CN114958783B - 一种三基因缺失的猫疱疹病毒i型重组病毒、猫传染性鼻气管炎活疫苗以及制备方法 - Google Patents

一种三基因缺失的猫疱疹病毒i型重组病毒、猫传染性鼻气管炎活疫苗以及制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN114958783B
CN114958783B CN202210630680.XA CN202210630680A CN114958783B CN 114958783 B CN114958783 B CN 114958783B CN 202210630680 A CN202210630680 A CN 202210630680A CN 114958783 B CN114958783 B CN 114958783B
Authority
CN
China
Prior art keywords
gene
virus
sgrna
fhv
feline
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202210630680.XA
Other languages
English (en)
Other versions
CN114958783A (zh
Inventor
彭贵青
杨梦芳
沈洲
焦宇洲
李梦霞
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Wuhan Keqian Biological Co ltd
Huazhong Agricultural University
Original Assignee
Wuhan Keqian Biological Co ltd
Huazhong Agricultural University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Wuhan Keqian Biological Co ltd, Huazhong Agricultural University filed Critical Wuhan Keqian Biological Co ltd
Priority to CN202210630680.XA priority Critical patent/CN114958783B/zh
Publication of CN114958783A publication Critical patent/CN114958783A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN114958783B publication Critical patent/CN114958783B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A61P31/22—Antivirals for DNA viruses for herpes viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
    • A61K2039/552—Veterinary vaccine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/16011—Herpesviridae
    • C12N2710/16021—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/16011—Herpesviridae
    • C12N2710/16022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/16011—Herpesviridae
    • C12N2710/16034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/16011—Herpesviridae
    • C12N2710/16051—Methods of production or purification of viral material
    • C12N2710/16052—Methods of production or purification of viral material relating to complementing cells and packaging systems for producing virus or viral particles
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/106—Plasmid DNA for vertebrates
    • C12N2800/107—Plasmid DNA for vertebrates for mammalian
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Abstract

本发明公开了一种三基因缺失的猫疱疹病毒I型重组病毒、猫传染性鼻气管炎活疫苗以及制备方法，属于动物生物制品和病毒学技术领域。该三基因缺失的猫疱疹病毒I型重组病毒是由猫疱疹病毒I型病毒同时缺失TK、gE和gI基因得到；具体为，采用CRISPRCas9基因编辑和同源重组方法对猫疱疹病毒I型FHV‑1毒株中的TK、gE和gI基因进行敲除，得到所述的三基因缺失的猫疱疹病毒I型重组病毒。本发明所构建的重组病毒对猫无致病性，其免疫原性被有效保留，使用该猫疱疹病毒I型重组病毒制备的疫苗免疫猫后可以为猫提供抵抗猫疱疹病毒I型的免疫力，为猫鼻支的防治奠定基础。

Description

一种三基因缺失的猫疱疹病毒I型重组病毒、猫传染性鼻气管 炎活疫苗以及制备方法
技术领域
本发明涉及动物生物制品和病毒学技术领域，特别是涉及一种三基因缺失的猫疱疹病毒I型重组病毒、猫传染性鼻气管炎活疫苗以及制备方法。
背景技术
猫传染性鼻气管炎又称为猫鼻支，是一种以急性上呼吸道症状为特征的高度接触性传染病，具体症状包括：角膜结膜炎、上呼吸道感染和流产，但以打喷嚏、过度流涎、眼鼻分泌物增多等上呼吸道症状为主。本病临床常见于猫，猫的发病率高达100％，病死率在不同年龄段的猫中差异很大，成年猫一般不引起死亡，但幼仔猫的死亡率可达50％。患病动物可终生带毒排毒，且在一定条件刺激下反复感染。
目前，国内尚无自主研发的猫疱疹病毒I型(FHV-1)疫苗，主要依靠接种进口灭活疫苗防治猫鼻支。有研究表明，临床宠物猫免疫FHV-1疫苗后需要较长时间刺激免疫系统，且中和抗体合格率只有60％，抗体滴度达不到抵抗病毒感染的效价，表明进口商品化疫苗可以在一定程度上减轻猫在感染FHV-1后所导致的临床症状，但其免疫效果不佳，不能有效控制当前我国FHV-1的流行。因此，基于现有技术中存在的问题，亟需一种具有良好安全性和免疫原性的疫苗出现以用于有效防治国内猫鼻支的流行。
随着分子生物学的发展，对FHV-1基因组研究的不断深入，更进一步了解基因组结构对病毒生物学性质和免疫原性的影响，第二代弱毒活疫苗——基因缺失疫苗应运而生。猫疱疹病毒I型基因缺失疫苗其优势主要表现在：基因缺失疫苗稳定，不易发生毒力返祖增强；FHV-1基因缺失株毒力低，免疫原性强，保护时间长；可用于疫苗免疫动物与自然感染动物的鉴别诊断。但是，至今没有FHV-1基因缺失疫苗的相关报道。鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的是提供一种三基因缺失的猫疱疹病毒I型重组病毒、猫传染性鼻气管炎活疫苗以及制备方法，以解决上述现有技术存在的问题，该重组病毒缺失了猫疱疹病毒I型的主要毒力基因TK、gI、gE基因，对猫无致病性，其免疫原性被有效保留，使用该猫疱疹病毒I型重组病毒制备的疫苗免疫猫后可以为猫提供抵抗猫疱疹病毒I型的免疫力，为猫鼻支的防治奠定基础。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种三基因缺失的猫疱疹病毒I型重组病毒，其由猫疱疹病毒I型病毒同时缺失TK、gE和gI基因得到。
本发明还提供一种上述的三基因缺失的猫疱疹病毒I型重组病毒的构建方法，采用CRISPR Cas9基因编辑和同源重组方法对猫疱疹病毒I型FHV-1毒株中的TK、gE和gI基因进行敲除，得到所述的三基因缺失的猫疱疹病毒I型重组病毒。
进一步地，包括以下步骤：
(1)构建FHV-1病毒目的基因的外源筛选基因同源重组片段：体外分别扩增FHV-1TK基因的左右侧同源臂TKhm1、TKhm2，gI、gE同源臂gIhm1、gEhm2；PCR扩增获得含有外源筛选基因的线性化片段；再将扩增片段进行融合PCR扩增，分别得到所述FHV-1病毒目的基因的外源筛选基因同源重组片段和FHV-1病毒目的基因同源重组片段；
(2)构建目的基因sgRNA表达载体：根据FHV-1病毒目的基因序列设计用于特异性靶向目的基因的sgRNA，再在目的基因的sgRNA的基础上设计sgRNA引物，通过所述sgRNA引物，将所述sgRNA与线性化载体连接，转化提取得到目的基因sgRNA表达载体；
(3)构建重组病毒：将所述FHV-1病毒目的基因的外源筛选基因同源重组片段与所述目的基因sgRNA表达载体混合转染，得到转染细胞，将转染细胞感染FHV-1病毒野毒株，得到FHV-1多基因缺失病毒；再将所述FHV-1病毒目的基因同源重组片段与所述目的基因sgRNA表达载体混合转染，得到转染细胞，将转染细胞感染所述FHV-1多基因缺失病毒，得到所述三基因缺失的猫疱疹病毒I型重组病毒。
进一步地，步骤(2)所述sgRNA在目的基因上的靶序列符合5’-GN(20)GG或5’-N(21)GG的序列位点。
进一步地，所述sgRNA引物包括目的基因TK、gE和gI的sgRNA引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1-6所示。
本发明还提供一种上述的三基因缺失的猫疱疹病毒I型重组病毒在制备猫传染性鼻气管炎疫苗中的应用。
本发明还提供一种猫传染性鼻气管炎疫苗，包括上述的三基因缺失的猫疱疹病毒I型重组病毒。
