CN107304417B - 一株猪流行性腹泻病毒变异弱毒株及应用 - Google Patents

一株猪流行性腹泻病毒变异弱毒株及应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于动物病毒学与动物传染病技术领域，具体涉及一株猪流行性腹泻病毒变异弱毒株及应用。该弱毒株为猪流行性腹泻病毒AJ1102‑R株(保藏号CCTCC NO:V201433)，经细胞传代、蚀斑克隆和培育证明增殖性能稳定。该弱毒株的基因组序列出现下述突变：第96代在3’UTR的第71～72位发生序列突变，缺失了2个碱基TT；在位于S基因的第3805～3816位存在序列突变，添加了12个碱基GATGCTATTGTT。该弱毒株的免疫效力可以诱导免疫仔猪产生高水平的中和抗体和足够攻毒保护，可以作为疫苗株应用。

Description

一株猪流行性腹泻病毒变异弱毒株及应用
技术领域
本发明属于动物病毒学与动物传染病学技术领域。具体涉及一种猪流行性腹泻病毒变异弱毒株及其应用。
背景技术
猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea,PED)是由猪流行性腹泻病毒(PEDV)引起的猪的一种高度接触性传染病，该病的主要特征是水样腹泻、呕吐和脱水。各种年龄的猪均易感，1～2周龄哺乳仔猪的发病率高达90％～100％，给养猪业带来了很大的经济损失。1971年，英国首先报道了PED的发生，比利时、德国、瑞士、日本等许多国家相继报道了该病的发生(Pensaert M B et al,A new coronavirus-like particles associated withdiarrhea in swine.Arch Virol,1978,58:243-247；Takahashi K et al,An outbreak ofswine diarrhea of a new type associated with coronavirus like particles injapan.Vet Sci,1983,45:829-832)。近年来，亚洲一些国家，如日本、韩国、泰国和我国也都多次报道PED的发生(Kweon C H et al,Rapid diagnosis of porcine epidemicdiarrhea virus infection by polymerase chain reaction.J Vet Med Sci,1997,59(3):231-232)。上世纪90年代后期，我国开始大面积地使用TGE和PED二联疫苗进行免疫，取得了很好的效果(童昆周等.猪流行性腹泻弱毒疫苗的研究.中国兽医科技，1996，26(1)：3-4)。
同猪的其它病毒性传染病的防制一样，PED的防制也主要是免疫预防。近几年来，在PEDV灭活和弱毒疫苗在猪场广泛应用的同时，由PEDV引起的仔猪腹泻仍然不断发生。2010年底首先在我国华南，随后蔓延至全国的哺乳小猪“顽固性腹泻”疾病，具有流行范围广、发病地区多、发病率高和死亡率高等特点，该病主要导致哺乳小猪出现水样腹泻、呕吐等主要临床特征和肠道出血为主要病理特征，发病猪场哺乳小猪的发病率100％，死亡率在80％以上，尤其是5日龄内的仔猪，死亡率可达到100％，对我国养猪业造成了极大的危害和重大的经济损失，严重影响了农民增收和猪肉消费市场稳定及养猪业的生产安全。随后经过病毒全基因组测序证实，导致本次PED大爆发的病原为PEDV变异株，该变异株与经典株CV777相比，主要位于S基因的S1区域(l-2217nt)存在3个插入区域(162nt,170-180nt,413-415nt)和1个缺失区域(470-475nt)(Sun et al,Outbreak of porcine epidemicdiarrhea in suckling piglets,China.Emerging infectious diseases,2012,18:161-163)。因此，迫切需要研制PEDV变异株的疫苗来预防和控制该病的发生与流行。
发明内容
本发明的第一个目的在于针对现有技术中的上述问题，提供一株猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,简称PEDV)变异弱毒株，用该弱毒株制备的弱毒疫苗对猪流行性腹泻具有良好的保护效力。
