CN108486012A - 鸭传染性浆膜炎活疫苗及其制备方法 - Google Patents

鸭传染性浆膜炎活疫苗及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了鸭传染性浆膜炎活疫苗及其制备方法，本发明的鸭传染性浆膜炎活疫苗含有鸭疫里默氏杆菌GD12株及冻干保护剂，鸭疫里默氏杆菌GD12株已于2016年4月1日送交至中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO：M 2016161。本发明的鸭传染性浆膜炎活疫苗安全性好，不会对鸭产生任何不良反应；免疫效果好，能显著提高雏鸭对1型鸭疫里默氏杆菌引起的鸭传染性浆膜炎的抵抗力，可以用于临床上预防由1型鸭疫里默氏杆菌引起的鸭传染性浆膜炎，具有重大的经济和社会效益。

Description

鸭传染性浆膜炎活疫苗及其制备方法
技术领域
本发明属于动物疫苗领域，涉及一种鸭疫里默氏杆菌病弱毒活疫苗(即鸭传染性浆膜炎活疫苗)及其制备方法。
背景技术
鸭疫里默氏杆菌病又称鸭传染性浆膜炎、新鸭病、鸭疫综合征，是由鸭疫里默氏杆菌(Riemerella anatipestifer，RA)引起的一种接触性急性或慢性败血性传染病，主要侵害2～7周龄的雏鸭，临诊上主要表现为眼和鼻分泌物增多、喘气、咳嗽、下痢、共济失调和头颈震颤，慢性经过的病鸭主要表现为脑膜炎症状、颈斜、生长缓慢或成僵鸭，病变以纤维素性心包炎、肝周炎和气囊炎为主要特征，死亡率高达90％，给养鸭业造成巨大的经济损失。调查显示，鸭传染性浆膜炎普遍存在，由于RA具有抗原的多样性和变异性，因此血清型的种类多且复杂，目前全世界公认的RA有21个血清型之多，且各型之间几乎无交叉保护，致使该病的防控更加困难。总体上，1型已经成为我国各地区鸭疫里默氏杆菌流行的优势血清型，因此多以1型为主研制鸭传染性浆膜炎灭活疫苗。目前比较有效的方法是针对当地主要流行的血清型，选取相应菌株研制灭活疫苗，可以达到较好的预防效果。但是灭活苗存在抗体产生较慢，免疫持续期较短等缺点。而活疫苗在免疫后10天即可产生较高的抗体水平，可以满足养鸭生产的需要。
迄今为止，未见国内有关鸭传染性浆膜炎活疫苗研究的报道。因此，研制一种安全有效的鸭传染性浆膜炎活疫苗对我国养鸭业的发展具有重大意义。
发明内容
为了解决上述存在的问题，本申请从广东地区某鸭场鸭的肝脏和心脏组织中分离到1株鸭疫里默氏杆菌，经血清型鉴定为1型，命名为鸭疫里默氏杆菌GD12株，动物试验结果显示，GD12株毒力较弱，安全性良好，且具有较好的免疫原性。
本发明提供了一种鸭疫里默氏杆菌病弱毒活疫苗(又称鸭传染性浆膜炎活疫苗)，该弱毒活疫苗安全性好，免疫效果可靠。
本发明的目的在于提供一株1型鸭疫里默氏杆菌GD12株及其应用。
本发明的另一目的在于提供一种鸭疫里默氏杆菌病弱毒活疫苗(即鸭传染性浆膜炎活疫苗)及其制备方法。
本发明所采取的技术方案是：
鸭疫里默氏杆菌GD12株，其分类命名为(Riemerella anatipestifer)GD12，已保藏于中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为：CCTCC M 2016161。
鸭疫里默氏杆菌GD12株在制备鸭传染性浆膜炎活疫苗中的应用。
一种鸭传染性浆膜炎活疫苗，该活疫苗中含有鸭疫里默氏杆菌GD12株。
