报道的RA血清型共有21型。2003年我国四川农业大学程安春教授等报道了22～25四个新的血清型，进一步丰富了该病的病原学的研究。由于各型毒力有所差异，型间交叉保护性极差或缺少，因此对某地区本病的预防，最好方法是制备与当地相关型疫苗，才能获得最佳的免疫效果。(程安春，等.我国鸭疫里默氏杆菌血清型调查及新血清型的发现.中国畜牧兽医学会禽病学分会第十一次学术研讨会论文集，2004，453-457)。

发明内容

本发明的目的是采用免疫原性良好的鸭疫里默氏杆菌1型YBYN株、2型YBSD株、4型YBRA04株分别接种于适宜培养基，收获培养物，经甲醛溶液灭活后，加入油佐剂混合乳化制成。用于预防由1型、2型和4型鸭疫里默氏杆菌引起的鸭传染性浆膜炎。

一、生产用菌株

1.菌株来源

制造和检验用鸭疫里默氏杆菌1型YBYN株(从云南省鸭场病死鸭的肝脏分离)和2型YBSD株(从山东省鸭场病死鸭脑部分离)和4型YBRA04株(从山东省鸭场病死鸭心脏分离)已于2011年2月25日和2011年11月22日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号：YBYN株为CGMCC No.4615，YBSD株为CGMCC No.4614和YBRA04株为CGMCC No.5485。三株菌株均由本发明人分离、鉴定、保存和供应。

2.毒株特点

(1)形态本菌为革兰氏阴性(G^-)小杆菌，有荚膜、无芽孢、无鞭毛，常单个存在，少数呈双排列，偶见呈长丝状排列，涂片经瑞氏染色，可见部分菌体两端浓染。

(2)生化特性过氧化氢酶、氧化酶、精氨酸脱羧酶试验为阳性，能缓慢液化明胶，靛基质、VP、甲基红、柠檬酸利用、硝酸盐还原试验为阴性，不产生硫化氢，不发酵葡萄糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖。

(3)培养特性本菌在普通琼脂培养基和麦康凯培养基上不生长。初次分离培养，需要供给5％～10％的CO₂。将本菌接种于巧克力琼脂、含3％小牛血清的胰蛋白胨大豆琼脂(改良TSA配方见附注2)，置5％～10％CO₂、37℃培养24～48小时，可生长出圆形微隆起、表面光滑、直径1～2mm无色素菌落。在5％绵羊鲜血琼脂平板上生长但不溶血。在含有3％小牛血清的胰蛋白胨大豆肉汤培养基中，37℃培养24小时，呈上下一致轻微浑浊，管底有少量沉淀，无菌膜。

(4)血清型 YBYN株为血清1型、YBSD株为血清2型、YBRA04株为血清4型。

(5)最小致病菌量能使10只1月龄健康易感鸭至少8只发病的最小致病菌量分别为：YBYN株为1×10⁹CFU、YBSD株为2×10⁸CFU、YBRA04株为2×10⁹CFU。

(6)免疫原性用鸭疫里默氏杆菌1型YBYN株、2型YBSD株、4型YBRA04株灭活菌液按水相∶油相＝1∶2的比例分别制备单价油乳剂灭活疫苗(灭活前各型活菌含量约为9×10¹⁰CFU/ml)，分别颈部皮下注射3-7日龄健康易感鸭10只，0.3ml/只，另设两个非免疫对照组，每组各10只。免疫后14日，连同相同饲养条件下的对照鸭各一组，分别用相应的YBYN株、YBSD株、YBRA04株新鲜菌液腿部肌肉注射攻毒1ml(YBYN株活菌含量约为2×10⁹CFU/ml、2型YBSD株活菌含量约为4×10⁸CFU/ml、4型YBRA04株活菌含量约为4×10⁹CFU/ml)，观察10日，每株菌攻毒后对照组应全部发病(发病判定标准详见附注1)，免疫组应至少9只保护。

二、鸭疫里默氏杆菌三价灭活疫苗的生产方法，主要是：

1.采用发酵罐分别培养1型YBYN株、2型YBSD株、4型YBRA04株。先加入TSB肉汤培养基。对发酵罐进行灭菌，待温度降至37～38℃时，将2～8℃保存的二级种子液分别按2％～2.5％加入到发酵罐内。培养温度控制在37～38℃，搅拌转速为100～200r/min，pH为7.2，罐压为0.03～0.05Pa，容氧量为40％，培养9～10小时收获，留样检验，离心浓缩后将菌泥置2～8℃保存，不超过5日。

