CN104788561B

CN104788561B - 抗猪传染性胃肠炎病毒与猪流行性腹泻病毒卵黄抗体及其制备方法

Info

Publication number: CN104788561B
Application number: CN201410022975.4A
Authority: CN
Inventors: 侯艳红; 王贵华; 赵亚荣; 刘明明; 满坤; 于萍萍; 卢会英
Original assignee: Beijing Kemufeng Biological Pharmaceutical Co ltd; Fuzhou Da Bei Nong Biotech Co ltd; ANIMAL MEDICINE RESEARCH CENTER OF BEIJING DABEINONG SCIENCE & TECHNOLOGY GROUP; Beijing Dabeinong Technology Group Co Ltd
Current assignee: ANIMAL MEDICINE RESEARCH CENTER OF BEIJING DABEINONG SCIENCE & TECHNOLOGY GROUP; Beijing Biomedical Technology Center Of Zhaofenghua Biotechnology Nanjing Co ltd; Beijing Kemufeng Biological Pharmaceutical Co ltd; Zhaofenghua Biotechnology Fuzhou Co ltd; Zhaofenghua Biotechnology Nanjing Co ltd; Beijing Dabeinong Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2014-01-17
Filing date: 2014-01-17
Publication date: 2019-07-16
Anticipated expiration: 2034-01-17
Also published as: CN104788561A

Abstract

本发明公开了抗猪传染性胃肠炎病毒与猪流行性腹泻病毒卵黄抗体，其以猪传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒的二联灭活疫苗为免疫原，免疫产蛋鸡，再从卵黄中纯化出卵黄抗体而成，其中，所述的猪传染性胃肠炎病毒为猪传染性胃肠炎病毒HB08株，其保藏号为CGMCC No.7807，所述的猪流行性腹泻病毒为猪流行性腹泻病毒ZJ08株，保藏号CGMCC No.7806。本发明制备的卵黄抗体性状良好，安全，本发明制备的卵黄抗体人工感染治愈率达100%，明显高于经典毒株制备的卵黄抗体治愈率，临床病例治愈率93.0%，临床预防试验中可使试验猪的腹泻发生率降低17~24个百分点。

Description

抗猪传染性胃肠炎病毒与猪流行性腹泻病毒卵黄抗体及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种卵黄抗体的制备方法，具体是一种治疗猪传染性胃肠炎病毒与猪流行性腹泻病毒卵黄抗体的制备方法。

背景技术

猪传染性胃肠炎（porcine transmissible gastroenteritis, TGE）和猪流行性腹泻（porcine epidemic diarrhoea, PED）是引起猪腹泻的两种重要接触性病毒性肠道传染病，均以呕吐、严重水样腹泻、脱水和对2周龄以内仔猪的高度致死率为特征。目前尚无有效的治疗方法。临床上经常有猪传染性胃肠炎和猪流行性腹泻感染发生的报道，严重制约养殖业的顺利发展。

卵黄抗体与初乳中母源抗体的作用机理相似，都是以被动免疫的方式使仔猪获得免疫力，达到保护仔猪的目的。因而研制抗猪传染性胃肠炎和猪流行性腹泻卵黄抗体，用于猪传染性胃肠炎和猪流行性腹泻的防制具有重要意义。

曾有抗猪传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒卵黄抗体制备的报道，但是随着临床流行毒株的变异，原有卵黄抗体保护性越来越差。本试验以临床上新近分离的猪传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒流行毒株为免疫抗原，免疫产蛋鸡，收集高效价卵黄，并对制备的卵黄抗体的治疗效果进行了研究，从而为防制猪传染性胃肠炎和猪流行性腹泻，提供一种成本低、治疗效果好、易于生产且无环境污染的生物制品。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供一种猪传染性胃肠炎病毒与猪流行性腹泻病毒卵黄抗体的制备制备方法。

本发明提供的抗猪传染性胃肠炎病毒与猪流行性腹泻病毒卵黄抗体，其为以猪传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒的二联灭活疫苗为免疫原，免疫产蛋鸡，再从卵黄中纯化出卵黄抗体而成，其中，所述的猪传染性胃肠炎病毒为猪传染性胃肠炎病毒HB08株，其保藏号为CGMCC No. 7807，所述的猪流行性腹泻病毒为猪流行性腹泻病毒ZJ08株，保藏号CGMCC No.7806。

