CN106518991A - 鸭疫里默氏杆菌血清1型铁载体受体蛋白srp及其基因工程突变菌株的构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种鸭疫里默氏杆菌血清1型铁载体受体蛋白SRP及其编码基因，利用其SRP编码基因构建的缺失SRP基因的突变菌株在限铁环境中生长速度明显晚于野生型鸭疫里默氏杆菌，并且该缺失SRP基因的突变菌株具有降低RA毒力的作用，因此，有望通过对SRP蛋白或基因的进一步改造获得低毒株，在鸭疫里默氏杆菌的防控方面具有广阔的应用前景。

Description

鸭疫里默氏杆菌血清1型铁载体受体蛋白SRP及其基因工程突 变菌株的构建方法

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，更具体地涉及一种鸭疫里默氏杆菌血清1型铁载体受体蛋白及其基因工程突变菌株的构建方法。

背景技术

鸭疫里默氏杆菌病是鸭、鹅、火鸡和其他鸟类的一种高致病性、接触性传染病之一，其病原体为鸭疫里默氏杆菌(Riemerella anatipestifer，RA)，主要侵害1～8周龄(尤其2～3周龄)雏鸭、雏鹅及雏火鸡等。鸭疫里默氏杆菌病多呈急性或慢性败血症病程，主要以神经症状和纤维素性心包炎、肝周炎和气囊炎为特征，发病率90％以上，死亡率高达75％，耐过的病鸭常长成残次鸭或僵鸭，饲料转化率降低，生长发育迟缓，且由RA引起的输卵管炎严重影响鸭成年后产蛋率。因此，鸭疫里默氏杆菌病的广泛流行，给养鸭业带来严重的经济损失。

基因敲除是在80年代后半期应用DNA同源重组原理发展起来的一门新技术。基因敲除是指对一个已知的基因，从分子水平上设计实验，将该基因敲除，或用其它基因取代，然后对敲除后的个体进行研究，通过其性状的变化而研究被敲除基因的功能。该技术已广泛应用于细菌突变株的构建。

铁是生命系统所必需的分子，在脊椎动物体液中，铁绝大部分与转铁蛋白和乳铁蛋白结合在一起，致病菌要想在宿主体内建立感染，很大程度上依赖于其利用宿主铁复合物的能力，因此微生物的铁载体运输系统，是致病菌战胜宿主非特异性防御机制，并在宿主体内繁殖的关键。铁载体运输系统主要由铁载体、铁载体受体蛋白(Siderophore ReceptorProtein，SRP)组成，其中，SRP在细菌铁离子摄取机制中起着至关重要的作用，是细菌重要的毒力因子和潜在的疫苗靶分子。

目前，国内外关于鸭疫里默氏杆菌铁载体受体蛋白未见公开，因此，开发一种鸭疫里默氏杆菌SRP基因工程突变菌株将有助于为鸭疫里默氏杆菌的毒力研究和防控开辟新的思路。

发明内容

本发明的目的在于提供一种鸭疫里默氏杆菌血清1型铁载体受体蛋白SRP的氨基酸序列及编码SRP蛋白的核苷酸序列，另一目的是提供一种缺失SRP基因的鸭疫里默氏杆菌血清1型基因工程突变菌株及其构建方法。

本发明所采取的技术方案是：

鸭疫里默氏杆菌血清1型铁载体受体蛋白SRP，氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

编码鸭疫里默氏杆菌血清1型铁载体受体蛋白SRP的核苷酸序列，优选的，核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

鸭疫里默氏杆菌血清1型铁载体受体蛋白SRP基因工程突变菌株的构建方法，包括如下步骤：

(1)以鸭疫里默氏杆菌血清1型铁载体受体蛋白SRP的核苷酸序列为目的缺失基因，分别设计SRP左臂基因片段的上、下游引物、SRP右臂基因片段的上、下游引物以及抗性基因的上、下游引物，其中所述SRP左臂基因片段的上游引物与所述SRP右臂基因片段的上游引物均具有相同的限制性内切酶的酶切位点；

(2)采用步骤(1)所述的SRP左臂基因片段的上、下游引物扩增SRP左臂基因片段，SRP右臂基因片段的上、下游引物扩增SRP右臂基因片段，抗性基因的上、下游引物扩增抗性基因；

(3)采用步骤(1)所述的SRP左臂基因片段的上游引物、SRP右臂基因片段上游引物和抗性基因的上、下游引物组成的引物组，以SRP左臂基因片段、SRP右臂基因片段和抗性基因为模板，重叠延伸扩增将SRP左臂基因片段、抗性基因、SRP右臂基因片段串联，构建出缺失SRP基因的片段，记为ΔSRP；

(4)将步骤(3)制备得到ΔSRP基因片段和自杀性质粒pDS132分别用步骤(1)所述的限制性内切酶进行酶切，并将酶切后的自杀性质粒pDS132用CIAP去磷酸化后，用T4DNA连接酶连接，得到pDS132：：ΔSRP自杀性质粒；

