CN104056263B

CN104056263B - 一种预防和治疗由萎缩性鼻炎继发的呼吸系统疾病的疫苗组合物及制备方法和应用

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Publication number: CN104056263B
Application number: CN201310095338.5A
Authority: CN
Inventors: 张许科; 孙进忠; 白朝勇
Original assignee: Pulaike Biological Engineering Co Ltd
Current assignee: Pulaike Biological Engineering Co Ltd
Priority date: 2013-03-22
Filing date: 2013-03-22
Publication date: 2016-05-11
Anticipated expiration: 2033-03-22
Also published as: CN104056263A

Abstract

本发明提供了一种预防和治疗由萎缩性鼻炎继发的呼吸系统疾病的疫苗组合物，该疫苗组合物包括：免疫量的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌抗原；免疫量的多杀性巴氏杆菌抗原；免疫量的支气管败血波氏杆菌抗原；以及佐剂。该疫苗组合物具有安全性能高、免疫原性好、免疫期长、成本低等优点，并能降低成本，降低免疫劳动量，减少动物应激。

Description

一种预防和治疗由萎缩性鼻炎继发的呼吸系统疾病的疫苗组合物及制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种预防和治疗由萎缩性鼻炎继发的呼吸系统疾病的疫苗组合物。

背景技术

猪传染性胸膜肺炎、猪多杀性巴氏杆菌病和猪萎缩性鼻炎是常见的猪呼吸道系统疾病。猪传染性胸膜肺炎是由胸膜肺炎放线杆菌(APP)引起的猪的一种高度致死性呼吸道传染病，世界各国均有发生。本病主要引起猪发生伴有胸膜炎的出血性、坏死性肺炎，多呈最急性或急性病程而迅速致死。该病可发生于任何年龄的猪只，尤其在集约化养猪场，一旦发生会造成重大的经济损失。

猪巴氏杆菌病(swinepasteurellosis)是由多杀性巴氏杆菌引起的一种传染病，又名猪肺疫、猪出血性败血症，俗称“锁喉风”。该病的最急性型其特征呈败血症变化，咽喉部急性肿胀，呼吸高度困难。该病的急性型其特征呈纤维素性胸膜肺炎症状。慢性型症状不明显，多为慢性肺炎、胃肠炎以及逐渐消瘦，有时伴发关节炎，在国外又将该型称为肺炎巴氏杆菌病。该病广泛分布于世界各地，是猪的一种常见传染病。发病率达40％，死亡率在5％左右。多杀性巴氏杆菌按荚膜可分为A、B、D、E和F五种荚膜抗原血清型。在美国及欧洲一些国家，流行的猪多杀性巴氏杆菌病多以荚膜A型菌为主,其次是荚膜D型菌，B型菌所占比例较少。而在我国，过去流行的菌株多以B型为主，由于长期用B型菌苗免疫,取得较好的效果，B型菌株引起的多杀性巴氏杆菌病已较少发生。随着我国养猪业的规模化发展，A型和D型菌株在我国也呈流行趋势，并在一些地区已造成一定危害，并随着我国集约化养猪业的迅猛发展，猪群巴氏杆菌病的报道逐渐增多。

猪萎缩性鼻炎（atrophicrhinitis,AR）是猪群的一种重要的呼吸系统传染病，它会引起猪的慢性鼻炎、打喷嚏、流眼泪、颜部变性和鼻甲骨萎缩等症状，严重的还可以导致鼻吻变形并影响全身骨骼发育，从而导致猪生长迟缓，使猪容易感染继发性复合性肺炎，给养猪业造成巨大的损失。该病可感染任何年龄阶段的猪，其中4周龄以内的猪感染率最高，症状一般出现在8-12周龄。

猪萎缩性鼻炎可分为进行性猪萎缩性鼻炎（progressiveatrophicrhinitis,PAR）和非进行性猪萎缩性鼻炎（nonprogressiveatrophicrhinitis,NPAR）。进行性猪萎缩性鼻炎主要由产毒素多杀性巴士杆菌（toxigenicPasteurellamultocida）引起，病原通常为荚膜D型或A型，或与波氏杆菌共同感染引起。非进行性猪萎缩性鼻炎则单纯由支气管败血波氏杆菌（Bordetellabronchiseptica）引起，其通常只引起轻微的鼻甲骨萎缩，往往观察不到鼻吻部的典型病变。进行性猪萎缩性鼻炎给养猪业带来的危害十分巨大。

采用疫苗进行免疫预防是国内外控制猪传染性胸膜肺炎、猪多杀性巴氏杆菌病和猪萎缩性鼻炎的根本手段，而市场销售的商品疫苗只有猪传染性胸膜肺炎灭活疫苗单苗，猪多杀性巴氏杆菌单苗和活苗，猪萎缩性鼻炎灭活疫苗单苗。这些疫苗的应用起到了一定的预防作用，但疫苗的免疫效果不太理想并且保护期较短，同时弱毒苗有不易保存和存在散毒的风险等问题。

猪传染性胸膜肺炎疫苗免疫程序为仔猪35～40日龄进行第1次免疫接种，首免后4周加强免疫1次，猪多杀性巴氏杆菌病灭活疫苗免疫程序为猪30日龄内一次免疫4ml；而猪萎缩性鼻炎灭活苗的免疫程序为在7～10日龄进行第1次免疫接种，首免后2周加强免疫1次，市售商品疫苗需多次免疫，成本较高，对猪只的应激较大；随着病原流行株和混合感染已经使现有疫苗很难达到预期的免疫效果，另外同时针对控制猪传染性胸膜肺炎、猪多杀性巴氏杆菌病和猪萎缩性鼻炎的疫苗，国内外也还是空白。并且，发明人在重现一种猪的继发感染猪传染性胸膜肺炎的非进行性猪萎缩性鼻炎试验时发现，存在检测不到支气管败血波氏杆菌病原的情况，但是仍然偶尔有轻微的非进行性猪萎缩性鼻炎的症状；而当有外源产毒素多杀性巴氏杆菌荚膜A型或D型病原侵入时，常常会引起严重的继发感染猪传染性胸膜肺炎混合进行性萎缩性鼻炎的综合呼吸系统疾病，而发明人在检测时，依然没有检测到支气管败血波氏杆菌病原。