其中，所述的二联灭活疫苗为弗氏完全佐剂疫苗或弗氏不完全佐剂疫苗。

本发明提供的猪传染性胃肠炎病毒与猪流行性腹泻病毒卵黄抗体的制备方法，包括如下步骤：

1）制备猪传染性胃肠炎病毒TGEV和猪流行性腹泻病毒PEDV二联灭活疫苗：将猪传染性胃肠炎病毒HB08株和猪流行性腹泻病毒ZJ08株病毒液等病毒量混合，加入0.2~0.5%的甲醛，置于35℃~37℃恒温培养箱24h~36h进行灭活，加入等量的弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂制备成猪传染性胃肠炎和猪流行性腹泻二联弗氏完全佐剂疫苗或弗氏不完全佐剂疫苗；

2）动物免疫：免疫方式均为胸部肌肉分点注射，共免疫五次。首免、二免、三免均间隔两周，三免后一个月四免，四免后两周五免。首次免疫lml TGEV-PEDV 二联弗氏完全佐剂疫苗，二免、三免和四免均接种TGEV-PEDV 二联弗氏不完全佐剂疫苗，剂量分别为分别为2ml 、4ml和2ml，五免接种2ml TGEV-PEDV 二联病毒液，

3）抗体效价测定：第五次免疫后１周开始每隔7日收集高免蛋，并利用琼脂扩散试验检测高免卵黄抗体效价，待卵黄抗体效价达到1:64时收集卵黄；

4）卵黄抗体的纯化：无菌条件下收集卵黄，先后加入2倍体积的PBS缓冲液（0.01M，pH7.2）和1/2 体积氯仿充分振荡，离心后收集上清液，先后用50% 和35% 硫酸铵沉淀卵黄抗体，最后溶于与原卵黄量等体积的PBS缓冲液中，4℃透析24小时, 即为提纯卵黄抗体。

在本发明一个实施方案中，将猪流行性腹泻病毒ZJ08株与细胞维持液按1:50~1:100的比例接种到已长满单层的ST细胞上，将猪传染性胃肠炎病毒HB08株与细胞维持液按1:50~1:100的比例接种到已长满单层的Vero E6细胞上，两种病毒均置于35℃~38℃培养，待80%细胞出现病变时收获病毒，病毒量为≥10^7.0TCID₅₀/ml。

本发明的PEDV ZJ08株是申请人从浙江一发病猪场分离到的强毒株经过105代致弱后获得的猪流行性腹泻病毒弱毒株，是目前国内的PEDV流行株，该疫苗株毒力稳定，安全，免疫原性好，能够抵抗目前临床上流行的强毒株的攻击，保护率达90%以上。

将分离到的PEDV 105-145代PEDV致弱株命名为猪流行性腹泻病毒ZJ08株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址是：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号是CGMCC No. 7806，保藏时间是2013年6月28日。

本发明的TGEV HB08株是申请人从河北一发病猪场分离到的强毒株经过125代致弱后获得的TGEV 弱毒株，是目前国内的TGEV流行株，该疫苗株毒力稳定，安全，免疫原性好，能够抵抗目前临床上流行的强毒株的攻击，保护率达90%以上。

将分离到的TGEV 125-165代TGEV致弱株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址是：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号是CGMCC No. 7807，保藏时间是2013年6月28日。

本发明还提供所述的卵黄抗体在制备治疗猪传染性胃肠炎病毒和/或猪流行性腹泻病毒感染引起的疾病的药物中的应用。

本发明成功试制出了猪传染性胃肠炎病毒与猪流行性腹泻病毒卵黄抗体，其物理性状良好，无细菌生长，纯化的抗体效价达1:128。人工感染治疗试验结果表明，本发明制备的卵黄抗体治愈率达100%，明显高于经典毒株制备的卵黄抗体治愈率；临床治疗试验治愈率为93.0％，比经典毒株制备的卵黄抗体治愈率高6个百分点；临床预防试验中，与对照组相比，本发明可使试验猪的腹泻发生率降低17~24个百分点，而经典毒株制备的卵黄抗体仅可使试验猪的腹泻发生率降低9~12个百分点。

附图说明

图1为PEDV CPE图片（400×）。

图2为PEDV 分离毒S基因PCR检测结果。图中，1: 样品；2: 阴性对照；M: DNAMarker DL2000。

图3为PEDV 分离毒M基因PCR检测结果。图中，1: 样品；2: 阴性对照；M: DNAMarker DL2000。

图4为PEDV 分离毒M基因系统进化分析结果。

图5为PEDV 分离毒ORF3基因PCR检测结果。图中，1: 样品；2: 阴性对照；M: DNAMarker DL2000。

图6为不同代次PEDV ORF3 序列比对结果。

图7为TGEV CPE图片（400×）。

图8为TGEV分离毒S基因PCR检测结果。图中，M：DNA Marker DL2000；1：样品；2：阴性对照。

图9为不同代次TGEV ORF3 序列比对结果。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1 猪流行性腹泻病毒ZJ08株病毒液的制备

