CN102908616A

CN102908616A - 鸭疫里默氏杆菌三价灭活疫苗及其制备方法

Info

Publication number: CN102908616A
Application number: CN2012103382367A
Authority: CN
Inventors: 于圣青; 丁铲; 韩先干; 王小兰; 仇旭升; 宋翠萍; 谭磊
Original assignee: Shanghai Veterinary Research Institute CAAS
Current assignee: Shanghai Inst. of Animal Medicines, C.A.A.S; Yangzhou Youjiachuang Biotechnology Co., Ltd.
Priority date: 2012-09-13
Filing date: 2012-09-13
Publication date: 2013-02-06
Anticipated expiration: 2032-09-13
Also published as: CN102908616B

Abstract

本发明属于生物技术领域，本发明公开了一种鸭疫里默氏杆菌三价灭活疫苗，所述鸭疫里默氏杆菌三价灭活疫苗包含鸭疫里默氏杆菌血清1型灭活全菌、血清2型灭活全菌和血清10型灭活全菌以及佐剂。本发明对血清1型、2型和10型鸭疫里默氏杆菌强毒菌株攻毒的免疫保护率均达到100%。本发明具有良好的对各个组成血清型菌株感染的免疫保护效果。

Description

鸭疫里默氏杆菌三价灭活疫苗及其制备方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地，本发明涉及一种鸭疫里默氏杆菌三价灭活疫苗及其制备方法。

背景技术

鸭疫里默氏杆菌（Riemerella anatipestifer，RA )感染是鸭、鹅、火鸡等多种鸟类的一种高致病性、接触传染性疾病。本病以10-35日龄的雏鸭发病较多，发病率最高可达90% 以上，死亡率为5%-75%，是影响养鸭业的重大传染病之一。

RA 血清型众多，目前世界范围内已确定的有21种，各血清型之间的交叉保护作用差。研究表明我国RA感染流行菌株的优势血清型是1、2和10型，目前国内可用于预防RA感染的疫苗为鸭传染性浆膜炎灭活油乳剂疫苗，为预防单一血清1型鸭疫里默氏杆菌感染的疫苗，对国内经常发生的血清2型和10型鸭疫里默氏杆菌感染无预防保护作用。由于细菌培养基等因素的限制使得培养的菌数很难达到制备三价灭活疫苗的菌数要求，迄今尚无包括血清1型、2型和10型鸭疫里默氏杆菌在内的RA三价灭活疫苗的研究报道或商品化疫苗。

发明内容

为了解决上述问题，本发明的目的是提供一种鸭疫里默氏杆菌三价灭活疫苗及其制备方法。本发明提供的鸭疫里默氏杆菌三价灭活疫苗可用于预防血清1型、血清2型和血清10型鸭疫里默氏杆菌感染。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种鸭疫里默氏杆菌三价灭活疫苗，所述鸭疫里默氏杆菌三价灭活疫苗包含鸭疫里默氏杆菌血清1型灭活全菌、血清2型灭活全菌和血清10型灭活全菌以及佐剂。

本发明的另一方面，所述鸭疫里默氏杆菌三价灭活疫苗的菌株为血清1型CH3株、血清2型NJ3株和血清10型HXb2株。

本发明的另一方面，所述鸭疫里默氏杆菌三价灭活疫苗中，灭活CH3株、NJ3株和HXb2株的抗原含量分别都大于等于4×10⁹CFU/mL、2×10⁹CFU/mL 和2×10⁹CFU/mL。