进一步的，上述活疫苗中还含有冻干保护剂。
进一步的，上述冻干保护剂的配方为：明胶2～3％，蔗糖5～6％，硫脲2～4％，余量为水，所述百分比为质量体积百分比。
一种鸭传染性浆膜炎活疫苗的制备方法，包括以下步骤：
1)将鸭疫里默氏杆菌GD12株进行扩大培养，收获扩大培养后的菌液；
2)将上步扩大培养后的菌液离心浓缩；
3)将离心后的菌液加冻干保护剂混匀，冷冻真空干燥后即得。
进一步的，步骤1)的具体操作为：将鸭疫里默氏杆菌GD12株菌种划线接种于含新生牛血清的TSA平板，36.5～37.5℃培养16～24h，挑单菌落接种于含新生牛血清的TSB培养基中，于36.5～37.5℃、160～180rpm/min震荡培养16～24h既得种子液，再将种子液按体积比1:80～150接种于含新生牛血清的TSB培养基中扩大培养，于36.5～37.5℃，160～180rpm/min震荡培养16～24h，收获扩大培养后的菌液。
进一步的，步骤2)的具体操作为：将扩大培养后的菌液置于无菌离心管中，于5000～8000rpm/min、离心8～12min，收获沉淀，按体积比45～55:1浓缩后溶于培养液中。
进一步的，步骤3)的具体操作为：将浓缩后的菌液与冻干保护剂按体积比0.8～1.2:1进行混匀，–80℃预冻12～16h，转置冷冻真空干燥机中冻干。
进一步的，上述冻干保护剂配方为明胶2～3％，蔗糖5～6％，硫脲2～4％，余量为水，所述百分比为质量体积百分比；将该配方物质混匀后经高压灭菌后制得。
申请人将本发明菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址为中国武汉武汉大学，保藏中心于2016年4月1日收到申请人提供的菌株。保藏中心给予该培养物的保藏号为CCTCC NO：M 2016161，建议的分类命名为鸭疫里默氏杆菌GD12Riemerellaanatipestifer GD12，已于2016年4月8日鉴定保藏的菌株是存活的。
本发明的有益效果是：
(1)本发明的鸭疫里默氏杆菌病弱毒活疫苗(又称鸭传染性浆膜炎活疫苗)安全性好，即使用量达免疫剂量的100倍时，也不会对鸭只产生任何不良反应；免疫效果好，能显著提高雏鸭对1型鸭疫里默氏杆菌引起的鸭传染性浆膜炎的抵抗力。
(2)本发明的活疫苗安全性良好，以10羽份/只的剂量接种雏鸭，在观察期内，全部健活，未见明显不良反应；免疫效果好，雏鸭以1羽份/只的剂量接种该疫苗，免疫后14日用强毒RA攻毒，结果，攻毒对照组10/10发病，活疫苗免疫组10/10获得保护，灭活疫苗免疫组10/10获得保护，表明本发明的活疫苗免疫保护较好，能够保护雏鸭抵抗1型强毒RA的攻击，可以用于临床上预防由1型鸭疫里默氏杆菌引起的鸭传染性浆膜炎，具有重大的经济和社会效益。
附图说明
图1为鸭疫里默氏杆菌GD12株在平板上的生长状态；左为麦康凯琼脂平板；右为TSA平板；
图2为鸭疫里默氏杆菌GD12株PCR鉴定结果；M.DNA标准DL2000；1.RA1标准株；2.鸭疫里默氏杆菌GD12株；3：阴性对照。
图3为动物回归试验分离鸭疫里默氏杆菌GD12株的PCR扩增结果，M：DL2000，1：RA1标准株，2：鸭疫里默氏杆菌GD12株，3：阴性对照。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1鸭疫里默氏杆菌GD12株
1、菌株来源、保藏情况