此外，因疫苗的生产、运输、储存、销售等环节均需在较低温度下进行，使用联合疫苗可以使成本降低。因此，本领域需要能产生保护性免疫应答以同时抵抗猪传染性胸膜肺炎和多杀性巴氏杆菌及支气管波氏杆菌感染的疫苗，减少所述感染的发生率和/或减轻所述感染的严重性，或预防与所述感染有关的临床表现。联合疫苗不仅方便、多效、低成本，与单一疫苗相比，还可以减少疫苗接种次数，避免因漏种而不能得到全程免疫；另外，疫苗大多不耐热，其生产、运输、存贮、销售乃至全部使用过程均需在较低温度下进行，即所谓的“冷链”，这种环环相扣的冷链运作，费用极高，使疫苗成本居高不下，而使用联合疫苗，则可以大大降低冷链运作的费用，因此具有显著的优越性。

发明内容

为解决现有技术的不足，本发明提供了一种疫苗组合物，该疫苗组合物可以很好地预防由萎缩性鼻炎继发的呼吸系统疾病；本发明疫苗具有安全性能高、免疫原性好、免疫期长、成本低等优点，并能降低成本，降低免疫劳动量，减少动物应激。

本发明的主要目的在于提供一种预防和治疗由萎缩性鼻炎继发的呼吸系统疾病的疫苗组合物，所述疫苗组合物包括：

免疫量的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌抗原；免疫量的多杀性巴氏杆菌抗原；免疫量的支气管败血波氏杆菌抗原；以及佐剂。

所述猪传染性胸膜肺炎放线杆菌抗原是指含有至少一种猪传染性胸膜肺炎放线杆菌抗原形式的任何组合物，所述猪传染性胸膜肺炎放线杆菌抗原接种猪可诱导、刺激或增强抵抗猪传染性胸膜肺炎放线杆菌感染的免疫应答。猪传染性胸膜肺炎放线杆菌包括本领域技术人员熟知的临床分离的野毒株，包含目前已鉴定的生物I型1～12个血清型。

所述猪巴氏杆菌抗原是指含有至少一种猪巴氏杆菌抗原形式的任何组合物，所述猪巴氏杆菌抗原接种猪可诱导、刺激或增强抵抗猪巴氏杆菌感染的免疫应答。猪巴氏杆菌包括本领域技术人员熟知的临床分离的野毒株，包含目前按荚膜区分已鉴定的A、B、D、E四种荚膜血清型。

本发明的支气管败血波氏杆菌抗原和D型猪巴氏杆菌抗原联合可以预防进行性猪萎缩性鼻炎，所述支气管败血波氏杆菌抗原是指含有至少一种支气管败血波氏杆菌抗原形式的任何组合物，所述支气管败血波氏杆菌抗原接种猪可诱导、刺激或增强抵抗支气管败血波氏杆菌感染的免疫应答。支气管败血波氏杆菌包括本领域技术人员熟知的临床分离的野毒株。

优选地，所述猪传染性胸膜肺炎放线杆菌抗原包括猪传染性胸膜肺炎放线杆菌1型全菌抗原、5型全菌抗原、7型全菌抗原；所述多杀性巴氏杆菌抗原包括A型全菌抗原、B型全菌抗原、D型全菌抗原；以及所述支气管败血波氏杆菌抗原包括支气管败血波氏杆菌全菌抗原。

更优选地，所述猪传染性胸膜肺炎放线杆菌1型全菌抗原为猪传染性胸膜肺炎放线杆菌1型LC株灭活株，所述猪传染性胸膜肺炎放线杆菌5型全菌抗原为猪传染性胸膜肺炎放线杆菌5型YC株灭活株，所述猪传染性胸膜肺炎放线杆菌7型全菌抗原为猪传染性胸膜肺炎放线杆菌7型YS株灭活株；所述多杀性巴氏杆菌A型全菌抗原为HN5株灭活株，所述多杀性巴氏杆菌B型全病毒抗原为C44-1株灭活株，所述多杀性巴氏杆菌D型全菌抗原为HB4株灭活株；所述支气管败血波氏杆菌全菌抗原为支气管败血波氏杆菌HN8株灭活株。

胸膜肺炎放线杆菌血清1型LC株（ActinobacillusPleuropneumoniaeSerotype1StrainLC,APP-1）保藏号为：CCTCCNO:M2011458;猪胸膜肺炎放线杆菌血清5型YC株（ActinobacillusPleuropneumoniaeSerotype5StrainYC,APP-5）保藏号为：CCTCCNO:M2011459;猪胸膜肺炎放线杆菌血清7型YS株（ActinobacillusPleuropneumoniaeSerotype7StrainYS,APP-7）保藏号为：CCTCCNO:M2011460；保藏日期均为2011年12月09日，保藏地址为：中国武汉，武汉大学；保藏单位均为中国典型培养物保藏中心（简称CCTCC）。

多杀性巴氏杆菌A型HN5株（PasteurellamultocidaAtypeHN5）保藏号为：CCTCCNO.M2011222，多杀性巴氏杆菌D型HB4株（PasteurellamultocidaDtypeHB4）保藏号为：CCTCCNO.M2011221，保藏日期均为2011年06月28日，保藏地址为：中国武汉，武汉大学；保藏单位均为中国典型培养物保藏中心（简称CCTCC）；多杀性巴氏杆菌血清B型C44-1株来自中国兽医药品监察所。

支气管败血波氏杆菌HN8株（BordetellabronchisepticaHN8）保藏号为：CCTCCNO.M2011223，保藏日期为2011年06月28日，保藏地址为：中国武汉，武汉大学；保藏单位均为中国典型培养物保藏中心（简称CCTCC）。