进一步地，所述猫传染性鼻气管炎疫苗还包括保护剂。
本发明还提供一种上述的猫传染性鼻气管炎疫苗的制备方法，先将上述三基因缺失的猫疱疹病毒I型重组病毒接种细胞，收获病毒液；之后将所述病毒液与保护剂混合，再进行真空冷冻干燥，即得所述的猫传染性鼻气管炎疫苗。
进一步地，所述细胞包括CRFK细胞、F81细胞或fcwf-4细胞。
本发明公开了以下技术效果：
本发明提供一种猫疱疹病毒I型重组病毒，该重组病毒是经人工改造后得到的，通过CRISPR Cas9基因编辑和同源重组技术缺失了猫疱疹病毒I型的主要毒力基因TK、gI、gE基因。所构建的重组病毒对猫无致病性，其免疫原性被有效保留，使用该猫疱疹病毒I型重组病毒制备的疫苗免疫猫后可以为猫提供抵抗猫疱疹病毒I型的免疫力，为猫鼻支的防治奠定基础。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为三基因缺失毒株rWH/2020-ΔTK/gI/gE构建示意图；
图2为表达EGFP、mCherry绿色、红色荧光的重组病毒rWH/2020-ΔTK/gI/gE-EGFP+-mCherry+感染CRFK细胞后细胞病变图；图A、B、C分别是绿色荧光、红色荧光、明场视野下重组病毒rWH/2020-ΔTK/gI/gE-EGFP+-mCherry+感染CRFK细胞后细胞病变结果；
图3为重组病毒rWH/2020-ΔTK/gI/gE感染CRFK细胞后细胞病变图；图A、B、C分别是绿色荧光、红色荧光、明场视野下重组病毒rWH/2020-ΔTK/gI/gE感染CRFK细胞后细胞病变结果；
图4为重组病毒rWH/2020-ΔTK/gI/gE的PCR鉴定结果；图A是对TK基因进行扩增，M：DL2000 DNA Marker，泳道1是重组病毒rWH/2020-ΔTK/gI/gE扩增条带，泳道2是亲本毒株WH/2020扩增条带，泳道3是阴性对照；图B是对gI/gE基因进行扩增，M：DL5000 DNAMarker，泳道1是重组病毒rWH/2020-ΔTK/gI/gE扩增条带，泳道2是亲本毒株WH/2020扩增条带，泳道3是阴性对照；图C是对gD基因进行扩增，M：DL2000 DNA Marker，泳道1是重组病毒rWH/2020-ΔTK/gI/gE扩增条带，泳道2是亲本毒株WH/2020扩增条带，泳道3是阴性对照；
图5为重组病毒rWH/2020-ΔTK/gI/gE遗传稳定鉴定图，图A、B和C分别是使用FHV-1特异性引物TK-F/R、gI/gE-F/R、gD-F/R扩增条带结果；图A中M：DL2000 DNA Marker，泳道1-10分别是1-10代rWH/2020-ΔTK/gI/gE经引物TK-F/R扩增条带，泳道11是亲本毒株WH/2020扩增条带，泳道12是阴性对照；图B中M：DL5000 DNA Marker，泳道1-10分别是1-10代rWH/2020-ΔTK/gI/gE经引物gI/gE-F/R扩增条带，泳道11是亲本毒株WH/2020扩增条带，泳道12是阴性对照；图C中M：DL2000 DNA Marker，泳道1-10分别是1-10代rWH/2020-ΔTK/gI/gE经引物gD-F/R扩增条带，泳道11是亲本毒株WH/2020扩增条带，泳道12是阴性对照；
图6是二次免疫后21日中和抗体检测结果；
图7为攻毒保护试验体温曲线图。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
实施例1人工改造猫疱疹病毒I型
1、毒株
FHV-1/WH/2020株(以下简称WH/2020株)，为发明人前期申请专利(CN113308441A)公开的猫疱疹病毒I型FHV-1/WH/2020，其保藏编号为：CCTCC NO:V202026；发病猫主要表现为体温升高，食欲不佳，打喷嚏、眼鼻分泌物增多等临床症状。WH/2020株以108.0TCID50/只的剂量感染3月龄幼猫，无神经症状，攻毒后7天死亡30％。
CRFK细胞与293T细胞，以含10％胎牛血清的DMEM培养液培养(gbico公司)。
2、重组载体构建
以载体pBAC为模板扩增CMV enhancer+CMV promoter+EGFP，引物为CMV+EGFP-F(CATGCCTGCAGGTCGACGATCGTTACATAACTTACGGT)、CMV+EGFP-R(GCGGCCGCCACTGTGCTGTTACTTGTACAGCTCGTCCATG)，扩增体系为：2×phanta MIX25μL，上游引物2μL，下游引物2μL，模板2μL，ddH2O 19μL。将上述试剂充分混匀，按下列条件进行扩增：95℃变性5min后进入循环，循环参数：95℃15s，55℃15s，72℃40s，35个循环后72℃延伸5min，16℃2min；以载体pcDNA3.1为模板扩增bGH poly(A)signal，引物为polyA-F1(GACGAGCTGTACAAGTAACAGCACAGTGGCGG)、polyA-R1(CCCGGGGATCCTCTAGAGATCCATAGAGCCCACCGC)，扩增体系同上。将上述试剂充分混匀，按下列条件进行扩增：95℃变性5min后进入循环，循环参数：95℃15s，55℃15s，72℃10s，35个循环后72℃延伸5min，16℃2min；各扩增产物序列如下：
CMV enhancer+CMVpromoter+EGFP：
CATGCCTGCAGGTCGACGATCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTGGTTTAGTGAACCGTCAGATCCGCTAGCGCTACCGGTCGCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAACAGCACAGTGGCGGCCGC。
bGH poly(A)signal
GACGAGCTGTACAAGTAACAGCACAGTGGCGGCCGCTCGAGTCTAGAGGGCCCGTTTAAACCCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGATCTCTAGAGGATCCCCGGG。
使用同源重组分别将扩增得到的CMV enhancer+CMV promoter+EGFP和bGH poly(A)signal片段分别克隆到pMD18T载体上，命名为重组质粒pMD18T-EGFP，重组体系为2×Uniclone Seamless Cloning Mix 5μL，线性化载体0.03pmol，插入片段0.02pmol，ddH2Oup to10μL。
以载体pBAC为模板扩增CMV enhancer+CMV promoter，引物为CMV-F(CATGCCTGCAGGTCGACGATCGTTACATAACTTACGGT)、CMV-R(ctcgcccttgctcaccatGGTGGCGACCGGTA)，扩增体系同上。将上述试剂充分混匀，按下列条件进行扩增：95℃变性5min后进入循环，循环参数：95℃15s，55℃15s，72℃15s，35个循环后72℃延伸5min，16℃2min；以载体pLVX-T2A-mCherry-Puro为模板，扩增mCherry，引物为mCherry-744-F(GCGCTACCGGTCGCCACCatggtgagcaagggc)、mCherry-744-R(GCCGCCACTGTGCTGTTActtgtacagctcgtccatg)，扩增体系同上。将上述试剂充分混匀，按下列条件进行扩增：95℃变性5min后进入循环，循环参数：95℃15s，55℃15s，72℃30s，35个循环后72℃延伸5min，16℃2min；各扩增产物序列如下：
CMV enhancer+CMVpromoter：
CATGCCTGCAGGTCGACGATCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTGGTTTAGTGAACCGTCAG。
mCherry：
GCGCTACCGGTCGCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGGATAACATGGCCATCATCAAGGAGTTCATGCGCTTCAAGGTGCACATGGAGGGCTCCGTGAACGGCCACGAGTTCGAGATCGAGGGCGAGGGCGAGGGCCGCCCCTACGAGGGCACCCAGACCGCCAAGCTGAAGGTGACCAAGGGTGGCCCCCTGCCCTTCGCCTGGGACATCCTGTCCCCTCAGTTCATGTACGGCTCCAAGGCCTACGTGAAGCACCCCGCCGACATCCCCGACTACTTGAAGCTGTCCTTCCCCGAGGGCTTCAAGTGGGAGCGCGTGATGAACTTCGAGGACGGCGGCGTGGTGACCGTGACCCAGGACTCCTCCCTGCAGGACGGCGAGTTCATCTACAAGGTGAAGCTGCGCGGCACCAACTTCCCCTCCGACGGCCCCGTAATGCAGAAGAAGACCATGGGCTGGGAGGCCTCCTCCGAGCGGATGTACCCCGAGGACGGCGCCCTGAAGGGCGAGATCAAGCAGAGGCTGAAGCTGAAGGACGGCGGCCACTACGACGCTGAGGTCAAGACCACCTACAAGGCCAAGAAGCCCGTGCAGCTGCCCGGCGCCTACAACGTCAACATCAAGTTGGACATCACCTCCCACAACGAGGACTACACCATCGTGGAACAGTACGAACGCGCCGAGGGCCGCCACTCCACCGGCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAACAGCACAGTGGCGGCCGC。
使用同源重组分别将扩增得到的CMV enhancer+CMVpromoter、mCherry和bGHpoly(A)signal片段分别克隆到pMD18T载体上，命名为重组质粒pMD18T-mCherry，重组体系为2×Uniclone Seamless Cloning Mix 5μL，线性化载体0.03pmol，插入片段0.02pmol，ddH2O up to 10μL。