本疫苗生产用菌株是黄杆菌科，里氏杆菌新属，鸭疫里默氏杆菌GD12株，是本发明人于2012年从广东省某鸭场雏鸭心脏中分离而得，已于2016年4月1日送交中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号：CCTCC NO：M 2016161。经革兰氏染色、PCR技术、动物回归试验、生化试验等方法进行鉴定。
2、菌株特性
(1)鸭疫里默氏杆菌GD12株的形态
方法：无菌方法取鸭的心脏，划线接种于TSA平板和麦康凯琼脂平板，于37℃烛缸中培养18～48h，挑取单个可疑菌落进行纯培养。
结果：该菌在TSA平板上长成圆形、光滑、湿润、半透明的奶油状菌落，而在麦康凯平板上不生长(见图1)。
(2)鸭疫里默氏杆菌GD12株的革兰氏染色
方法：挑取纯培养的单菌落进行革兰氏染色并镜检，观察细菌的形态和染色特性。
结果：镜检观察到该菌为革兰氏阴性的小杆菌，单个或成对存在，无鞭毛。
(3)鸭疫里默氏杆菌GD12株的生化试验
方法：将鸭疫里默氏杆菌GD12株分别接种于蔗糖、麦芽糖、葡萄糖、木糖、果糖、乳糖、甘露糖、甘露醇、山梨醇、明胶、尿素等生化鉴定管。同时做氧化酶还原试验、硫化氢试验、柠檬酸盐利用试验、靛基质试验、MR、VP试验、过氧化氢试验、硝酸盐还原试验。具体操作、培养时间及判定结果见说明书。
结果：该菌不发酵蔗糖、乳糖、木糖、葡萄糖、果糖、甘露糖、甘露醇、山梨醇、麦芽糖；硫化氢试验、西蒙氏枸橼酸盐利用试验、靛基质试验、硝酸盐还原试验、VP试验阴性；液化明胶；尿素酶试验、过氧化氢试验、氧化酶还原试验、MR试验阳性。
(4)鸭疫里默氏杆菌GD12株的PCR鉴定
方法：根据覃宗华等报道(覃宗华、蔡建平、吕敏娜、余劲术、吴彩艳、温列娜、谢明权，鸭疫里默氏杆菌病与大肠杆菌病鉴别诊断双重PCR方法的建立和应用，畜牧兽医学报，517-521。)合成一对鸭疫里默氏杆菌特异性引物RA-F、RA-R(引物由Invitrogen合成)，预期扩增产物大小为342bp。鸭疫里默氏菌基因组DNA，采用Promega公司基因组DNA提取试剂盒提取。
PCR扩增反应：以鸭疫里默氏菌GD12株基因组DNA为模板，用RA-F、RA-R引物，按如下体系进行，反应体积20μL，Premix Taq 10μL，primer(RA-F)1μL，primer(RA-R)1μL，基因组DNA1μL，ddH2O 7μL，总体积20μL。PCR扩增程序如下:94℃预变性5min,然后进行30个循环，PCR的扩增(94℃变性30s、50℃退火1min、72℃延伸1min),然后72℃延伸7min。反应结束后取PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳分析,酶切回收目的片段并与pGEM2T-easy连接后转化E.coli JM109。
结果：通过特异性PCR扩增，分离株扩增到300bp左右的条带，与目的条带大小一致(见图2)。
(5)鸭疫里默氏杆菌GD12株的血清型鉴定
利用玻片凝集试验鉴定分离株的血清型，将自制的兔抗RA标准株1型、2型、3型、4型、5型、8型、9型、10型高免血清与制备的凝集抗原按常规方法进行凝集试验，凝集抗原的制备根据吴彩艳等报道方法进行(吴彩艳、覃宗华、袁建丰、吕敏娜、余劲术、蔡建平，广东地区鸭疫里默氏杆菌的血清型及抗药性情况调查，畜牧与兽医，22-25)。
结果：该分离株凝集抗原与1型高免血清凝集，与其它血清型高免血清均不凝集，因此确定GD12株为血清1型。