2.根据活菌计数结果，将灭活的鸭疫里默氏杆菌1、2、4型菌液均稀释成约9×10¹⁰CFU/ml后等量混合。

3.按常规方法制备成油乳剂灭活疫苗。

本发明的详细描述

一、疫苗制备

1.生产用种子制备

(1)一级种子繁殖与鉴定将1型YBYN株、2型YBSD株、4型YBRA04株的冻干菌种分别接种于巧克力琼脂平板上，置5％～10％CO₂、37℃培养20小时，选典型菌落接种于含3％小牛血清的TSA琼脂斜面，37℃培养24小时，然后接种于TSB肉汤，37℃振荡培养24小时，按15％加入灭菌甘油混匀，定量分装，注明菌株名称、装量、分装日期，经纯粹检验，按中华人民共和国兽药典(中国兽药典委员会.中华人民共和国兽药典二○一○年版(三部).中国农业出版社，2011，本发明简称《中国兽药典》)规定方法进行，合格后，作为一级种子，-20℃保存，保存期不超过3个月。

(2)二级种子繁殖将一级种子划线接种到3％小牛血清的TSA琼脂平板，37℃培养24小时，挑选典型菌落(或菌苔)接种于TSA肉汤，37℃振荡培养24小时，经纯粹检验后，作为二级种子。在2～8℃保存，应不超过48小时。

2.菌液培养采用发酵罐分别培养YBYN株、YBSD株、YBRA04株。先将半合成肉汤培养基进行灭菌，待温度降至37～38℃时，将2～8℃保存的二级种子液分别按2％～2.5％加入到发酵罐内。培养温度控制在37～38℃，搅拌转速为100～200r/min，pH为7.2，罐压为0.03～0.05Pa，容氧量为40％，培养9～10小时收获，留样检验，置2～8℃保存，不超过5日。

3.活菌计数取培养9～10h的菌液1ml，按《中国兽药典》规定方法进行活菌计数，各型活菌含量均应不低于9×10⁹CFU/ml。

4.灭活将检验合格的菌液导入灭活罐中，按菌液体积的0.3％加入甲醛溶液，37℃搅拌灭活20小时，置2～8℃保存，不超过7日。

5.疫苗制备

(1)水相配制取灭菌的吐温-80 4份、无菌检验合格的菌液96份，导入配液罐中，开启搅拌电机，匀速搅拌至吐温-80完全溶解。

(2)油相制备取注射用白油94份、司本-80 6份和硬脂酸铝1份加入油相制备罐中，开启搅拌电机，匀速搅拌，同时开启导热油开关，125℃加热30min，冷却后，导入贮油罐中备用。

(3)乳化取油相2份置于乳化罐内，开动电机低速搅拌，同时缓缓加入水相1份，再以4000r/min乳化30min。乳化后，取样10ml，以3000r/min离心15min，应不分层；若有分层现象，应重新乳化1次。

(4)分装定量分装，加盖密封。

二、疫苗的安全试验

1.鸭传染性浆膜炎三价灭活疫苗对靶动物的一次单剂量接种的安全性试验用本发明人按本法试制的2010001、2010002、2010003三批鸭疫里默氏杆菌三价灭活疫苗对3～7日龄健康易感鸭(购自青岛平度)进行一次单剂量接种安全性试验，0.3ml/只，观察14日，记录疫苗接种对试验鸭的安全性。试验结果表明，本实验室试制的2010001、2010002、2010003批疫苗接种后，试验鸭的精神、饮食与对照鸭无明显差异，接种后14日疫苗吸收良好。说明我们试制的疫苗一次单剂量接种3～7日龄健康易感鸭是安全的(详见表1)。

表1试验鸭一次单剂量接种安全性试验结果

2.对靶动物一次超剂量接种的安全性试验

用本发明人试制的3批(200801、200802、200803)鸭传染性浆膜炎三价灭活疫苗按颈部皮下注射和胸部肌肉注射两种接种途径对3日龄、5日龄、7日龄健康肉鸭分别进行一次超剂量接种，0.6ml/只，同时也对8日龄、10日龄、15日龄健康蛋鸭分别按两种接种途径进行一次超剂量接种，1.0ml/只，观察14日，记录疫苗接种试验鸭的安全性。同时继续观察接种蛋鸭至产蛋，观察接种鸭和对照鸭产蛋率是否存在明显差别。试验结果表明，本实验室试制的3批疫苗按此两种接种途径超剂量接种，对3～7日龄肉鸭和8～15日龄蛋鸭均无明显不良反应，14日疫苗吸收良好，试验鸭增重与对照鸭无明显差异。继续观察接种蛋鸭至产蛋，接种鸭和对照鸭的产蛋率也未见明显差别。说明我们试制的3批疫苗按不同途径对肉鸭和蛋鸭一次超剂量接种都是安全的(详见表2)。