本发明的另一方面，所述鸭疫里默氏杆菌三价灭活疫苗中血清1型、2型、10型抗原与佐剂的混合重量比例为1：1：1：7。

本发明的另一方面，所述鸭疫里默氏杆菌三价灭活疫苗是灭活全菌疫苗。

本发明的另一方面，所述鸭疫里默氏杆菌三价灭活疫苗佐剂为白油佐剂或者Montanide ISA 70 VG佐剂。

本发明的另一实施方面，一种鸭疫里默氏杆菌三价灭活疫苗的制备方法包括下列步骤：

（1）所述鸭疫里默氏杆菌三价灭活疫苗各组成菌株灭活抗原的制备：取血清1、2和10型鸭疫里默氏杆菌制苗用菌株CH3、NJ3和HXb2分别接种到TSB中复苏后划线接种于TSA平板上，置适温培养箱中培养过夜,肉眼观察，挑选呈奶油状、微蓝色半透明的特征单菌落分别进行一级和二级种子繁殖后，培养至对数生长期进行细菌的大量繁殖，经纯度检验和细菌计数后加入福尔马林，适宜温度下振荡后进行灭活；分别取各灭活菌液少量接种于TSA平板适温培养过夜，进行无菌检验,应无细菌生长；

（2）所述鸭疫里默氏杆菌三价灭活疫苗各组分的配制与疫苗乳化,根据细菌计数结果，分别将CH3、NJ3或HXb2灭活菌液稀释或浓缩；取各灭活菌液混匀，加入Montanide ISA 70 VG佐剂于搅拌机低速搅拌后，高速搅拌乳化1分钟/次，2次以上，即为鸭疫里默氏杆菌三价灭活疫苗。

本发明的另一方面，一种鸭疫里默氏杆菌三价灭活疫苗的制备方法包括下列步骤：

（1）所述鸭疫里默氏杆菌三价灭活疫苗各组成菌株灭活抗原的制备，取-80 ℃保存的血清1、2、10型RA制苗用菌株CH3、NJ3、HXb2分别接种到TSB中复苏后划线接种于TSA平板上，置5% CO₂培养箱中37℃培养24小时。肉眼观察，挑选呈奶油状、微蓝色半透明的特征单菌落分别进行一级和二级种子繁殖后，在通气量1.0 SLPM, 转速400rpm，培养基PH值7.4，接种量为体积比5%的条件下培养至对数生长期进行细菌的大量繁殖，经纯度检验和细菌计数后加入体积比0.4 %福尔马林，37℃ 200 rpm振荡15小时进行灭活；分别取各灭活菌液少量接种于TSA平板37 ℃ 5% CO₂培养24 h，进行无菌检验。应无细菌生长。

（2）所述鸭疫里默氏杆菌三价灭活疫苗各组分的配制与疫苗乳化。根据细菌计数结果，分别将CH3、NJ3或HXb2灭活菌液稀释或浓缩至4×10¹⁰ CFU/mL、2×10¹⁰ CFU/mL或2×10¹⁰ CFU/mL；取各灭活菌液各1份混匀，加入Montanide ISA 70 VG佐剂7份于搅拌机低速搅拌30秒后，高速搅拌乳化1分钟/次×2次，即为鸭疫里默氏杆菌三价灭活疫苗。

本发明的另一方面，鸭疫里默氏杆菌三价灭活疫苗于TSA或TSB培养基中培养，应无细菌生长，于室温保存6个月或4 ℃保存1年应无分层现象发生，3倍剂量疫苗接种10日龄易感鸭安全，易感鸭分别用免疫剂量（0.3 mL）于5日龄和15日龄颈部皮下接种后，应产生1：400以上针对CH3、NJ3和HXb2的血清抗体，对3个半数致死量YL4、Yb2和HXb2的攻毒保护应在90%以上。

本发明的有益效果为：本发明可以有效地预防国内养鸭地区流行的血清1型、血清2型和血清10型鸭疫里默氏杆菌的感染。

本发明提供一种鸭疫里默氏杆菌三价灭活疫苗，可用于免疫预防血清1型、2型和10型鸭疫里默氏杆菌感染的鸭疫里默氏杆菌三价灭活疫苗。本发明血清1型、2型和10型鸭疫里默氏杆菌单价油乳剂灭活疫苗具有良好的对各自血清型菌株感染的免疫保护效果（90%以上）。

本发明对筛选获得的制苗用血清1型菌株CH3、血清2型菌株NJ3和血清10型菌株HXb2进行培养条件的优化、最佳免疫剂量的确定、疫苗佐剂的筛选、疫苗制备以及检验规程的制定。通过对上述条件进行优化、筛选，最终获得本发明提供的一种鸭疫里默氏杆菌三价灭活疫苗。