(6)鸭疫里默氏杆菌GD12株的药敏试验
按K-B标准纸片法进行，即用灭菌棉拭子沾取菌液，在TSA平板上均匀涂布，待平板面稍干，用灭菌镊子将上述药敏纸片平放在板上，然后将平板于37℃培养18～24h，测量并记录鸭疫里默氏杆菌GD12株抑菌圈的直径。
结果显示，鸭疫里默氏杆菌GD12株对阿莫西林、头孢噻吩、利福平、氨苄青霉素、头孢曲松钠、头孢氨噻肟、氧氟沙星、氟苯尼考、痢特灵、庆大霉素、复方新诺明和恩诺沙星、丁胺卡那、四环素、环丙沙星、强力霉素、新霉素、先锋必素、左氧沙星、奥复兴、青霉素敏感，对链霉素、克拉霉素、罗红霉素、多粘菌素B均敏感。
(7)动物回归试验
方法：取5～10日龄健康易感鸭20只，随机分成2组，每组10只。接种组每只鸭腿部肌肉注射鸭疫里默氏杆菌GD12株菌液0.2ml(活菌数约2.0×1010CFU)，对照组每只鸭腿部肌肉注射生理盐水0.2ml，接种组和对照组分开饲养。连续观察4日，记录试验鸭临床表现和剖检病变情况，无菌采集鸭疫里默氏杆菌GD12株接种组鸭的心脏和肝脏组织，进行细菌分离鉴定。
结果：观察期间，试验鸭全部健活；接种组试验鸭的采食、饮水、精神及活动状况均表现正常，与对照组无差异；剖检观察，接种组心脏和肝脏等内脏器官未见鸭传染性浆膜炎病变，对照组鸭的内脏器官无病变；将动物回归试验采集的鸭的心脏和肝脏组织分别涂布TSA平板和麦康凯平板，于37℃恒温箱中培养后，在TSA平板上有细菌生长，在麦康凯平板无细菌生长。挑取可疑菌落在TSA平板上纯培养后，可见圆形、湿润、光滑、半透明的小菌落；分离株经革兰氏染色，镜检为革兰氏阴性小杆菌；分离株不发酵蔗糖、麦芽糖、葡萄糖、木糖、果糖、乳糖、甘露糖、甘露醇、山梨醇；硫化氢试验、西蒙氏枸橼酸盐利用试验、靛基质试验、硝酸盐还原试验、VP试验阴性；液化明胶；尿素酶试验、过氧化氢试验、氧化酶还原试验、MR试验阳性；分离株经PCR扩增后，以1％的琼脂糖凝胶电泳分析，获得与预期大小一致的条带，结果见图3；玻片凝集试验显示，分离株与1型鸭疫里默氏杆菌标准阳性血清出现凝集反应，因此，分离株血清型为1型。综上，动物回归试验分离的菌株经生长特性、形态、生化特性、PCR鉴定、血清型鉴定确定与原始分离株GD12株一致。
(8)鸭疫里默氏杆菌GD12株的稳定性试验
方法：2周龄SPF鸭经腿部肌肉注射鸭疫里默氏杆菌GD12株，接种剂量为2.0×1010
CFU/只，3～5天后剖检观察病变并无菌采集肝脏、心脏等病料，研磨病料并离心取上清肌肉注射2周龄SPF鸭，如此反复4次，最后一次接种后观察21天，分离鸭疫里默氏杆菌。
结果：2周龄SPF鸭经腿部肌肉注射鸭疫里默氏杆菌GD12株，剖检未见鸭疫里默氏杆菌病典型病变，经鸭体连续传递4代后，未见毒力返强现象，最后1次接种组织病料，观察21天后未分到鸭疫里默氏杆菌。结果表明鸭疫里默氏杆菌GD12株遗传性能稳定。
(9)鸭疫里默氏杆菌GD12株的安全性试验
方法：取5～10日龄健康易感鸭40只，随机分成4组，每组10只。3个接种组每只鸭腿部肌肉注射鸭疫里默氏杆菌GD12株菌液0.2ml(活菌数分别为2.0×109CFU、4.0×109CFU、6.0×109CFU)，对照组每只鸭腿部肌肉注射生理盐水0.2ml，连续观察14日，记录试验鸭临床表现及剖检病变情况。