(5)将步骤(4)制备的得到的pDS132：：ΔSRP自杀性质粒转入鸭疫里默氏杆菌血清1型GDGZ菌株感受态细胞，氯霉素抗性平板筛选重组突变菌株即为鸭疫里默氏杆菌血清1型SRP基因工程突变菌株。

优选的，步骤(3)所述的模板浓度比为SRP左臂基因片段∶SRP右臂基因片段∶抗性基因＝1∶1∶1。

优选的，所述的抗性基因为氨苄抗性基因。

优选的，所述的限制性内切酶为SalI。

优选的，所述SRP左臂基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，SRP右臂基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示，所述ΔSRP基因片段核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。

一种鸭疫里默氏杆菌血清1型铁载体受体蛋白SRP基因工程突变菌株，采用上述鸭疫里默氏杆菌血清1型铁载体受体蛋白SRP基因工程突变菌株的构建方法构建而成。

本发明的有益效果是：

本发明提供了一种鸭疫里默氏杆菌血清1型铁载体受体蛋白SRP及其编码基因，利用其SRP编码基因构建的缺失SRP基因的突变菌株在限铁环境中生长速度明显晚于野生型鸭疫里默氏杆菌，并且该缺失SRP基因的突变菌株具有降低RA毒力的作用，因此，对SRP蛋白或基因的进一步改造，有望获得低毒株，在鸭疫里默氏杆菌的防控方面有广阔的应用前景。

附图说明

图1：SRP左、右臂基因片段及氨苄抗性基因的PCR扩增产物电泳图【M：DNA Marker；1～3：SRP基因左臂片段；4～6：SRP基因右臂片段；7～9：氨苄抗性基因】；

图2：ΔSRP基因的SOE-PCR扩增产物电泳图【M：DNA Marker；1：ΔSRP基因】；

图3：pDS132：：ΔSRP自杀性质粒菌落PCR鉴定电泳图【M：DNA Marker；1：pDS132：：ΔSRP质粒】；

图4：RA血清1型ΔSRP基因工程突变菌株的生长曲线，其中，A：普通培养基野生型；B：普通培养基突变株；C：限铁培养基野生型；D：限铁培养基突变株。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明进一步解释，实施例中未详细描述的培养基和分子生物学材料及操作方法为本领域的常规技术。

本发明涉及的RA血清1型铁载体受体蛋白SRP的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，基因片段长度2262bp。

选取SRP基因左右各1000bp左右的序列为构建左右臂的基因序列，SRP左臂基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，SRP右臂基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示，ΔSRP基因(如SEQ ID NO：5所示)由SRP左臂基因片段、SRP右臂基因片段、氨苄抗性基因组成。

实施例中未详细描述的培养基和分子生物学材料及操作方法为该领域技术人员所公知。

1、扩增引物的设计

根据SRP左臂基因片段、SRP右臂基因片段以及氨苄抗性基因设计PCR扩增引物，引物序列如下所示(下划线显示Sal I酶切位点)：

左臂上游引物：5’-GCGGTCGACCGCTTTATTTTTGTTTGCAG-3’(SEO ID NO：6)；

左臂延伸引物：5’-CCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATTAGTTAAATCTACATTAGGG-3’(SEQ ID NO：7)；

右臂上游引物：5’-GCGGTCGAC GAAGCCCTAACTGATAGATTGG-3’(SEQ ID NO：8)：

右臂延伸引物：5’-TAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAAGCGGTTGGGGATAGGTTG-3’(SEQ ID NO：9)；

氨苄基因上游引物：5’-GTAGGAGAAGCCAGTTGTATATTAACCCTAATGTAGATTTAACTAATGAGTATTCAACATTTCCG-3’(SEQ ID NO：10)；

氨苄基因下游引物：5’-TCATTAAAATATTATTTTCCATAAAACCAACCTATCCCCAACCGCTTACCAATGCTTAATCAGTG-3’(SEQ ID NO：11)。

2、SRP左、右臂基因片段及氨苄抗性基因的扩增

参照天根细菌基因组DNA试剂盒说明书步骤提取的RA血清1型GDGZ菌株基因组DNA，作为扩增模板。用SRP左臂基因片段的上、下游引物扩增SRP左臂基因片段，SRP右臂基因片段的上、下游引物扩增SRP右臂基因片段，氨苄基因的上、下游引物扩增氨苄抗性基因。PCR扩增体系为：PreMixTaq 10μL，GDGZ菌株基因组DNA 1μL，上下游引物各1μL，加灭菌水至50μL。PCR反应程序：首先，94℃预变性5min；然后94℃变性30s，55℃退火1min，72℃延伸1min，进行35个循环；循环结束后，72℃延伸10min；4℃+∞。1％琼脂糖凝胶电泳检测上述PCR扩增结果产物，电泳结果如图1所示，扩增获得1kb左右的目的条带。

