CN107365720B

CN107365720B - 一种具有交叉保护力的血清5型副猪嗜血杆菌及其应用

Info

Publication number: CN107365720B
Application number: CN201710439942.3A
Authority: CN
Inventors: 贾爱卿; 王贵平; 包银莉; 邓胜朝
Original assignee: Sichuan Hailinge Biological Pharmaceutical Co ltd; Guangdong Haid Animal Husbandry And Veterinary Research Institute Co ltd
Current assignee: Sichuan Hailinge Biological Pharmaceutical Co ltd; Guangdong Haid Animal Husbandry And Veterinary Research Institute Co ltd
Priority date: 2017-06-12
Filing date: 2017-06-12
Publication date: 2018-10-12
Anticipated expiration: 2037-06-12
Also published as: CN107365720A

Abstract

本发明公开了一种具有交叉保护力的血清5型副猪嗜血杆菌及其应用。该副猪嗜血杆菌的保藏编号为GDMCC No：60189，记名为副猪嗜血杆菌GDMZ株，毒力较血清5型参考菌株Nagasaki株强，并具有较好的交叉保护力，能保护目前国内主要的流行血清型1、4、5、6、12、13型副猪嗜血杆菌菌株的侵害。利用本发明筛选出的副猪嗜血杆菌GDMZ制备副猪嗜血杆菌疫苗，工艺简单，仅需单独培养副猪嗜血杆菌GDMZ，经常规处理即可制备得到副猪嗜血杆菌疫苗。本发明技术工艺简单，可以完全克服目前市场上多价副猪嗜血杆菌疫苗生产中工艺繁琐的缺陷。

Description

一种具有交叉保护力的血清5型副猪嗜血杆菌及其应用

技术领域

本发明属于兽医生物制品技术领域，具体涉及一种具有交叉保护力的血清5型副猪嗜血杆菌及其应用。

背景技术

副猪嗜血杆菌病是近年来严重危害养猪业的新发细菌性传染病，引起猪的多发性浆膜炎、关节炎和脑膜脑炎等，发病率一般为10-15％，死亡率可达50％以上，给养猪业带来了巨大的经济损失，引起了人们的日益重视。该病的致病菌副猪嗜血杆菌(Hps)的血清型复杂多样，按Kieleetin Rapp-Gbarideosn(KRG)琼脂扩散血清分型方法，至少可将Hps分为15个血清型，另有20％以上的分离株血清型不可定。已有的资料表明，Hps具有明显的地方性特征。

因副猪嗜血杆菌极易产生耐药性，所以控制该病的有效方式是疫苗接种。文献报道商业疫苗或自家苗的使用可以控制副猪嗜血杆菌的感染。但是也有使用灭活菌苗预防失败的实例，这可能是由于致病菌株与疫苗菌株血清型不同因而缺乏交叉保护。虽然交叉保护是对商品灭活疫苗的基本要求，但是菌株特异性灭活菌苗可能因为猪群中存在不止一种菌株或血清型而缺乏效力，也可能因为后来猪群中引入了新的菌株而失去效力。基于副猪嗜血杆菌血清型的多样性，占很大比例的菌株不能分型，菌株毒力的差异等原因，以及当前对保护性抗原和毒力因子缺乏深刻认识的现状下，目前还没有一种商品菌苗同时对所有的致病菌株产生交叉保护力。因此，现今市售的副猪嗜血杆菌疫苗均为多价疫苗。比如武汉某公司生产的副猪嗜血杆菌二价灭活疫苗为2个血清型的毒株，包括血清4型和5型。西班牙某公司生产的副猪嗜血杆菌灭活疫苗为多个血清型的毒株，包括2个血清型，1型和6型。上述多价疫苗在生产过程中需分别培养毒株，再经分别浓缩后，将抗原混合到一起，工艺繁琐。