表2试验肉鸭一次超剂量接种安全性试验结果

3.单剂量重复接种安全试验

用本发明人试制的2010001批鸭疫里默氏杆菌三价灭活疫苗对3～7日龄健康易感鸭进行颈部皮下接种，0.3ml/只，于接种后14日、28日再重复注射2次，记录疫苗接种对试验鸭的安全性。试验结果表明，本实验室试制的疫苗单剂量重复接种后，试验鸭的精神、饮食与对照鸭无明显差异。说明我们试制的疫苗单剂量重复接种3～7日龄健康易感鸭是安全的。详见表3

表3试验鸭单剂量重复接种安全性试验结果

4.疫苗接种对靶动物免疫学功能的影响

用本发明人试制的2010002批鸭传染性浆膜炎三价灭活疫苗接种6日龄健康易感鸭，同时接种鸭瘟活疫苗，观察我们制备的疫苗对鸭瘟活疫苗的免疫效力有无影响。试验结果表明，试验鸭无论单独接种鸭瘟活疫苗，还是接种鸭瘟活疫苗后再接种我们研制的鸭传染性浆膜炎三价灭活疫苗，免后14日后所产生攻毒保护效力没有明显差异。该试验结果表明，我们研制的疫苗对试验鸭的免疫学功能没有明显影响。详见表4

表4疫苗接种对鸭免疫学功能影响结果

注：/表示未进行试验

5.疫苗对非使用日龄试验动物的安全性试验

为了检验疫苗对非使用日龄试验动物的安全性，用本发明人试制的2010003批鸭传染性浆膜炎三价灭活疫苗对1日龄健康蛋鸭进行了安全性试验。试验结果表明：疫苗对1日龄健康蛋鸭接种存在一定的不良反应。详见表5

表51日龄试验鸭接种安全性试验结果

三、鸭传染性浆膜炎三价灭活疫苗的交叉保护试验

为了确定本发明人试制的鸭传染性浆膜炎三价灭活疫苗的免疫交叉保护性，分别用鸭疫里默氏杆菌(简称RA)制苗菌株YBYN株、YBSD株、YBRA04株株制备了1、2、4型单价灭活疫苗各1批(批号为：2010003)，免疫3～7日龄健康蛋鸭，颈部皮下注射0.3ml/只，免后14日分别用YBYN株、YBSD株、YBRA04株进行交叉攻毒保护试验，结果表明，鸭疫里默氏杆菌1、2、4型单价疫苗间缺乏交叉保护。详见表6

表6 RA1、2型单价疫苗的型间交叉保护力的测定结果

注：分数表示：健康鸭羽数/攻毒鸭羽数，“/”表示未进行试验。

四、鸭传染性浆膜炎二价灭活疫苗的保存期试验

用本发明人试制的三价灭活疫苗3批(200801、200802、200803)，分别置于2～8℃、室温(20～25℃)及37℃三种条件下保存，间隔一定时间检测疫苗的物理性状并抽样进行效力检验，对免疫后的试验鸭，定期购回，测定对RA-1型、RA-2型和RA-4型的攻毒保护率，确定疫苗保存期。试验结果表明，实验室制备的三批灭活疫苗在2～8℃可以保存18个月；室温可以保存6个月；37℃保存1个月。在上述时间内，灭活疫苗的物理性状没有发生改变，同时免疫效力不变(详见表7和表8)。