以WH/2020株为模板PCR扩增TK左右侧同源臂TKhm1、TKhm2；gI、gE同源臂gIhm1、gEhm2；以质粒pMD18T-EGFP、pMD18T-mCherry为模板扩增CMV+EGFP+polyA、CMV+mCherry+polyA；引物分别为TKhm1-F(CATGCCTGCAGGTCGACGATggctcacgccaataatcc)、TKhm1-R(ACCGTAAGTTATGTAACGcgtctgatctgtgtatgatg)；TKhm2-F(ATGCGGTGGGCTCTATGGacattagtggtgttccct)、TKhm2-R(CGGGGATCCTCTAGAGATccgtccatgtcttgtgg)；gIhm1-F(CATGCCTGCAGGTCGACGATggatccgaagataacagctg)、gIhm1-R(ACCGTAAGTTATGTAACGctgttccaatcgccatca)；gEhm2-F(ATGCGGTGGGCTCTATGGcagatgaggaggagccat)、gEhm2-R(CCCGGGGATCCTCTAGAGATcatccgcaattgaattgtcatc)；EGFP-F(tcatacacagatcagacgCGTTACATAACTTACGGT)、EGFP-R(agggaacaccactaatgtCCATAGAGCCCACCGC)；mCherry-F(tgatggcgattggaacagCGTTACATAACTTACGGT)、mCherry-R(atggctcctcctcatctgCCATAGAGCCCACCGC)。扩增体系为：2×phanta MIX 25μL，上游引物2μL，下游引物2μL，模板2μL，ddH2O 19μL。将上述试剂充分混匀，按下列条件进行扩增：95℃变性5min后进入循环，循环参数：95℃15s，55℃15s，72℃45s，35个循环后72℃延伸5min，16℃2min。各扩增产物序列如下：
TKhm1：
GGCTCACGCCAATAATCCACTGGAAATGTGGGAGTAATAAAATTTCTAGTGTCCGATAAAATCAGATCATCCCCGATGTTAGTTATTCGCATCGAGTCGAATACGTATTCGACTCGTCCAGTCATGATGACCCGTCTTCGACAACTTCTCCTCTCCAACAAATGATACCAGTGATTAATCTCTTTGATCCTAAATAAGGTTTTGATATATGATCTATATAGACTCATTACCCATCACATATAGGGCATATTAATACTCACGTGGTTGCGTAGCGGAGTGATCGGGAAAGAGAGATGCTACCCATTTTAAAGGGTTACTTTCGCCGCTTCCTATTGGAGTTAAAGTGTTTTTTTTATCCTTCACAGATACACACGATGACATCGGTACGTGGTTCGTATGTTTATAGACCCCAGACCCAGACCTTGGGTATTTTGATTTTTTCTTGGAGCGGATTACACCACCACTCTCGATTGGATTGTATTCGGCGAGCTTGGTAATATTAGCAGCCAGAACAGAAATGTTACTCGTAAGCATCTGCGGGGGTAAACTAGTAACTCCCAAAATTCTCAGACCGCGCTGCGCGATAAATGCCAATATGGGTATTAGAGTGAGCTTCTCCCCCCCTGGTGGTAGAATCTTGGTTATTAAACCCACAGAATCTGTTAATTGTTTCAAACCCTCACGACGTTGAATGTCTTTACTAGTTGTATCCATATTTTTTGAAAAACGACACGTTTTCAGCTCAATTAGAAAACATATACCACCCCCTTCTCCCTCAAATTGTATAGTACATACACAATCAGGTCGGCGACGACCCAAGTTAACCTCACATGCTAGGTACACGCCCTTAGCCTTTTTAAGAGACTCTGCGGATACAGAGCCGCCCAATAAACACTCGAGTCGGTCGGTATATACTCCACTCGCAGAGGTCGAGGATATATCGCGCTTGAGGACAGCATAAAAGCGATTGTGGCATCGAATTCCAGCCCGGAGCCTCAATCCGACACTGCGTCGTTGTTCACGTTTCATCATACACAGATCAGACG
CMV+EGFP+polyA：
CGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTGGTTTAGTGAACCGTCAGATCCGCTAGCGCTACCGGTCGCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAACAGCACAGTGGCGGCCGCTCGAGTCTAGAGGGCCCGTTTAAACCCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGG
TKhm2：
ACATTAGTGGTGTTCCCTATTACCCCCCTGTGGTGAATGTGTGGAGGTCAGGGGATAATTGTATAATGACCATCGTTTCATGAATAAAATAACCGTGTGTGATGTGGATGTATTCATTAATTGAATTTCTCTTCCGGTTTTAGATCTTTATAAGCGTAAAACTGGTGTTTTAAATCCAAGAGCCGGGTTCTTTGGAGGTTGGTCACATCATCGCCACAGCCCGTGGATTCAAGCAATCTATGATGTGTTTGATAATATACCTATCGATATTCCTGATCATTGTATCGAGGATGTTGACTGGTTTACCGATGATGGATAGACCTGATGAAGGTGGGCTGGCTCGACGAACAGTTGGTGAAGTAGAAGGGGAGTTTTCTTATAGGGACGATGTTGATGTAGCAGACGTGAGAAACTTATTTATCATGTTACCAAAAAATGGGAGCGATATATTTCTATTCATATTCGATAGACGCAGTCAACGTCAACGCGGTACTATGTTTTTATTCCCCAAGGCTGGGTTTGTACAACCAACACCCGCGAAGGTTCGCGATGAAGCGGCGGCCGCCCCATTTGGGTTTATATCCCCTGTATATCCACTATCGAGTCTTTTATTTAATCCATACAATGGGAGATATCTGACGACACGCCATCTGATTGCCTTTGAGGTAACCCCGGAATCCTCTCTTCATGATTGGTATTTTGCACGATCACCAACAACTGCTACTCAGACACAGCCATTAGGACATATAACTAACCCCCCCCGACGATCGCCAAAAGACAAACCGACCACCTCCGGCCATACAGATTTAATTATACGCTATTGCGCATTGGAGTTGGATTTTTTCCAGGACACAAGACGACAGCGTGATGGAATATATTTACCTAATTACGAGGCCGTATGGCCATTGGCAATGAATTTTTTGGAGGGGATGTGGATATGGAGTAATCGTACTTTAGTCAATGTAACGATCGGTGTTGGCTTTATGGGGTTTTCTTTAACCTCCATCTCTTATCCACCCTTGGAGATTATCGTCACACCTCACTACACCAATGCAAGAATGATAACACGATTTAAATCTAGTCTAGTATTAGATCCACCGGGACCTTCGGAAGGCCCATTGTATAAAGTATATGTTTTAGGCTATGGTAACAATAGGATCAATGGGAGCTTTTATAAGACCATGCGTACGATAGCATCATACCCAGAACAAAGCCTAGATTATCGTTACCACCTTTCCATGGCACATATGGAAACGGCCTTATTTTTATCACACGCTACACCACAAGACATGGACGG
gIhm1：
GGATCCGAAGATAACAGCTGAAGTACGTTATGTAACATCAATGGATTCATGTGGGATGGTGGCATTGATATCAGAGCCGGATATAGACGCTACTATTCGAACCATACAACTATCTCAAAAAAAAACATATAACGCGACTATAAGTTGGTTTAAGGTAACCCAGGGTTGTGAATACCCTATGTTTCTTATGGATATGAGACTTTGTGATCCTAAACGGGAATTTGGAATATGTGCTTTACGGTCGCCTTCATATTGGTTGGAACCTTTAACAAAGTATATGTTCCTAACAGACGATGAACTGGGTTTGATTATGATGGCCCCGGCCCAATTTAATCAAGGACAATATCGAAGAGTTATAACCATCGATGGTTCCATGTTTTATACAGATTTTATGGTACAACTATCTCCAACGCCATGTTGGTTCGCAAAACCCGATAGATACGAAGAGATTCTACATGAATGGTGTCGAAATGTTAAAACTATTGGCCTTGATGGAGCTCGTGATTACCACTATTATTGGGTACCCTATAACCCACAACCTCACCATAAAGCCGTACTCTTATATTGGTATCGGACTCATGGCCGAGAACCCCCAGTAAGATTCCAAGAGGCCATTCGATATGATCGTCCCGCCATACCGTCTGGGAGTGAGGATTCGAAACGGTCCAACGACTCTAGAGGAGAATCGAGTGGACCCAATTGGATAGACATTGAAAATTACACTCCTAAAAATAATGTGCCTATTATAATATCTGACGATGACGTTCCTACAGCCCCTCCCAAGGGCATGAATAATCAGTCAGTAGTGATACCCGCAATCGTACTAAGTTGTCTTATAATAGCACTGATTCTAGGAGTGATATATTATATTTTGAGGGTAAAGAGGTCTCGATCAACTGCATATCAACAACTTCCTATAATACATACAACTCACCATCCTTAAGTCCACATTCCAATCGAGTTGGTAGGGAAGATATGAAGTGGGCGGTACCAACCATCATAAAATAGGTTGGAGTCTGGACCAACGTTCACTCTTTTGAGTGTAAAGGACCACAGCATAATACTTAATATGTCGTCGATAGCCTTCATCTATATATTGATGGCGATTGGAACAG