因此，研制具有交叉保护的商品菌苗及单价疫苗是预防和控制副猪嗜血杆菌病的必然要求和大势所趋。此外还需要控制成本，使得免疫成本低廉，不能超出养殖者的承受能力。

发明内容

本发明的目的在于提供一种具有交叉保护力的血清5型副猪嗜血杆菌及其应用。

本发明所采取的技术方案是：

一种副猪嗜血杆菌，该副猪嗜血杆菌的保藏编号为GDMCC No：60189，记名为副猪嗜血杆菌GDMZ株。

本发明提供的副猪嗜血杆菌GDMZ株，于2017年05月17日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省微生物研究所)，保藏号为：GDMCCNo：60189，保藏中心建议的分类命名为Haemophilus parasuis。保藏中心于2017年05月18日鉴定菌株是存活的。

上述副猪嗜血杆菌在制备防控猪副猪嗜血杆菌病的药物中的应用。

优选的，所述的药物为疫苗。

一种疫苗，是用上述所述的副猪嗜血杆菌作为抗原制备的。

优选的，所述的疫苗为灭活疫苗。

优选的，所述疫苗中的佐剂为铝胶。

优选的，所述的疫苗为单价疫苗。

优选的，所述的副猪嗜血杆菌的含量为3×10⁹～3×10¹²CFU/mL。

本发明的有益效果是：

本发明申请人从200多株菌株中筛选出一株血清5型副猪嗜血杆菌，记名为副猪嗜血杆菌GDMZ株，其毒力较强，较血清5型参考菌株Nagasaki株毒力强，其免疫原性佳，优于商品疫苗，并具有较好的交叉保护力，能保护猪免受目前国内主要的流行血清1、4、5、6、12、13型副猪嗜血杆菌的侵害。

本发明副猪嗜血杆菌GDMZ制备得到的副猪嗜血杆菌疫苗为单价灭活疫苗，为市场上首创性产品，可以弥补这一块的市场空白。所述单价疫苗具有较好的交叉保护力，利用其对猪进行免疫接种，可以抵御国内主要的副猪嗜血杆菌流行血清型1、4、5、6、12、13型菌株的侵害，市场前景广阔。

利用本发明筛选出的副猪嗜血杆菌GDMZ制备副猪嗜血杆菌单价灭活疫苗，工艺简单，仅需单独培养副猪嗜血杆菌GDMZ，经常规处理即可制备得到副猪嗜血杆菌疫苗。本发明技术工艺简单，成本低廉，可以克服市场上多价副猪嗜血杆菌疫苗生产中工艺繁琐的缺陷。

附图说明

图1为平板上的菌落生长形态；

图2为经革兰氏染色后在显微镜下的菌落形态；

图3为副猪嗜血杆菌在血平板上的卫星现象；

图4为PCR鉴定结果；

图5为血清型鉴定结果；

图6为副猪嗜血杆菌GDMZ株的生长曲线。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但不限于此。

实施例1副猪嗜血杆菌GDMZ株的分离、筛选、鉴定和毒力试验

一、副猪嗜血杆菌GDMZ株的分离、筛选和鉴定：

1、副猪嗜血杆菌菌株的分离和初步鉴定：

2015年从广东梅州地区某发病猪群采集病料，无菌操作下，用棉拭子蘸取脑组织，接种于含体积百分比10％犊牛血清和0.1％NAD(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，Nicotinamideadenine dinucleotide)的TSA平板，37℃培养过夜。

菌落在平板上的生长形态如图1所示，挑取在平板上生长良好，菌落形态较小，灰白色、半透明、边缘整齐、稍黏菌落，经革兰氏染色，显微镜下观察，显微镜下的菌落形态如图2所示，为呈淡红色，呈长链或短链的菌落；可疑菌落在金黄色葡萄球菌两侧有针尖大小、圆形、边缘整齐的菌落生长，离金黄色葡萄球菌愈近菌落较大，愈远菌落较小，呈现出明显的“卫星现象”，初步证实是副猪嗜血杆菌，图3所示。

