CN104560853A - 一株鸭疫里默氏杆菌ch1减毒菌株及其构建方法和应用 - Google Patents

一株鸭疫里默氏杆菌ch1减毒菌株及其构建方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株鸭疫里默氏杆菌CH1减毒菌株及构建方法，属于生物工程技术领域。它是通过将同源重组方法将<i>crp</i>基因敲除并利用细菌结合法构建而得。得到的减毒菌株保藏号为CCTCC？M？2014556，保藏时间为2014年11月07日，该减毒菌株的毒性很低，可为后续疫苗载体的构建和鸭疫里默氏杆菌基因调控网络的构建奠定了基础。本发明还提供了该减毒菌株在疫苗上的应用。

Description

一株鸭疫里默氏杆菌CH1减毒菌株及其构建方法和应用
技术领域
    本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一株鸭疫里默氏杆菌CH1减毒菌株及其构建方法和应用。
背景技术
    鸭疫里默氏杆菌 (Riemerella anatipestifer, RA) 引起的一种主要侵害雏鸭、雏火鸡、鹅等多种禽类的急性或慢性、败血性、接触性传染病。在我国，其流行毒株包含有血清1型，2型和10型。该病以10-35日龄的雏鸭发病较多，发病率可达90％以上，死亡率为5％-75％，每年均给养殖业造成了巨大的经济损失。目前，鸭疫里默氏杆菌病的防治主要依靠抗生素治疗，然而随着多种药物耐药性的不断增加以及对食品安全性等问题的考虑，疫苗免疫是控制疫病发生与传播的最经济、最有效的手段。国内对于灭活疫苗的研究较多，如鸭传染性浆膜炎灭活苗、鸭疫里默氏杆菌和大肠杆菌蜂胶二联灭活苗、鸭疫里默氏杆菌多价灭活苗研制等，而且市场上已经有针对血清1型，2型和10型的灭活疫苗在销售。而这些疫苗存在缺陷：如应用比较广泛的油乳剂灭活苗无法提供完全保护（70%左右的保护率）且存在注射吸收不理想，毒株覆盖不完全等问题，研制新的、高效、覆盖多种血清型的鸭传染性浆膜炎疫苗成为我国养禽业发展的迫切需求。
crp 基因编码合成的cAMP受体蛋白与cya (adenylate cyclase) 编码的腺苷酸环化酶都是细菌重要的毒力调控蛋白,它主要参与调控细菌的碳水化合物和氨基酸代谢，并会影响菌毛与鞭毛的表达。
而在鸭疫里默氏杆菌中全局调控基因crp研究尚未见报道，现有技术也没有报道通过对crp改造是否可以获得减毒菌株。
发明内容
    本发明的目的之一是提供一株鸭疫里默氏杆菌CH1减毒菌株，该减毒菌株缺失了crp基因片段；所述crp基因片段的核苷酸序列如 SEQ ID No.1所示，该减毒菌株的分类命名为Riemerella anatipestifer CH1Δcrp，保藏于位于中国.武汉.武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M 2014556，保藏时间为2014年11月07日。
所述减毒菌株中的crp基因片段由spec抗性基因所替代。
所述壮观霉素抗性基因片段的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
本发明的目的之二是提供一种鸭疫里默氏杆菌CH1减毒菌株的构建方法。该方法包括如下步骤：
    1）构建重组自杀质粒pRE112-Δcrp::spec；
    2）将步骤1）所得重组自杀质粒转化入到x7213大肠杆菌中；
    3）将步骤2）中含有重组质粒的x7213大肠杆菌与鸭疫里默氏杆菌CH1菌自然结合，使同源臂导入鸭疫里默氏杆菌CH1菌的基因组中，经过同源臂交换和壮观霉素抗性筛选得到阳性克隆；
4）通过PCR筛选得到缺失crp基因的鸭疫里默氏杆菌CH1减毒菌株。
所述步骤3）中，将含有重组质粒的x7213大肠杆菌与鸭疫里默氏杆菌CH1菌自然结合时，具体的结合步骤为：分别将含有pRE112-Δcrp::spec重组质粒x7213菌株与鸭疫里默氏杆菌CH1培养至0D600=0.6-0.8,按体积比3:2的比例，在固体平板培养基上混合，37℃下，于 5% CO2培养箱中培养18-24h，将菌苔刮下，划线于含有50μg/ml的spec和l50μg/m的kan的胰蛋白大豆肉汤固体平板培养基上进行培养，挑取生长的单菌落。
所述步骤4）中，PCR筛选的步骤为：