本发明通过以下技术方案实施：
本发明用PEDV AJ1102株(本申请人所在的华中农业大学农业微生物学国家重点实验室分离鉴定，文献：Jing Bi,a,b Songlin Zeng,a Shaobo Xiao,a Huanchun Chen,aand Liurong Fanga，Complete Genome Sequence of Porcine Epidemic Diarrhea VirusStrain AJ1102Isolated from a Suckling Piglet with Acute Diarrhea in China，GENOME ANNOUNCEMENT，Journal of Virology p.10910–10911)强毒适应Vero细胞系。经细胞传代、蚀斑克隆和培育得到增殖性能稳定的弱毒株；以第96代毒在猪体内进行5次返祖试验，对3～5日龄仔猪均不致病，证明传代弱毒的毒力是稳定的。该弱毒株的分类地位为冠状病毒科冠状病毒属猪流行性腹泻病毒，申请人将得到的弱毒株命名为猪流行性腹泻病毒AJ1102-R株，Porcine epidemic diarrhea virus AJ1102-R，于2014年10月24日送交中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO:V201433。
本发明所获得的PEDV AJ1102-R株接种细胞后能够产生细胞病变，且在细胞上增殖稳定，毒价均达107 . 0TCID50/ml以上。
该弱毒株的第96代全基因组序列与PEDV AJ1102株的全基因组序列进行比较分析发现：第96代基因组的核苷酸序列中存在下述特征性突变：在3’UTR的第71～72位发生核苷酸序列突变，缺失了2个碱基即TT碱基，序列见SEQ ID NO：1所述；另外，位于S基因的第3805～3816位存在核苷酸序列突变，添加了12个碱基：GATGCTATTGTT，序列见SEQ ID NO：2所述。
本发明所获得的PEDV AJ1102-R株，经动物试验证实对3～5日龄仔猪不致病。
本发明所获得的PEDV AJ1102-R株，经动物试验证实可以诱导免疫仔猪产生高水平的中和抗体，能够提供足够的保护，因此，获得的PEDV AJ1102-R株为活疫苗的研制奠定了良好的基础。
本发明的第二个目的是提供上述猪流行性腹泻病毒变异弱毒株的应用。
应用方法如下：分别取长至单层的Vero细胞(购于ATCC)，弃去培养液，用含10μg/ml胰酶的无血清DMEM基础培养液(美国GIBCO公司产品)洗2遍，接本发明弱毒株后，并添加胰酶至终浓度10μg/ml，放置于37℃的5％CO2条件下吸附1h，其间轻摇1次，待吸附结束后，弃掉吸附液，加入含10μg/ml胰酶的无血清DMEM基础培养液，37℃条件下继续培养，逐日观察，当80％以上细胞出现病变时(约36～42h)，取出反复冻融2次，收取病毒悬液，将收获的病毒液每5瓶为一组分别取样，进行无菌检验，应无菌生长；病毒含量应≥107 . 0TCID50/ml。将检验合格的病毒液按照2:1(猪流行性腹泻病毒液:猪传染性胃肠炎病毒液)的比例混合，与蔗糖明胶保护剂(明胶96g，蔗糖400g，氯化镁0.168g，磷酸二氢钠0.152g，无水氯化钙0.2g，氯化钾0.4g，葡萄糖1.0g，氯化钠6.8g，待试剂充分溶解后，定容至1000ml，分装到500ml试剂瓶中，盖上透气胶塞，无纺布包扎封口处理，116℃高压蒸汽灭菌30min，37℃放置，新鲜配制。)按7:1(体积比病毒液:保护剂)配苗，充分混匀，定量分装。
本疫苗的使用方法：
按瓶签注明的头份，用稀释液稀释成每头份1.0ml，颈部肌肉注射。推荐免疫程序为：母猪产前4～5周接种2头份，免疫母猪所产仔猪于断奶后7～10日接种1头份。非免疫母猪所产仔猪于出生后3日接种1头份。其它日龄的猪每次接种1头份。
本发明的疫苗主动免疫持续期为6个月；仔猪被动免疫持续期为断奶后1周。
本发明的应用范围较宽，例如，可以用于制备成诊断猪流行性腹泻的诊断试剂，还可以制备成单苗或 联苗(活或者灭活疫苗)疫苗等。
附图说明
序列表SEQ ID NO:1是PEDV AJ1102-R株第96代的3’UTR序列(343bp)，在该序列的第71～72位发生核苷酸序列突变，缺失了2个碱基：TT。