本发明疫苗对易感鸭可在5日龄左右进行首次免疫，首次免疫后10日左右进行二次免疫。本发明疫苗对易感雏鸭进行免疫后对血清1型、2型和10型鸭疫里默氏杆菌强毒菌株攻毒的免疫保护率均达到100%。本发明可用于预防雏鸭免受国内主要流行的血清1型、2型和10型鸭疫里默氏杆菌感染，为国内外首创。

附图说明

图1 是本发明RA制苗用菌株在不同液体培养基的生长曲线；

图2 是本发明不同免疫剂量二次免疫后血清抗体效价；

图3 是本发明不同佐剂二次免疫后血清抗体效价。

具体实施方式

以下结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限定本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。

本发明中未标注的试剂和原料均为市场上购买所得。

1：制苗用候选菌株的复壮以及鉴定

我们的前期研究获得了血清1型、2型和10型制苗用候选菌株CH3株, NJ3株和HXb2株。将该三个候选菌株分别经过易感鸭体内复壮后进行菌株的形态、生化反应特性、分子生物学特性以及免疫保护率鉴定。将复壮后的菌株在胰酶大豆肉汤（TSB）和胰酶大豆琼脂平板（TSA）上传代50次，每隔5代对其菌株的形态、生化反应特性（氧化酶、过氧化氢酶试验为阳性；尿素分解、柠檬酸盐利用、硝酸盐还原、硫化氢产生试验为阴性；不发酵葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、果糖、木糖、甘露糖和山梨醇；液化明胶）、分子生物学特性（PCR扩增16S rRNA，ompA基因和groEL基因均为阳性反应，序列测定结果正确）以及免疫保护率进行鉴定，表明3个菌株在体外连续传代50次后的各种特性均不发生变化。

2：制苗用候选菌株体外培养条件的优化

分别对3个疫苗候选菌株的液体培养基和高密度发酵技术进行了研究。比较研究疫苗候选菌株在TSB（北京奥博星生物技术有限责任公司）、胰酪胨大豆酵母浸膏肉汤（TSB-YE，北京奥博星生物技术有限责任公司），TSB+0.5%酵母浸出液（YE，英国OXOID公司）, TSB+1.5% YE和P-L肉汤中的增菌效果，结果表明TSB-YE的增菌效果明显优于其他液体培养基，RA CH3、NJ3、HXb2在TSB-YE中培养10-12 h即可达到生长高峰，菌数达1.4 -1.7×10¹⁰CFU/mL。

RA制苗用菌株CH3、NJ3、HXb2在不同液体培养基的生长曲线见图1，可以看出TSB-YE培养基对血清1、2、10型制苗用菌株的增菌效果优于其他液体培养基，3个制苗用菌株均在TSB-YE中生长迅速，培养10-12小时即可达对数生长中后期。

本研究建立了高密度发酵 RA 的液体培养技术。利用液体发酵装置，运用正交试验设计方法，分别测定了通气量（SLPM，分别为2.0，1.0，和0.1）、转速（rpm,分别为400，200和100）、培养基酸碱度（PH值，分别为7.0，7.4和7.8）以及接种量（%,分别为1，3和5）对RA血清1、2、10型制苗用菌株发酵的影响，具体试验分组如下：

如表1，表2和表3所示，按照上述试验分组条件，以TSB-YE为培养基，发酵温度为37℃，发酵液为2000 mL，分别进行血清1、2、10型RA制苗用菌株CH3、NJ3、HXb2的液体发酵培养。收集发酵后2-12小时的菌液样品，应用紫外分光光度计检测样品OD₆₀₀值，记录数据并进行比较。结果表明：在培养温度为37℃条件下，三个菌株在4号反应条件下均达到培养的最高OD值，设定为：通气量1.0 SLPM, 转速400 rpm，培养基PH值7.4，接种量为体积比5%。因此上述发酵条件为RA制苗用菌株的最佳发酵条件。