结果：5～10日龄健康易感鸭腿部肌肉注射鸭疫里默氏杆菌GD12株菌液，至试验结束，试验鸭均健活，接种组和对照组试验鸭的采食、饮水、精神及消化均正常，与对照组相比无差异；剖检观察，接种组内脏器官无鸭传染性浆膜炎病变，与对照组相比无差异，结果见表1。
表1鸭疫里默氏杆菌GD12株安全性试验结果
(10)鸭疫里默氏杆菌GD12株的免疫原性试验
方法：取5～10日龄健康易感鸭30只，随机分成3组，每组10只。2个免疫组每只鸭腿部肌肉注射鸭疫里默氏杆菌GD12株菌液0.2ml(活菌数分别为2.0×108CFU、4.0×108CFU)，对照组每只鸭腿部肌肉注射生理盐水0.2ml。免疫后14日攻毒，免疫组和对照组每只鸭腿部肌肉注射1型鸭疫里默氏杆菌QY株菌液0.2ml(活菌数约2.0×104CFU)，连续观察14日，记录试验鸭发病情况。评价鸭疫里默氏杆菌GD12株的免疫原性。
结果：免疫组均获得10/10及以上保护，而对照组10/10发病，结果见表2。
表2鸭疫里默氏杆菌GD12株免疫原性试验结果
注：“+”表示鸭精神状态良好，活泼、行动正常。精神状态良好、行动正常、眼鼻无分泌物、
粪便正常。对无临床症状的鸭剖检观察，不出现心包膜炎或肝周炎或浆膜炎病变。
“-”表示鸭出现精神不振、行动蹒跚、眼鼻有分泌物流出、排绿色或黄绿色粪便、角弓反张等鸭传染性浆膜炎临床症状或死亡的。对无临床症状的鸭剖检观察，出现心包膜炎或肝周炎或浆膜炎病变。
实施例2鸭疫里默氏杆菌病弱毒活疫苗(即鸭传染性浆膜炎活疫苗)及其制备方法
实验材料：鸭疫里默氏杆菌GD12株，由广东省农业科学院动物卫生研究所寄生生物研究室于2012年从广东省分离及鉴定，于2016年4月1日送交至中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC M 2016161，2016年4月8日检测结果为存活。SPF鸭购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，用于安全性和免疫效力试验。
鸭疫里默氏杆菌病弱毒活疫苗(即鸭传染性浆膜炎活疫苗)的制备步骤如下：
1)菌种
将鸭疫里默氏杆菌GD12株接种于TSA(含5％新生牛血清)平板，置37℃温箱中培养18～48h，挑取单个菌落接种于TSB(含5％新生牛血清)培养基，于37℃摇床160～180rpm/min震荡培养16～24h即得种子液，作为生产用菌种备用。
2)扩大培养
将种子液按体积比1:100接种于TSB(含5％新生牛血清)培养基中扩大培养，于37℃摇床160～180rpm/min震荡培养16～24h，测定菌液OD600值，无菌条件下收获含菌菌液，用于制备疫苗。
3)制苗
将收获的菌液离心浓缩并重悬于适量的TSB培养基中，与冻干保护剂按质量比1:1混匀，分装于灭菌的西林瓶中，-70℃预冻12～16h，冷冻真空干燥40～48h后即得本发明的“鸭疫里默氏杆菌病弱毒活疫苗(鸭传染性浆膜炎活疫苗)”。制备好的疫苗密封后置于2～8℃冰箱保存备用。
所述冻干保护剂配方为明胶2～3％，蔗糖5～6％，硫脲2～4％，余量为水，所述百分比为质量体积百分比；将该配方中物质混匀后经高压灭菌后制得。
4)成品
对成品进行性状、纯粹、活菌计数、剩余水分、真空度的测定，经上述检验合格后，置于2～8℃条件保存。共制备2批疫苗，批号分别为1501、1502。
下面对本发明制得的鸭疫里默氏杆菌病弱毒活疫苗(又称鸭传染性浆膜炎活疫苗)做进一步的效果检测。
一、鸭传染性浆膜炎活疫苗的安全性试验