序列表SEQ ID NO:2是PEDV AJ1102-R株第96代的S基因序列。序列长度为4170bp。在该序列的第3805～3816位存在核苷酸序列突变，即插入(即添加)12个碱基：GATGCTATTGTT。
序列表SEQ ID NO:3是PEDV AJ1102-R株的第96代的全基因组序列。序列长度为28054bp。
图1：是利用RT-PCR检测不同代次的感染PEDV AJ1102-R株的Vero细胞培养物的结果。附图标记说明：泳道1为阴性对照，2为第75代细胞培养物，3为第96代细胞培养物，4为第125代细胞培养物。
图2：是本发明涉及的载体pGEM-T easy的图谱。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步对本发明进行解释，以使本领域技术人员能更好地理解本发明并能予以实施，但实施例并不作为对本发明的限定。
实施例1猪流行性腹泻病毒变异弱毒株(简称PEDV AJ1102-R)株的获得
用PEDV AJ1102株(文献：Jing Bi,a,b Songlin Zeng,a Shaobo Xiao,aHuanchun Chen,a and Liurong Fanga，Complete Genome Sequence of PorcineEpidemic Diarrhea Virus Strain AJ1102Isolated from a Suckling Piglet withAcute Diarrhea in China，GENOME ANNOUNCEMENT，Journal of Virology p.10910–10911)强毒适应Vero细胞系。经细胞传代、蚀斑克隆和培育得到增殖性能稳定的弱毒株；以第96代毒在猪体内进行5次返祖试验，对3～5日龄仔猪均不致病，证明传代弱毒的毒力是稳定的。申请人将得到的弱毒株命名为猪流行性腹泻病毒AJ1102-R株，Porcine epidemicdiarrhea virus AJ1102-R，于2014年10月24日送交中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO:V201433。
1.PEDV AJ1102-R株不同代次细胞培养物的RT-PCR检测
将不同代次的病毒液各取200μl(微升)至1.5ml离心管，每管加入1ml
Figure BDA0000974069270000031
Reagent RNA Isolation Solvent，颠倒混匀，室温静置5～10min。每管加入200μl氯仿，涡旋15sec，严格冰浴10min，4℃12,000r/min离心10min。取80％的上清转至新的1.5ml离心管，加入500μl异丙醇，混匀，室温静置10min，室温12,000r/min离心10min。弃上清，每管加入1.2ml无水乙醇和300μl DEPC水，轻微涡旋，7500r/min离心5min，弃上清，用枪头吸干残留水份，风干5～10min，最后加入20μl DEPC水溶解。采用宝生物工程大连有限公司的RNAPCR Kit(AMV)试剂盒进行RT-PCR扩增(按该试剂盒提供的说明书操作)。提取后的RNA用下面的反应体系和条件进行反转录：试剂如下：1.0μl 10×RT Buffer，2.0μl MgCl2 1.0μldNTPs(10mM)，0.25μl RNase Inhibitor，0.5μl ReverTra
Figure BDA0000974069270000032
1.0μl Oligo(dT)20，1.0μlRNA和3.75μl的RNase-Free H2O，混匀后置于PCR仪上，按如下条件反应：30℃10min；42℃30min；95℃5min。
反转录后获得的cDNA用下述引物进行PCR，检测目的片段，
上游引物P1：5’-TTCCCGTTGATGAGGTGAT-3’；
下游引物P2：5’-AAGCATTGACTGAACGACC-3’。
反应体系为25μl：Ex Taq 0.125μl，10×Ex Buffer 2.5μl，10pmol/L上、下游引物各0.75μl，模板cDNA 5μl，加去离子水至25μl，混合均匀。PCR反应条件为：95℃预变性5min；94℃变性1min，54℃退火1min，72℃延伸1min的程序，35个循环；最后72℃延伸10min。检测样品采用第75、96、125代接种PEDV AJ1102株后的细胞培养物，检测结果显示不同代接种的细胞培养物都能检测到较亮的目的条带(图1)。