表1 CH3试验各组发酵2 -12小时测定OD ₆₀₀

表2 NJ3试验各组发酵2 -12小时测定OD ₆₀₀

表3 HXb2试验各组发酵2 -12小时测定OD ₆₀₀

“-”，OD₆₀₀值与空白对照相差不大，即该实验组细菌不生长。

3：鸭疫里默氏杆菌三价灭活疫苗各组成菌株的最佳含菌量以及疫苗佐剂的选择

将252只5日龄樱桃谷鸭随机分成3大组，84只/组，分别为RA 制苗菌株CH3、NJ3和HXb2试验组。每个试验组再随机分成7小组，12只/组，分别为免疫剂量5×10⁷ CFU/只、10⁸ CFU/只、2×10⁸CFU/只、5×10⁸ CFU/只、10⁹ CFU/只、2×10⁹CFU/只和未免疫对照组。将各组疫苗分别按相应剂量颈部皮下接种于相应编号的樱桃谷鸭，对照组不做任何接种处理。各组2周后同法加强免疫1次。

如图2所示，首次免疫及二次免疫后10天分别颈静脉采血分离血清，间接ELISA方法检测血清抗体水平。结果表明不同剂量的疫苗免疫后均能刺激机体产生一定的抗体水平，未接种疫苗组的血清ELISA效价低于1：100。

免疫后14天，各组分别用相同血清型的强毒进行攻毒保护试验。观察记录攻毒后7日内的发病死亡情况。结果见表4：

表4 不同剂量RA灭活油乳剂疫苗的免疫保护效果

*为未免疫对照组

综合考虑免疫攻毒后鸭的状态及免疫保护率等因素，确定血清1、2、10型RA灭活油乳剂疫苗最佳含菌量依次为：10⁹ CFU/只、5×10⁸CFU/只、5×10⁸ CFU/只。

使用各菌株的最佳含菌量，分别用白油佐剂（吉林市吉化江城油脂化工有限责任公司）和Montanide ISA 70 VG佐剂（赛比克上海特殊化学品有限公司）制备鸭疫里默氏杆菌三价灭活疫苗。

制备白油佐剂疫苗：取-80 ℃保存的血清1、2、10型RA制苗用菌株CH3、NJ3、HXb2复苏后转接到TSB中培养至对数生长期，纯度检验和细菌计数后加入体积比0.4 %福尔马林，37℃ 200 rpm振荡15 h进行灭活。分别取灭活菌液少量接种于TSA平板37℃ 5% CO₂静置培养24 h，进行无菌检验。根据细菌计数结果，分别对灭活CH3、NJ3、HXb2菌液进行稀释或浓缩至6×10¹⁰ CFU/mL、3×10¹⁰ CFU/mL、3×10¹⁰ CFU/mL。各灭活菌液等量混合后取40 mL与Tween 80 9.6 mL混合备用。高压灭菌的白油140.8 mL与司班80 9.6 mL室温下于commercial blender 中低速搅拌30秒混合，缓慢加入上述灭活菌液与Tween 80的混合液，高速搅拌乳化1.5分钟/次×3次即为白油佐剂疫苗。分装100 mL/瓶后4℃保存。0.25 mL疫苗含菌量分别为10⁹ CFU、5×10⁸ CFU、5×10⁸CFU，免疫时颈部皮下接种0.3 mL。

制备Montanide ISA 70 VG佐剂疫苗：血清1、2、10型RA制苗用菌株CH3、NJ3、HXb2如上述方法复苏、生长、灭活、检验后，制备 Montanide ISA 70 VG佐剂疫苗。方法为：分别取含菌量4×10¹⁰ CFU/mL CH3、2×10¹⁰CFU/mL NJ3、2×10¹⁰ CFU/mL HXb2灭活菌液各1份混匀，加入Montanide ISA 70 VG 佐剂7份于commercial blender 低速搅拌30秒后，高速搅拌乳化1分钟/次×2次即为 Montanide ISA 70 VG佐剂疫苗。分装100 mL/瓶后4℃保存。0.25 mL疫苗含菌量分别为10⁹ CFU、5×10⁸ CFU、5×10⁸ CFU，免疫时颈部皮下接种0.3 mL。