取浙江某猪场猪流行性腹泻阳性小肠适量，刮取肠粘膜和内容物，按照1:5的比例（重量:体积）加入PBS，反复冻融3次，离心取上清，0.22μm滤膜过滤，滤液中加入终浓度为20μg/ml的胰酶，37℃处理1.5小时。

按常规方法接种长满单层的Vero细胞，按照10%的比例接种病毒，37℃吸附1小时，补足细胞维持液（含10µg/ml的胰酶），37℃温箱培养。传至第17代时则出现明显、稳定的CPE变化，细胞圆缩，颗粒增加，聚堆呈葡萄串样，细胞出现损伤和脱落（图1）。

根据S基因设计检测引物对：正向引物为5’-GGATACTTTGGCCTCTTGTG-3’；反向引物为5’-CGCACTCGGATTACTCACAGC -3’， 95℃预变性5min，95℃ 45s 、50℃ 1min、72℃ 2min进行32个循环后，72℃5min延伸。PEDV扩增片段为484bp。结果见图2。

根据GenBank中PEDV的基因序列设计扩增M基因序列的引物：

PEDV-M-F: GTCTTACATGCGAATTGACC

PEDV-M-R: GGCATAGAGAGATAATGGCA

扩增的M基因片段的大小为：808 bp，结果见图3，序列如SEQ ID No.5所示。

结果表明， PEDV（ZJ08株）与经典参考株如英国CV777株、比利时Brl/87株、韩国KPD-9F株和日本JMe2株等相比，不在一个进化分支上，已经发生了明显的变异（图4），为国内新发现的流行株。

扩增ORF3序列的引物为：

ORF3-F: TCCTAGACTTCAACCTTACG

ORF3-R: GGTGACAAGTGAAGCACAGA

扩增的ORF3的片段的大小为：833 bp（图5）。

将猪流行性腹泻病毒在Vero细胞上连续传代100代，并在此过程进行了克隆纯化，然后继续在Vero细胞上传代至145代。将第145代病毒进行RT-PCR检测，扩增S基因片段为484bp。PEDV ZJ08株ORF3基因序列在第105代开始ORF3基因突然出现49个核苷酸的缺失，第105代、125代、145代保持稳定缺失49个核苷酸（图6），序列如SEQ ID No.6所示。

按现行《中国兽药典》附录对第105~145代病毒进行无菌、支原体及外源病毒检验，结果无细菌，霉菌，支原体及外源病毒污染。

将分离致弱的105~145代致弱株种毒命名为PEDV ZJ08株，其微生物保藏号是CGMCC No. 7806；保藏时间是2013年6月28日；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址是：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

取PEDV ZJ08株第125代与细胞维持液按1:50的比例接种到已长满单层的Vero细胞上，置于37℃培养，待80%细胞出现病变时收获病毒，测定毒价，病毒含量为10^7.5TCID₅₀/ml，-20℃保存备用

实施例2 猪传染性胃肠炎病毒HB08株病毒液的制备

取河北某猪场猪传染性胃肠炎阳性小肠适量，刮取肠粘膜和内容物，按照1:5的比例（重量:体积）加入PBS，反复冻融3次，离心取上清，0.22μm滤膜过滤，滤液中加入终浓度为20μg/ml的胰酶，37℃处理1.5小时。

按常规方法接种长满单层的ST细胞，按照10%的比例接种病毒，37℃吸附1小时，补足细胞维持液（含10µg/ml的胰酶），37℃温箱培养。如此操作盲传至第8代时细胞出现轻微的CPE变化，传至第17代时则出现明显、稳定的CPE变化，细胞圆缩，颗粒增加，聚堆呈葡萄串样，细胞出现损伤和脱落（图7）。

参考行业标准SN/T1446-2010中反转录聚合酶链式反应方法进行（SOP）。即根据S基因设计检测引物对：S-F:5’-TATTTGTGGTYTTGGTYGTAATGC-3’；S-R: 5’-GGCTGTTTGGTAACTAATTTRCCA-3’，以95℃45S、50℃45S、72℃1min进行32个循环后，72℃延伸5min。扩增S基因片段为886bp，结果见图8。