2.PEDV AJ1102-R株不同代次病毒的毒价测定
按常规方法将长满单层的Vero细胞(购于ATCC)用胰酶消化后，用DMEM细胞生长液(为美国GIBCO公司产品)吹下，计数后用DMEM细胞生长液调整细胞密度至3×105～5×105个/ml，将调整好细胞密度的细胞悬液接种于96孔细胞培养板，每孔100μl(细胞量为3×104～5×104个/孔)，置于37℃含5％CO2的培养箱培养。当96孔细胞培养板中的Vero细胞长至单层时，在EP管或青霉素瓶中用含10μg/ml胰酶的无血清DMEM培养液将病毒液作连续10倍稀释，从10-1至10-9。用PBS(0.01mol/L，pH值7.2)将96孔板中的Vero细胞单层洗2次，取10-4至10-9稀释度的病毒液接种到洗好的Vero细胞孔中，每一稀释度接种一纵排共8孔，每孔100μl。设8孔正常细胞对照，细胞对照孔的Vero细胞单层同样用PBS(0.01mol/L，pH值7.2)洗2次后加100μl含10μg/ml胰酶的无血清DMEM培养液。将上述96孔微量培养板置于37℃含5％CO2的培养箱培养96～120小时，观察并记录细胞病变，正常细胞对照孔应不出现细胞病变。按Reed-Muench法计算TCID50。PEDV AJ1102-R株经细胞连续传代至125代，不同代次取样测定毒价，结果第75代以后的病毒的滴度均在107 . 0TCID50/ml以上，说明病毒可以在Vero上稳定增殖(表1)。
表1PEDV AJ1102株不同代次的增殖滴度
Figure BDA0000974069270000041
3.PEDV AJ1102-R株的全基因组序列测定
取200μL PEDV AJ1102-R株的第96代Vero细胞培养物，RNA提取和反转录体系及条件同上述步骤2。反转录后的cDNA用下述引物进行PCR，扩增全基因组(表2)。
表2PEDV AJ1102-R株全基因组扩增引物
Figure BDA0000974069270000042
Figure BDA0000974069270000051
PCR反应条件为：95℃预变性5min；94℃变性40s，50℃退火40s，72℃延伸2.5min的程序，35个循环；最后72℃延伸10min。将各个片段的PCR产物用0.8％琼脂糖凝胶电泳回收，切下目的条带，用天根生化科技(北京)有限公司的凝胶回收纯化试剂盒回收目的片断，克隆到Promega公司生产的pGEM-T easy载体(图2)，连接产物转化宝生物工程大连有限公司)生产的DH5ɑ感受态细胞，菌液涂布在含100μg/L Amp的LB平板上，37℃培养16～18h，挑取单菌落培养后抽提质粒，进行酶切鉴定后送南京金斯瑞公司进行测序。PEDV AJ1102-R株的第75代的全基因组序列如SEQ ID NO.3所示。
利用DNAStar软件对测序结果进行分析，结果显示：PEDV AJ1102-R株第96代全基因组序列与PEDV AJ1102强毒株(登录号为JX188454)的全基因组序列进行比较分析发现：第96代的3’UTR的第71～72位核苷酸发生突变，缺失了2个碱基(TT，序列见SEQ ID NO：1所示)，另外，第96代的S基因处第3805～3816 位核苷酸序列发生突变，添加了12个碱基(GATGCTATTGTT，序列见SEQ ID NO：2所示)，这些突变为PEDV AJ1102-R株特有的插入缺失变异标志。
实施例2本发明弱毒株的安全性试验
1.PEDV不同代次的致病性试验
1.1试验方法：将PEDV第15代、35代、55代、75代、96代、125代分别口服感染PEDV中和抗体[采用Kusanagi等(Isolation and serial propagation of porcine epidemicdiarrhea virus infection in cell cultures and partial characterization of theisolate.J.Vet.Med.Sci.54,303–318)报道的改良的中和抗体检测方法，检测血清中的中和抗体水平]不高于1∶4母猪所产的3～5日龄仔猪，每组5头，1ml/头，其中第15代的攻毒剂量为106 . 5TCID50，其余各代次的攻毒剂量均为107 . 0TCID50，另设1组对照组。