CMV+mCherry+polyA：
CGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTGGTTTAGTGAACCGTCAGATCCGCTAGCGCTACCGGTCGCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGGATAACATGGCCATCATCAAGGAGTTCATGCGCTTCAAGGTGCACATGGAGGGCTCCGTGAACGGCCACGAGTTCGAGATCGAGGGCGAGGGCGAGGGCCGCCCCTACGAGGGCACCCAGACCGCCAAGCTGAAGGTGACCAAGGGTGGCCCCCTGCCCTTCGCCTGGGACATCCTGTCCCCTCAGTTCATGTACGGCTCCAAGGCCTACGTGAAGCACCCCGCCGACATCCCCGACTACTTGAAGCTGTCCTTCCCCGAGGGCTTCAAGTGGGAGCGCGTGATGAACTTCGAGGACGGCGGCGTGGTGACCGTGACCCAGGACTCCTCCCTGCAGGACGGCGAGTTCATCTACAAGGTGAAGCTGCGCGGCACCAACTTCCCCTCCGACGGCCCCGTAATGCAGAAGAAGACCATGGGCTGGGAGGCCTCCTCCGAGCGGATGTACCCCGAGGACGGCGCCCTGAAGGGCGAGATCAAGCAGAGGCTGAAGCTGAAGGACGGCGGCCACTACGACGCTGAGGTCAAGACCACCTACAAGGCCAAGAAGCCCGTGCAGCTGCCCGGCGCCTACAACGTCAACATCAAGTTGGACATCACCTCCCACAACGAGGACTACACCATCGTGGAACAGTACGAACGCGCCGAGGGCCGCCACTCCACCGGCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAACAGCACAGTGGCGGCCGCTCGAGTCTAGAGGGCCCGTTTAAACCCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGG。
gEhm2：
CAGATGAGGAGGAGCCATTGAATAATCATCATATTTCAACAACCCAACATACTGATATTAATCCAGAAAAATCCGGATCTGGGTACAGTGTATGGTTTCGTGATACAGAAGATACATCACCTCAGCCCCTACACGCTCCTCCAGATTACAGTCGCGTAGTTAAAAGATTAAAGTCTATTTTAAAATGACCCGTCGACGAGTTCTAGCACCACGGGAATTGGAAGCTGCTCGTAAACTCCGTGAGATTTTCAACGCAGAGTACGTCGCACCTACGTTCACACTAGTCGATCCGGGGGATACGTCAAACGCGTATATTGTATGTAGGACCCCGGTGACCGAAGTAGTCTCTTCCATATCAAGAGGTATCGACAATAGAAAATCGGTAGATTCTTCATTTATTCGAATCGTCAGTAAATTAATCATTAGGAATGCTATTCACATGGGACTATCCGTCCTATGTGCATTTATATCCTATAATAAACCATGATAAATTTTATGTGGATATTTTATTAATCCTCCAAACCGTATGGGGGAGCACTTTTATAGAAATCTACCATAAAGAGTATATCCGTTAAATACCCGGGTTTGATTATATGTTTGTCAGTTGGTAGTTGAACTTCCATCGCCATCTAAGATGGACCATCAAACATCACTTATTAATGCCACAGATGATAATTGCTTAGACACGGATTCTAGTATAAACTTGCCAAGCATAGATAAATGCGAAATTGATGACAATTCAATTGCGGATG。
使用同源重组分别将扩增得到TKhm1、CMV+EGFP+polyA、TKhm2；gIhm1、CMV+mCherry+polyA、gEhm2；TKhm1、TKhm2；gIhm1、gEhm2片段分别克隆到pMD18T载体上，分别命名为重组质粒pMD18T-TK-EGFP、pMD18T-gI/gE-mCherry、pMD18T-TK、pMD18T-gI/gE，重组体系为2×Uniclone Seamless Cloning Mix 5μL，线性化载体0.03pmol，插入片段0.02pmol，ddH2O up to 10μL。以上述四个重组质粒为模板，分别扩增TKhm1+CMV+EGFP+polyA+TKhm2、gIhm1+CMV+mCherry+polyA+gEhm2、TKhm1+TKhm2、gIhm1+gEhm2片段用于同源重组，引物分别为TK-F1(ggctcacgccaataatcc)、TK-R1(ggctcacgccaataatcc)；gI-F1(ggatccgaagataacagctg)、gE-R1(catccgcaattgaattgtcatc)；TK-F1(ggctcacgccaataatcc)、TK-R1(ggctcacgccaataatcc)；gI-F1(ggatccgaagataacagctg)、gE-R1(catccgcaattgaattgtcatc)；扩增体系为：2×phanta MIX 25μL，上游引物2μL，下游引物2μL，模板2μL，ddH2O 19μL。将上述试剂充分混匀，按下列条件进行扩增：95℃变性5min后进入循环，循环参数：95℃15s，55℃15s，72℃1min45s，35个循环后72℃延伸5min，16℃2min。各扩增产物序列如下：
TKhm1+CMV+EGFP+polyA+TKhm2：
GGCTCACGCCAATAATCCACTGGAAATGTGGGAGTAATAAAATTTCTAGTGTCCGATAAAATCAGATCATCCCCGATGTTAGTTATTCGCATCGAGTCGAATACGTATTCGACTCGTCCAGTCATGATGACCCGTCTTCGACAACTTCTCCTCTCCAACAAATGATACCAGTGATTAATCTCTTTGATCCTAAATAAGGTTTTGATATATGATCTATATAGACTCATTACCCATCACATATAGGGCATATTAATACTCACGTGGTTGCGTAGCGGAGTGATCGGGAAAGAGAGATGCTACCCATTTTAAAGGGTTACTTTCGCCGCTTCCTATTGGAGTTAAAGTGTTTTTTTTATCCTTCACAGATACACACGATGACATCGGTACGTGGTTCGTATGTTTATAGACCCCAGACCCAGACCTTGGGTATTTTGATTTTTTCTTGGAGCGGATTACACCACCACTCTCGATTGGATTGTATTCGGCGAGCTTGGTAATATTAGCAGCCAGAACAGAAATGTTACTCGTAAGCATCTGCGGGGGTAAACTAGTAACTCCCAAAATTCTCAGACCGCGCTGCGCGATAAATGCCAATATGGGTATTAGAGTGAGCTTCTCCCCCCCTGGTGGTAGAATCTTGGTTATTAAACCCACAGAATCTGTTAATTGTTTCAAACCCTCACGACGTTGAATGTCTTTACTAGTTGTATCCATATTTTTTGAAAAACGACACGTTTTCAGCTCAATTAGAAAACATATACCACCCCCTTCTCCCTCAAATTGTATAGTACATACACAATCAGGTCGGCGACGACCCAAGTTAACCTCACATGCTAGGTACACGCCCTTAGCCTTTTTAAGAGACTCTGCGGATACAGAGCCGCCCAATAAACACTCGAGTCGGTCGGTATATACTCCACTCGCAGAGGTCGAGGATATATCGCGCTTGAGGACAGCATAAAAGCGATTGTGGCATCGAATTCCAGCCCGGAGCCTCAATCCGACACTGCGTCGTTGTTCACGTTTCATCATACACAGATCAGACGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTGGTTTAGTGAACCGTCAGATCCGCTAGCGCTACCGGTCGCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAACAGCACAGTGGCGGCCGCTCGAGTCTAGAGGGCCCGTTTAAACCCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGACATTAGTGGTGTTCCCTATTACCCCCCTGTGGTGAATGTGTGGAGGTCAGGGGATAATTGTATAATGACCATCGTTTCATGAATAAAATAACCGTGTGTGATGTGGATGTATTCATTAATTGAATTTCTCTTCCGGTTTTAGATCTTTATAAGCGTAAAACTGGTGTTTTAAATCCAAGAGCCGGGTTCTTTGGAGGTTGGTCACATCATCGCCACAGCCCGTGGATTCAAGCAATCTATGATGTGTTTGATAATATACCTATCGATATTCCTGATCATTGTATCGAGGATGTTGACTGGTTTACCGATGATGGATAGACCTGATGAAGGTGGGCTGGCTCGACGAACAGTTGGTGAAGTAGAAGGGGAGTTTTCTTATAGGGACGATGTTGATGTAGCAGACGTGAGAAACTTATTTATCATGTTACCAAAAAATGGGAGCGATATATTTCTATTCATATTCGATAGACGCAGTCAACGTCAACGCGGTACTATGTTTTTATTCCCCAAGGCTGGGTTTGTACAACCAACACCCGCGAAGGTTCGCGATGAAGCGGCGGCCGCCCCATTTGGGTTTATATCCCCTGTATATCCACTATCGAGTCTTTTATTTAATCCATACAATGGGAGATATCTGACGACACGCCATCTGATTGCCTTTGAGGTAACCCCGGAATCCTCTCTTCATGATTGGTATTTTGCACGATCACCAACAACTGCTACTCAGACACAGCCATTAGGACATATAACTAACCCCCCCCGACGATCGCCAAAAGACAAACCGACCACCTCCGGCCATACAGATTTAATTATACGCTATTGCGCATTGGAGTTGGATTTTTTCCAGGACACAAGACGACAGCGTGATGGAATATATTTACCTAATTACGAGGCCGTATGGCCATTGGCAATGAATTTTTTGGAGGGGATGTGGATATGGAGTAATCGTACTTTAGTCAATGTAACGATCGGTGTTGGCTTTATGGGGTTTTCTTTAACCTCCATCTCTTATCCACCCTTGGAGATTATCGTCACACCTCACTACACCAATGCAAGAATGATAACACGATTTAAATCTAGTCTAGTATTAGATCCACCGGGACCTTCGGAAGGCCCATTGTATAAAGTATATGTTTTAGGCTATGGTAACAATAGGATCAATGGGAGCTTTTATAAGACCATGCGTACGATAGCATCATACCCAGAACAAAGCCTAGATTATCGTTACCACCTTTCCATGGCACATATGGAAACGGCCTTATTTTTATCACACGCTACACCACAAGACATGGACGG。
gIhm1+CMV+mCherry+polyA+gEhm2：
GGATCCGAAGATAACAGCTGAAGTACGTTATGTAACATCAATGGATTCATGTGGGATGGTGGCATTGATATCAGAGCCGGATATAGACGCTACTATTCGAACCATACAACTATCTCAAAAAAAAACATATAACGCGACTATAAGTTGGTTTAAGGTAACCCAGGGTTGTGAATACCCTATGTTTCTTATGGATATGAGACTTTGTGATCCTAAACGGGAATTTGGAATATGTGCTTTACGGTCGCCTTCATATTGGTTGGAACCTTTAACAAAGTATATGTTCCTAACAGACGATGAACTGGGTTTGATTATGATGGCCCCGGCCCAATTTAATCAAGGACAATATCGAAGAGTTATAACCATCGATGGTTCCATGTTTTATACAGATTTTATGGTACAACTATCTCCAACGCCATGTTGGTTCGCAAAACCCGATAGATACGAAGAGATTCTACATGAATGGTGTCGAAATGTTAAAACTATTGGCCTTGATGGAGCTCGTGATTACCACTATTATTGGGTACCCTATAACCCACAACCTCACCATAAAGCCGTACTCTTATATTGGTATCGGACTCATGGCCGAGAACCCCCAGTAAGATTCCAAGAGGCCATTCGATATGATCGTCCCGCCATACCGTCTGGGAGTGAGGATTCGAAACGGTCCAACGACTCTAGAGGAGAATCGAGTGGACCCAATTGGATAGACATTGAAAATTACACTCCTAAAAATAATGTGCCTATTATAATATCTGACGATGACGTTCCTACAGCCCCTCCCAAGGGCATGAATAATCAGTCAGTAGTGATACCCGCAATCGTACTAAGTTGTCTTATAATAGCACTGATTCTAGGAGTGATATATTATATTTTGAGGGTAAAGAGGTCTCGATCAACTGCATATCAACAACTTCCTATAATACATACAACTCACCATCCTTAAGTCCACATTCCAATCGAGTTGGTAGGGAAGATATGAAGTGGGCGGTACCAACCATCATAAAATAGGTTGGAGTCTGGACCAACGTTCACTCTTTTGAGTGTAAAGGACCACAGCATAATACTTAATATGTCGTCGATAGCCTTCATCTATATATTGATGGCGATTGGAACAGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTGGTTTAGTGAACCGTCAGATCCGCTAGCGCTACCGGTCGCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGGATAACATGGCCATCATCAAGGAGTTCATGCGCTTCAAGGTGCACATGGAGGGCTCCGTGAACGGCCACGAGTTCGAGATCGAGGGCGAGGGCGAGGGCCGCCCCTACGAGGGCACCCAGACCGCCAAGCTGAAGGTGACCAAGGGTGGCCCCCTGCCCTTCGCCTGGGACATCCTGTCCCCTCAGTTCATGTACGGCTCCAAGGCCTACGTGAAGCACCCCGCCGACATCCCCGACTACTTGAAGCTGTCCTTCCCCGAGGGCTTCAAGTGGGAGCGCGTGATGAACTTCGAGGACGGCGGCGTGGTGACCGTGACCCAGGACTCCTCCCTGCAGGACGGCGAGTTCATCTACAAGGTGAAGCTGCGCGGCACCAACTTCCCCTCCGACGGCCCCGTAATGCAGAAGAAGACCATGGGCTGGGAGGCCTCCTCCGAGCGGATGTACCCCGAGGACGGCGCCCTGAAGGGCGAGATCAAGCAGAGGCTGAAGCTGAAGGACGGCGGCCACTACGACGCTGAGGTCAAGACCACCTACAAGGCCAAGAAGCCCGTGCAGCTGCCCGGCGCCTACAACGTCAACATCAAGTTGGACATCACCTCCCACAACGAGGACTACACCATCGTGGAACAGTACGAACGCGCCGAGGGCCGCCACTCCACCGGCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAACAGCACAGTGGCGGCCGCTCGAGTCTAGAGGGCCCGTTTAAACCCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGCAGATGAGGAGGAGCCATTGAATAATCATCATATTTCAACAACCCAACATACTGATATTAATCCAGAAAAATCCGGATCTGGGTACAGTGTATGGTTTCGTGATACAGAAGATACATCACCTCAGCCCCTACACGCTCCTCCAGATTACAGTCGCGTAGTTAAAAGATTAAAGTCTATTTTAAAATGACCCGTCGACGAGTTCTAGCACCACGGGAATTGGAAGCTGCTCGTAAACTCCGTGAGATTTTCAACGCAGAGTACGTCGCACCTACGTTCACACTAGTCGATCCGGGGGATACGTCAAACGCGTATATTGTATGTAGGACCCCGGTGACCGAAGTAGTCTCTTCCATATCAAGAGGTATCGACAATAGAAAATCGGTAGATTCTTCATTTATTCGAATCGTCAGTAAATTAATCATTAGGAATGCTATTCACATGGGACTATCCGTCCTATGTGCATTTATATCCTATAATAAACCATGATAAATTTTATGTGGATATTTTATTAATCCTCCAAACCGTATGGGGGAGCACTTTTATAGAAATCTACCATAAAGAGTATATCCGTTAAATACCCGGGTTTGATTATATGTTTGTCAGTTGGTAGTTGAACTTCCATCGCCATCTAAGATGGACCATCAAACATCACTTATTAATGCCACAGATGATAATTGCTTAGACACGGATTCTAGTATAAACTTGCCAAGCATAGATAAATGCGAAATTGATGACAATTCAATTGCGGATG。
TKhm1+TKhm2：