（1）鸭疫里默氏杆菌CH1保守序列引物
F：AGAAGATTTTAAGGCGGAG
R：GGCTTCTGATTGATTTCC
PCR扩增鸭疫里默氏杆菌CH1的特异性基因的1514bp片段，判定候选突变株是否为鸭疫里默氏杆菌CH1；
（2）以spec抗性基因的引物
    Spec-F ：GCACCTGCAGGGACCAGCCAGGACAGAAA
    Spec-R：ATGCGGCCGCCCACGTCAAATAATCAAGGCG
扩增抗性片段的1185bp片段，判断是否发生基因的替换；
（3）以引物
    crp-up-F：GATTGATATCTTTGAGGCTT
crp-down-R：ATTACAGGAATACCTGCATTG
进行扩增以检测替换片段是否正确；
(4)以引物
crp-F: CATGCCATGGTGTTTGAAAAACAGTT
    crp-R: CGCGGATCCAGAAACCACATGTCCTACTT
扩增目的基因以检测是否crp是否被缺失。
    所述重组自杀质粒pRE112-Δcrp::spec的构建方法，包括如下步骤：
1）crp基因的左右同源臂的引物设计：
crp-up-F：GATTGATATCTTTGAGGCTT
crp-up-R：CCTGCAGGGATGCGGCCGCTTAACTGATATTTATCAGCA
crp-down-F：GCGGCCGCATCCCTGCAGGTAAATTTTTAATGAAGTAAAAAT
crp-down-R：ATTACAGGAATACCTGCATTG
    2）以鸭疫里默氏杆菌CH1全基因组作为模板，分别对crp基因的左右臂进行PCR扩增，回收产物用引物crp-up-F 和crp-down-R进行扩增，得到左右同源臂产物；
    3）利用加A试剂盒对同源臂末端进行加A处理，然后与用AhdI限制性内切酶处理的pRE112自杀质粒产物进行连接，将连接产物转入c7232大肠杆菌感受态中；
   4）将步骤3）所得c7232大肠杆菌摇菌培养至对数期，进行质粒抽提，得到重组质粒pRE112-crp；在crp-up-R和crp-down-F引物间引入NotI和SbfI酶切位点；
    5）spec抗性基因的引物设计
spec-F：GCACCTGCAGGGACCAGCCAGGACAGAAA
Spec-R：ATGCGGCCGCCCACGTCAAATAATCAAGGCG；
将spec抗性基因的引物进行PCR扩增，PCR扩增片段回收后用NotI和SbfI进行双酶酶切，再与经NotI和SbfI双酶酶切处理的pRE112-Δcrp连接，得到重组质粒pRE112-Δcrp::spec。
所述重组自杀质粒pRE112-Δcrp::spec的构建方法的步骤2）中，对crp基因的左右臂进行PCR扩增时，具体PCR扩增条件为：先于94℃变性2 min，经98℃变性10s、55℃ 退火10s、72℃延伸15s，循环扩增35次，再于72℃延伸10min。
所述步骤5）重组自杀质粒pRE112-Δcrp::spec的构建方法的步骤2）中，对spec抗性基因的引物进行PCR扩增时，具体PCR扩增条件为：先于94℃变性2min,经98℃变性10s、55℃退火10s、72℃延伸20s循环扩增35次，再于72℃延伸10min。
由于pRE112-Δcrp::spec重组质粒不能在RA中复制存活，将转入有重组质粒的c7213菌株与RA结合，使同源片段导入RA基因组中，利用壮观霉素抗性筛选得到阳性克隆。再利用PCR方法鉴定得到突变株。
药敏试验表明鸭疫里默氏杆菌CH1菌株天然就对很多抗生素不敏感，利用壮观霉素抗性基因片段进行重组质粒的构建，具有较好效果。
本发明的第三个目的是提供该减毒菌株在疫苗上的应用。
    本发明的有益效果：
    1、目前，对鸭疫里默氏菌的毒力因子认识较少，用于构建鸭疫里默氏菌减毒菌株的方法十分有限，本发明通过敲除鸭疫里默氏菌中的crp基因，成功构建了缺失crp基因的鸭疫里默氏杆菌CH1的减毒菌株；
    2、本发明构建的减毒菌株可用于鸭疫里默氏杆菌基因减毒疫苗，用于研制预防多个血清型的鸭疫里默氏杆菌的感染或者作为疫苗载体；
3、本发明构建的减毒菌株可用于对鸭疫里默氏杆菌基因调控网络的构建，为后续研究奠定基础。
附图说明