1.2试验结果：从75代开始，病毒对仔猪已无致病性(表3)，说明75代后的病毒毒力已大大减弱，为与强毒株相区别，将第75代以后的致弱毒命名为PEDV AJ1102-R株。
表3 3～5日龄仔猪攻毒后发病情况
Figure BDA0000974069270000061
注：“+++”表示仔猪出现典型症状，水样腹泻，部分仔猪伴有呕吐；“++”表示仔猪粪便细软，但不出现水样腹泻；“+”仔猪仅出现一过性腹泻，仅排一两次较稀粪便；“－”表示仔猪没有出现任何症状。
2.PEDV弱毒的毒力返强试验
2.1试验方法：将猪流行性腹泻病毒AJ1102-R株F96代毒经口服感染3～5日龄仔猪，每头2ml(病毒含量为107 . 0TCID50/ml)，共3头，于感染后72h剖杀，观察病变，并取小肠组织制作冰冻切片观察肠绒毛的变化；刮取肠粘膜及内容物，用含500IU/ml青霉素和500μg/ml链霉素的生理盐水稀释5倍，4℃作用4h，反复冻融3次，5000r/min离心10min，取上清提取RNA通过RT-PCR扩增PEDV M基因；取上清经0.45μm滤膜过 滤后接种Vero细胞进行病毒分离，如无病变，则盲传5代。取第1代毒力返强试验获得的上清液再经口服感染3～5日龄仔猪3头，每头5ml，同样于接种后72h剖杀，观察病变和病理变化，并刮取肠粘膜及内容物，如上处理后再进行RT-PCR扩增和病毒分离，并接种3～5日龄仔猪，如此在猪体上传至第5代。
2.2试验结果：结果所有接种仔猪均未出现腹泻症状，剖检亦未见特征性病变，小肠病理切片显示小肠绒毛正常，说明猪流行性腹泻病毒AJ1102-R株第96代毒在猪体内传代稳定，毒力没有返强(表4)。
表4第1～5代毒力返强试验临床观察结果
Figure BDA0000974069270000071
3.PEDV弱毒的安全性试验
3.1试验猪：PEDV和TGEV中和抗体均不高于1∶4的妊娠母猪所产3～5日龄仔猪和妊娠79～86日龄健康母猪，购自湖北某猪场。
3.2试验方法：将PEDV AJ1102-R株P75，P96和P125 3个代次分别经颈部肌肉接种3～5日龄健康仔猪，每个代次接种5头，每头超剂量接种10头份(105 . 5TCID50/头份)，连续14日观察仔猪的临床反应及接种部位的变化，测定接种前体温和接种后连续7日的体温，体温测定在每天上午8:00(进食前)进行。将PEDV AJ1102-R株P75，P96和P125 3个代次分别通过颈部肌肉接种妊娠母猪，每个代次接种5头，每头超剂量接种10头份(105 . 5TCID50/头份)，测定接种前和接种后连续7日的体温；同时于接种后连续14日观察接种部位的变化和临床表现，在母猪产仔时统计产仔成绩。
3.3试验结果：通过3个代次的PEDV AJ1102-R株对仔猪的一次超剂量接种试验，结果所有接种仔猪在整个观察期间接种部位也无肿块形成，体温均无明显升高，呼吸、食欲、精神状态都正常，表明本发明弱毒株对仔猪是安全的(表5)。将3个代次的PEDV AJ1102-R株分别免疫妊娠母猪，免疫后没有出现体温方面的异常变化，在整个观察期内均没有出现不良反应，且最后的产仔成绩也无显著差异，没有出现流产、死胎和弱仔。接种部位也无肿块形成和炎症反应，说明本发明弱毒株对妊娠母猪是安全的(表6)。
表5本发明弱毒株一次超剂量接种的安全性试验
Figure BDA0000974069270000072
Figure BDA0000974069270000081
表6本发明弱毒株一次超剂量接种的安全性试验
Figure BDA0000974069270000082
实施例3本发明弱毒株(PEDV)的保护效力试验
1.试验材料
1.1病毒与疫苗
猪流行性腹泻病毒AJ1102株强毒由华中农业大学动物医学院预防兽医学实验室保存并供应。
3批猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻二联活疫苗(WH-1R株+AJ1102-R株)，由华中农业大学动物医学院预防兽医学实验室试制。
1.2试验动物
TGEV、PEDV中和抗体均不高于1:4的妊娠79～86日龄的母猪及TGEV、PEDV中和抗体均不高于1:4妊娠母猪所产3～5日龄仔猪，购自湖北某猪场。