GGCTCACGCCAATAATCCACTGGAAATGTGGGAGTAATAAAATTTCTAGTGTCCGATAAAATCAGATCATCCCCGATGTTAGTTATTCGCATCGAGTCGAATACGTATTCGACTCGTCCAGTCATGATGACCCGTCTTCGACAACTTCTCCTCTCCAACAAATGATACCAGTGATTAATCTCTTTGATCCTAAATAAGGTTTTGATATATGATCTATATAGACTCATTACCCATCACATATAGGGCATATTAATACTCACGTGGTTGCGTAGCGGAGTGATCGGGAAAGAGAGATGCTACCCATTTTAAAGGGTTACTTTCGCCGCTTCCTATTGGAGTTAAAGTGTTTTTTTTATCCTTCACAGATACACACGATGACATCGGTACGTGGTTCGTATGTTTATAGACCCCAGACCCAGACCTTGGGTATTTTGATTTTTTCTTGGAGCGGATTACACCACCACTCTCGATTGGATTGTATTCGGCGAGCTTGGTAATATTAGCAGCCAGAACAGAAATGTTACTCGTAAGCATCTGCGGGGGTAAACTAGTAACTCCCAAAATTCTCAGACCGCGCTGCGCGATAAATGCCAATATGGGTATTAGAGTGAGCTTCTCCCCCCCTGGTGGTAGAATCTTGGTTATTAAACCCACAGAATCTGTTAATTGTTTCAAACCCTCACGACGTTGAATGTCTTTACTAGTTGTATCCATATTTTTTGAAAAACGACACGTTTTCAGCTCAATTAGAAAACATATACCACCCCCTTCTCCCTCAAATTGTATAGTACATACACAATCAGGTCGGCGACGACCCAAGTTAACCTCACATGCTAGGTACACGCCCTTAGCCTTTTTAAGAGACTCTGCGGATACAGAGCCGCCCAATAAACACTCGAGTCGGTCGGTATATACTCCACTCGCAGAGGTCGAGGATATATCGCGCTTGAGGACAGCATAAAAGCGATTGTGGCATCGAATTCCAGCCCGGAGCCTCAATCCGACACTGCGTCGTTGTTCACGTTTCATCATACACAGATCAGACGACATTAGTGGTGTTCCCTATTACCCCCCTGTGGTGAATGTGTGGAGGTCAGGGGATAATTGTATAATGACCATCGTTTCATGAATAAAATAACCGTGTGTGATGTGGATGTATTCATTAATTGAATTTCTCTTCCGGTTTTAGATCTTTATAAGCGTAAAACTGGTGTTTTAAATCCAAGAGCCGGGTTCTTTGGAGGTTGGTCACATCATCGCCACAGCCCGTGGATTCAAGCAATCTATGATGTGTTTGATAATATACCTATCGATATTCCTGATCATTGTATCGAGGATGTTGACTGGTTTACCGATGATGGATAGACCTGATGAAGGTGGGCTGGCTCGACGAACAGTTGGTGAAGTAGAAGGGGAGTTTTCTTATAGGGACGATGTTGATGTAGCAGACGTGAGAAACTTATTTATCATGTTACCAAAAAATGGGAGCGATATATTTCTATTCATATTCGATAGACGCAGTCAACGTCAACGCGGTACTATGTTTTTATTCCCCAAGGCTGGGTTTGTACAACCAACACCCGCGAAGGTTCGCGATGAAGCGGCGGCCGCCCCATTTGGGTTTATATCCCCTGTATATCCACTATCGAGTCTTTTATTTAATCCATACAATGGGAGATATCTGACGACACGCCATCTGATTGCCTTTGAGGTAACCCCGGAATCCTCTCTTCATGATTGGTATTTTGCACGATCACCAACAACTGCTACTCAGACACAGCCATTAGGACATATAACTAACCCCCCCCGACGATCGCCAAAAGACAAACCGACCACCTCCGGCCATACAGATTTAATTATACGCTATTGCGCATTGGAGTTGGATTTTTTCCAGGACACAAGACGACAGCGTGATGGAATATATTTACCTAATTACGAGGCCGTATGGCCATTGGCAATGAATTTTTTGGAGGGGATGTGGATATGGAGTAATCGTACTTTAGTCAATGTAACGATCGGTGTTGGCTTTATGGGGTTTTCTTTAACCTCCATCTCTTATCCACCCTTGGAGATTATCGTCACACCTCACTACACCAATGCAAGAATGATAACACGATTTAAATCTAGTCTAGTATTAGATCCACCGGGACCTTCGGAAGGCCCATTGTATAAAGTATATGTTTTAGGCTATGGTAACAATAGGATCAATGGGAGCTTTTATAAGACCATGCGTACGATAGCATCATACCCAGAACAAAGCCTAGATTATCGTTACCACCTTTCCATGGCACATATGGAAACGGCCTTATTTTTATCACACGCTACACCACAAGACATGGACGG。
gIhm1+gEhm2：
GGATCCGAAGATAACAGCTGAAGTACGTTATGTAACATCAATGGATTCATGTGGGATGGTGGCATTGATATCAGAGCCGGATATAGACGCTACTATTCGAACCATACAACTATCTCAAAAAAAAACATATAACGCGACTATAAGTTGGTTTAAGGTAACCCAGGGTTGTGAATACCCTATGTTTCTTATGGATATGAGACTTTGTGATCCTAAACGGGAATTTGGAATATGTGCTTTACGGTCGCCTTCATATTGGTTGGAACCTTTAACAAAGTATATGTTCCTAACAGACGATGAACTGGGTTTGATTATGATGGCCCCGGCCCAATTTAATCAAGGACAATATCGAAGAGTTATAACCATCGATGGTTCCATGTTTTATACAGATTTTATGGTACAACTATCTCCAACGCCATGTTGGTTCGCAAAACCCGATAGATACGAAGAGATTCTACATGAATGGTGTCGAAATGTTAAAACTATTGGCCTTGATGGAGCTCGTGATTACCACTATTATTGGGTACCCTATAACCCACAACCTCACCATAAAGCCGTACTCTTATATTGGTATCGGACTCATGGCCGAGAACCCCCAGTAAGATTCCAAGAGGCCATTCGATATGATCGTCCCGCCATACCGTCTGGGAGTGAGGATTCGAAACGGTCCAACGACTCTAGAGGAGAATCGAGTGGACCCAATTGGATAGACATTGAAAATTACACTCCTAAAAATAATGTGCCTATTATAATATCTGACGATGACGTTCCTACAGCCCCTCCCAAGGGCATGAATAATCAGTCAGTAGTGATACCCGCAATCGTACTAAGTTGTCTTATAATAGCACTGATTCTAGGAGTGATATATTATATTTTGAGGGTAAAGAGGTCTCGATCAACTGCATATCAACAACTTCCTATAATACATACAACTCACCATCCTTAAGTCCACATTCCAATCGAGTTGGTAGGGAAGATATGAAGTGGGCGGTACCAACCATCATAAAATAGGTTGGAGTCTGGACCAACGTTCACTCTTTTGAGTGTAAAGGACCACAGCATAATACTTAATCCCGTCGACGAGTTCTAGCACCACGGGAATTGGAAGCTGCTCGTAAACTCCGTGAGATTTTCAACGCAGAGTACGTCGCACCTACGTTCACACTAGTCGATCCGGGGGATACGTCAAACGCGTATATTGTATGTAGGACCCCGGTGACCGAAGTAGTCTCTTCCATATCAAGAGGTATCGACAATAGAAAATCGGTAGATTCTTCATTTATTCGAATCGTCAGTAAATTAATCATTAGGAATGCTATTCACATGGGACTATCCGTCCTATGTGCATTTATATCCTATAATAAACCATGATAAATTTTATGTGGATATTTTATTAATCCTCCAAACCGTATGGGGGAGCACTTTTATAGAAATCTACCATAAAGAGTATATCCGTTAAATACCCGGGTTTGATTATATGTTTGTCAGTTGGTAGTTGAACTTCCATCGCCATCTAAGATGGACCATCAAACATCACTTATTAATGCCACAGATGATAATTGCTTAGACACGGATTCTAGTATAAACTTGCCAAGCATAGATAAATGCGAAATTGATGACAATTCAATTGCGGATGAAACTCTATCCGACAAGGGCTCCCCGGTCGCTATACCGCTATGCGCCACCATCGAGATCCCGCGTGGGAATGCGGACCGGCAGTCCCCAAGCCACGACGTACGAGGGGCCAATAGGACAAATTACGACTCCGATACCGGCTGTTATTATAGCGAGAGTGACAACGAGACGGCGACGCTGTTCATAAATAGAATAGGCAAACGCGAGACGGCCAAGAGACGGCGACGGAGGCGGTGTCTGGTGGCACTGGCCGTCTCAGGGGTGGCGACACTATGCGTGCTATCGGGATTATTAGGTGCGCTGCTGTGGCGGCTGATGGATGCCCCCGGGACGCGCCGGTGACGGGCTCGTTCAATAAACATAGCATACGTTATGACATGGTCTACCGCGTCTTATATGGGGACGATTGTTTTAGATTGGGTTTTCAGCGAGGCGCGTACAATATTGTACAGGGGAGTCTCCACGAACCCTAGGTTTTGGGTCGTAGATCACCACGGGGAGGGGATAGGGTACGAGTACATAAATCTTGTTGCTGGGATCGATCGTGTGATAAAGAATTTTGAGACCTTAGATGGCTTATGAAGGCGAG。
3、CRFK稳转细胞系的构建
在gI、gE、TK、EGFP、mCherry基因上分别选择5’-GN(20)GG或者5’-N(21)GG的序列位点，通过guidRNA在线设计工具(http://crispr.mit.edu/)和BLAST工具比对确定，所选的sgRNA靶标序列在病毒基因组中唯一位点，尽量避免脱靶的可能性。将设计合成的sgRNA放入沸水中自然降至室温成对变性、退火，退火之后形成具有粘性末端的DNA双链，可连入经BsmBI酶切线性化的LentiCRISPR真核表达载体中。其中，BsmBI酶切LentiCRISPR载体的体系为BsmBI酶5μL，10×3.1buffer 5μL，LentiCRISPR载体5μg，ddH2O up to 50μL，于55℃水浴锅酶切1h，电泳鉴定后使用omega胶回收试剂盒回收纯化；将sgRNA与线性化LentiCRISPOR载体连接产物转化大肠杆菌感受态细胞(DH5α)，并涂布氨苄抗性平板，挑取单克隆菌落。利用U6启动子通用引物(gactatcatatgcttaccgt)测序鉴定阳性克隆；37℃摇床培养阳性克隆12-16h，提取质粒，得到gI-sgRNA、gE-sgRNA、TK-sgRNA、EGFP-sgRNA、mCherry-sgRNA的表达载体。将上述表达载体分别与辅助质粒pSPAX2、pMD2.0G共转染293T细胞，转染48-72h后收取慢病毒，感染CRFK，使用嘌呤霉素加压筛选后即获得CRFK稳转细胞系。