3、ΔSRP基因片段的扩增

SRP左臂序列、SRP右臂和氨苄基因序列经测序正确后，以SRP左臂上游引物、SRP右臂上游引物和氨苄基因的引物用重叠延伸PCR(SOE-PCR)将左臂基因、右臂基因和氨苄抗性基因序列按左臂-AMP-右臂串联，构建ΔSRP基因片段，即为缺失SRP基因的基因片段。SOE-PCR扩增体系为：PreMixTaq 10μL，SRP左臂上游引物1μL，SRP右臂上游引物1μL，氨苄基因上、下游引物各1μL，左臂基因片段1μL，右臂基因片段1μL，氨苄基因片段1μL加灭菌水至50μL。PCR反应程序：首先，94℃预变性5min；随后，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸3min，进行35个循环；循环结束后72℃延伸10min；4℃+∞。1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增结果，电泳结果如图2所示，可见一条大片段3kb左右的目的条带，另一条小片段1kb左右的条带是非特异性扩增。

4、pDS132：：ΔSRP自杀性质粒的构建

将自杀性质粒pDS132和ΔSRP基因片段分别用Sal I酶切，并将酶切的自杀性质粒pDS132用CIAP去磷酸化后，pDS132 2μL，ΔSRP基因片段4μL，T4DNA连接酶1μL，T4连接酶缓冲液1μL，4℃连接16h，得到pDS132：：ΔSRP自杀性质粒，转化大肠杆菌SM10pir，然后进行菌落PCR鉴定，1.0％琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增结果，电泳结果如图3所示，可见一条3kb左右的目的条带。

5、RA血清1型ΔSRP基因工程菌株的构建

将阳性质粒pDS132-ΔSRP化大肠杆菌β2155感受态细胞，得到供体菌大肠杆菌β2155(pDS132-ΔSRP。以转化了质粒pDS132-ΔSRP的大肠杆菌β2155为供体菌，RA血清1型为受体菌进行结合转移。供体菌和受体菌分别在适合的琼脂平板上培养过夜，然后以TSB洗两遍，调整菌浓度至OD₆₀₀为0.4，各取100μL菌液混合，将无菌硝酸纤维滤膜贴于含二氨基庚二酸(DAP)的TSA平板上，将混合菌液滴于滤膜上。37℃接合8h，接合结束后用无菌接种环将滤膜上的菌落刮下来，以TSB重悬，再用TSB洗两遍，涂布于TSA平板(含氯霉素50μg/mL，不含DAP)，37℃培养24h。Cm抗性菌落分别影印到Cm抗性平板和10％蔗糖平板上。筛选带有Cm抗性蔗糖敏感的接合子。将接合子接种于无NaCl的TSB中37℃培养过夜，适当稀释涂布含有10％蔗糖的TSA平板上，过夜培养，挑取单菌落分别影印到Cm抗性平板和10％蔗糖平板上。筛选Cm敏感蔗糖抗性的菌落，确定发生了交换。

6、RA血清1型ΔSRP基因工程突变菌株的生长曲线的测定

将RA血清1型ΔSRP基因工程突变菌株在铁丰富及限铁环境下培养，以含5％血清的TSB培养基作为铁丰富培养基；以加入2，2-吡啶作为螯合剂的TSB培养基作为限铁培养基，以模拟体内感染环境。

取RA血清1型ΔSRP基因工程突变菌株划TSA琼脂平板置于37℃培养，24h活化后挑取单菌落于5mL液体培养基中，200rpm/min，37℃过夜培养12h，得到的菌液作为菌种。取1ml菌种分别加入到100mL铁丰富液体培养基和100mL限铁液体培养基中混合均匀，200rpm/min37℃培养，每隔1h取一管之后测定每管的OD_600mm下的吸光值绘制时间与OD值之间的曲线。

结果如图4所示，在铁丰富环境中，ΔSRP基因工程突变菌株与野生型菌株生长曲线无明显差异，而在限铁环境中，ΔSRP基因工程突变菌株生长速度显著慢于野生型菌株，对数生长期起始时间较野生型晚约10个小时，这说明SRP基因与鸭疫里默氏杆菌铁离子摄取密切相关。

7、RA血清1型ΔSRP基因工程突变菌株的动物攻毒试验

将7日龄雏鸭分为4组，将RA血清1型ΔSRP基因工程突变菌株和野生型菌株分别用1.5×10⁸CFU/mL、3×10⁷CFU/mL、6×10⁶CFU/mL、1.2×10⁶CFU/mL的攻毒剂量分别腿部肌肉注射，10只/组，每组分笼饲养，观察7天，记录每组雏鸭的死亡情况。

结果如表1所示，动物攻毒实验表明6×10⁶CFU/mL和1.2×10⁶CFU/mL的攻毒剂量下，ΔSRP基因工程突变菌株的致死率低于野生菌株，观察雏鸭开始死亡时间发现，野生型菌株攻毒雏鸭24小时后开始死亡，突变菌株是在攻毒48小时后开始死亡。说明突变菌株在体内增值并达到致死数量的速度明显要晚于野生型。可见，构建的RA血清1型ΔSRP基因工程突变菌株毒力有所下降，表明本发明的SRP蛋白与菌株的毒力相关。有望对SRP编码基因进一步改造，获得更有效的减毒菌株，应用于鸭疫里默氏杆菌的防控及相关毒力研究，具有广阔的应用前景。