1.3对妊娠母猪的效力实验
将妊娠79～86日龄的母猪随机分成4组，其中3组(5头/组)分别经颈部肌肉接种3批猪传染性胃肠、猪流行性腹泻二联活疫苗(WH-1R株+AJ1102-R株)，2头份/头(PEDV病毒含量为105 . 5TCID50/头份)，另1组(3头)作为对照。于免疫母猪所产仔猪3～5日龄时，每窝随机挑选1头，每组共选5头，未免疫母猪所产仔猪每窝任选3～4头每组共选5头。对所选仔猪分别采血，测定血清PEDV中和抗体。采血结束后，仔猪分别经口服2ml 106 . 0TCID50/ml猪流行性腹泻病毒AJ1102株强毒进行攻毒，于攻毒后连续观察7天，整个试验期间每天观察临床发病情况；以无临床症状作为保护，计算各组的保护率。
1.4对3～5日龄仔猪的效力实验
将3～5日龄仔猪随机分成4组，5头/组。其中3组分别经颈部肌肉接种3批猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻二联活疫苗(WH-1R株+AJ1102-R株)，1头份/头(PEDV病毒含量为105 . 5TCID50/头份)，另外1组作为对照。仔猪免疫后21日分别采血，分离血清，测定血清中PEDV中和抗体。仔猪免疫21日采血完成后，仔猪分别口服10ml 106 . 0TCID50/ml的猪流行性腹泻病毒AJ1102株强毒攻毒；攻毒后连续观察14日，整个试验期间每天观察临床发病情况；以无临床症状作为保护，计算各组的保护率。
1.5实验结果
抗体检测结果显示所有的免疫仔猪在接种后21天产生了高水平的PEDV中和抗体，抗体水平不低于1:16，非免疫对照组中和抗体效价均不高于1:4(表7)。攻毒结果表明5/5的免疫仔猪获得保护，而对 照组仔猪在攻毒后第5天至第8天全部发病，持续3～4天逐渐恢复正常(表7)。在母猪分娩后3～5日测定
表7仔猪PEDV中和抗体检测与攻毒结果
Figure BDA0000974069270000091
仔猪PEDV母源抗体，结果除2批疫苗免疫组有1头仔猪PEDV中和抗体略低于1:16(1:10)，免疫组其它仔猪PEDV中和抗体均达到1:16以上，且不同批次疫苗免疫后试验猪PEDV中和抗体水平无明显差异，而对照母猪所产仔猪的中和抗体效价均不高于1:4(表8)。在仔猪3～5日龄时，对免疫组和对照组各5头口服PEDV AJ1102株攻毒，结果3批疫苗免疫组均至少保护4/5的仔猪不发病，而对照组仔猪攻毒后全部发病(表8)。
表8母猪所产仔猪PEDV中和抗体检测与攻毒结果
Figure BDA0000974069270000092
由此说明本发明弱毒株PEDV AJ1102-R株对猪流行性腹泻病毒具有良好的免疫保护率。
Figure IDA0000974069380000011
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Figure IDA0000974069380000171

Claims (5)

1.一株猪流行性腹泻病毒AJ1102-R株，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:V201433。
2.如权利要求1所述的猪流行性腹泻病毒AJ1102-R株，其特征在于，该毒株的全基因组序列如SEQ ID NO：3所示，其3’UTR序列如SEQ ID NO：1所示；在SEQ ID NO：1所示的第71～72位碱基发生突变，缺失了2个碱基即缺失碱基TT；该毒株的S基因序列如SEQ ID NO：2所示，在SEQ ID NO：2所示的3805～3816位碱基发生突变，添加了12个碱基，即GATGCTATTGTT。
3.权利要求1或2所述猪流行性腹泻病毒AJ1102-R株在制备猪流行性腹泻疫苗中的应用。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的猪流行性腹泻疫苗选自单苗或联苗。
5.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的猪流行性腹泻疫苗选自活疫苗或者灭活疫苗。
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