将90只5日龄未免疫健康易感樱桃谷鸭（无锡市青阳鸭场）随机分成3组，30只/组，编号为A、B、C、对照，A组一、二免RA白油佐剂疫苗，B组一、二免RA Montanide ISA 70 VG佐剂疫苗，C组为对照组，不做任何接种处理；将疫苗分别颈部皮下接种于相应编号的樱桃谷鸭，0.3 mL/只。10日后同法加强免疫1次。

首次免疫及二次免疫后10天分别颈静脉采血分离血清，并分别以CH3、NJ3、HXb2作为包被抗原，用间接ELISA方法检测血清抗体水平。

如图3所示，抗体效价检测结果表明Montanide ISA 70 VG佐剂疫苗诱导产生的抗体水平显著高于白油佐剂疫苗，血清1、2和10型RA抗体效价分别高达1：6400，1：3200和1：6400。

攻毒保护试验：如表5，二次免疫后14天后各免疫组再随机分成3组，10只/组，分别用攻毒剂量分别为3 LD₅₀/0.5mL/只的YL4、Yb2或HXb2菌液腿部肌肉注射攻毒，观察记录攻毒后1周内发病死亡情况。

结果表明两种佐剂疫苗免疫均能对RA强毒提供良好的保护，保护率达90 % ~ 100 %，其中Montanide ISA 70 VG佐剂疫苗经两次免疫后对3种血清型RA强毒攻击的免疫保护率均达到100 %。

表5不同佐剂RA三价灭活疫苗免疫保护效果

A：白油佐剂疫苗B：Montanide ISA 70 VG佐剂疫苗

4：疫苗制备以及检验规程的制定

鸭疫里默氏杆菌三价灭活疫苗的制备规程：

鸭疫里默氏杆菌三价灭活疫苗的制苗用菌株CH3、NJ3、HXb2冻干保存于-80 ℃。取-80 ℃保存的血清1、2、10型RA制苗用菌株CH3、NJ3、HXb2分别接种到TSB中复苏后，在通气量1.0 SLPM, 转速400 rpm，培养基PH值7.4，接种量为体积比5%的条件下培养至对数生长期，经纯度检验和细菌计数后加入体积比0.4 %福尔马林，37℃ 200 rpm振荡15 h进行灭活。分别取各灭活菌液少量接种于TSA平板37℃ 5% CO₂培养24 h，进行无菌检验。根据细菌计数结果，分别将CH3、NJ3或HXb2灭活菌液浓缩至4×10¹⁰ CFU/mL、2×10¹⁰ CFU/mL或2×10¹⁰ CFU/mL。取各灭活菌液各1份混匀，加入Montanide ISA 70 VG 佐剂7份于commercial blender 低速搅拌30秒后，高速搅拌乳化1分钟/次×2次，即为鸭疫里默氏杆菌三价灭活疫苗。分装100 mL/瓶后4℃保存。0.25 mL疫苗含菌量分别为10⁹CFU、5×10⁸CFU、5×10⁸CFU，免疫时颈部皮下接种0.3 mL。

鸭疫里默氏杆菌三价灭活疫苗的检验规程：

鸭疫里默氏杆菌三价灭活疫苗于TSA或TSB培养基中培养，应无细菌生长。于室温保存6个月或4 ℃保存1年应无分层现象发生。3倍剂量疫苗接种10日龄易感鸭安全。易感鸭分别用免疫剂量（0.3 mL）于5日龄和15日龄颈部皮下接种后，应产生1：400（ELISA效价）以上针对CH3、NJ3和HXb2的血清抗体。对3个半数致死量（3LD₅₀）YL4、Yb2和HXb2的攻毒保护应在90%以上。

本发明范围内还包括功能等同的方法和组分。实际上，除了本文所述的内容外，本领域技术人员参照上文的描述和附图可以容易地掌握对本发明的多种改进。所述改进也落入所附权利要求书的范围之内。