表1 ΔSRP基因工程突变菌株动物攻毒试验

SEQUENCE LISTING

<110> 广东省农业科学院动物卫生研究所

广东海大畜牧兽医研究院有限公司

<120> 鸭疫里默氏杆菌血清1型铁载体受体蛋白SRP及其基因工程突变菌株的构建方

法

<130>

<160> 11

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 753

<212> PRT

<213> Riemerella anatipestifer

<400> 1

Met Lys Lys Asn His Phe Tyr Gln Arg Asn Gly Tyr Tyr Leu Ser Thr

1 5 10 15

Met Leu Leu Lys Ala Cys Asn Ile Ala Leu Leu Thr Ala Pro Leu Phe

20 25 30

Ser Asn Ala Gln His Lys Glu Arg Ile Lys Asp Ile Gln Glu Val Glu

35 40 45

Leu Val Lys Arg Lys Leu Glu Ala Phe Glu Ser Arg Lys Leu Arg Glu

50 55 60

Val Glu Gly Thr Ser Ile Phe Ala Ala Lys Lys Thr Glu Val Val Leu

65 70 75 80

Met Asp Leu Lys Leu Ala Asn Lys Ala Leu Asn Asn Pro Arg Gln Val

85 90 95

Phe Ser Gln Val Ser Gly Val Asn Val Phe Asp Ser Asn Asp Gly Gly

100 105 110

Leu Gln Leu Asn Ile Gly Gly Arg Gly Leu Asn Pro Asn Arg Ser Ala

115 120 125

Asn Phe Asn Thr Arg Gln Asn Gly Tyr Asp Ile Ser Ala Asp Val Leu

130 135 140

Gly Tyr Pro Glu Ser Tyr Tyr Thr Pro Pro Ala Glu Ala Leu Glu Glu

145 150 155 160

Ile Gln Val Val Arg Gly Ala Ala Ser Leu Gln Tyr Gly Thr Gln Phe

165 170 175

Gly Gly Leu Leu Asn Phe Lys Leu Lys Thr Pro Thr Lys Thr Gln Pro

180 185 190

Leu Glu Leu Ile Ser Arg Asn Thr Tyr Ala Ser Phe Asn Thr Tyr Thr

195 200 205

Ser Phe Ser Ala Leu Ser Gly Thr Val Gly Lys Trp Ser Tyr Tyr Thr

210 215 220

Phe Phe Asn Tyr Lys Gln Gly Asp Gly Phe Gln Glu Asn Ser Glu Tyr

225 230 235 240

Asn Ala Arg Asn Phe Tyr Val His Leu Asn Tyr Glu Ile Thr Pro Gln

245 250 255

Thr Ser Ile Ser Thr Glu Phe Thr Arg Phe Asn Tyr Leu Ala His Gln

260 265 270

Pro Gly Gly Leu Thr Asp Phe Gln Phe Tyr Gln Asn Pro Tyr Gln Ser

275 280 285

Asn Arg Ala Arg Asn Trp Phe Lys Val Asp Trp Asn Leu Trp Asn Val

290 295 300

Ser Leu Lys His Gln Phe Thr Pro Arg Ala Lys Leu Ser Leu Ser Gly

305 310 315 320

Phe Gly Leu Gly Ala Ser Arg Tyr Ser Leu Lys Val Ser Ser Ile His

325 330 335

Val Ala Asp Val Asp Tyr Glu Gly Ala Thr Arg Asp Leu Ile Thr Gly

340 345 350

Asp Phe Lys Asn Trp Gly Val Glu Ala Arg Phe Leu Gln Gln Tyr Gly

355 360 365

Asn Lys Asn His Thr Phe Leu Val Gly Gly Lys Tyr Tyr Lys Ala Gln

370 375 380

Asn Ser Gly Lys Gln Gly Pro Gly Ser Ala Phe Ser Gly Ala Asp Phe

385 390 395 400

Asn Phe Asp Gln Thr Asn Lys Asn Tyr Phe Phe Gln Ser Asn Tyr Ser

405 410 415

Tyr Pro Asn Arg Asn Ile Ala Val Phe Ser Glu Asn Ile Phe Lys Leu

420 425 430

Gly Ala Pro Trp Ser Val Val Pro Gly Val Arg Trp Glu Phe Ile Asp

435 440 445

Thr Gly Ala Asp Gly Ala Tyr Gln Arg Val Ile Glu Asp Asn Ala Gly

450 455 460

Asn Val Ile Tyr Asn Lys Arg Phe Glu Glu Gln Glu Lys Arg Gln Arg

465 470 475 480

Asn Phe Ala Leu Phe Gly Leu Gly Val Ser Tyr Lys Pro Thr Lys Ala

485 490 495

Phe Glu Phe Tyr Thr Asn Leu Ser Gln Asn Tyr Arg Ser Val Thr Phe

500 505 510

Ser Asp Ile Arg Val Glu Asn Asn Ser Gln Val Ile Asp Pro Asn Ile

515 520 525

Lys Asp Glu Thr Gly Tyr Thr Gly Asp Leu Gly Ile Arg Gly Asn Trp

530 535 540

Lys Asn Thr Leu Ser Tyr Asp Ile Asn Met Phe Gly Leu Trp Tyr Asn

545 550 555 560

Asn Arg Ile Asp Asn Val Phe Arg Lys Arg Glu Gly Leu Phe Ser Asp