方法：共进行了2次试验。第一次试验用疫苗批号为1501(规格为500羽份/瓶)，将1瓶冻干苗溶于10mL灭菌生理盐水。取5～10日龄健康易感鸭20只，随机分成2组，每组10只。免疫组每只鸭腿部肌肉注射0.2ml(10羽份)疫苗，对照组每只鸭腿部肌肉注射生理盐水0.2ml，连续观察14日。
结果：试验鸭全部健活，不出现由疫苗引起的局部或全身不良反应。表明该疫苗安全性良好(见表3)。
方法：第二次试验用疫苗批号为1502(规格为500羽份/瓶)，将1瓶冻干苗溶于10mL灭菌生理盐水。取5～10日龄健康易感鸭20只，随机分成2组，每组10只。免疫组每只鸭腿部肌肉注射0.2ml(10羽份)疫苗，对照组每只鸭腿部肌肉注射生理盐水0.2ml，连续观察14日。
结果：试验鸭全部健活，不出现由疫苗引起的局部或全身不良反应。表明该疫苗安全性良好(见表4)。
表3批号为1501的鸭传染性浆膜炎活疫苗安全性试验结果
表4批号为1502的鸭传染性浆膜炎活疫苗安全性试验结果
二、鸭传染性浆膜炎活疫苗的效力检验
材料：鸭传染性浆膜炎活疫苗(1型GD12株)：自制
鸭传染性浆膜炎二价灭活疫苗(1型RA+2型RA)：市售
方法：共进行了2次试验。第一次试验用疫苗批号为1501(规格为500羽份/瓶)，将1瓶冻干苗溶于100mL灭菌生理盐水。取5～10日龄健康易感鸭40只，随机分成4组，每组10只。活疫苗免疫组每只鸭腿部肌肉注射0.2ml(1羽份)疫苗，灭活疫苗免疫组每只鸭腿部肌肉注射0.3ml(1羽份)疫苗，同时设攻毒对照组和空白对照组。免疫后14日攻毒，免疫组和攻毒对照组每只鸭腿部肌肉注射1型鸭疫里默氏杆菌QY株菌液0.2ml(活菌数约2.0×104CFU)，连续观察14日。
结果：试验结束，活疫苗免疫组和灭活苗免疫组均获得10/10保护，攻毒对照组10/10发病，空白对照组均健康存活，结果见表5。说明本发明的鸭传染性浆膜炎活疫苗具有良好的免疫原性。
方法：第二次试验用疫苗批号为1502(规格为500羽份/瓶)，将1瓶冻干苗溶于100mL灭菌生理盐水。取5～10日龄健康易感鸭40只，随机分成4组，每组10只。活疫苗免疫组每只鸭腿部肌肉注射0.2ml(1羽份)疫苗，灭活疫苗免疫组每只鸭腿部肌肉注射0.3ml(1羽份)疫苗，同时设攻毒对照组和空白对照组。免疫后14日攻毒，免疫组和攻毒对照组每只鸭腿部肌肉注射1型鸭疫里默氏杆菌QY株菌液0.2ml(活菌数约2.0×104CFU)，连续观察14日。
结果：试验结束，活疫苗免疫组和灭活苗免疫组均获得10/10保护，攻毒对照组10/10发病，空白对照组均健康存活，结果见表6。说明本发明的鸭传染性浆膜炎活疫苗具有良好的免疫原性。
表5批号为1501的鸭传染性浆膜炎活疫苗效力检验结果
注：“+”表示鸭精神状态良好，活泼、行动正常。精神状态良好、行动正常、眼鼻无分泌物、
粪便正常。对无临床症状的鸭剖检观察，不出现心包膜炎或肝周炎或浆膜炎病变。
“-”表示鸭出现精神不振、行动蹒跚、眼鼻有分泌物流出、排绿色或黄绿色粪便、角弓反张等鸭传染性浆膜炎临床症状或死亡的。对无临床症状的鸭剖检观察，出现心包膜炎或肝周炎或浆膜炎病变。
表6批号为1502的鸭传染性浆膜炎活疫苗效力检验结果
注：“+”表示鸭精神状态良好，活泼、行动正常。精神状态良好、行动正常、眼鼻无分泌物、
粪便正常。对无临床症状的鸭剖检观察，不出现心包膜炎或肝周炎或浆膜炎病变。