Claims

1.一种鸭疫里默氏杆菌三价灭活疫苗，其特征在于，所述鸭疫里默氏杆菌三价灭活疫苗包含鸭疫里默氏杆菌血清1型灭活全菌、血清2型灭活全菌和血清10型灭活全菌以及佐剂。

2. 根据权利要求1所述的一种鸭疫里默氏杆菌三价灭活疫苗，其特征在于，所述鸭疫里默氏杆菌三价灭活疫苗的菌株为血清1型CH3株、血清2型NJ3株和血清10型HXb2株。

3. 根据权利要求2所述的一种鸭疫里默氏杆菌三价灭活疫苗，其特征在于，所述鸭疫里默氏杆菌三价灭活疫苗中，灭活CH3株、NJ3株和HXb2株的抗原含量分别大于等于4×10⁹CFU/mL、2×10⁹CFU/mL 和2×10⁹CFU/mL。

4. 根据权利要求1所述的一种鸭疫里默氏杆菌三价灭活疫苗，其特征在于，所述鸭疫里默氏杆菌三价灭活疫苗中血清1型、2型、10型抗原与佐剂的混合重量比例为1：1：1：7。

5. 根据权利要求1所述的一种鸭疫里默氏杆菌三价灭活疫苗，其特征在于，所述鸭疫里默氏杆菌三价灭活疫苗是灭活全菌疫苗。

6. 根据权利要求1所述的一种鸭疫里默氏杆菌三价灭活疫苗，其特征在于，所述鸭疫里默氏杆菌三价灭活疫苗佐剂为白油佐剂或者Montanide ISA 70 VG佐剂。

7. 根据权利要求1-6任一所述的一种鸭疫里默氏杆菌三价灭活疫苗的制备方法，其特征在于，其包括下列步骤：

（2）所述鸭疫里默氏杆菌三价灭活疫苗各组分的配制与疫苗乳化,根据细菌计数结果，分别将所述CH3、NJ3或HXb2灭活菌液稀释或浓缩；取各灭活菌液混匀，加入Montanide ISA 70 VG佐剂于搅拌机低速搅拌后，高速搅拌乳化1分钟/次，2次以上，即为鸭疫里默氏杆菌三价灭活疫苗。

8. 根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，其包括下列步骤：

（1）所述鸭疫里默氏杆菌三价灭活疫苗各组成菌株灭活抗原的制备，取-80℃保存的血清1、2、10型鸭疫里默氏杆菌制苗用菌株CH3、NJ3、HXb2分别接种到TSB中复苏后划线接种于TSA平板上，置5% CO₂培养箱中37℃培养24小时，肉眼观察，挑选呈奶油状、微蓝色半透明的特征单菌落分别进行一级和二级种子繁殖后，在通气量1.0 SLPM, 转速400rpm，培养基PH值7.4，接种量为体积比5%的条件下培养至对数生长期进行细菌的大量繁殖，经纯度检验和细菌计数后加入体积比0.4 %福尔马林，37℃ 200 rpm振荡15小时进行灭活；分别取各灭活菌液少量接种于TSA平板37℃ 5%CO₂培养24h，进行无菌检验，应无细菌生长；

（2）所述鸭疫里默氏杆菌三价灭活疫苗各组分的配制与疫苗乳化：根据细菌计数结果，分别将CH3、NJ3或HXb2灭活菌液稀释或浓缩至4×10¹⁰ CFU/mL、2×10¹⁰ CFU/mL或2×10¹⁰ CFU/mL；取各灭活菌液各1份混匀，加入Montanide ISA 70 VG佐剂7份于搅拌机低速搅拌30秒后，高速搅拌乳化1分钟/次×2次，即为鸭疫里默氏杆菌三价灭活疫苗。

9. 根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述鸭疫里默氏杆菌三价灭活疫苗于TSA或TSB培养基中培养，应无细菌生长，于室温保存6个月或4℃保存1年应无分层现象发生，3倍剂量疫苗接种10日龄易感鸭安全，易感鸭分别用免疫剂量于5日龄和15日龄颈部皮下接种后，应产生1：400以上针对CH3、NJ3和HXb2的血清抗体，对3个半数致死量YL4、Yb2和HXb2的攻毒保护应在90%以上。