565 570 575

Val Ala Lys Val Arg Thr Asn Val Gly Ala Ala Phe Ile Ala Gly Leu

580 585 590

Glu Ser Leu Val Asp Val Asn Ile Asn Lys Leu Leu Leu Gly Asn Leu

595 600 605

Gln His Trp Lys Trp Asn Leu Phe Phe Asn Thr Ala Leu Thr His Ser

610 615 620

Gln Tyr Val Lys Ser Glu Ile Pro Gly Ile Lys Gly Asn Arg Val Glu

625 630 635 640

Tyr Val Pro Lys Val Asn Leu Lys Ser Gly Leu Asn Phe Gly Tyr Arg

645 650 655

Asn Phe Leu Gly Ser Leu Leu Phe Thr Tyr Met Ser Glu Gln Phe Thr

660 665 670

Thr Ala Thr Asn Glu Pro Thr Asp Lys Thr Asp His Leu Trp Gly Ile

675 680 685

Arg Gly Ser Ile Pro Ala Tyr Lys Leu Leu Asp Ala Ser Phe Ser Tyr

690 695 700

Arg Ile Thr Pro Asn Ile Arg Leu Glu Thr Gly Val Asn Asn Val Leu

705 710 715 720

Asn Glu Val Tyr Phe Thr Arg Arg Ala Thr Gly Tyr Pro Gly Pro Gly

725 730 735

Ile Ile Pro Ser Ala Pro Arg Gln Tyr Tyr Phe Thr Leu Glu Met Lys

740 745 750

Leu

<210> 2

<211> 2262

<212> DNA

<213> Riemerella anatipestifer

<400> 2

atgaagaaga atcattttta ccaaagaaat ggctattacc tttcaacgat gttattaaag 60

gcttgtaaca ttgcattgct taccgcacca ttattttcga atgctcaaca caaagaaaga 120

atcaaggata tacaggaggt agaactggtt aaaagaaagt tggaagcctt tgaatccaga 180

aaattgaggg aagtggaagg caccagcatc tttgccgcta aaaaaacgga agtggtgcta 240

atggatttaa agttggctaa taaagccctt aataatccca gacaggtctt ttcccaagta 300

tcgggcgtta atgtttttga tagtaacgac ggggggcttc agctcaacat aggagggcga 360

gggcttaacc ctaaccgttc agctaacttt aacaccagac agaatgggta cgatattagt 420

gccgatgtat tgggttatcc agagagctat tatacaccac ccgcagaggc attggaggag 480

attcaggtgg tgagaggagc ggcttcgttg caatacggaa cacagttcgg agggttgctt 540

aattttaaac taaaaacgcc aactaaaaca caaccgttgg agcttatcag caggaatact 600

tatgcaagtt ttaatactta cacgagtttc agtgctttga gcggaacggt gggcaagtgg 660

tcttattata ctttttttaa ttataagcaa ggggacggat ttcaagaaaa ttcggaatat 720

aatgccagaa acttttatgt tcatttaaac tatgagataa cgcctcaaac aagtatcagt 780

acggagttta cccgttttaa ttatttggca catcaacctg gggggcttac cgattttcag 840

ttctaccaaa atccttatca aagcaaccga gcaagaaatt ggtttaaagt ggactggaac 900

ctttggaatg tgtcattaaa gcatcagttt acccctcgtg ccaaattaag tttaagtggg 960

tttggcttgg gagcgtcccg ttattcttta aaagtctcgt ctatccatgt cgcagatgtg 1020

gattatgaag gggctacacg ggatttgatt acaggagatt ttaagaattg gggagtagaa 1080

gcaaggttcc tgcaacaata tgggaataaa aaccatactt ttttggtagg aggtaaatat 1140

tataaagctc aaaactcggg gaagcaagga ccgggaagtg ctttttctgg ggcagatttt 1200

aactttgacc agactaataa aaactatttc tttcagtcga attatagcta tcctaaccga 1260

aatatagcgg tgttttcaga gaatatattt aagttgggag ctccttggtc ggtagttcct 1320

ggtgtgcgtt gggagtttat agatactggt gcagatgggg cgtaccaaag ggtgatagaa 1380

gataatgcag gaaatgtaat ctataacaaa cgctttgaag aacaagagaa acgccaaagg 1440

aatttcgcac tatttgggtt gggtgtttct tataagccta ccaaagcgtt tgaattttac 1500

actaacttgt cccaaaatta ccgctctgta acctttagtg atattagagt agaaaataat 1560

tcccaagtga tagaccccaa cattaaggac gaaacaggct atacgggaga tttggggata 1620

agagggaatt ggaaaaatac actgtcttac gacatcaata tgtttggatt gtggtataat 1680

aacagaatag ataatgtttt tagaaaaagg gaaggcttgt tctccgatgt agcaaaggta 1740