表1 sgRNA构建引物信息
4、重组病毒构建
将CRFK稳转细胞置于6孔板中进行培养(含胎牛血清10％、青霉素100U/ml和链霉素100U/ml)，待细胞汇合度到70-80％后进行转染。将同源重组片段TKhm1+CMV+EGFP+polyA+TKhm2、gIhm1+CMV+mCherry+polyA+gEhm2混合转染，转染量比例为1：1，800μL转染液37℃孵育4h。转染细胞孵育完成后，感染FHV-1野毒株(moi＝0.01)，1mL病毒液37℃孵育2h后换液；培养36-48h后，在显微镜下观察，出现有红色和绿色两种荧光的细胞病变斑之后将其挑取出来进行多轮空斑纯化，直至所有病毒均带红绿色双荧光，将带有红绿色双荧光的病毒接种CRFK细胞，收获病毒液，按常规方法提取DNA后分别使用引物TK-F(gatacagagccgcccaat)、TK-R(tgtggcgatgatgtgacc)及引物gI/gE-F(agtcagtagtgatacccgc)、gI/gE-R(gagactacttcggtcaccg)进行PCR扩增，对扩增出的片段进行序列测定，将序列测定后纯化的重组病毒命名为rWH/2020-△TK/gI/gE-EGFP+-mCherry+。图2A-B分别为绿色荧光、红色荧光、明场视野下重组病毒rWH/2020-ΔTK/gI/gE-EGFP+-mCherry+感染CRFK细胞后细胞病变结果图。
使用同样的方法，将TKhm1+TKhm2、gIhm1+gEhm2共转CRFK稳转细胞系，转然后按0.01moi接种rWH/2020-△TK/gI/gE-EGFP+-mCherry+，多轮空斑纯化直至所有病毒均无荧光，将无荧光的病毒接种CRFK细胞，收获病毒液，按常规方法提取DNA后使用引物TK-F(gatacagagccgcccaat)、TK-R(tgtggcgatgatgtgacc)及引物gI/gE-F(agtcagtagtgatacccgc)、gI/gE-R(gagactacttcggtcaccg)进行PCR扩增，对扩增出的片段进行序列测定，将序列测定后纯化的重组病毒命名为rWH/2020-△TK/gI/gE。该重组病毒的构建示意图见图1。图3A-B分别为绿色荧光、红色荧光、明场视野下重组病毒rWH/2020-ΔTK/gI/gE感染CRFK细胞后细胞病变结果图。
5、重组病毒的保存
将鉴定后的rWH/2020-△TK/gI/gE病毒按照常规方法接种CRFK细胞，培养至90％以上细胞出现CPE(细胞病变效应)后收获病毒上清，分装后-80℃保存。
实施例2重组病毒rWH/2020-△TK/gI/gE的遗传稳定性、纯净性检验
1、重组病毒rWH/2020-△TK/gI/gE的遗传稳定性检验
将rWH/2020-△TK/gI/gE在CRFK细胞上增殖连续传代至十代，利用常规方法提取各代病毒基因组DNA，分别扩增FHV-1gD基因、TK基因、gI/gE基因，经PCR鉴定、测序验证重组病毒rWH/2020-△TK/gI/gE遗传稳定性。扩增体系为：2×phantaMIX 25μL，上游引物2μL，下游引物2μL，模板2μL，ddH2O 19μL。将上述试剂充分混匀，按下列条件进行扩增：95℃变性5min后进入循环，循环参数：95℃15s，55℃15s，72℃1min45s/15s，35个循环后72℃延伸5min，16℃2min。反应结束后，将PCR反应液进行1％琼脂糖凝胶电泳检测。图4为重组病毒rWH/2020-ΔTK/gI/gE的PCR鉴定结果；图A是对TK基因进行扩增，M：DL2000 DNA Marker，泳道1是重组病毒rWH/2020-ΔTK/gI/gE扩增条带，泳道2是亲本毒株WH/2020扩增条带，泳道3是阴性对照；图B是对gI/gE基因进行扩增，M：DL5000 DNA Marker，泳道1是重组病毒rWH/2020-ΔTK/gI/gE扩增条带，泳道2是亲本毒株WH/2020扩增条带，泳道3是阴性对照；图C是对gD基因进行扩增，M：DL2000 DNA Marker，泳道1是重组病毒rWH/2020-ΔTK/gI/gE扩增条带，泳道2是亲本毒株WH/2020扩增条带，泳道3是阴性对照。电泳结果显示，重组病毒rWH/2020-△TK/gI/gE缺失基因部分没有返祖，可稳定遗传(见图5A-C，A：TK基因扩增，B：gI/gE基因扩增，C：gD基因扩增)。
2、重组病毒rWH/2020-△TK/gI/gE的纯净性检验
将rWH/2020-△TK/gI/gE在CRFK细胞上增殖连续传代至十代，按照《中国兽药典》附录记载的方法对不同代次病毒进行无菌、支原体、外源病毒检验，结果如下：
表2 rWH/2020-△TK/gI/gE纯净性检验
实施例3重组病毒rWH/2020-△TK/gI/gE的致病性试验
取约2月龄的FHV-1抗体阴性幼猫20只，随机分为4组，分别标记为A、B、C、D组，按照下表进行攻毒试验。攻毒后连续观察14日。
表3 rWH/2020-△TK/gI/gE和WH/2020对幼猫的致病性试验
组别 攻毒毒株 攻毒剂量 接种方式 备注
A rWH/2020-△TK/gI/gE 108TCID50 滴鼻
B rWH/2020-△TK/gI/gE 106TCID50 滴鼻
C DMEM培养液 1.0mL 滴鼻 空白对照
D WH/2020 106TCID50 滴鼻
攻毒后每日观察并测定幼猫体温，观察是否出现猫传染性鼻气管炎临床症状和死亡。结果如下表4所示：rWH/2020-△TK/gI/gE滴鼻后高剂量组仅出现一过性体温升高和一过性打喷嚏，无其他临床症状，而滴鼻接种WH/2020的幼猫在攻毒后第三天有幼猫出现体温升高、打喷嚏、眼鼻分泌物和呼吸啰音等症状。空白对照组未出现任何临床症状，整个试验过程中均正常。
表4 rWH/2020-△TK/gI/gE和WH/2020对幼猫的致病性试验结果统计
组别 发热 眼鼻分泌物增多 打喷嚏 呼吸啰音
A 1/5 0/5 1/5 0/5
B 0/5 0/5 0/5 0/5
C 0/5 0/5 0/5 0/5
D 5/5 5/5 5/5 5/5
实施例4猫传染性鼻气管炎活疫苗rWH/2020-△TK/gI/gE的制备和检验
将rWH/2020-△TK/gI/gE接种CRFK细胞，待90％以上细胞病变时收获病毒液。将收获病毒液稀释后与保护剂(水解乳蛋白6％、谷氨酸钠3％、蔗糖5％、海藻糖2％、明胶0.85％)按体积比1：1混合后，按1mL/瓶分装进行冷冻真空干燥。按照《中国兽药典》附录检验无细菌与支原体污染，无外源病毒污染。培养病毒液效价为108.2TCID50/mL，冻干疫苗恢复成原体积病毒含量为107.35TCID50/mL。
实施例5猫传染性鼻气管炎活疫苗rWH/2020-△TK/gI/gE的免疫原性
选取约8-9周龄猫疱疹病毒I型抗原抗体阴性幼猫15只，随机均分为A、B、C共3组，按表5进行皮下注射免疫。第一次免疫后21日进行第二次免疫。二免21日后，所有试验猫采血，进行血清中和抗体(WH/2020中和)检测，所有试验猫滴鼻接种WH/2020(106.0TCID50/只)进行攻毒保护试验。攻毒后每天观察并记录幼猫的临床反应情况共14天。表6结果显示，对照组(DMEM)在攻毒后3d开始出现体温升高、打喷嚏、眼鼻分泌物增多、食欲下降等典型猫传染性鼻气管炎症状；rWH/2020-△TK/gI/gE和英特威猫三联活疫苗(Commercial vaccine)免疫组在攻毒后有一过性的体温升高，并表现出轻微的一过性临床症状，包括食欲降低，打喷嚏等，但在攻毒后两周内全部存活；在二次免疫21d后rWH/2020-△TK/gI/gE和英特威猫三联活疫苗免疫组中和抗体水平相当(见图6)。图7为攻毒保护试验各组体温曲线图。
表5 rWH/2020-△TK/gI/gE对FHV-1免疫原性试验分组
组别 免疫原 动物周龄 免疫剂量 攻毒毒株 攻毒剂量
A rWH/2020-△TK/gI/gE 8-9周龄 106TCID50 WH/2020 106TCID50
B Commercialvaccine 8-9周龄 1mL WH/2020 106TCID50
C DMEM 8-9周龄 1mL WH/2020 106TCID50
表6 rWH/2020-△TK/gI/gE对FHV-1免疫原性攻毒保护试验结果统计
组别 发热 眼鼻分泌物增多 打喷嚏 呼吸啰音 结果
A 1/5 0/5 1/5 0/5 5/5保护
B 2/5 0/5 2/5 1/5 5/5保护
C 5/5 5/5 5/5 4/5 5/5发病
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (8)

1.一种三基因缺失的猫疱疹病毒I型重组病毒，其特征在于，其由猫疱疹病毒I型病毒同时缺失TK、gE和gI基因得到；所述猫疱疹病毒I型病毒的保藏编号为CCTCC NO：V202126；
所述猫疱疹病毒I型病毒同时缺失TK、gE和gI基因的操作为：采用CRISPR Cas9基因编辑和同源重组方法对猫疱疹病毒I型FHV-1毒株中的TK、gE和gI基因进行敲除；具体包括以下步骤：
(1)构建FHV-1病毒目的基因的外源筛选基因同源重组片段：体外分别扩增FHV-1 TK基因的左右侧同源臂TKhm1、TKhm2，gI基因、gE基因同源臂gIhm1、gEhm2；PCR扩增获得含有外源筛选基因的线性化片段；再将扩增片段进行融合PCR扩增，分别得到所述FHV-1病毒的TKhm1+外源筛选基因+TKhm2、gIhm1+外源筛选基因+gEhm2、TKhm1+TKhm2和gIhm1+gEhm2片段；