2、副猪嗜血杆菌菌株的筛选

对初步证实是副猪嗜血杆菌的200多株菌株进行筛选。经初步筛选，确定8株副猪嗜血杆菌进行进一步的动物试验，进行毒力比较。

取250g豚鼠45只，随机分成9组，每组5只，其中5只作为阴性对照，注射生理盐水，其它每组腹腔注射副猪嗜血杆菌，5×10⁸/只，连续观察10天，观察记录试验豚鼠发病及死亡情况，部分结果如表1所示。根据毒力情况，筛选毒力菌株。

表1毒力比较结果

菌株名称	感染菌量(CFU)	豚鼠数(头)	发病数(头)	发病率
					GDMZ	5×10⁸	5	5	100％
GD01	5×10⁸	5	2	40％
					GD02	5×10⁸	5	1	20％
GD03	5×10⁸	5	3	60％
					GD04	5×10⁸	5	0	0
GD05	5×10⁸	5	1	20％
					GD06	5×10⁸	5	1	20％
GD07	5×10⁸	5	0	0
					生理盐水	1ml	5	0	0

表1结果显示：试验结果显示命名为GDMZ的副猪嗜血杆菌菌株能引起5只试验豚鼠全部发病，毒力最强。

3、副猪嗜血杆菌菌株的鉴定

对毒力最强的副猪嗜血杆菌GDMZ株扩大培养后进行16S rRNA的鉴定。使用的引物序列为：

P1：5'-TGACCAGCCACACTGGAAC-3'(SEQ ID NO:1)；

P2：5'-GCAACAAAGGATAAGGGT-3'(SEQ ID NO:2)。

PCR结果见图4。16S rRNA PCR产物送上海生工生物工程有限公司测序，测序结果与GenBank中已知序列进行Blast比对，比对结果显示PCR获得的基因片段为822bp，与已知副猪嗜血杆菌的同源性在99～100％，确定分离到的菌株为副猪嗜血杆菌。

用副猪嗜血杆菌标准阳性血清进行凝集试验。结果显示该菌株为血清5型。另外用PCR方法对其进行血清型分型鉴定引物序列如下：

funK5-up：5'-TAGTTGGTATATTATTTTCT-3'(SEQ ID NO:3)；

funK5-down：5'-AGAATGCATCTGTACCACTAAG-3'(SEQ ID NO:4)。

如图5所示，经PCR扩增获得大小约为560bp的目的片段，扩增产物经测序，测序结果比对副猪嗜血杆菌血清5型的funK基因，显示同源性为100％，因此确定所分离的菌株为血清5型，记名为副猪嗜血杆菌GDMZ株。

二、副猪嗜血杆菌GDMZ株的培养

对副猪嗜血杆菌GDMZ株进行培养，生长曲线结果见图5。

图6中GDMZ株的培养特性显示，在液体培养基TSB中培养副猪嗜血杆菌，在接种4h左右，溶液的OD_600nm值开始上升，在培养12～24h之间溶液的OD_600nm值达到最大，以后随着时间延长，溶液的OD_600nm值反而下降。

三、副猪嗜血杆菌GDMZ株的毒力试验

取25日龄断奶仔猪30头，随机分成6组，每组5头，其中5头作为阴性对照，注射生理盐水，1组腹腔注射副猪嗜血杆菌5型标准菌株Nagasaki株，4组注射GDMZ株，连续观察10天，观察记录试验仔猪发病及死亡情况，结果如表2所示。

表2仔猪攻毒结果

试验结果显示，腹腔注射1×10⁹CFU Nagasaki株后，5头试验仔猪均发病，而注射1×10⁹、5×10⁸CFU GDMZ株时，各实验组5头仔猪均发病，注射1×10⁸CFU时3头仔猪发病，注射5×10⁷CFU时1头仔猪发病。试验结果显示副猪嗜血杆菌GDMZ株毒力较强。