cgaactaatg taggagcggc atttattgcg gggttagaat cgttggtaga cgtaaatatc 1800

aacaaacttc ttttagggaa tttgcaacat tggaaatgga atttgttttt taatacagca 1860

ctcacgcatt ctcaatatgt aaagtccgag atacctggga ttaagggcaa ccgtgtggaa 1920

tatgtaccta aagtcaattt aaaatcgggg cttaactttg ggtaccgtaa ctttttagga 1980

agccttttgt ttacctatat gtcggagcaa tttaccacgg caactaatga acctacggat 2040

aaaacagacc atctgtgggg gatacgaggg agcataccag cttataagct attagatgcc 2100

tctttttcgt accgcatcac acctaatatc cgattggaaa caggcgtgaa taatgtactg 2160

aatgaagtct attttacccg aagagccaca gggtatccag gaccggggat tattccttcc 2220

gctcctcgcc aatattattt cactttggaa atgaagctgt ag 2262

<210> 3

<211> 1094

<212> DNA

<213> Riemerella anatipestifer

<400> 3

cgctttattt ttgtttgcag ggctaatggc ttttttagta atggtggggc ggtattaccg 60

aatggcaatc gttggttttt tcctttcgtt tacttacatc gaacttatgg ataagactaa 120

ttatcttaac cattattact ttatcagtat tttgagcttt ttgttgatat ttttaccgat 180

gaacgtggct ttctctgccg atgcggaagc caatcccgaa aagaaaagag agtttgttcc 240

agtatggacg attaacgcca ttaagtttct ggtaggcttg gtttatttct atgcaggtgt 300

gtgtaagctc aattccgatt ggctattgga agcaatgccg ctcaagttat ggttggcttc 360

aaagtttcat cttccgctga taggtggttt gatggataaa actataaccg cctatttgtt 420

cagttgggca ggagcattgt acgatttgag tatccctttt ttactattat atcgtaaaac 480

cagaggctgg gcatttggga gtgtggtggt ttttcatacg ctcacttggt ggttgtttcc 540

tattggtatt tttccttttg tgatgatgtt tggagctacg atttactttt cttccgaatg 600

gcatcagaag ttttggtaca ggctgtactc ttgtttcaaa tgggatttta aggcttactt 660

taatggcaag gtttaccaat atgcgccgta tttcaagaaa cctatctgtg gaattttggt 720

tttatttttt accgttcaag tgttactgcc ttggcggtat ttgctttatc cgggggaatt 780

attctggacg gaggagggct ttagattttc ttggcgggtg atgctgatgg aaaaaggcgg 840

ttatgcagag tttaaagtct ataatcctaa aactaaggaa tattaccgag tggaaaattc 900

ggattttctc acccctacac aagaaaaaca gatggcattt caacctgatt ttattttaga 960

atacgcccac tttttaaagg attattttga aagggaaaaa ggagtaaaaa acgccaaggt 1020

ctatgccgag gtgtatgtgg ctctcaatgg taggagaagc cagttgtata ttaaccctaa 1080

tgtagattta acta 1094

<210> 4

<211> 1064

<212> DNA

<213> Riemerella anatipestifer

<400> 4

gcggttgggg ataggttggt tttatggaaa ataatatttt aatgaaaaag ccgctgtaac 60

aaatgttaca acggcttttt cgatattcta tttttagtag tttattgttt tatgattttt 120

ttggttatca tctttccgtc cacttttatt gataggaggt aaactccttt ttttaggtga 180

tttaggtcaa tagttttgcc gtgggcattg gataaaataa gcgttccgga agcgtcgtaa 240

aggtttattt cggaaactgt tttcttggaa gcaatgtata gaatatcttt tacagggtta 300

ggataaagcg ttacatcatc gcttgaagaa gataagttgg aggtggacat agtaccgcaa 360

tctgtattat aggttacacc actatcttgt tgccacgtag aacttacttt ttcgccttcg 420

gtaattttta cacaagttaa gttagggtta ttggtaatat ctaatcccga aaaattagca 480

taacttccga atgcaatgtt tagactattg aggttattgc ttgccagaga taaattaacc 540

aaatctggat ttttactggc gtctaaagtt tctattttat tattgcttaa atctacactt 600

acaagtttgg ggttcttatc aatgctgata ttggtaaggc tgttcccgta gcaagatagg 660

ctggtaagtt ttgtattgtt atctatgttt agcgaagtta gttggttgtt atagccttct 720

aaggtaataa gttctgggtt tttgcttagg tctatattac tgatttggtt gtcgccaaaa 780

tttaaaatct ttagcttttt gttttggctt acgtctaagg aagttaaatt gttatagtag 840

