CN102309753A

CN102309753A - 鸭疫里默氏菌血清1型、2型、4型三价油乳剂灭活疫苗

Info

Publication number: CN102309753A
Application number: CN201010218877XA
Authority: CN
Inventors: 岳华; 汤承; 田令
Original assignee: Southwest Minzu University
Current assignee: Southwest Minzu University
Priority date: 2010-07-07
Filing date: 2010-07-07
Publication date: 2012-01-11

Abstract

鸭疫里默氏菌血清1型、2型、4型三价灭活油乳剂疫苗。它是应用我国鸭疫里默氏菌三个主要的流行血清型的分离株作为抗原，通过LB肉汤培养扩繁18h后，经过0.3％甲醛灭活11-13h，三个血清型的抗原以1∶1∶1的比例混合，然后加入与抗原总体积相等的油相，再经乳化制备而成。用于预防由当前流行的鸭疫里默氏菌主要血清型菌株引起的鸭的纤维素性多发浆膜炎和脑膜炎。

Description

鸭疫里默氏菌血清1型、2型、4型三价油乳剂灭活疫苗

1.技术领域本发明涉及一种鸭疫里默氏菌三价油乳剂灭活的制备方法及其在预防由鸭疫里默氏菌引起的各种病症中的应用。

2.背景技术鸭疫里默氏菌(Rimerella-anatipestifer，RA)是鸭传染性浆膜炎病的病原体，它侵入机体可引起以纤维素性多发性浆膜炎、脑膜炎为特征的全身性疾病。鸭疫里默氏菌是一种非溶血性，非运动性、革兰氏阴性细小杆菌。随着世界养鸭业的发展，该病已成为全球范围内影响养鸭业的一种重要细菌性疾病。

在鸭群的养殖中，做好平时的预防工作尤为重要。至今，我国几乎所有养鸭地区都报道了本病的发生。近年来由于养鸭数量增大，鸭疫里默氏菌病的发生呈上升趋势。研究表明各地区都有RA优势血清型的存在，而针对优势血清型研制疫苗是一种有效的防治手段。大量研究证实了免疫商品疫苗成功的案例，目前使用的疫苗主要是灭活的单价及二价灭活疫苗，通过接种这些疫苗可以有效控制该疫病的发生。但是，RA血清型众多且没有交叉保护作用，而目前在RA感染的鸭场中血清型大多呈多样化分布这都直接影响了疫苗效果的发挥。血清型复杂多变，在不同时期，不同地区流行的血清型存在着差异，加强血清型的监测工作并研制有效的多价苗是目前解决该病的关键。所以，研制一种多价血清型且含有独特菌株的商品疫苗是非常关键的。

3.发明内容现有的鸭疫里默氏菌灭活苗多为单价及二价灭活苗，分别针对血清1型、血清2型。本发明提供一种三价的灭活疫苗，同时预防当前我国鸭疫里默氏菌流行菌株的主要血清型即血清1型、2型和4型引起的疾病。

4.技术方案本发明的技术方案是，将鸭疫里默氏菌血清1、2、4型分离株分别进行培养，灭活后加入吐温-80制成油乳剂的水相；利用马可52轻质石蜡油及司本-80、硬脂酸铝制成油相。将水相和油相等体积混合后乳化，从而得到鸭疫里默氏菌三价灭活疫苗。其具体制备方法如下：

1)细菌的培养：将鸭疫里默氏菌血清1型、2型和4型三株种子菌分别接种于TSA固体培养基，37℃恒温箱中培养，24h后挑取单个菌落，接入含小牛血清的LB液体培养基中，37℃、180r/min条件下振荡培养12-16h后再将此菌液按3％的比例加入新配制的LB液体培养基中进行大量增殖。37℃、180r/min振荡培养24h后，收集菌液，用分光光度计测定细菌总菌含量。

2)细菌的灭活：按TSB液体培养基总体积加入0.3％甲醛灭活，于37℃振荡灭活11-13h。

3)油乳剂水相的制备：三个血清型的菌种灭活后，将各个血清型的菌液浓度均调至1×10¹⁰CFU/ml，按1∶1∶1的体积比混合，按总体积4％加入灭菌吐温-80，边加边搅拌。4)油相制备：取马可52轻质石蜡油93份，加入硬脂酸铝1份并搅拌直到透明为止，随后加入6份司本-80，充分混匀，121℃高压蒸汽灭菌30min，冷却至室温备用。

5)油乳剂灭活苗的制备：将制备好的油相和水相等体积混合，边加边搅拌，至完全溶解，并于均质机中进行乳化。

本三价油乳剂灭活苗的保存条件为：2～8℃。

本发明的优点是可以预防由鸭疫里默氏菌血清1、2、4型菌株引起的疾病，对于同血清型菌株的免疫保护达到83％。相对于目前的商品疫苗来讲，可以单针免疫较多的血清型，使用方便，并提高了对其他血清型交叉保护的可能性。