“-”表示鸭出现精神不振、行动蹒跚、眼鼻有分泌物流出、排绿色或黄绿色粪便、角弓反张等鸭传染性浆膜炎临床症状或死亡的。对无临床症状的鸭剖检观察，出现心包膜炎或肝周炎或浆膜炎病变。
以上试验表明，本发明的鸭传染性浆膜炎活疫苗安全性良好，所有试验鸭全部健活，剖检内脏器官无鸭传染性浆膜炎病变；活疫苗与灭活疫苗免疫后攻毒，试验鸭均获得10/10保护，说明本发明的活疫苗与市售的灭活疫苗的保护效果相当，可以用于临床上预防由1型鸭疫里默氏杆菌引起的鸭传染性浆膜炎，具有重大的经济和社会效益。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.鸭疫里默氏杆菌GD12株，其分类命名为(Riemerella anatipestifer)GD12，已于中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为：CCTCC NO：M 2016161。
2.权利要求1所述鸭疫里默氏杆菌GD12株在制备鸭传染性浆膜炎活疫苗中的应用。
3.鸭传染性浆膜炎活疫苗，其特征在于，该活疫苗中含有权利要求1所述的鸭疫里默氏杆菌GD12株。
4.根据权利要求3所述的鸭传染性浆膜炎活疫苗，其特征在于，该活疫苗中还含有冻干保护剂。
5.根据权利要求4所述的鸭传染性浆膜炎活疫苗，其特征在于，所述冻干保护剂的配方为：明胶2～3％，蔗糖5～6％，硫脲2～4％，余量为水，所述百分比为质量体积百分比。
6.一种鸭传染性浆膜炎活疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将权利要求1所述的鸭疫里默氏杆菌GD12株进行扩大培养，收获扩大培养后的菌液；
2)将上步扩大培养后的菌液离心浓缩；
3)将离心后的菌液加冻干保护剂混匀，冷冻真空干燥后即得。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤1)的具体操作为：将鸭疫里默氏杆菌GD12株菌种划线接种于含新生牛血清的TSA平板，36.5～37.5℃培养16～24h，挑单菌落接种于含新生牛血清的TSB培养基中，于36.5～37.5℃，160～180rpm/min震荡培养16～24h既得种子液，再将种子液按体积比1:80～150接种于含新生牛血清的TSB培养基中扩大培养，于36.5～37.5℃，160～180rpm/min震荡培养16～24h，收获扩大培养后的菌液。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤2)的具体操作为：将扩大培养后的菌液置于无菌离心管中，于5000～8000rpm/min、离心8～12min，收获细菌沉淀，按体积比45～55:1浓缩后溶于培养液中。
9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤3)的具体操作为：将浓缩后的菌液与冻干保护剂按体积比0.8～1.2:1进行混匀，–70℃预冻12～16h，转置冷冻真空干燥机中冻干。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述冻干保护剂配方为明胶2～3％，蔗糖5～6％，硫脲2～4％，余量为水，所述百分比为质量体积百分比；将该配方物质混匀后经高压灭菌后制得。
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