ctgtttaaat cctccaattc tgtattttga ctaatattta tggaagaaat attagaccct 900

tctaagtaaa ctctctttag agctttgttc ccgctgaagt ctatttctgt aaggctccct 960

gtattgtagt ataattgtat ttcttccaca tttttgaagg cttctaatcc cgtaagattg 1020

ttgatttttt tatctgataa atccaatcta tcagttaggg cttc 1064

<210> 5

<211> 3019

<212> DNA

<213> Riemerella anatipestifer

<400> 5

cgctttattt ttgtttgcag ggctaatggc ttttttagta atggtggggc ggtattaccg 60

aatggcaatc gttggttttt tcctttcgtt tacttacatc gaacttatgg ataagactaa 120

ttatcttaac cattattact ttatcagtat tttgagcttt ttgttgatat ttttaccgat 180

gaacgtggct ttctctgccg atgcggaagc caatcccgaa aagaaaagag agtttgttcc 240

agtatggacg attaacgcca ttaagtttct ggtaggcttg gtttatttct atgcaggtgt 300

gtgtaagctc aattccgatt ggctattgga agcaatgccg ctcaagttat ggttggcttc 360

aaagtttcat cttccgctga taggtggttt gatggataaa actataaccg cctatttgtt 420

cagttgggca ggagcattgt acgatttgag tatccctttt ttactattat atcgtaaaac 480

cagaggctgg gcatttggga gtgtggtggt ttttcatacg ctcacttggt ggttgtttcc 540

tattggtatt tttccttttg tgatgatgtt tggagctacg atttactttt cttccgaatg 600

gcatcagaag ttttggtaca ggctgtactc ttgtttcaaa tgggatttta aggcttactt 660

taatggcaag gtttaccaat atgcgccgta tttcaagaaa cctatctgtg gaattttggt 720

tttatttttt accgttcaag tgttactgcc ttggcggtat ttgctttatc cgggggaatt 780

attctggacg gaggagggct ttagattttc ttggcgggtg atgctgatgg aaaaaggcgg 840

ttatgcagag tttaaagtct ataatcctaa aactaaggaa tattaccgag tggaaaattc 900

ggattttctc acccctacac aagaaaaaca gatggcattt caacctgatt ttattttaga 960

atacgcccac tttttaaagg attattttga aagggaaaaa ggagtaaaaa acgccaaggt 1020

ctatgccgag gtgtatgtgg ctctcaatgg taggagaagc cagttgtata ttaaccctaa 1080

tgtagattta actaatgagt attcaacatt tccgtgtcgc ccttattccc ttttttgcgg 1140

cattttgcct tcctgttttt gctcacccag aaacgctggt gaaagtaaaa gatgctgaag 1200

atcagttggg tgcacgagtg ggttacatcg aactggatct caacagcggt aagatccttg 1260

agagttttcg ccccgaagaa cgttttccaa tgatgagcac ttttaaagtt ctgctatgtg 1320

gcgcggtatt atcccgtatt gacgccgggc aagagcaact cggtcgccgc atacactatt 1380

ctcagaatga cttggttgag tactcaccag tcacagaaaa gcatcttacg gatggcatga 1440

cagtaagaga attatgcagt gctgccataa ccatgagtga taacactgcg gccaacttac 1500

ttctgacaac gatcggagga ccgaaggagc taaccgcttt tttgcacaac atgggggatc 1560

atgtaactcg ccttgatcgt tgggaaccgg agctgaatga agccatacca aacgacgagc 1620

gtgacaccac gatgcctgta gcaatggcaa caacgttgcg caaactatta actggcgaac 1680

tacttactct agcttcccgg caacaattaa tagactggat ggaggcggat aaagttgcag 1740

gaccacttct gcgctcggcc cttccggctg gctggtttat tgctgataaa tctggagccg 1800

gtgagcgtgg gtctcgcggt atcattgcag cactggggcc agatggtaag ccctcccgta 1860

tcgtagttat ctacacgacg gggagtcagg caactatgga tgaacgaaat agacagatcg 1920

ctgagatagg tgcctcactg attaagcatt ggtaagcggt tggggatagg ttggttttat 1980

ggaaaataat attttaatga aaaagccgct gtaacaaatg ttacaacggc tttttcgata 2040

ttctattttt agtagtttat tgttttatga tttttttggt tatcatcttt ccgtccactt 2100

ttattgatag gaggtaaact ccttttttta ggtgatttag gtcaatagtt ttgccgtggg 2160

cattggataa aataagcgtt ccggaagcgt cgtaaaggtt tatttcggaa actgttttct 2220

tggaagcaat gtatagaata tcttttacag ggttaggata aagcgttaca tcatcgcttg 2280

aagaagataa gttggaggtg gacatagtac cgcaatctgt attataggtt acaccactat 2340

cttgttgcca cgtagaactt actttttcgc cttcggtaat ttttacacaa gttaagttag 2400

ggttattggt aatatctaat cccgaaaaat tagcataact tccgaatgca atgtttagac 2460

tattgaggtt attgcttgcc agagataaat taaccaaatc tggattttta ctggcgtcta 2520

aagtttctat tttattattg cttaaatcta cacttacaag tttggggttc ttatcaatgc 2580

tgatattggt aaggctgttc ccgtagcaag ataggctggt aagttttgta ttgttatcta 2640

tgtttagcga agttagttgg ttgttatagc cttctaaggt aataagttct gggtttttgc 2700

ttaggtctat attactgatt tggttgtcgc caaaatttaa aatctttagc tttttgtttt 2760

ggcttacgtc taaggaagtt aaattgttat agtagctgtt taaatcctcc aattctgtat 2820

tttgactaat atttatggaa gaaatattag acccttctaa gtaaactctc tttagagctt 2880

tgttcccgct gaagtctatt tctgtaaggc tccctgtatt gtagtataat tgtatttctt 2940

ccacattttt gaaggcttct aatcccgtaa gattgttgat ttttttatct gataaatcca 3000

atctatcagt tagggcttc 3019

<210> 6

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gcggtcgacc gctttatttt tgtttgcag 29

<210> 7

<211> 66

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ccgcaaaaaa gggaataagg gcgacacgga aatgttgaat actcattagt taaatctaca 60

ttaggg 66

<210> 8

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

gcggtcgacg aagccctaac tgatagattg g 31

<210> 9

<211> 64

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

tagacagatc gctgagatag gtgcctcact gattaagcat tggtaagcgg ttggggatag 60

gttg 64

<210> 10

<211> 65

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

gtaggagaag ccagttgtat attaacccta atgtagattt aactaatgag tattcaacat 60

ttccg 65

<210> 11

<211> 65

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

tcattaaaat attattttcc ataaaaccaa cctatcccca accgcttacc aatgcttaat 60

cagtg 65

Claims (9)

1.鸭疫里默氏杆菌血清1型铁载体受体蛋白SRP，其特征在于：氨基酸序列如SEQ IDNO:1 所示。

2.编码权利要求1所述的鸭疫里默氏杆菌血清1型铁载体受体蛋白SRP的核苷酸序列。

3.根据权利要求2所述的核苷酸序列，其特征在于：核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

4.鸭疫里默氏杆菌血清1型铁载体受体蛋白SRP基因工程突变菌株的构建方法，包括如下步骤：

（1）以权利要求2或3所述的核苷酸序列为目的缺失基因，分别设计SRP左臂基因片段的上、下游引物、SRP右臂基因片段的上、下游引物以及抗性基因的上、下游引物，其中所述SRP左臂基因片段的上游引物与所述SRP右臂基因片段的上游引物均具有相同的限制性内切酶的酶切位点；

（2）采用步骤（1）所述的SRP左臂基因片段的上、下游引物扩增SRP左臂基因片段，SRP右臂基因片段的上、下游引物扩增SRP右臂基因片段，抗性基因的上、下游引物扩增抗性基因；

（3）采用步骤（1）所述的SRP左臂基因片段的上游引物、SRP右臂基因片段上游引物和抗性基因的上、下游引物组成的引物组，以SRP左臂基因片段、SRP右臂基因片段和抗性基因为模板，重叠延伸扩增将SRP左臂基因片段、抗性基因、SRP右臂基因片段串联，构建出缺失SRP基因的片段，记为ΔSRP；

（4）将步骤（3）制备得到ΔSRP基因片段和自杀性质粒pDS132分别用步骤（1）所述的限制性内切酶进行酶切，并将酶切后的自杀性质粒pDS132 用CIAP 去磷酸化后，用T4 DNA 连接酶连接，得到pDS132::ΔSRP 自杀性质粒；

（5）将步骤（4）制备的得到的pDS132::ΔSRP 自杀性质粒转入鸭疫里默氏杆菌血清1型GDGZ 菌株感受态细胞，氯霉素抗性平板筛选重组突变菌株即为鸭疫里默氏杆菌血清1型SRP基因工程突变菌株。

5.根据权利要求4所述的鸭疫里默氏杆菌血清1型SRP基因工程突变菌株的构建方法，其特征在于：步骤（3）所述的模板浓度比为SRP左臂基因片段：SRP右臂基因片段：抗性基因=1:1:1。

6.根据权利要求4所述的鸭疫里默氏杆菌血清1型SRP基因工程突变菌株的构建方法，其特征在于：所述的抗性基因为氨苄抗性基因。

7.根据权利要求4所述的鸭疫里默氏杆菌血清1型SRP基因工程突变菌株的构建方法，其特征在于：所述的限制性内切酶为SalⅠ。

8.根据权利要求4所述的鸭疫里默氏杆菌血清1型SRP基因工程突变菌株的构建方法，其特征在于：所述SRP左臂基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:3 所示，SRP右臂基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示，所述ΔSRP基因片段核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。

9.一种鸭疫里默氏杆菌血清1 型铁载体受体蛋白SRP基因工程突变菌株，其特征在于：采用权利要求4所述的构建方法构建而成。