将猪传染性胃肠炎病毒在ST细胞上连续传代120代，并在此过程进行了克隆纯化，然后继续在ST细胞上传代至165代。TGEV ORF3基因序列在第20代、40代、70代、100代处于比较稳定的的状态，有个别碱基的变化，但没有改变氨基酸；而第125代开始ORF3基因连同前面的间隔区序列出现81个核苷酸的缺失（起始密码子前30个核苷酸、后51个核苷酸连续81个核苷酸缺失），第125代、145代、165代稳定缺失81个核苷酸，结果如图9，序列如SEQ IDNo.11所示。扩增ORF3序列的引物的引物为：

ORF3-F:AATTGAAAAAGTGCACGTCC-3’

ORF3-R:CAACAGGAACCAGAAAAATGA-3’

按现行《中国兽药典》附录对第125~165代病毒进行无菌、支原体及外源病毒检验，结果无细菌，霉菌，支原体及外源病毒污染。将125~165代致弱株种毒命名为猪传染性胃肠炎病毒HB08株，其保藏编号是CGMCC No. 7807；保藏时间是2013年6月28日；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址是：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

取TGEV HB08株第145代与细胞维持液按1:100的比例接种到已长满单层的ST细胞上，置于37℃培养，待80%细胞出现病变时收获病毒，测定毒价，病毒含量为10⁸TCID₅₀/ml，-20℃保存备用。

实施例3 TGEV-PEDV 二联灭活疫苗制备

TGEV-PEDV 二联弗氏完全佐剂疫苗：取上述TGEV和PEDV 病毒液，等病毒量混合，加入0.3%的甲醛，置于37℃恒温培养箱24h进行灭活，期间摇动数次，加入等量的弗氏完全佐剂，用玻璃注射器进行乳化，制备成首免灭活疫苗，4℃保存备用。

TGEV-PEDV 二联弗氏不完全佐剂疫苗：取上述TGEV和PEDV 病毒液，等病毒量混合，采用同样方式灭活后加入等量弗氏不完全佐剂，乳化，制备好的疫苗于4℃保存备用。

实施例4 卵黄抗体制备

1）免疫程序

免疫方式均为胸部肌肉分点注射，共免疫五次。首免、二免、三免均间隔两周，三免后一个月四免，四免后两周五免。首次免疫lml TGEV-PEDV 二联弗氏完全佐剂疫苗，二免、三免和四免均接种TGEV-PEDV 二联弗氏不完全佐剂疫苗，剂量分别为分别为2ml 、4ml和2ml，五免接种2ml TGEV-PEDV 二联病毒液。

2）抗体效价测定

第五次免疫后１周开始每隔7日收集高免蛋，并利用琼脂扩散试验检测高免卵黄抗体效价，待卵黄抗体效价≥1:64时收集卵黄。结果第五次免疫后2周，卵黄抗体效价逐渐上升，第五次免疫后4周达到高峰，抗体效价为1:512，并维持8周以上。

3）卵黄抗体的纯化

无菌条件下收集卵黄，先后加入2倍体积的PBS缓冲液（0.01M，pH7.2）和1/2 体积氯仿充分振荡，离心后收集上清液，先后用50% 和35 % 硫酸铵沉淀卵黄抗体，最后溶于与原卵黄量等体积的PBS缓冲液中，4℃透析24小时, 即为提纯卵黄抗体。

4）纯化卵黄抗体浓度和效价的测定

利用蛋白质定量试剂盒，采用微量法测定纯化抗体的浓度，并采用琼脂扩散试验检测纯化卵黄抗体的效价。卵黄经氯仿去脂后，再经硫酸铵盐析法纯化，测定纯化抗体的浓度为8.86mg/ml。纯化的抗体效价为1:128。

5）微生物学检测

将上述纯化的卵黄抗体按照《中国兽药典》进行微生物学检测，观察有无细菌生长。结果无细菌生长。

实施例5 安全性检验

取健康小鼠20只，随机均分为２组，一组为试验组，灌服纯化的卵黄抗体1ml，另一组为对照组，灌服生理盐水1ml，连续观察72h后剖检小鼠，观察心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏等器官及消化道有无病理变化。

结果试验组和对照组小鼠均未呈现异常症状，72h后对20只小鼠进行剖检，与对照组相比，试验组小鼠肝脏、脾脏、心脏、肺脏、肾脏及消化道均未呈现任何病理变化，说明所制备的卵黄抗体安全性较好。