具体实施方式

结合实施对本发明做进一步描述和论证。

实施例1

已制备好的鸭疫里默氏菌血清1型、2型、4型三价油乳剂灭活疫苗，3日龄樱桃谷鸭70只，灭菌生理盐水，规格为1ml注射器，疫苗菌株。

实验步骤：

1、70只3日龄樱桃谷鸭分为注射疫苗组30只，攻毒组30只，空白对照组10只。

2、疫苗组雏鸭每只颈部皮下注射疫苗0.5ml，空白对照组注射等量灭菌生理盐水。

3、全部雏鸭均置于相同条件下饲养，14d后，进行攻毒保护试验。

4、先将每个疫苗菌株扩繁11-13h，然后将浓度均调至2×10⁹CFU/ml。做攻毒保护试验时，将注射疫苗组雏鸭分为3组，每组10只，分别颈部皮下注射SWS1、SWS2、SWS4菌株菌液，每只雏鸭注射菌液1ml。攻毒组也分为三组，每组10只，攻毒组的攻毒方式同疫苗注射组。攻毒后，注意观察雏鸭的临床症状，并记录死亡时间和死亡率。

实验结果：攻毒对照组在72h内，死亡率均在70％以上，而疫苗免疫组的攻毒保护率均在80％左右。

实施例2

已制备好的鸭疫里默氏菌三价灭活苗，3日龄樱桃谷雏鸭20只，灭菌生理盐水，1ml注射器

实验步骤：

1、将3日龄樱桃谷雏鸭分为两组，一组为注射疫苗组，另一组为注射生理盐水的空白对照组。

2、注射疫苗组的雏鸭每只注射疫苗0.5ml，对照组注射等量生理盐水。所有雏鸭均置于相同条件下饲养。

3、注射后28d内观察雏鸭的精神及采食等情况。

实验结果：28d内，雏鸭没有出现精神萎靡，采食量降低等不良状况。表明该疫苗对于雏鸭具有较高的安全件。

Claims

1.鸭疫里默氏菌血清1型、2型、4型三价油乳剂灭活疫苗，其特征是由我国当前鸭疫里默氏菌主要流行血清型1、2、4型的分离株经灭活后按比例混合制成三价油乳剂灭活疫苗。所含佐剂的成份有矿物油、表面活性剂。

2.根据权利要求1所述的三价油乳剂灭活疫苗所用的分离株为鸭疫里默氏菌血清1、2、4型，菌株编号为SWS1、SWS2、SWS3，均为临床分离株。

3.根据权利要求1所述的三价油乳剂灭活疫苗，其中所述抗原的制备方法为，将鸭疫里默氏菌血清1、2、4型分离株接种于5％新生小牛血清的LB肉汤，37℃、180r/min振荡培养24h，加入终浓度为0.3％的甲醛灭活11-13h，最后将三种菌株的培养物浓度均浓缩至1×10¹⁰CFU/ml。

4.根据权利要求1所述的三价油乳剂灭活疫苗，其中所述矿物油为马可52轻质石蜡油。

5.根据权利要求1所述的三价油乳剂灭活疫苗，其中所述表面活性剂为司本-80、吐温-80、硬脂酸铝。

6.根据权利要求1所述的三价油乳剂灭活疫苗，其中所述的油乳剂灭活苗的制备方法，该方法包括以下步骤：

1)细菌的培养：将鸭疫里默氏菌血清1型、2型和4型三株种子菌分别接种于TSA固体培养基，37℃恒温箱中培养，24h后挑取单个菌落，接入含小牛血清的LB液体培养基中，37℃、180r/min条件下振荡培养12-16h后再将此菌液按3％的比例加入新配制的LB液体培养基中进行大量增殖。37℃、180r/min振荡培养24h后，收集菌液，用分光光度计测定细菌浓度。

2)细菌的灭活：按LB液体培养基总体积0.3％缓慢加入甲醛，于37℃振荡灭活11-13h。

3)油乳剂水相的制备：三个血清型的菌种灭活后，将各个血清型的菌液浓度均调至1×10¹⁰CFU/ml，然后将调整浓度后的菌液按1∶1∶1的体积比混合，按总体积的4％缓慢加入灭菌吐温-80并搅拌均匀。

4)油相制备：取马可52轻质石蜡油93份，加入硬脂酸铝1份，边加边搅拌，直到透明为止，再加入6份司本-80，充分混匀，121℃高压蒸汽灭菌30min，冷却至室温备用。

5)油乳剂灭活苗的制备：将制备好的油相和水相等体积混合，于均质机中乳化。