血清5型强毒株Nagasaki株是副猪嗜血杆菌的标准参考菌株，而血清5型被认为是毒力最强的血清型，Nagasaki株5×10⁸CFU时仅引起2头仔猪发病，因此，本发明筛选出来的副猪嗜血杆菌GDMZ株的毒力比Nagasaki株的毒力更强。

实施例2副猪嗜血杆菌疫苗的制备以及免疫效力检测

一、副猪嗜血杆菌疫苗的制备

通过以下步骤制备疫苗：

1)一级种子液制备：取冻干保存的副猪嗜血杆菌GDMZ株接种于TSA固体平板，在温度为37℃的条件下培养18h；然后挑取单菌落于TSB培养基中，在温度为37℃的条件下，以转速120rpm振荡培养18h，进行纯粹检验合格后，作为一级种子液，置2～8℃保存备用，保存时间均不超过3天。

2)二级种子液制备：取步骤1)得到的一级种子液，按种子液与培养基的体积比1:20接种于TSB培养基中，在温度为37℃的条件下，以转速120rpm振荡培养16h，进行纯粹检验合格后，作为二级种子液，置2～8℃保存备用，保存时间均不超过3天。

3)原菌液制备：取步骤2)得到的二级种子培养液，按种子液与培养基的体积比1:100接种于TSB培养基中，在温度为37℃的条件下，以转速120rpm振荡培养24h后，得到原菌液。

4)活菌计数：将步骤3)中获得的菌液进行活菌计数，步骤如下：

将副猪嗜血杆菌接种于TSA固体培养基上，37℃培养12h左右，用pH 7.4PBS洗下菌苔后反复吹打混合均匀，再进行平板菌落计数：每个样品取1mL，用pH 7.4PBS做10倍系列稀释，每个稀释度换1支吸管。具体方法是：准确吸取菌液100μL，放入盛有稀释液900μL的第一支1.5mL离心管中(不接触液面)，另取1支1mL枪头将第一管液体混合均匀后，吸取100μL放入盛有稀释液900μL的第2支1.5mL离心管中，依次稀释至最后1管。根据对样品含菌数的估计，选择适宜稀释度，吸取最终稀释度的菌液接种适宜的培养基平板3个，每个滴100μL，使菌液散开，置37℃凉干后，翻转平板，培养48～72h，按照下列方法数出每个平皿中的菌落个数，计算每mL菌液中的活菌数(CFU/mL)。

5)灭活：在上述菌液中加入终浓度为0.2-0.4％的甲醛溶液，37℃振荡灭活24h。

6)乳化：在步骤5)得到的灭活菌液中取样，按照《中华人民共和国兽药典》附录进行纯粹检验；将原菌液在转速为8000rpm的条件下离心10min取沉淀的菌体，用无菌生理盐水重悬菌体后洗涤，经洗涤的菌体用生理盐水稀释成浓度为3×10¹⁰CFU/mL的制苗菌液，将制苗菌液与铝胶佐剂以体积比4：1～9:1混合，转速8000rpm的条件下乳化20min，得到治疗副猪嗜血杆菌病的疫苗，2～8℃保存备用。

二、副猪嗜血杆菌疫苗的免疫效力检测

A.对豚鼠的免疫保护试验

取豚鼠15只，随机分成3组，每组5只，A组用上述制备的副猪嗜血杆菌疫苗肌肉注射豚鼠，2mL/只，14天后二免，2mL/只，B组注射市售副猪嗜血杆菌灭活疫苗，2mL/只，14天后二免，2mL/只，C组免疫生理盐水，二免14天后，对免疫组和对照组豚鼠用血清5型强毒株Nagasaki株进行攻毒，腹腔注射，1.5×10⁹CFU/只，连续观察10天，观察记录豚鼠发病和死亡情况，计算每组保护率，如表3所示。

表3疫苗免疫保护试验结果

组别	组别	豚鼠数(只)	发病数(只)	死亡数(只)	死亡率
						A	免疫组	5	0	0	0％
B	市售商品苗	5	2	2	40％
						C	对照组	5	5	4	80％