图1 ：是本发明中用于构建鸭疫里默氏杆菌杆菌crp基因突变株示意图，图中，crp：鸭疫里默氏杆菌CH1 crp基因，B739-0374：鸭疫里默氏杆菌CH1 crp基因上游邻近的读码框，B739-0372：鸭疫里默氏杆菌crp基因下游邻近的读码框；
图2：为重组质粒pRE112-Δcrp::spec质粒图谱；
图3：为利用crp基因上下游扩增目的基因结果图，其中1-3为crp突变株，4-9为未突变株，10为鸭疫里默氏杆菌CH1阳性对照；
图4：为鸭疫里默氏杆菌crp突变株构建鉴定，其中1为阴性对照，2-4分别扩增鸭疫里默氏杆菌crp突变株保守序列和crp-up-F/crp-up-R扩增USD替换片段全长，5为鸭疫里默氏杆菌保守序列，6-10为crp-up-F/crp-up-R扩增野生株全长；
图5：是本发明中鸭疫里默氏杆菌突变株对鸭胚成纤维细胞侵袭力和粘附力的结果，其中，左侧Adherence代表粘附力实验，右侧invasion代表侵袭力实验，RA CH1为野生株，RA CH1Δcrp为本发明减毒菌株；
图6：是本发明中不同剂量鸭疫里默氏杆菌突变株对试验动物生长的影响情况；其中1为免疫剂量5×109CFU组，2为免疫剂量5×108CFU组, 3为免疫剂量5×107CFU组；对照组1为不免疫不攻毒，对照组2为不免疫但用10×LD50攻毒组。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明进行具体描述，有必要在此指出的是以下实施例只是用于对本发明进行进一步的说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员根据上述发明内容所做出的一些非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
实施例1
鸭疫里默氏杆菌(RA-CH1) 减毒菌株的制备：
    所述的鸭疫里默氏杆菌为四川农业大学禽病中心实验室保存（RA-CH1），所述的沙门氏菌为鼠伤寒沙门氏菌UK-1（c3761），大肠杆菌为大肠杆菌工程菌，如c7232, c7213, c6212等。
第一步，鸭疫里默氏杆菌血清1（RA-CH1）潜在crp基因功能鉴定，根据鼠伤寒沙门氏菌UK-1菌株中crp序列利用BLASTP进行对比发现RA-CH1中存在两个潜在的crp基因序列，将其命名为crp1与crp2。设计引物：
crp1为：
crp1-F：CATGCCATGGTGTTTGAAAAACAGTT
crp1-R：CGCGGATCCAGAAACCACATGTCCTACTT
crp2为：
crp2-F：CATGCCATGGTGGAAAAGGAACACTTC 
crp2-R：CGCGGATCCTTCGCCTAAAGAAAGTCTGC
扩增出序列后用NcoI和BamHI双酶切，回收双酶切后连接到同样处理的质粒pYA3332，pYA3337质粒上转入鼠伤寒沙门氏菌UK-1  Δcrp突变株，利用平板显色发进行潜在crp基因功能的鉴定，结果表明crp1为真正的鸭疫里默氏杆菌crp基因。
    第二步，鸭疫里默氏杆菌血清1型（RA-CH1）突变株构建，根据RA-CH-1 已经确定基因功能的crp上下游同源臂设计引物（crp-1F/1R,2F/2R）
crp-1F（crp-up-F）：GATTGATATCTTTGAGGCTT
crp-1R（crp-up-R）：CCTGCAGGGATGCGGCCGCTTAACTGATATTTATCAGCA
crp-2F（crp-down-F）：GCGGCCGCATCCCTGCAGGTAAATTTTTAATGAAG
TAAAAAT
crp-2R（crp-down-R）：ATTACAGGAATACCTGCATTG
    扩增crp基因上下游同源臂，并在其中加入了NotI和sbfI酶切位点。PCR条件为：94℃变性2 min，经98℃ 10s、55℃ 10s、72℃ 15s循环扩增35次，72℃延伸10min。扩增片段经TA克隆后测序验证。将扩增的同源臂扩增回收后利用crp-1F/2R将上下游同源臂融合在一起再与酶切后的pRE112自杀质粒连接，挑取氯霉素抗性平板上的单菌落，增殖后进行PCR鉴定，得到重组质粒pRE12-UD。
    第三步：根据pYES1质粒中的Spec抗性基因片段设计引物spec-F/R，并在两端加入NotI和sbfI酶切位点，
spec-F：GCACCTGCAGG GACCAGCCAGGACAGAAA(NotI)