(2)构建目的基因sgRNA表达载体：根据FHV-1病毒目的基因序列设计用于特异性靶向目的基因的sgRNA，再在目的基因的sgRNA的基础上设计sgRNA引物，通过所述sgRNA引物，将所述sgRNA与线性化载体连接，转化提取得到目的基因sgRNA表达载体；将所述目的基因sgRNA表达载体转染293T细胞，收取慢病毒后感染CRFK细胞获得CRFK稳转细胞系；所述sgRNA引物包括目的基因TK、gE和gI的sgRNA引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1-6所示；
(3)构建重组病毒：将所述TKhm1+外源筛选基因+TKhm2、gIhm1+外源筛选基因+gEhm2转染至步骤（2）获得的所述CRFK稳转细胞系，得到转染细胞，将转染细胞感染FHV-1病毒野毒株，得到FHV-1多基因缺失病毒；再将所述TKhm1+TKhm2和gIhm1+gEhm2转染至步骤（2）获得的所述CRFK稳转细胞系，得到转染细胞，将转染细胞感染所述FHV-1多基因缺失病毒，得到所述三基因缺失的猫疱疹病毒I型重组病毒；
所述TK基因的左右侧同源臂TKhm1、TKhm2的核苷酸序列依次为序列表中的序列34和序列36所示；所述gI基因同源臂gIhm1的核苷酸序列为序列表中的序列37所示；所述gE基因同源臂gEhm2的核苷酸序列为序列表中的序列39所示。
2.一种权利要求1所述的三基因缺失的猫疱疹病毒I型重组病毒的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)构建FHV-1病毒目的基因的外源筛选基因同源重组片段：体外分别扩增FHV-1 TK基因的左右侧同源臂TKhm1、TKhm2，gI、gE同源臂gIhm1、gEhm2；PCR扩增获得含有外源筛选基因的线性化片段；再将扩增片段进行融合PCR扩增，分别得到所述FHV-1病毒的TKhm1+外源筛选基因+TKhm2、gIhm1+外源筛选基因+gEhm2、TKhm1+TKhm2和gIhm1+gEhm2；
(2)构建目的基因sgRNA表达载体：根据FHV-1病毒目的基因序列设计用于特异性靶向目的基因的sgRNA，再在目的基因的sgRNA的基础上设计sgRNA引物，通过所述sgRNA引物，将所述sgRNA与线性化载体连接，转化提取得到目的基因sgRNA表达载体；将所述目的基因sgRNA表达载体转染293T细胞，收取慢病毒后感染CRFK细胞获得CRFK稳转细胞系；所述sgRNA引物包括目的基因TK、gE和gI的sgRNA引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1-6所示；
(3)构建重组病毒：将所述TKhm1+外源筛选基因+TKhm2、gIhm1+外源筛选基因+gEhm2转染至步骤（2）获得的所述CRFK稳转细胞系，得到转染细胞，将转染细胞感染FHV-1病毒野毒株，得到FHV-1多基因缺失病毒；再将所述TKhm1+TKhm2和gIhm1+gEhm2转染至步骤（2）获得的所述CRFK稳转细胞系，得到转染细胞，将转染细胞感染所述FHV-1多基因缺失病毒，得到所述三基因缺失的猫疱疹病毒I型重组病毒。
3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，步骤(2)所述sgRNA在目的基因上的靶序列符合5’-GN(20)GG或5’-N(21)GG的序列位点。
4.一种权利要求1所述的三基因缺失的猫疱疹病毒I型重组病毒在制备猫传染性鼻气管炎疫苗中的应用。
5.一种猫传染性鼻气管炎疫苗，其特征在于，包括权利要求1所述的三基因缺失的猫疱疹病毒I型重组病毒。
6.根据权利要求5所述的猫传染性鼻气管炎疫苗，其特征在于，所述猫传染性鼻气管炎疫苗还包括保护剂。
7.一种权利要求5-6任一项所述的猫传染性鼻气管炎疫苗的制备方法，其特征在于，先将权利要求1所述三基因缺失的猫疱疹病毒I型重组病毒接种细胞，收获病毒液；之后将所述病毒液与保护剂混合，再进行真空冷冻干燥，即得所述的猫传染性鼻气管炎疫苗。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述细胞包括CRFK细胞、F81细胞或fcwf-4细胞。
CN202210630680.XA 2022-06-06 2022-06-06 一种三基因缺失的猫疱疹病毒i型重组病毒、猫传染性鼻气管炎活疫苗以及制备方法 Active CN114958783B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210630680.XA CN114958783B (zh) 2022-06-06 2022-06-06 一种三基因缺失的猫疱疹病毒i型重组病毒、猫传染性鼻气管炎活疫苗以及制备方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210630680.XA CN114958783B (zh) 2022-06-06 2022-06-06 一种三基因缺失的猫疱疹病毒i型重组病毒、猫传染性鼻气管炎活疫苗以及制备方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN114958783A CN114958783A (zh) 2022-08-30
CN114958783B true CN114958783B (zh) 2023-07-25

Family

ID=82958910

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210630680.XA Active CN114958783B (zh) 2022-06-06 2022-06-06 一种三基因缺失的猫疱疹病毒i型重组病毒、猫传染性鼻气管炎活疫苗以及制备方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN114958783B (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117143924B (zh) * 2023-09-11 2024-03-22 华中农业大学 共表达猫杯状病毒和猫细小病毒抗原蛋白的重组猫疱疹病毒及其活载体疫苗和应用
CN117085119B (zh) * 2023-10-07 2024-02-09 中国农业科学院上海兽医研究所(中国动物卫生与流行病学中心上海分中心) 一株表达猫杯状病毒vp1基因重组猫疱疹病毒疫苗及其应用

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113308441B (zh) * 2021-06-02 2022-05-10 华中农业大学 一株猫疱疹病毒i型病毒株及其应用
CN116042540A (zh) * 2022-12-28 2023-05-02 武汉科前生物股份有限公司 一种猫鼻气管炎病毒fhv-1wh-2017株的分离及应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN114958783A (zh) 2022-08-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN110093324B (zh) 基因缺失的减毒非洲猪瘟病毒及其作为疫苗的应用
CN114958783B (zh) 一种三基因缺失的猫疱疹病毒i型重组病毒、猫传染性鼻气管炎活疫苗以及制备方法
CN110551695A (zh) 非洲猪瘟病毒四基因缺失弱毒株及其应用
CN104894075A (zh) CRISPR/Cas9和Cre/lox系统编辑伪狂犬病毒基因组制备疫苗方法和应用
CN110628730B (zh) 表达猪繁殖与呼吸综合征病毒gp蛋白的重组猪伪狂犬病病毒及应用
JPS62118881A (ja) ウシヘルペスウイルス−１のチミジンキナ−ゼ欠失突然変異体
WO2023092863A1 (zh) 一种非洲猪瘟病毒asfv基因的重组病毒组合及由其制备的疫苗
CN105018433B (zh) 猪伪狂犬病病毒基因缺失株、疫苗组合物及其制备方法和应用
CA2366541C (en) Novel recombinant and mutant herpesviruses
CN111748563A (zh) 非洲猪瘟基因缺失弱毒株的构建及其作为疫苗的应用
CN112779287A (zh) 利用双sgRNA敲除伪狂犬病毒TK基因的方法及其应用
CN116200347A (zh) 一种gI、gE和TK三基因缺失株猫疱疹病毒疫苗及其应用
CN104059889A (zh) 伪狂犬病病毒变异株双基因缺失毒株及其构建方法和应用
CN106031793B (zh) 一种活疫苗及其制备方法和应用
EP3970741A1 (en) Stabilised superoxide dismutase (sod) homolog gene and uses thereof
CN113943714A (zh) 一种猫杯状病毒毒株及其应用
CN101353670B (zh) 牛传染性鼻气管炎病毒重组毒株、其构建方法及应用
CN109022373B (zh) 鸭瘟病毒ul56基因3’端缺失和lorf5基因缺失突变株及其构建方法与应用
CN115386556B (zh) 一株串联表达非洲猪瘟病毒p30、p54基因重组伪狂犬病毒基因工程疫苗及其应用
CN106916832B (zh) O型口蹄疫病毒重组核酸、重组疫苗株及其制备方法和应用
JPH05501950A (ja) 変異株仮性狂犬病ウィルス及びそれを含有するワクチン
CN112430625B (zh) 含有变异猪伪狂犬病病毒gD蛋白基因的重组腺相关病毒转移载体、病毒及其制备和应用
CN117143924B (zh) 共表达猫杯状病毒和猫细小病毒抗原蛋白的重组猫疱疹病毒及其活载体疫苗和应用
CN111979202A (zh) 一种伪狂犬病毒弱毒株及其应用
CN117085119B (zh) 一株表达猫杯状病毒vp1基因重组猫疱疹病毒疫苗及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant