CN111979202A - 一种伪狂犬病毒弱毒株及其应用 - Google Patents

一种伪狂犬病毒弱毒株及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种伪狂犬病毒弱毒株，为伪狂犬病病毒TK缺失株，是将猪伪狂犬病病毒QD株缺失TK基因制备的；所述的伪狂犬病病毒QD株的保藏编号为CGMCC No.10266。本发明又提供了所述的伪狂犬病病毒弱毒株在制备伪狂犬疫苗中的应用。本发明伪狂犬病毒弱毒株是由保存的伪狂犬病病毒株经过TK基因缺失处理获得，于其往前构建方法相比，采用brdU压力与EGFP荧光标记双重筛选，缩短了重组伪狂犬病毒病病毒纯化代次和纯化时间，重组伪狂犬病病毒其致病力低，免疫原性强，用改伪狂犬病病毒弱毒株制备的弱毒活疫苗可以对小鼠和猪只等伪狂犬病病毒易感动物提供有效免疫保护。

Description

一种伪狂犬病毒弱毒株及其应用
技术领域
本发明属于疫苗制备技术领域，特别是涉及到一种伪狂犬病毒弱毒株及其应用。
背景技术
猪伪狂犬病是由猪伪狂犬病毒(Pseudorabies virus，PRV)引起的一种急性传染病，该病的临床症状表现为哺乳期仔猪出现呕吐、昏睡、麻痹等神经症状，直至最后衰竭死亡，死亡率几乎为100％；而妊娠母猪感染后会出现流产、死胎及木乃伊胎等症状；育肥猪感染后出现呼吸道疾病症状；公猪感染后出现睾丸肿胀、萎缩及精液质量下降等症状；成年猪只多为隐性感染，耐过后会造成长期排毒的现象，成为危险的传染源。猪伪狂犬病因以上特点成为危害全球养猪业的重大传染病之一，已经给全世界养猪业带来巨大的经济损失。目前，很多欧洲国家宣布通过接种疫苗并结合血清学诊断技术净化猪伪狂犬病。我国自从2011年来，伪狂犬病又有卷土重来之势。
研究显示伪狂犬病毒PRV是一种病毒粒子为圆形、直径为150-180nm、基因组为双链DNA、长度大小约为145kb的带有囊膜的疱疹病毒(Herpesviridae)。PRV由长度特区(UL区域)、短独特区(US区域)、内部倒转重复序列(IRs区域)、US区段两侧末端重复序列(TRs区域)四个部分组成。其核衣壳主要由UL19基因、UL35基因编码蛋白构成，核衣壳与囊膜之间存在被膜蛋白，至少有14种蛋白来自病毒基因组编码。PRV毒力收到多种基因的联合控制，其中有UL区的UL10、UL13、UL21、UL23(TK)、UL39/40、UL44、UL50，US区的US3、US7、US8。
伪狂犬病尚无有效的治疗药物，通过接种疫苗是预防和控制猪伪狂犬病最直接有效的方法。现在应用较为广泛的是伪狂犬经典毒株Bartha株和BUK株所制备的疫苗。BarthaK61是由Bartha株在异源细胞反复传代所得，BUK则是将弱毒株Bucharest株通过鸡胚和鸡胚成纤维细胞连续传代约800代后获得的，上述两株对妊娠母猪和仔猪都有一定的免疫保护作用。
基因缺失疫苗是一种通过基因工程技术去除与毒力相关的基因或者基因片段而获得的疫苗，其优点在于缺失位点明确稳定，不容易发生毒力反强，缺失后毒力降低但不影响免疫原性，但目前在伪狂犬病的防治和控制还缺少有效的基因缺失疫苗。
发明内容
本发明的目的是提供一种伪狂犬病毒弱毒株及其应用，从而弥补现有技术的不足。
本发明首先提供一种伪狂犬病毒弱毒株，为伪狂犬病病毒TK缺失株，是将猪伪狂犬病病毒QD株缺失TK基因制备的；
所述的伪狂犬病病毒QD株，为疱疹病毒Ⅰ型(Porcine herpesvirus type I)伪狂犬病病毒QD株，于2015年3月6日保藏于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.10266。
本发明又提供了所述的伪狂犬病病毒弱毒株在制备伪狂犬疫苗中的应用。
所述伪狂犬病疫苗接种的对象为猪伪狂犬病毒易感动物。
所述的伪狂犬病毒易感动物为小鼠和猪。
本发明伪狂犬病毒弱毒株是由保存的伪狂犬病病毒株经过TK基因缺失处理获得，于其往前构建方法相比，采用brdU压力与EGFP荧光标记双重筛选，缩短了重组伪狂犬病毒病病毒纯化代次和纯化时间，重组伪狂犬病病毒其致病力低，免疫原性强，用改伪狂犬病病毒弱毒株制备的弱毒活疫苗可以对小鼠和猪只等伪狂犬病病毒易感动物提供有效免疫保护。
具体实施方式
本发明所使用的材料记载如下：
PCDNA3.1-EGFP、pBluescript质粒均为本实验室保存；病毒DNA提取试剂盒、胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒均购买于Omega公司；primeSTAR聚合酶、2×GC buffer、dNTPmix、5000bp maker、pMD18-T kit、Blunting Kination Ligation均购买于宝生物工程有限公司；胎牛血清购买于金源康有限公司；DMEM培养基购买于生工生物工程股份有限公司；brdU购买于北京索莱宝公司；低熔点琼脂粉购买于sigma公司；DH5a感受态、ClonExpressUltra One Step Cloning Kit购买于南京诺唯赞生物科技有限公司，磷酸钙转染试剂盒购买于Invitrogen公司。小鼠购买于济南朋悦实验动物中心；猪购买于济南金丰实验动物有限公司。
但本领域的普通技术人员在本发明的技术思路下，可以选择本领域的其它常规试剂材料来进行替换。
其中TK基因位于伪狂犬病毒PRV的UL23区，全长963bp，编码320个氨基酸，其主要功能是催化脱氧胸苷或嘧啶磷酸化为dTTP，参与核苷酸的合成途径以维持并促进病毒的复制。
下面结合实施例对本发明进行详细的描述。
实施例1：猪伪狂犬病病毒株TK基因扩增与克隆
将于PK-15细胞繁殖的伪狂犬病病毒回收，经过反复冻融3次后，使用病毒DNA提取试剂盒提取PRV基因组，以PRV基因组为模板进行PCR扩增，体系为50μL体系，2×GC buffer25μL，dNTP mix 4μL，primeSTAR酶0.5μL，模板1μL，上下游引物各1μL，最后水补齐至50μL。PCR反应程序为98℃预变性2min，98℃变性1min，55℃退火15s，72℃延伸2min，30个循环。PCR产物用1％浓度的琼脂糖凝胶电泳检测后，切胶纯化所需目的条带，使用Omega公司胶回收试剂盒进行回收，具体过程如下：
在PCR产物中加入等体积的Binding buffer于2mL EP管中，60℃下融化胶条，孵育7min，每2分钟颠倒混匀溶液一次，保证胶条溶解充分。将溶解好的上述溶液加入试剂盒的Hibind DNA Columms中，不要超过700uL的体积，在10000g/min 1min的条件下离心，弃去收集管中溶液。再次加入300μL binding buffer后离心。加入SPW buffer 700μL在10000g/min 1min的条件下离心，重复2次此操作。之后13000g/min 2min的条件下空离，弃去收集管，将Hibind DNA Columms至于自备1.5mL EP管中，加入30uL Elution buffer，室温静置2min后，13000g/min 1min离心收集PCR产物。
取回收的PCR产物0.2—20pmol，加入2μL 10×Blunting Kination buffer，1μLBlunting Kination Enzyme Mix，用水补齐至20μL体系，37℃反应10min，70℃热处理5min。之后取上述反应液5μL到新的微量离心管中，加入1μL已经去磷酸化处理的平末端载体DNA(50ng/μL—100ng/μL)混匀。再加入6μL的Ligation solution I，混合。16℃反应一小时。
将上述全量反应液转化至DH5a大肠杆菌感受态，之后涂布于氨苄抗性的LB固体培养基平板上，37℃过夜培养。待生长至合适大小时，挑取单个菌落，经PCR鉴定菌液为阳性后，提取质粒编号TKLR-T送至生工生物工程公司测序。根据测序结果序列，设计扩增TK基因相关的上下游同源臂的引物，将由生工生物工程公司合成。
实施例2：猪伪狂犬病病毒QD株缺失TK基因
1、引物设计和PCR扩增
设计扩增TK基因两侧的同源臂引物TKLP1、TKLP2、TKRP1和TKRP2。其中引入PmeI酶切位点(下划线标出)，为了在后续操作中加入到上下游中间的EGFP片段预留。同时设计扩增EGFP表达盒的EGFPP1和EGFPP2引物备用。引物如下表所示，由生工生物工程公司合成。
Figure BDA0002653942420000051
2、TK转移载体的构建
以PKLR-T为模板，分别用TKLP1、TKLP2和TKRP1、TKRP2扩增TK的同源臂TKL和TKR。PCR体系为：2×GC buffer 25μL，dNTP mix 4μL，上下游引物各加1μL，DNA模板1μL，PrimeSTAR酶0.5μL，最后用水补齐至50μL体系。PCR反应程序是：98℃预变性2min，98℃变性10s，55℃退火15s，72℃延伸1min。PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测。回收PCR产物。
以pcDNA3.1-EGFP为模板，使用EGFPP1和EGFPP2引物扩增EGFP表达盒，体系反应条件同上，PCR产物琼脂糖电泳后回收，连于T载体鉴定无误后，以正确序列质粒为模板，扩增回收EGFP表达盒。
将pBluescript载体用EcoRV单酶切后回收后，按照诺唯赞公司One Step CloningKit试剂盒说明书进行TK基因缺失质粒构建，方法如下：
按照多片段同源重组反应最适合克隆载体量＝[0.02×克隆载体碱基对数]ng、每个片段适用量[0.02×克隆载体碱基对数]ng加入到微量反应管中，再加入5μL 2×ClonExpress Mix，用水补齐至10μL。轻柔混匀后50℃，孵育15min；之后立即置于冰上冷却。将DH5a于冰上解冻，取5-10μL重组产物加入到100μL感受态中，轻弹管壁混匀，冰上静置30min。42℃热激45s，立即置于冰上2-3min。加入900μL LB液体培养基，37℃摇菌1h。取100μL涂布在LB固体培养基平板(含氨苄抗性)，37℃过夜培养，待菌落大小适中，挑取菌落摇菌培养，经菌液PCR鉴定为阳性后，提取质粒编号为pBluescript-delTK送至生工生物工程公司测序鉴定，鉴定无误后保菌备用。
将pBluescript-delTK质粒经PmeI酶切处理后，用上述方法连接EGFP表达盒，构建pBluescript-delTKEGFP质粒，测序无误后用于同源重组第一步缺失TK基因后荧光标记筛选。
3、伪狂犬病病毒ΔTK基因株的构建
采用Invitrogen磷酸钙转染试剂盒进行转染实验。具体操作方法按照试剂盒说明书进行：将共转染基因组与pBluescript-delTKEGFP质粒按照质量比6：4、8：2或9：1(共10μg)加入到1.5mL EP管中，再加入CaCl2 18μL，用culture water补齐至150μL并标记为A管。另取1.5mL EP管标记为B管，在管中加入2×HBS溶液150μL。之后逐滴将A管中溶液缓慢加入B中，室温孵育30min。混合后的溶液滴加在铺好的PK-15 6孔板孔中，4h后用30％水甘油左休克处理，处理前洗脱两次，水甘油孵育2min后在洗脱两次，加入完全2.5mL培养液放入培养箱中观察。当使用荧光显微镜观察到细胞出现病变、并且有绿色荧光时回收病毒液，这可说明转染的病毒基因组和质粒都已经表达。
将收集回的病毒液-80℃反复冻融3次后接种于T25单层PK-15细胞瓶中，在细胞培养液中加入工作浓度30mg/L brdU试剂继续培养，细胞瓶中的细胞出现病变并且有绿色荧光激发，说明同源臂和EGFP表达盒整合到病毒基因组上，收集病毒液后反复冻融3次，按100倍稀释后接种于6孔板上，6孔板单层培养的PK-15细胞在接种病毒前12h换成含有30mg/LbrdU试剂的完全培养液，之后接毒孵育1.5h，洗脱，每个孔按照1mL 2×DMEM、0.8mL 2％低熔点琼脂糖、0.2mL血清比例封板，待凝固之后放于37℃培养箱中，连续观察。当细胞出现大小合适的病变并带有绿色荧光时，挑取相应的荧光蚀斑，并溶于500μL DMEM培养基中，重复以上纯化实验1-2次，可见孔中所有病变均有绿色荧光斑，即得到纯化的伪狂犬病病毒ΔTK-EGFP株。
提取纯化的伪狂犬病病毒ΔTK-EGFP株DNA基因组，按照上述磷酸钙转染方法与pBluescript-delTK质粒共转染于PK-15细胞，当有无荧光病变出现后回收病毒液，接着在6孔板上进行纯化，纯化步骤如上。待所有的病变蚀斑均无荧光激发，，即得到纯化的伪狂犬病病毒ΔTK基因株。
4、伪狂犬病病毒ΔTK基因株的鉴定以及病毒TCID50的测定
使用试剂盒回收伪狂犬病病毒基因组DNA，以引物TKJDF:cagacccggaagcagaacgg和TKJDR：ctgatgtccccgacgatgaa进行PCR鉴定，该上下游引物位于缺失基因两侧，所以缺失后无法有效扩增出条带，使用亲本毒株DNA模板作为阳性对照，PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测，纯化后的重组伪狂犬病病毒基因组未能扩增出TK基因，即证明TK基因已经被缺失。
将亲本伪狂犬病病毒株以及PRV-ΔTK基因株分别在长满单层PK-15细胞的96孔板上、进行TCID50的测定。待96孔板中的PK-15细胞长满单层时，将经过传代的细胞适应毒倍比稀释10-1—10-11接种于96孔板1—11列，每孔加入100μL。最后一列加入等体积的细胞培养液作为阴性对照。96孔板放置于37℃、5％CO2培养箱中进行培养，96h后出现细胞病变的孔数，按照Reed-Muench法计算病毒TCID50，亲本株以及PRV-ΔTK基因株分别为109TCID50/mL、108.8TCID50/mL。说明TK基因缺失后不会影响病毒在PK-15细胞上的增值情况。
实施例3：伪狂犬病病毒ΔTK基因株的致病性
1、小鼠致病性比较
实验方法：选择6—8周龄的BALB/c小鼠70只，随机分成7组，每组有10只。1—3组分别背部皮下注射100μL 106.0TCID50的ΔTK基因缺失株病毒液，4—6组则背部皮下注射100μL106.0TCID50的亲本PRV毒株，剩余一组小鼠则背部注射100μL DMEM作为阴性对照。接种后14d内连续观察，记录小鼠的精神状态、临床症状及死亡情况。
实验结果：接种100μL 106.0TCID50的ΔTK基因缺失株病毒液的小鼠，没有出现临床症状，接种14d后也无死亡。接种亲本PRV毒株组，36—48h后出现精神萎靡、食欲饮欲下降、注射部位发痒的症状，72h—96h内全部死亡。说明缺失TK基因之后，减弱了对小鼠致病性和毒力。
2、猪致病性比较
实验方法：选取12头PRV病原阴性、PRV抗体阴性的8—9周龄三元猪进行致病性比较试验。分为3组，每组随机4头，第1组接种亲本株，第2组接种ΔTK基因缺失株，第3组为阴性对照组。攻毒方法为滴鼻4mL/头，隔离饲养。每日定时测定体温，观察精神状态、食欲饮欲等。
实验结果：亲本株组攻毒后24h内，体温开始升高；48h后平均体温在41℃以上，食欲饮欲废绝、精神沉郁，有1头猪表现出神经症状；72h后，1头猪死亡，其余3头表现为明显发痒和神经症状；96h后，剩余3头猪全部死亡。ΔTK基因缺失株在攻毒48h后，所有接种猪体温有所升高，精神状态尚可；所有猪体温升高1.5℃内，持续72h，精神状态良好，食欲饮欲正常。对照组4头猪健康无临床症状。试验结果表明，缺失TK基因后，减弱了对猪的致病性和毒力。
实施例4：伪狂犬病病毒ΔTK基因株制备疫苗
1、疫苗的制备与检验
将效价为108.8TCID50/mL的ΔTK基因缺失株病毒液用β—丙内酯在4℃灭活48h后，接于PK-15单层细胞上，于37℃，5％CO2培养箱中培养48h，若无细胞病变，可以判定为灭活检验合格。病毒液与赛比克水性佐剂按照1：1混合，制备成ΔTK基因缺失株灭活疫苗。
2、小鼠免疫原性试验
将20只5—6周龄的SPF小鼠随机分配成2组，每组10只，一组腹腔注射灭活抗原含量为108.8TCID50/mL的ΔTK基因缺失株灭活疫苗0.2mL/只，一组腹腔注射DMEM 0.2mL/只作为阴性对照。免疫21d后用106.7TCID50/mL的PRV强毒进行攻毒，攻毒计量为皮下注射0.1mL/只，攻毒后观察小鼠临床症状，统计小鼠的死亡数量。
实验结果：免疫灭活疫苗后，免疫组小鼠精神状态良好，食欲饮欲正常，与对照组小鼠无差异，说明疫苗免疫没有副作用。攻毒之后，对照组小鼠72h内开始出现明显的伪狂犬病临床症状，精神萎靡，被毛杂乱，食欲下降，攻毒部位发痒，啃咬接种部位等。疫苗免疫组则无临床症状。连续观察14d，对照组小鼠死亡率100％，疫苗免疫组死亡率10％，这表明，在抗原含量108.8TCID50/mL时，ΔTK基因灭活疫苗可以对SPF小鼠产生90％的保护率。
3、猪免疫原性试验
选取10头PRV病原阴性、PRV抗体阴性的14日龄三元猪用于本试验，将猪随机分为两组，每组5头。第一组肌肉注射抗原含量108.8TCID50/mL的ΔTK基因灭活疫苗2mL/头，第二组不注射疫苗，作为空白对照组。免疫之后观察两组体温、精神状态等。收集免疫后7d、14d和21d的血清测定PRV抗体。免疫21d后用105.7TCID50的PRV强毒进行攻毒，攻毒方式为滴鼻4mL/头，观察攻毒后两组临床症状及死亡情况。收集死亡猪及14d后剖杀的脑、脾脏、肺脏、腹股沟淋巴结等组织器官，观察病理变化。收集攻毒后7—14d的血清、鼻、肛拭子，测定PRV病毒核酸拷贝数及PRV病毒再分离。
实验结果：注射灭活疫苗后观察14d，期间免疫组和对照组均表现精神状态良好，食欲饮欲正常，免疫组24—48h期间出现一过性体温升高，之后恢复正常体温。攻毒后观察14d，对照组攻毒后48h，开始出现体温升高及伪狂犬病临床症状，7d后对照组猪只全部死亡，死亡率为100％；免疫组攻毒后3d—5d体温出现一过性增高，14d连续观察无猪只死亡，且精神状态良好，存活率为100％。这表明再抗原含量为108.8TCID50/mL的ΔTK基因灭活疫苗可对14日龄仔猪产生100％的免疫保护。
上述试验结果表明，使用本发明所获得的ΔTK基因灭活疫苗有较强的免疫原性，可以对小鼠和猪都能产生较好的免疫保护。
实施例5：疫苗效果检测
将60只5—6周龄的SPF小鼠随机分成12组，每组5只，其中3组腹腔注射107TCID50/mL、0.1mL/只的ΔTK基因缺失株病毒液，3组106TCID50/mL、0.1mL/只的ΔTK基因缺失株病毒液，3组105TCID50/mL、0.1mL/只的ΔTK基因缺失株病毒液，3组DMEM培养液作为阴性对照，之后，分别在接种后4d、7d和14d用106TCID50的强毒进行攻毒，0.1mL/只，皮下多点注射。
实验结果：小鼠在接种不同浓度抗原含量的弱毒病毒液后，精神状态良好，食欲饮欲正常，未出现临床症状，与对照组相比无差异，说明ΔTK基因弱毒对小鼠无副作用。免疫后4d用PRV强毒株进行共组，攻毒后4d各组小鼠均出现80％以上的死亡；免疫后7d攻毒，105TCID50/mL组小鼠保护率不足20％，106TCID50/mL组小鼠保护率为40％，107TCID50/mL组保护率为50％；免疫14d后攻毒，105TCID50/mL组小鼠保护率50％，106TCID50/mL组小鼠保护率为80％，107TCID50/mL组保护率为90％。对照组小鼠死亡率均为90％以上。这表明，ΔTK基因缺失活疫苗免疫后4d不能对小鼠产生有效的保护，免疫7d对小鼠也达不到理想的保护水平，而免疫14d后，106TCID50/mL和107TCID50/mL两组可以使小鼠在PRV强毒攻毒后存活80％以上。
以上实验结果表明，本发明获得的ΔTK基因缺失株制备的弱毒活疫苗，当抗原含量达到106TCID50/mL以上时，免疫14d，可以对小鼠产生较好的免疫保护作用。

Claims (5)

1.一种伪狂犬病毒弱毒株，其特征在于，所述的伪狂犬病病毒弱毒株是将猪伪狂犬病病毒QD株缺失TK基因制备的；所述的伪狂犬病病毒QD株的保藏编号为CGMCC No.10266。
2.权利要求1所述的伪狂犬病毒弱毒株在制备疫苗中的应用。
3.一种疫苗，其特征在于，所述的疫苗中使用的抗原包含有权利要求1所述的伪狂犬病毒弱毒株。
4.如权利要求3所述的疫苗，其特征在于，所述的疫苗的接种对象为猪伪狂犬病毒易感动物。
5.如权利要求4所述的疫苗，其特征在于，所述的伪狂犬病毒易感动物为小鼠或猪。
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