试验结果显示，疫苗免疫组攻毒后未出现发病和死亡，市售商品苗组有2只豚鼠发病，2只死亡，死亡率达40％，而对照组5只豚鼠均发病，4只死亡，证实本发明制备的疫苗对强毒株具有较好的保护效率，且保护效果优于市售商品疫苗。

B.对不同血清型副猪嗜血杆菌的交叉保护试验

因我国临床中主要流行血清4、5、12、13型副猪嗜血杆菌，且现有的商品疫苗中除了4型和5型的二联疫苗外，还有1型和6型的二联苗，所以就疫苗对这6个血清型的交叉保护试验进行了验证。取60只豚鼠，随机分成12组，其中6组肌肉注射副猪嗜血杆菌(GDMZ株)灭活疫苗，2mL/只，14天后二免，2mL/只，对照组注射生理盐水，二免14天后分别用血清1、4、5、6、12、13型副猪嗜血杆菌进行攻毒，2×10⁹CFU/只，连续观察10天，观察记录豚鼠发病和死亡情况，计算每组保护率，如表4所示。

表4副猪嗜血杆菌(GDMZ株)灭活疫苗对豚鼠的免疫保护结果

试验结果显示，制备的副猪嗜血杆菌(GDMZ株)灭活疫苗对我国临床中主要流行的血清型1、4、5、6、12、13型均能够提供较好的交叉保护，具有良好的市场前景。

C.副猪嗜血杆菌(GDMZ株)灭活疫苗对仔猪的攻毒保护试验

取40头15日龄仔猪，随机分成8组，每组5头，其中A、C、E、F组分布颈部肌肉注射副猪嗜血杆菌(GDMZ株)灭活疫苗，2mL/头，14天后二免，2mL/头，B、D、F、H组分别注射生理盐水，所有实验组在二免14天后分别用血清1、4、5、6、12、13型副猪嗜血杆菌进行攻毒，3×10⁹CFU/只，连续观察10天，观察记录仔猪发病和死亡情况，计算每组保护率，如表5所示。

表5副猪嗜血杆菌(GDMZ株)灭活疫苗对仔猪的免疫保护结果

表5结果显示，本发明的副猪嗜血杆菌(GDMZ株)灭活疫苗对血清1、4、5、6、12、13型副猪嗜血杆菌的攻毒具有较好的免疫保护效果，对试验仔猪能产生较好的免疫保护效力，保护率均为90％以上。该毒株制备成疫苗后可以完全克服目前市场上多价副猪嗜血杆菌疫苗生产中工艺繁琐的缺陷，为疫苗厂大大的节约生产成本，且该疫苗对临床主要流行血清型具有较好的免疫保护效力，一旦上市将有着广阔的市场前景。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 广东海大畜牧兽医研究院有限公司，四川海林格生物制药有限公司

<120> 一种具有交叉保护力的血清5型副猪嗜血杆菌及其应用

<130>

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tgaccagcca cactggaac 19

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gcaacaaagg ataagggt 18

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tagttggtat attattttct 20

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

agaatgcatc tgtaccacta ag 22

Claims

1.一种副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis)，其特征在于：该副猪嗜血杆菌的保藏编号为GDMCC No：60189。

2.权利要求1所述的副猪嗜血杆菌在制备防控猪副猪嗜血杆菌病的药物中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述的药物为疫苗。

4.一种疫苗，其特征在于，所述的疫苗是用权利要求1所述的副猪嗜血杆菌作为抗原制备的。

5.根据权利要求4所述的疫苗，其特征在于，所述的疫苗为灭活疫苗。

6.根据权利要求4或5所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗中的佐剂为铝胶。

7.根据权利要求4所述的疫苗，其特征在于，所述的疫苗为单价疫苗。

8.根据权利要求4所述的疫苗，其特征在于，所述的副猪嗜血杆菌的含量为3×10⁹～3×10¹²CFU/mL。