本发明的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌抗原还可以包含以下抗原组合物：武汉科前动物生物制品有限责任公司的猪传染性胸膜肺炎三价灭活疫苗（血清1型、2型和7型）。

本发明的猪巴氏杆菌抗原还可以包含以下抗原组合物：中牧股份的猪多杀性巴氏杆菌灭活疫苗（C44-1株）。

本发明的支气管败血波氏杆菌抗原和D型猪巴氏杆菌还可以包含以下抗原组合物：武汉科前动物生物制品有限责任公司的猪萎缩性鼻炎灭活疫苗（波氏杆菌JB5株），英特威公司的猪萎缩性鼻炎灭活疫苗“AR-T”，海博莱公司的猪萎缩性鼻炎灭活疫苗“喜毕安”（支气管败血波氏杆菌833株和D型多杀性巴氏杆菌637株坏死毒素的类毒素），勃林格殷格翰公司的猪萎缩性鼻炎灭活疫苗“茵格发”，美国辉瑞动物保健品有限公司的猪萎缩性鼻炎灭活疫苗“克伟”以及上海海利的猪传染性萎缩性鼻炎灭活疫苗。

优选地，所述猪传染性胸膜肺炎放线杆菌抗原为10⁸～10¹⁰CFU/ml，所述多杀性巴氏杆菌抗原为10⁸～10¹⁰CFU/ml，所述支气管败血波氏杆菌抗原为10⁸～10¹⁰CFU/ml。

更优选地，所述猪传染性胸膜肺炎放线杆菌抗原为10⁹CFU/ml，所述多杀性巴氏杆菌抗原为10⁹CFU/ml，所述支气管败血波氏杆菌抗原为10⁹CFU/ml。

优选地，所述佐剂包括氢氧化铝胶、矿物油、卡波姆、Montanide^TMGel、蜂胶、ISA206、ISA760VG、氢氧化铝、磷酸铝、皂苷、植物油、油酸乙酯、二（辛酸／癸酸）丙二醇酯、三（辛酸／癸酸）甘油酯、二油酸丙二醇酯、异硬脂酸酯、山梨聚糖、二缩甘露醇、甘油、聚甘油、丙二醇、油酸、异硬脂酸、蓖麻油酸、羟基硬脂酸酯、聚氧丙烯、聚氧乙烯嵌段共聚物、丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物、顺丁烯二酸酐与烯基衍生物共聚物、糖或多元醇的聚烯基醚交联的丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物的一种或几种。

本发明的另一目的在于提供一种制备所述疫苗组合物的方法，所述方法包括：

（1）培养增殖所述猪传染性胸膜肺炎放线杆菌1型、5型和7型菌液，灭活；

（2）培养增殖所述多杀性巴氏杆菌A型、B型和D型菌液，灭活；

（3）培养增殖所述支气管败血波氏杆菌液，灭活；

（4）将已灭活的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌菌种1型、5型和7型、多杀性巴氏杆菌A型、B型和D型以及支气管败血波氏杆菌按比例混合，辅以佐剂制备成疫苗。

优选地，所述灭活的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌菌种1型、5型和7型、多杀性巴氏杆菌A型、B型和D型以及支气管败血波氏杆菌混合后浓度为10⁸～10¹⁰CFU/ml。

优选地，所述各灭活菌抗原混合比例为1:1:1:1:1:1:1。

本发明的再一目的在于提供所述的疫苗组合物在制备预防和治疗由萎缩性鼻炎继发的呼吸系统疾病的药物中的应用。

本发明解决了猪传染性胸膜肺炎、猪多杀性巴氏杆菌病和猪萎缩性鼻炎各单苗免疫程序不同且需多次免疫的问题，并且发现三者在免疫效果上具有相互促进的作用，本疫苗一次单剂量免疫可以产生很好的保护效果。

本发明通过大量的筛选研究，发现猪传染性胸膜肺炎放线杆菌、猪巴氏杆菌和支气管败血波氏杆菌的抗原制备的疫苗组合物，三种抗原相互并不会相互干扰或影响；相反地，猪传染性胸膜肺炎放线杆菌、猪巴氏杆菌和支气管败血波氏杆菌的疫苗组合物不仅能够产生保护性免疫应答，还具有相互增强的免疫效果，可以很好的预防由萎缩性鼻炎继发的呼吸系统疾病。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

本发明实施例中以猪传染性胸膜肺炎放线杆菌1型LC株、5型YC株、7型YS株、多杀性巴氏杆菌A型HN5株、D型HB4株、B型C44-1株、支气管败血波氏杆菌HN8株为例说明本发明。

实施1预防猪传染性胸膜肺炎、猪多杀性巴氏杆菌病和猪萎缩性鼻炎灭活疫苗的制备方法：

1.菌种

猪传染性胸膜肺炎放线杆菌1型LC株，保藏号为：CCTCCM2011458。

猪传染性胸膜肺炎放线杆菌5型YC株，保藏号为：CCTCCM2011459。

猪传染性胸膜肺炎放线杆菌7型YS株，保藏号为：CCTCCM2011460。

多杀性巴氏杆菌A型HN5株，保藏号为：CCTCCM2011222。

多杀性巴氏杆菌D型HB4株，保藏号为：CCTCCM2011221。

多杀性巴氏杆菌B型为荚膜B型（群）多杀性巴氏杆菌C44-1株，为中国兽医药品监察所鉴定、保管和供应。

支气管败血波氏杆菌HN8株，保藏号为：CCTCCM2011223。

2.疫苗的配制

2.1生产用种子的制备

2.1.1一级种子的繁殖

猪传染性胸膜肺炎放线杆菌1型LC株、5型YC株和7型YS株冻干菌种，分别划线接种于TSA/NAD（TSA为BD公司生产，NAD为Roche公司生产）平板上，置37℃培养18～24小时，选取符合要求的菌落，接种于TSB/NAD（NAD含量为0.05%）（TSB为BD公司生产，NAD为Roche公司生产）液体培养基中，37℃培养12～16小时，作为一级种子；多杀性巴氏杆菌A型HN5株、多杀性巴氏杆菌B型C44-1株、多杀性巴氏杆菌D型HB4株和支气管败血波氏杆菌HN8株冻干菌种，划线接种于含10%鸡血清TSA（鸡血清为郑州佰安生物工程有限公司生产）平板上，置37℃培养18～24小时后挑取单克隆接种于BHI肉汤培养基中，37℃震荡培养16～18小时，经纯粹检验合格后作为一级种子。

2.1.2二级种子的繁殖

猪传染性胸膜肺炎放线杆菌1型LC株、5型YC株和7型YS株取一级种子的培养物，按1%的量加入TSB/NAD（NAD含量为0.05%）液体培养基中，37℃培养12～16小时，经检验纯粹后作为二级种子；多杀性巴氏杆菌A型HN5株、多杀性巴氏杆菌B型C44-1株、多杀性巴氏杆菌D型HB4株和支气管败血波氏杆菌HN8株选取符合要求的一级种子的培养物，按1%的量接种于BHI肉汤培养基中，37℃震荡培养12～16小时，经纯粹检验合格后作为二级种子。

2.2菌液的培养

2.2.1在TSB培养基中，加入0.01%～0.05%NAD、5%～10%的小牛血清（浙江天杭生物科技有限公司），将猪传染性胸膜肺炎放线杆菌1型LC株、5型YC株和7型YS株菌液分别按1%的量加进培养基中分别培养，混匀后置37℃培养16～18小时时停止培养。

2.2.2在脑心浸液（BHI，BD公司生产）培养基中，将多杀性巴氏杆菌A型HN5株、多杀性巴氏杆菌B型C44-1株、多杀性巴氏杆菌D型HB4株和支气管败血波氏杆菌HN8株菌液按1%的量加进培养基中培养，混匀后置37℃培养16～18小时，收获菌液。

2.2.3纯粹检验

培养结束后，分别从制苗的菌液中取样，根据《中华人民共和国兽药典（二〇一〇年版）》附录进行纯粹检验，应纯粹。

2.2.4活菌计数

分别从制苗菌液中取样，猪传染性胸膜肺炎放线杆菌用TSA/NAD（NAD含量为0.05%）平板培养进行活菌计数；多杀性巴氏杆菌和支气管败血波氏杆菌用含10%鸡血清TSA（鸡血清，郑州佰安生物工程有限公司）进行活菌计数，以确定培养的菌数。

2.2.5灭活

向上述培养好的菌液中，按总量的0.2%（V/V）加入37%的甲醛溶液（烟台市双双化工有限公司），放置于37℃灭活24h，期间搅拌3～5次。

2.2.6灭活检验

取已经灭活的3种猪传染性胸膜肺炎放线杆菌菌液分别5ml接种于100ml含0.01%～0.05%NAD、5%～10%的血清的TSB培养基中，37℃培养24小时，再移植于上述100ml含0.01%～0.05%NAD、5%～10%的血清的TSB培养基中37℃培养24小时；取灭活的3种猪传染性胸膜肺炎放线杆菌菌液0.5ml划线接种于TSA/NAD平板培养基，37℃培养24小时。两种方法培养后，均应无菌生长。

取5ml已经灭活的3种多杀性巴氏杆菌菌液和支气管败血波氏杆菌菌液分别接种于100mlBHI中，37℃培养24小时，再移植于100mlBHI培养基中37℃培养24小时；分别取已经灭活的多杀性巴氏杆菌A型、多杀性巴氏杆菌B型、多杀性巴氏杆菌D型和支气管败血波氏杆菌0.5ml划线接种于TSA（10%鸡血清）平板，37℃培养24小时。两种方法培养后，均应无菌生长。

2.2.7安检

取上述已灭活的菌液分别静脉注射18～22g的Balb/C小鼠5只，每只0.2ml，三天内5/5健活，方为灭活彻底。

2.2.8菌液的浓缩

将灭活后的菌液离心浓缩，弃上清，用PBS悬浮稀释菌体，使细菌含量相当于灭活前活菌数为1×10¹¹CFU/ml。

2.3疫苗配制

将上述已灭活、浓缩的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌1型、5型和7型菌液，多杀性巴氏杆菌A型、多杀性巴氏杆菌B型和多杀性巴氏杆菌D型菌液以及支气管败血波氏杆菌菌液按表1提供的配比比例混合，并加入疫苗总量0.01%的硫柳汞（北京市庆盛达化工技术有限公司），然后和MontanideIMS1313VG佐剂（法国赛比克公司）混合进行乳化，佐剂含量为10%～50%（按每头份用量为2ml计）；成品猪传染性胸膜肺炎放线杆菌、猪巴氏杆菌病和猪萎缩性鼻炎灭活疫苗抗原含量为灭活前猪传染性胸膜肺炎放线杆菌1型、5型和7型、多杀性巴氏杆菌A型、多杀性巴氏杆菌B型、多杀性巴氏杆菌D型和支气管败血波氏杆菌活菌数为10⁸～10¹⁰CFU／头份。除上述五种抗原和佐剂外，还补充PBS使得本发明中疫苗成品剂量（每头份用量）为2ml。

各疫苗具体成分配比如表1，配制三种疫苗A、疫苗B和疫苗C；疫苗A每种病原抗原含量（灭活前）为1×10⁸CFU/头份，疫苗B每种病原抗原含量（灭活前）为1×10⁹CFU/头份，疫苗C每种病原抗原含量（灭活前）为1×10¹⁰CFU/头份。

表1疫苗配比具体实施案例

3.疫苗的检验

3.1无菌检验按《中华人民共和国兽用生物制品规程》2000版附录50页的方法对疫苗进行无菌检验。

3.2安全试验

3.2.1小白鼠安全试验

选取3周龄BALB/c小鼠10只，分成两组，每组5只，一组各皮下注射本灭活苗0.5ml，另一组则于大腿肌肉注射0.1ml，观察10日，须无任何反应，无死亡。

3.2.2仔猪安全试验

选取30日龄以内的健康易感仔猪10头，随机取5只按用法的双倍剂量（4ml/只）颈部肌肉注射，其余5头为对照，观察三周，须无任何反应，无死亡。

3.3效力检验

选择健康易感的3周龄断奶仔猪210头，分为两组，免疫组105头，对照105头。免疫组分成三组，每组35头，分别免疫疫苗A、疫苗B和疫苗C，3周龄仔猪进行第一次免疫，间隔3周后，在6周龄用各个强毒株进行攻毒。

3.3.1猪传染性胸膜肺炎放线杆菌1型

选取免疫猪5头，连同条件相同的未免疫猪5头，气管注射猪传染性胸膜肺炎放线杆菌1型，攻毒计量为2.0×10⁹CFU/头，攻毒后观察14天，免疫仔猪4/5以上保护，对照仔猪4/5以上发病。

3.3.2猪传染性胸膜肺炎放线杆菌5型

选取免疫猪5头，连同条件相同的未免疫猪5头，气管注射猪传染性胸膜肺炎放线杆菌5型，攻毒计量为3.0×10⁹CFU/头，攻毒后观察14天，免疫仔猪4/5以上保护，对照仔猪4/5以上发病。

3.3.3猪传染性胸膜肺炎放线杆菌7型

选取免疫猪5头，连同条件相同的未免疫猪5头，气管注射猪传染性胸膜肺炎放线杆菌7型，攻毒计量为1.0×10⁹CFU/头，攻毒后观察14天，免疫仔猪4/5以上保护，对照仔猪4/5以上发病。

3.3.4多杀性巴氏杆菌A型HN5株

选取免疫猪5头，连同条件相同的未免疫猪5头，皮下注射1个致死剂量的多杀性巴氏杆菌A型HN5株，攻毒后观察14天，免疫仔猪4/5以上保护，对照仔猪5/5死亡。

3.3.5多杀性巴氏杆菌B型C44-1株

选取免疫猪5头，连同条件相同的未免疫猪5头，皮下注射1个致死剂量多杀性巴氏杆菌B型C44-1株，攻毒后观察14天，免疫仔猪4/5以上保护，对照仔猪5/5死亡。

3.3.6多杀性巴氏杆菌D型HB4株

选取免疫猪5头，连同条件相同的未免疫猪5头，皮下注射1个致死剂量多杀性巴氏杆菌D型HB4株，攻毒后观察14天，免疫仔猪4/5以上保护，对照仔猪5/5死亡。

3.3.7支气管败血波氏杆菌

选取免疫猪5头，连同条件相同的未免疫猪5头，滴鼻攻毒，攻毒剂量为每鼻孔2.0×10¹⁰CFU/头，攻毒后观察14天，免疫仔猪4/5以上保护，对照仔猪5/5发病。

3.4疫苗免疫期

选择健康易感的3周龄断奶仔猪140头，分为两组，免疫组70头，对照组70头。3周龄仔猪免疫疫苗B，分别在六个月和一年后按3.3效力检验方法进行攻毒校检。

实施例2猪传染性胸膜肺炎放线杆菌单苗、猪巴氏杆菌病单苗、波氏杆菌单苗和本发明的联苗免疫效果比较

选择健康易感的3周龄断奶仔猪210头，分为两组，免疫组105头，对照组105头。

其中免疫组中35头免疫本发明的猪传染性胸膜肺炎、猪多杀性巴氏杆菌病和猪萎缩性鼻炎的灭活疫苗B，3周龄仔猪进行免疫，间隔3周，在6周龄用各个强毒株进行攻毒，攻毒方式和剂量参见实施例1中3.3效力检验。

免疫组另外30头免疫猪传染性胸膜肺炎放线杆菌单苗（抗原含量为灭活前猪传染性胸膜肺炎放线杆菌1型、5型和7型活菌数均不少于1.0×10⁹CFU／ml）对3周龄仔猪进行第一次免疫，其中15头不进行第二次免疫，在6周龄用各个强毒株进行攻毒。另外15头一免后2周进行加强免疫，各肌肉注射疫苗2ml。二免后2周，在7周龄用各个强毒株进行攻毒，攻毒方式和剂量参见3.3效力检验。

免疫组另外30头免疫多杀性巴氏杆菌三价灭活苗（抗原含量为灭活前多杀性巴氏杆菌A型、多杀性巴氏杆菌B型和多杀性巴氏杆菌D型活菌数均不少于1.0×10⁹CFU／ml）3周龄仔猪进行免疫，其中15头各皮下注射疫苗2ml，另15头各皮下注射疫苗5ml，间隔3周，在5周龄用各个强毒株进行攻毒。

免疫组另外10头免疫波氏杆菌单价灭活苗（抗原含量为灭活前支气管败血波氏杆菌活菌数均不少于1.0×10⁹CFU／ml。）3周龄仔猪进行免疫，其中5头不进行第二次免疫，在6周龄用各个强毒株进行攻毒。另外5头一免后2周进行加强免疫，各肌肉注射疫苗2ml。二免后2周，在7周龄用各个强毒株进行攻毒，攻毒方式和剂量参见实施例1中3.3效力检验。

结果

1无菌检验：按“规程”附录50页的方法对疫苗进行无菌检验，结果均无菌生长。

2安全试验结果

2.1小白鼠安全试验

分别对3周龄BALB/c小鼠皮下注射本灭活苗0.5ml和大腿肌肉注射本灭活苗0.1ml，注射后观察10日，小鼠精神状态良好，无不良反应，无死亡情况。

2.2仔猪安全试验

对30日龄以内仔猪双倍剂量注射本发明的三种灭活苗，注射后观察三周，未见有不良反应，仔猪进食正常，神状态良好，无死亡情况。三周后剖杀，所有脏器未见异常变化。

综合以上安全试验证明疫苗安全性良好。

3效力检验结果

攻毒后观察记录各组发病情况，结果见表2、表3和表4。

表2疫苗A免疫后攻毒各组发病及保护情况表

毒株	免疫组	未免疫组
			猪传染性胸膜肺炎放线杆菌1型	4/5保护	5/5发病
猪传染性胸膜肺炎放线杆菌5型	4/5保护	4/5发病
			猪传染性胸膜肺炎放线杆菌7型	4/5保护	5/5发病
多杀性巴氏杆菌A型HN5株	4/5保护	5/5死亡