表7不同保存条件下疫苗物理性状和安全性检验结果

注：“/”表示未进行此项试验

表8200801、200802、200803三批疫苗的免疫效力

*分数表示：健康鸭只数/攻毒鸭只数

五、疫苗成品检验

(1)性状

外观乳白色乳液。

剂型油包水型。取一清洁吸管，吸取少量疫苗滴于冷水表面，除第一滴外，均应呈油滴状不扩散。

稳定性吸取疫苗10ml加入离心管中，以3000r/min离心15min，管底析出的水相应≤0.5ml。

粘度用1ml吸管(下口内径为1.2mm，上口内径为2.7mm)吸取25℃左右疫苗1.0ml，令其垂直自然流出，记录流出0.4ml所需的时间，应在6s以内。

(2)无菌检验按《中国兽药典》规定方法进行，应无菌生长。

(3)安全检验取3～7日龄的健康易感鸭10只，每只颈部皮下注射疫苗0.6ml，观察14日，应全部健活。

(4)效力检验取3～7日龄健康易感鸭(血清1型、2型、4型鸭疫里默氏杆菌抗体凝集效价均不高于1∶2)60只，随机均分为A、B、C、D、E、F六组，每组10只。A、B、C组为免疫组，每只颈部皮下注射疫苗0.3ml，D、E、F组为非免疫对照组。免后21日，A、D组用活菌量约为2×10⁹CFU/ml的YBYN株菌液1ml腿部肌肉注射攻毒，B、E组用活菌量约为4×10⁸CFU/ml的YBSD株菌液1ml腿部肌肉注射攻毒，C、F组用活菌量约为4×10⁹CFU/ml的YBRA04株菌液1ml腿部肌肉注射攻毒，观察10日，A、B、C组免疫鸭均应至少9只保护，D、E、F组对照鸭均全部发病(发病判定标准详见附注1)。

(5)甲醛残留量测定按《中国兽药典》规定的方法进行测定，应符合规定。

六、疫苗的作用与用途

用于预防由1型和2型鸭疫里默氏杆菌引起的鸭传染性浆膜炎。

七、用法与用量

颈部皮下注射。3～7日龄雏鸭，0.3ml/只，免疫期为4个月；8日龄以上，0.5ml/只，免疫期为6个月。

本发明所涉及的微生物

制造和检验用鸭疫里默氏杆菌1型YBYN株(从云南省鸭场病死鸭的肝脏分离)和2型YBSD株(从山东省鸭场病死鸭脑部分离)和4型YBRA04株(从山东省鸭场病死鸭心脏分离)已于2011年2月25日和2011年11月22日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号：YBYN株为CGMCC No.4615，YBSD株为CGMCC No.4614和YBRA04株为CGMCC No.5485。

本发明的积极意义：

实施例

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的保护范围。

实施例1

1生产用种子制备

1.1一级种子制备将YBYN株、YBSD株和YBRA04株的冻干菌种分别接种于巧克力琼脂平板上，置5％～10％CO₂、37℃培养18～24小时，选典型菌落接种于TSA琼脂斜面，37℃培养24小时，然后接种于TSB培养基，37℃振荡培养24小时，按15％加入灭菌甘油混匀，定量分装，注明菌株名称、装量、分装日期，经纯粹检验合格后，作为一级种子。-20℃保存，使用期不超过3个月。

1.2二级种子制备将一级种子划线接种到TSA琼脂平板，37℃培养18～24小时，挑选典型菌落(或菌苔)接种于TSB培养基，37℃振荡培养24小时，经纯粹检验合格后，作为二级种子。2～8℃保存，使用期不超过48个小时。

2培养基制备按照附注2制备TSB培养基

3菌液培养与浓缩采用发酵罐分别培养YBYN株、YBSD株、YBRA04株。按发酵罐容积60％加入TSB肉汤培养基，同时加入消泡剂，通入高压蒸汽进行灭菌，待温度降至37～38℃时，按2％～2.5％加入二级种子液发酵培养。培养温度控制在37～38℃，搅拌转速为100～200r/min，pH值为7.2～7.4，罐压为0.03～0.05MPa，溶氧量为40％，培养9～10小时收获，留样进行活菌计数和纯检，其余菌液导入管式离心机离心，将菌泥置于2～8℃保存。

4灭活根据活菌计数结果，将YBYN株、YBSD株、YBRA04株细菌菌泥重悬于适量生理盐水中，均稀释至9×10¹⁰CFU/ml，计量加入10倍稀释的甲醛溶液，使甲醛溶液的终浓度为0.3％，37℃搅拌灭活20小时后，置2～8℃保存，应不超过7日。

5半成品检验

5.1纯粹检验按《中国兽药典》规定的方法进行检验。

5.2活菌计数按《中国兽药典》规定的方法进行。

5.3灭活检验按《中国兽药典》规定的方法进行检验。

6疫苗制备

6.1油相制备取注射用白油94份、司本-806份和硬脂酸铝1份加入油相制备罐中，开启搅拌电机，匀速搅拌，同时开启导热油开关，115℃加热30分钟，冷却后，导入贮油罐中备用。

6.2水相制备将YBYN株、YBSD株和YBRA04株灭活菌液等体积混合，加入终浓度为4％吐温-80，充分混匀即为水相。

6.3乳化取油相2份加入乳化罐内，开动电机低速搅拌，同时缓缓加入水相1份，4000r/min乳化30分钟。取样10ml，3000r/min离心15分钟，观察管底析出水相的量。若管底析出水相多于0.5ml，应重新乳化1次。

6.4分装定量分装，加盖密封，置2～8℃保存。

7成品检验

7.1性状

7.1.1外观吸取5ml疫苗放一清洁玻璃管中进行观察。

7.1.2剂型取一清洁吸管，吸取少量疫苗滴于冷水表面，观察扩散情况。

7.1.3稳定性吸取疫苗10ml加入离心管中，以3000r/min离心15分钟，观察管底析出的水相的量。

7.1.4黏度按《中国兽药典》规定方法进行。

7.2装量检查按《中国兽药典》规定方法进行。

7.3无菌检验按《中国兽药典》规定方法进行。

7.4安全检验取5～6日龄的健康易感鸭(血清1型、2型、4型鸭疫里默氏杆菌抗体凝集效价均不高于1∶2)10只，每只颈部皮下注射疫苗0.6ml，观察14日内试验鸭有无局部或全身明显不良反应。

7.5效力检验取5～6日龄健康易感鸭(血清1型、2型、4型鸭疫里默氏杆菌抗体凝集效价均不高于1∶2)60只，随机均分为A、B、C、D、E、F六组，每组10只。A、B、C组为免疫组，每只颈部皮下注射疫苗0.3ml，D、E、F组为非免疫对照组。免后21日，A、D组用活菌量约为2×10⁹CFU/ml的YBYN株菌液1ml腿部肌肉注射攻毒，B、E组用活菌量约为4×10⁸CFU/ml的YBSD株菌液1ml腿部肌肉注射攻毒，C、F组用活菌量约为4×10⁹CFU/ml的YBRA04株菌液1ml腿部肌肉注射攻毒，观察10日内试验鸭发病死亡情况。

7.6甲醛残留量测定按《中国兽药典》规定方法进行。

实施例2

1生产用种子的制备结果用YBYN株、YBSD株和YBRA04株的F6代基础种子制备一级种子500ml，按15％加入灭菌甘油后，按5ml/瓶分装，标明收获日期、菌种代次、培养时间，经纯粹检验合格后，-20℃保存备用。用F6代制备的一级种子制备二级种子一批，14000ml，经纯粹检验合格后，用于制备2011001批疫苗。详见表9。

表9 鸭传染性浆膜炎三价灭活疫苗一级种子制备及检验汇总表

2疫苗半成品生产及检验结果用YBYN株、YBSD株和YBRA04株二级种子各制备了1批半成品，活菌数为84～90亿CFU/ml，纯粹检验及浓缩后灭活检验均合格，试验结果表明，我们的培养和灭活工艺是可行的。详见表102。

表10鸭传染性浆膜炎三价灭活疫苗半成品检验结果汇总表

3水相配制结果共制备水相1批，为182.5L。详见表11。

表11鸭传染性浆膜炎三价灭活疫苗水相配制汇总表

4疫苗制备与分装用剪切机按水相∶油相＝1∶2的乳化比例进行，制备了1批鸭传染性浆膜炎三价灭活疫苗，批号为2011001，批量为547.5L，分装规格分别为100ml/瓶。详见表12。

表12疫苗制备与分装汇总表

批次

水相(L)

油相(L)

总量(L)

规格(ml/瓶)

数量(瓶)

2011001

182.5

365.0

547.5

100

5363

5性状检验和装量检查结果 2011001批次疫苗外观均呈乳白色；取一清洁吸管，吸取少量疫苗滴于冷水表面，除第1滴外，均应不扩散，均为油包水型；吸取疫苗10ml加入离心管中，以3000r/min离心15分钟，2011001批疫苗无水相析出；按《中国兽药典》规定方法进行黏度测定，结果为72cp。2011001批疫苗装量检查均符合规定，判为合格。详见表13。

表13鸭传染性浆膜炎三价灭活疫苗性状检验结果

6无菌检验结果按《中国兽药典》规定方法对2011001批疫苗进行无菌检验，结果无菌生长。详见表14。

表14鸭传染性浆膜炎三价灭活疫苗无菌检验结果

批号	T.G培养	G.A培养	G.P培养	判定结果
					2011001	-	-	-	合格

注：“-”表示无菌生长。

7安全检验结果 2011001批疫苗颈部皮下注射5～6日龄健康易感鸭(血清1型、2型、4型鸭疫里默氏杆菌抗体凝集效价均不高于1∶2)10只，每只0.6ml，连续观察14日，所有试验鸭精神、采食均未见异常，注射部位均未见红肿、溃烂，剖检可见疫苗吸收良好。详见表15。

表15鸭传染性浆膜炎三价灭活疫苗安全性检验结果

8效力检验结果取5～6日龄健康易感鸭(血清1型、2型、4型鸭疫里默氏杆菌抗体凝集效价均不高于1∶2)60只，随机均分为A、B、C、D、E、F六组，每组10只。A、B、C组为免疫组，每只颈部皮下注射疫苗0.3ml，D、E、F组为非免疫对照组。免后21日，A、D组用活菌量约为2×10⁹CFU/ml的YBYN株菌液1ml腿部肌肉注射攻毒，B、E组用活菌量约为4×10⁸CFU/ml的YBSD株菌液1ml腿部肌肉注射攻毒，C、F组用活菌量约为4×10⁹CFU/ml的YBRA04株菌液1ml腿部肌肉注射攻毒，观察10日内试验鸭发病死亡情况。2011001批疫苗免疫后21日攻毒，免疫鸭均9/10以上保护，对照鸭均10/10发病。详见表16。

表16鸭传染性浆膜炎三价灭活疫苗效力检验结果

*注：保护鸭只数/攻毒鸭只数。

9甲醛残留量测定按《中国兽药典》规定方法测定2011001批鸭传染性浆膜炎三价灭活疫苗中甲醛残留量，结果表明，该批次灭活疫苗中甲醛残留量均符合规定，判为合格。详见表17。

表17鸭传染性浆膜炎三价灭活疫苗甲醛残留量测定结果

批号	疫苗总量	甲醛残留量(g/ml)	判定结果
				2011001	547500ml	0.094％	合格

附注：

1鸭发生鸭传染性浆膜炎的判定标准(符合下列条件之一，判为发病)

(1)精神不振、行动蹒跚、眼鼻有分泌物流出、排绿色或黄绿色稀薄粪便或死亡。

(2)对无临床症状的鸭剖检观察病变，出现心包膜炎或肝周炎或浆膜炎病变。

(3)对无病变的鸭无菌采集心血或肝脏或脾脏，接种巧克力琼脂平板分离细菌，分离到的细菌呈阳性。

2TSA培养基(不含琼脂为TSB)

胰蛋白胨17g、大豆胨3g、氯化钠5g、磷酸氢二钾2.5g、葡萄糖2.5g、琼脂12g、溶于1000ml无离子水中，115℃高压20分钟，待冷却至55℃左右时，按无菌要求加入30ml无菌小牛血清。

Claims

1.一种鸭传染性浆膜炎三价灭活疫苗，其特征是该疫苗含有经甲醛溶液灭活的鸭疫里默氏杆菌1型YBYN株菌、2型YBSD株菌和4型YBRA04株及常规的矿物油佐剂；鸭疫里默氏杆菌1型YBYN株(从云南省鸭场病死鸭的肝脏分离)和2型YBSD株(从山东省鸭场病死鸭脑部分离)已于2011年2月25日、4型YBRA04株(从山东省鸭场病死鸭心脏分离)于2011年11月22日分别送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号：YBYN株为CGMCC No.4615、YBSD株为CGMCC No.4614和YBRA04株为CGMCC No.5485。

2.权利要求1一种鸭传染性浆膜炎三价灭活疫苗的生产方法，其特征在于：

(1)采用机械搅拌发酵罐分别培养1、2、4型鸭疫里默氏杆菌CGMCC No.4615，CGMCCNo.4614和CGMCC No.5485株菌液：先将半合成肉汤培养基进行灭菌，待温度降至37～38℃时，将2～8℃保存的二级种子液分别按2％～2.5％加入到发酵罐内。培养温度控制在37～38℃，搅拌转速为100～200r/min，pH为7.2，罐压为0.03～0.05Pa，溶氧量为40％，培养9～10小时收获，留样检验，置2～8℃保存，不超过5日；

(2)根据活菌计数结果，将灭活的1、2、4型鸭疫里默氏杆菌CGMCC No.4615，CGMCCNo.4614和CGMCC No.5485株菌液均稀释成约3×10¹⁰CFU/ml后等量混合；

(3)按常规方法制备成矿物油佐剂灭活疫苗。