Spec-R：ATGCGGCCGCCCACGTCAAATAATCAAGGCG(SbfI)
    PCR条件为：94℃变性2min,经98℃ 10s、55℃ 10s、72℃20s循环扩增35次，72℃延伸10min。扩增片段经TA克隆后测序验证。将扩增产物酶切回收后与于同样酶切处理的重组质粒pRE112-UD连接过夜并转入其宿主菌c7232中，挑取壮观霉素抗性平板上的单菌落，增殖后进行酶切鉴定和PCR鉴定，得到重组质粒pRE12-USD(pRE112-Δcrp::spec)。然后将pRE112-USD质粒转入c7213中。
    第四步：将含有pRE112-USD重组质粒c7213菌株与RA-CH1摇菌至0D600为0.6-0.8时，按照3:2的比例将其于平板上混合，置于37℃ 5% CO2培养箱中培养24-18h。将菌苔刮下划线于含有spec（50μg/ml），kan（50μg/ml）的胰蛋白大豆肉汤平板上。挑取生长的单菌落通过利用crp-up-F和crp-down-R、spec-F/R、Ra-CH1保守序列及crp-F/R鉴定,即可得到RA-CH-1 Δcrp突变的菌株。
Ra-CH1保守序列引物： F：AGAAGATTTTAAGGCGGAG
R：GGCTTCTGATTGATTTCC
用spec抗性基因的引物：
    Spec-F ：GCACCTGCAGGGACCAGCCAGGACAGAAA
    Spec-R： ATGCGGCCGCCCACGTCAAATAATCAAGGCG
扩增抗性片段的1185bp片段，判断是否发生基因的替换；
用引物：
    crp-up-F：GATTGATATCTTTGAGGCTT
crp-down-R：ATTACAGGAATACCTGCATTG
进行扩增以检测替换片段是否正确；
用引物
crp-F: CATGCCATGGTGTTTGAAAAACAGTT
crp-R: CGCGGATCCAGAAACCACATGTCCTACTT
扩增目的基因以检测是否crp是否被缺失。
第五步：将RA-CH1Δcrp与RA-CH1进行攻毒试验以验证其毒力降低情况。并对10日龄雏鸭进行不同浓度减毒鸭疫里默氏杆菌的免疫，二免后14天用10×LD50剂量进行攻毒检测突变株对动物的保护情况。
不同剂量对雏鸭免疫两次后进行10×LD50剂量的同血清型的攻毒保护情况见表1。
本发明的范围不受所述具体实施方案的限制，所述方案只作为阐明本发明的单个例子。所述鸭疫里默氏杆菌血清1型crp突变株构建可以用于该血清型其他基因缺失株或其他血清型缺失株构建。实际上，除了本文所述的内容外，本领域技术人员参照上文的描述和附图可以容易地掌握对本发明的多种改进。所述改进也落入所述权利要求书的范围之内。

Claims (10)

1.一株鸭疫里默氏杆菌CH1减毒菌株，其特征在于：所述减毒菌株缺失了crp基因片段；所述crp基因片段的核苷酸序列如 SEQ ID No.1所示；所述减毒菌株的分类命名为Riemerella anatipestifer CH1△crp ，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M 2014556，保藏时间为2014年11月07日。
2.根据权利要求1所述的减毒菌株，其特征在于：所述减毒菌株中的crp基因片段由spec抗性基因所替代。
3.根据权利要求1或2所述的减毒菌株，其特征在于：所述壮观霉素抗性基因片段的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
4.一种鸭疫里默氏杆菌CH1减毒菌株的构建方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：
    1）构建重组自杀质粒pRE112-△crp::spec；
    2）将步骤1）所得重组自杀质粒转化入到x7213大肠杆菌中；
    3）将步骤2）中含有重组质粒的x7213大肠杆菌与鸭疫里默氏杆菌CH1菌自然结合，使同源臂导入鸭疫里默氏杆菌CH1菌的基因组中，经过同源臂交换和壮观霉素抗性筛选得到阳性克隆；
4）通过PCR筛选得到缺失crp基因的鸭疫里默氏杆菌CH1减毒菌株。
5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于：所述重组自杀质粒pRE112-△crp::spec的构建方法，包括如下步骤：