多杀性巴氏杆菌B型C44-1株	4/5保护	5/5死亡
			多杀性巴氏杆菌D型HB4株	4/5保护	5/5死亡
支气管败血波氏杆菌	5/5保护	5/5发病

表3疫苗B免疫后攻毒各组发病及保护情况表

毒株	免疫组	未免疫组
			猪传染性胸膜肺炎放线杆菌1型	5/5保护	5/5发病
猪传染性胸膜肺炎放线杆菌5型	5/5保护	4/5发病
			猪传染性胸膜肺炎放线杆菌7型	5/5保护	5/5发病
多杀性巴氏杆菌A型HN5株	4/5保护	5/5死亡
			多杀性巴氏杆菌B型C44-1株	5/5保护	5/5死亡
多杀性巴氏杆菌D型HB4株	4/5保护	5/5死亡
			支气管败血波氏杆菌	5/5保护	5/5发病

表4疫苗C免疫后攻毒各组发病及保护情况表

毒株	免疫组	未免疫组
			猪传染性胸膜肺炎放线杆菌1型	5/5保护	5/5发病
猪传染性胸膜肺炎放线杆菌5型	4/5保护	4/5发病
			猪传染性胸膜肺炎放线杆菌7型	5/5保护	5/5发病
多杀性巴氏杆菌A型HN5株	5/5保护	5/5死亡
			多杀性巴氏杆菌B型C44-1株	5/5保护	5/5死亡
多杀性巴氏杆菌D型HB4株	4/5保护	5/5死亡
			支气管败血波氏杆菌	4/5保护	5/5发病

以上结果表明配制的疫苗A、疫苗B和疫苗C三种疫苗效力检验合格，该发明的三种疫苗免疫仔猪能够抵御各强毒株的攻毒检验。以上结果还表明猪传染性胸膜肺炎、猪多杀性巴氏杆菌病和猪萎缩性鼻炎的灭活疫苗应用本发明的免疫程序三者免疫效力都达标，解决了三者免疫程序和免疫量不同的问题。

4猪传染性胸膜肺炎放线杆菌单苗、猪巴氏杆菌病单苗、波氏杆菌单苗和本发明的联苗免疫效果比较

表5猪传染性胸膜肺炎、猪多杀性巴氏杆菌病和猪萎缩性鼻炎的灭活疫苗B单剂量免疫后攻毒效力检验结果

毒株	免疫组	未免疫组
			猪传染性胸膜肺炎放线杆菌1型	4/5保护	5/5发病
猪传染性胸膜肺炎放线杆菌5型	5/5保护	4/5发病
			猪传染性胸膜肺炎放线杆菌7型	5/5保护	5/5发病
多杀性巴氏杆菌A型HN5株	5/5保护	5/5死亡
			多杀性巴氏杆菌B型C44-1株	5/5保护	5/5死亡
多杀性巴氏杆菌D型HB4株	4/5保护	5/5死亡
			支气管败血波氏杆菌	5/5保护	5/5发病

表6传染性胸膜肺炎放线杆菌单苗免疫后攻毒效力检验结果

表7多杀性巴氏杆菌三价灭活疫苗免疫后攻毒效力检验结果

表8支气管败血波氏杆菌灭活疫苗免疫后攻毒效力检验结果

以上结果表明本发明的猪传染性胸膜肺炎、猪多杀性巴氏杆菌病和猪萎缩性鼻炎的灭活疫苗单剂量单次免疫后可对仔猪提供对各个强毒株攻毒很好的免疫保护，而各个单苗需要进行两次免疫或增加一倍以上的免疫剂量才能达到三者之间联苗相同的保护效果。进而本数据表明本发明的猪传染性胸膜肺炎、猪多杀性巴氏杆菌病和猪萎缩性鼻炎的灭活疫苗各个组分之间在免疫效果上具有相互促进的作用，从而使单剂量单次免疫就能够产生足够的免疫保护。

5免疫期研究结果

表9本发明疫苗B免疫六个月后效力检验结果

毒株	免疫组	未免疫组
			猪传染性胸膜肺炎放线杆菌1型	5/5保护	5/5发病
猪传染性胸膜肺炎放线杆菌5型	4/5保护	4/5发病
			猪传染性胸膜肺炎放线杆菌7型	5/5保护	5/5发病
多杀性巴氏杆菌A型HN5株	4/5保护	5/5死亡
			多杀性巴氏杆菌B型C44-1株	5/5保护	5/5死亡

多杀性巴氏杆菌D型HB4株	5/5保护	5/5死亡
			支气管败血波氏杆菌	5/5保护	5/5发病

表10传染性胸膜肺炎放线杆菌单苗免疫后六个月攻毒效力检验结果

表11多杀性巴氏杆菌三价灭活疫苗单苗免疫后六个月攻毒效力检验结果

表12支气管败血波氏杆菌灭活疫苗单苗免疫后六个月攻毒效力检验结果

表13本发明疫苗B免疫一年后效力检验结果

毒株	免疫组	未免疫组
			猪传染性胸膜肺炎放线杆菌1型	4/5保护	5/5发病
猪传染性胸膜肺炎放线杆菌5型	5/5保护	4/5发病
			猪传染性胸膜肺炎放线杆菌7型	5/5保护	5/5发病
多杀性巴氏杆菌A型HN5株	5/5保护	5/5死亡
			多杀性巴氏杆菌B型C44-1株	4/5保护	5/5死亡
多杀性巴氏杆菌D型HB4株	5/5保护	5/5死亡
			支气管败血波氏杆菌	5/5保护	5/5发病

表14传染性胸膜肺炎放线杆菌单苗免疫后一年攻毒效力检验结果

表15多杀性巴氏杆菌三价灭活疫苗单苗免疫后一年攻毒效力检验结果

表16支气管败血波氏杆菌灭活疫苗单苗免疫后一年攻毒效力检验结果

以上结果表明本发明的猪传染性胸膜肺炎、猪多杀性巴氏杆菌病和猪萎缩性鼻炎的灭活疫苗单剂量单次免疫后可对仔猪提供对各个强毒株攻毒很好的免疫保护，保护期可达一年；而各个单苗需要进行两次免疫或者进行大剂量免疫才能达到三者之间联苗相同的保护效果。进而本数据表明本发明的猪传染性胸膜肺炎、猪多杀性巴氏杆菌病和猪萎缩性鼻炎的灭活疫苗各个组分之间在免疫效果上具有相互促进的作用，从而使单剂量单次免疫就能够产生足够的免疫保护，免疫保护期可达一年之久。

实施例3萎缩性鼻炎继发感染的呼吸系统疾病的感染模型

选取6周龄仔猪分成8组。所有小猪均通过口鼻途径按照表17的方案接种各菌毒液

表17萎缩性鼻炎继发感染的呼吸系统疾病的感染模型分组表

试验攻击结果：

A组：猪正常，未有任何症状，解剖各器官正常。

B组：猪正常，未有任何症状，解剖发现鼻甲骨有轻微萎缩，肺部未有病变，鼻拭子未检测到波氏杆菌。

C组：仔猪出现慢性型症状，偶有咳嗽症状，解剖发现肺部多处坏死灶、胸膜及心包有纤维素絮状物附着，取肺部病变能检测到多杀性巴氏杆菌A型病原。

D组：仔猪出现慢性型症状，轻度发热或不发热，食欲减退，肺脏上可见大小不等的结节，心包内可见到出血点。取肺部病变能检测到猪传染性胸膜肺炎放线杆菌。

E组：攻毒后仔猪死亡1头，其余仔猪食欲减退消瘦，被毛粗乱，有咳嗽、打喷嚏、流鼻涕等症状，肺有肺炎病变，有出血斑点、水肿、气肿和红色肝变区，有纤维样粘附物，与胸膜粘连，鼻甲骨严重萎缩。取肺部病变能检测到多杀性巴氏杆菌A型病原，肺部病变和鼻拭子未检测到波氏杆菌。

F组：攻毒后猪体温升高至41～42℃，心率增加，精神沉郁，死亡2头，病死猪剖检可见气管和支气管内充满泡沫状带血的分泌物。肺充血、出血和血管内有纤维素性血栓形成，其余仔猪剖检肺脏上可见大小不等的结节，心包内可见到出血点。取肺部病变能检测到猪传染性胸膜肺炎放线杆菌。肺部病变和鼻拭子未检测到波氏杆菌。

G组：仔猪出现慢性型症状，轻度发热、有咳嗽症状，仔猪未有死亡情况，解剖发现肺部多处坏死灶、胸膜及心包有纤维素絮状物附着，取肺部病变能检测到多杀性巴氏杆菌A型病原和猪传染性胸膜肺炎放线杆菌。

H组：攻毒后仔猪体温升高至41～42℃，心率增加，精神沉郁，猪死亡4头，其余仔猪食欲减退消瘦，被毛粗乱，有咳嗽、打喷嚏、流鼻涕等症状，病死猪剖检可见气管和支气管内充满泡沫状带血的分泌物。肺充血、出血和血管内有纤维素性血栓形成。肺泡与间质水肿。肺有肺炎病变，有出血斑点、水肿、气肿和红色肝变区，有纤维样粘附物，与胸膜粘连，鼻甲骨严重萎缩。取肺部病变能检测到多杀性巴氏杆菌A型病原猪传染性胸膜肺炎放线杆菌，肺部病变和鼻拭子未检测到波氏杆菌。

2仔猪免疫后混合攻毒效检

选择健康易感的3周龄断奶仔猪10头，分为两组，免疫组5头，对照组5头。3周龄仔猪免疫疫苗B，间隔3周后，在6周龄用各个强毒株按照H组的攻毒方式和剂量，攻毒后观察4周。免疫组未有临床症状，解剖发现只有一头仔猪有轻微肺部病变，鼻甲骨正常，免疫保护率为5/5。未免疫组仔猪4/5死亡，另外一头有严重的鼻甲骨萎缩和肺部病变，对照组发病率为5/5。有以上结果表明免疫本发明组合物，在混合攻击（H组攻毒方式）的攻毒模式，能产生很好的免疫效果。

1、本发明采用国内流行猪传染性胸膜肺炎放线杆菌1型LC株、5型YC株和7型YS株；猪多杀性巴氏杆菌A型HN5株、多杀性巴氏杆菌B型C44-1株和多杀性巴氏杆菌D型HB4株；支气管败血波氏杆菌HN8株毒株制备的疫苗免疫效果良好，能够同时有效预防猪传染性胸膜肺炎、猪肺疫和猪萎缩性鼻炎。

2、本发明的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌抗原、多杀性巴氏杆菌抗原及支气管败血波氏杆菌抗原疫苗组合物，三者在免疫效果上具有相互促进的作用，抗体持续期增长，免疫保护期可达一年以上。

3、本发明的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌抗原、多杀性巴氏杆菌抗原及支气管败血波氏杆菌抗原疫苗组合物，单剂量单次免疫就能够产生足够的免疫保护，可使免疫次数大大减少，减少多次免疫对猪只产生的应激反应。

4、本发明的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌抗原、多杀性巴氏杆菌抗原及支气管败血波氏杆菌抗原疫苗组合物，实施例中证明可以很好的预防由萎缩性鼻炎继发的呼吸系统疾病。

5、含有两种或两种以上抗原、可以预防两种或两种以上疾病的联合疫苗以其方便、多效、低成本成为新一代疫苗研究的特点。与单一疫苗相比，联合疫苗可以减少疫苗的接种次数，避免因漏种而不能得到全程免疫；另外，疫苗大多不耐热，其生产、运输、储存乃至全部使用过程均需在较低温度下进行，即所谓的“冷链”，这种环环相扣的冷链运作，费用极高，使疫苗成本居高不下，而使用联合疫苗，则可以大大降低冷链运作的费用，因此具有显著的优越性。

本发明的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌抗原、多杀性巴氏杆菌抗原及支气管败血波氏杆菌抗原疫苗组合物，制备方法简单，疫苗的效价含量高，免疫方便快捷，与现有技术中的多次免疫，至少需要打2针或3针才能防治以上二种疾病的疫苗及其免疫方法相比，本发明仅免疫1次就能够预防猪传染性胸膜肺炎放线杆菌和猪多杀性巴氏杆菌以及支气管败血波氏杆菌三种病原感染，降低了免疫成本，节约了免疫程序，更加经济可靠。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种预防由萎缩性鼻炎继发的呼吸系统疾病的疫苗组合物，所述疫苗组合物包括：

免疫量的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌抗原；

免疫量的多杀性巴氏杆菌抗原；

免疫量的支气管败血波氏杆菌抗原；以及佐剂；

其中，所述猪传染性胸膜肺炎放线杆菌抗原包括猪传染性胸膜肺炎放线杆菌1型全菌抗原、5型全菌抗原、7型全菌抗原；所述多杀性巴氏杆菌抗原包括A型全菌抗原、B型全菌抗原、D型全菌抗原；以及所述支气管败血波氏杆菌抗原包括支气管败血波氏杆菌全菌抗原；

其中所述猪传染性胸膜肺炎放线杆菌抗原为10⁸～10¹⁰CFU/ml，所述多杀性巴氏杆菌抗原为10⁸～10¹⁰CFU/ml，所述支气管败血波氏杆菌抗原为10⁸～10¹⁰CFU/ml；其中，所述猪传染性胸膜肺炎放线杆菌1型全菌抗原为猪传染性胸膜肺炎放线杆菌1型LC株灭活株，所述猪传染性胸膜肺炎放线杆菌5型全菌抗原为猪传染性胸膜肺炎放线杆菌5型YC株灭活株，所述猪传染性胸膜肺炎放线杆菌7型全菌抗原为猪传染性胸膜肺炎放线杆菌7型YS株灭活株，所述LC株保藏号为：CCTCCNO:M2011458,所述YC株保藏号为：CCTCCNO:M2011459,所述YS株保藏号为：CCTCCNO:M2011460；

所述多杀性巴氏杆菌A型全菌抗原为HN5株灭活株，所述多杀性巴氏杆菌B型全菌抗原为C44-1株灭活株，所述多杀性巴氏杆菌D型全菌抗原为HB4株灭活株，所述HN5株保藏号为：CCTCCNO.M2011222，所述HB4株保藏号为：CCTCCNO.M2011221；

所述支气管败血波氏杆菌全菌抗原为支气管败血波氏杆菌HN8株灭活株，所述HN8株保藏号为：CCTCCNO.M2011223。

2.根据权利要求1所述的疫苗组合物，其中所述猪传染性胸膜肺炎放线杆菌抗原为10⁹CFU/ml，所述多杀性巴氏杆菌抗原为10⁹CFU/ml，所述支气管败血波氏杆菌抗原为10⁹CFU/ml。

3.根据权利要求1所述的疫苗组合物，其中，所述佐剂包括氢氧化铝胶、矿物油、卡波姆、Montanide^TMGel、蜂胶、ISA206、ISA760VG、氢氧化铝、磷酸铝、皂苷、植物油、油酸乙酯、二辛酸丙二醇酯、二癸酸丙二醇酯、三辛酸甘油酯、三癸酸甘油酯、二油酸丙二醇酯、异硬脂酸酯、山梨聚糖、二缩甘露醇、甘油、聚甘油、丙二醇、油酸、异硬脂酸、蓖麻油酸、羟基硬脂酸酯、聚氧丙烯、聚氧乙烯嵌段共聚物、丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物、顺丁烯二酸酐与烯基衍生物共聚物、糖或多元醇的聚烯基醚交联的丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物的一种或几种。

4.一种制备权利要求1所述疫苗组合物的方法，所述方法包括：

(1)培养增殖所述猪传染性胸膜肺炎放线杆菌1型、5型和7型菌液，灭活；

(2)培养增殖所述多杀性巴氏杆菌A型、B型和D型菌液，灭活；

(3)培养增殖所述支气管败血波氏杆菌液，灭活；

(4)将已灭活的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌菌种1型、5型和7型、多杀性巴氏杆菌A型、B型和D型以及支气管败血波氏杆菌按比例混合，辅以佐剂制备成疫苗；

其中所述猪传染性胸膜肺炎放线杆菌抗原为10⁸～10¹⁰CFU/ml，所述多杀性巴氏杆菌抗原为10⁸～10¹⁰CFU/ml，所述支气管败血波氏杆菌抗原为10⁸～10¹⁰CFU/ml。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其中，所述灭活的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌菌种1型、5型和7型、多杀性巴氏杆菌A型、B型和D型以及支气管败血波氏杆菌混合后浓度为10⁸～10¹⁰CFU/ml；

所述灭活的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌菌种1型、5型和7型分别为灭活的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌菌种1型LC株、5型YC株和7型YS株；

所述灭活的多杀性巴氏杆菌A型、B型和D型分别为灭活的多杀性巴氏杆菌A型HN5株、B型C44-1株和D型HB4株。

所述灭活的支气管败血波氏杆菌为支气管败血波氏杆菌HN8株灭活株。

6.根据权利要求4所述的制备方法，其中，所述各灭活菌抗原混合比例为1:1:1:1:1:1:1。

7.根据权利要求1～3所述的疫苗组合物在制备预防由萎缩性鼻炎继发的呼吸系统疾病的药物中的应用。