1）crp基因的左右同源臂的引物设计：
crp-up-F：GATTGATATCTTTGAGGCTT
crp-up-R：CCTGCAGGGATGCGGCCGCTTAACTGATATTTATCAGCA
crp-down-F：GCGGCCGCATCCCTGCAGGTAAATTTTTAATGAAGTAAAAAT
crp-down-R：ATTACAGGAATACCTGCATTG
2）以鸭疫里默氏杆菌CH1全基因组作为模板，分别对crp基因的左右臂进行PCR扩增，回收产物用引物crp-up-F 和crp-down-R进行扩增，得到左右同源臂产物；
3）利用加A试剂盒对同源臂末端进行加A处理，然后与用AhdI限制性内切酶处理的pRE112自杀质粒产物进行连接，将连接产物转入c7232大肠杆菌感受态中；
4）将步骤3）所得c7232大肠杆菌摇菌培养至对数期，进行质粒抽提，得到重组质粒pRE112-△crp；在crp-up-R和crp-down-F引物间引入NotI和SbfI酶切位点；
5）spec抗性基因的引物设计
spec-F：GCACCTGCAGGGACCAGCCAGGACAGAAA
Spec-R：ATGCGGCCGCCCACGTCAAATAATCAAGGCG；
将spec抗性基因的引物进行PCR扩增，PCR扩增片段回收后用NotI和SbfI进行双酶酶切，再与经NotI和SbfI双酶酶切处理的pRE112-△crp连接，得到重组质粒pRE112-△crp::spec。
6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，所述步骤2）中，对crp基因的左右臂进行PCR扩增时，具体PCR扩增条件为：先于94℃变性2 min，经98℃变性10s、55℃ 退火10s、72℃延伸15s，循环扩增35次，再于72℃延伸10min。
7.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，所述步骤5）中，对spec抗性基因的引物进行PCR扩增时，具体PCR扩增条件为：先于94℃变性2min,经98℃变性10s、55℃退火10s、72℃延伸20s，循环扩增35次，再于72℃延伸10min。
8.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述步骤3）中，将含有重组质粒的x7213大肠杆菌与鸭疫里默氏杆菌CH1菌自然结合时，具体的结合步骤为：分别将含有pRE112-△crp::spec重组质粒x7213菌株与鸭疫里默氏杆菌CH1培养至0D600=0.6-0.8,按体积比3:2的比例，在固体平板培养基上混合，37℃下，于 5% CO2培养箱中培养24-18h，将菌苔刮下，划线于含有50μg/ml的spec和l00μg/m的kan的胰蛋白大豆肉汤固体平板培养基上进行培养，挑取生长的单菌落。
9.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述步骤4）中，PCR筛选的步骤为：
（1）鸭疫里默氏杆菌CH1保守序列引物
F：AGAAGATTTTAAGGCGGAG
R：GGCTTCTGATTGATTTCC
PCR扩增鸭疫里默氏杆菌CH1的特异性基因的1514bp片段，判定候选突变株是否为鸭疫里默氏杆菌CH1；
（2）以spec抗性基因的引物
    Spec-F：GCACCTGCAGGGACCAGCCAGGACAGAAA
    Spec-R：ATGCGGCCGCCCACGTCAAATAATCAAGGCG
扩增抗性片段的1185bp片段，判断是否发生基因的替换；
（3）以引物
    crp-up-F：GATTGATATCTTTGAGGCTT
crp-down-R：ATTACAGGAATACCTGCATTG
进行扩增以检测替换片段是否正确；
(4)以引物
crp-F: CATGCCATGGTGTTTGAAAAACAGTT
crp-R: CGCGGATCCAGAAACCACATGTCCTACTT
扩增目的基因以检测是否crp是否被缺失。
10.如权利要求1所述的鸭疫里默氏杆菌CH1减毒菌株在疫苗上的应用。
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