实施例6 人工感染治疗试验

将30头刚出生未吃初乳的仔猪随机分成3组，每组10头，第１组第2组为试验组，即卵黄抗体治疗组；第3组为空白对照组，即未进行治疗组。各组仔猪以传染性胃肠炎病毒强毒pl株（甘肃省畜牧兽医研究所提供第5代组织强毒）和流行性腹泻病毒强毒p55株（福建省农科院提供第4代组织强毒）混合液攻毒（口服2ml），两种病毒含量均达到1000×MID/ml。当仔猪开始出现腹泻症状时，试验1组仔猪口服本发明提纯的卵黄抗体，每次2ml，每天2次；试验2组仔猪口服由TGEV华毒弱毒株（H）+PEDV 弱毒疫苗株CV777二联病毒（病毒由哈尔滨兽医研究所赠送）制备的卵黄抗体（简称经典卵黄抗体），每次2ml（卵黄抗体含量与试验1组相同），每天2次；空白对照组肌肉注射生理盐水2ml。观察治疗效果，统计发病及死亡情况。

攻毒后12~24h，所有仔猪均出现腹泻症状，试验1组在口服本发明卵黄抗体后腹泻症状逐渐减轻，4~5日后全部恢复正常；试验2组在口服经典卵黄抗体后腹泻症状虽逐渐减轻，但第二日即有两头猪死亡， 5日后70%恢复正常；未采取治疗措施的空白对照组则全部死亡，死亡率为100%，结果见表1，从表中可以看出本发明制备的卵黄抗体治愈率要高于经典毒株制备的卵黄抗体。

表1 仔猪攻毒治疗后不同天数死亡情况

组别

1日

2日

3日

4日

5日

死亡率

试验1组

10/10

7/10

2/10

0/10

0%

试验2组

10/10

8/8

7/8

3/7

0/7

30%

对照组

10/10

5/5

1/1

0

100%

注：分子为腹泻仔猪数，分母为存活仔猪数。

实施例7 临床应用实验

一、临床治疗试验

对临床上疑似猪传染性胃肠炎和猪流行性腹泻感染的病猪，取粪便经猪传染性胃肠炎和猪流行性腹泻胶体金免疫试剂盒检测为阳性的病例，每头每次口服本发明制备的卵黄抗体2ml，每天２次，轻症病猪口服1~3日，重症的病猪可再口服2日，同时注射抗生素辅助治疗，本试验共治疗病猪100例，命名为试验1组。另采用同样的方式选择猪传染性胃肠炎和猪流行性腹泻阳性的病例100例，每头每次口服实施例6中制备的经典卵黄抗体2ml，每天２次，轻症病猪口服1~3日，重症的病猪可再口服2日，同时注射抗生素辅助治疗，该组命名为试验2组。记录两个试验组猪的发病时间，投药时间，口服卵黄抗体后的治愈情况及死亡情况。

试验1组治疗结果如表2所示，100例病猪中，治愈93例，治愈率为93.0％。从表中可以看出，早期病猪使用卵黄抗体治疗效果较好，随病程延长，治愈率逐渐降低。

试验2组治疗结果如表3所示， 100例病猪中，治愈87例，治愈率为87.0％（表２）。比本发明制备的卵黄抗体治愈率低6个百分点。

表2 本发明卵黄抗体临床治疗结果

表3 经典卵黄抗体临床治疗结果

二、临床预防试验

2012年在福建武夷山某猪场将本发明制备的卵黄抗体和经典卵黄抗体分别添加在水中，检验卵黄抗体对猪腹泻的预防效果，同时比较两种卵黄抗体的作用。试验选择刚刚断奶仔猪，设3组，每组40头，第1组服用本发明卵黄抗体，第2组服用经典卵黄抗体，第3组为空白对照组，每头服用2ml，每天1次。试验均在机体产生饥渴的情况下进行，以保证足够的产品进入猪体，持续两周，统计发生腹泻猪的数量；同年，在福建漳州市某猪场也进行了相同试验。

结果显示：武夷山市某猪场应用本发明制备的卵黄抗体的试验组腹泻发生率为2%，应用经典卵黄抗体试验组腹泻发生率为10%，对照组腹泻发生率为19%，试验1组发病率比对照组降低了17个百分点，比试验2组降低了8个百分点；漳州市某猪场试验1组腹泻发生率为7%，试验2组腹泻发生率为19%，对照组腹泻发生率为31%，试验1组比对照组降低了24个百分点，比试验2组降低了12个百分点。

结果证实了本发明制备的卵黄抗体在临床的应用效果要好于经典卵黄抗体。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 北京大北农科技集团股份有限公司动物医学研究中心

福州大北农生物技术有限公司

北京科牧丰生物制药有限公司

北京大北农科技集团股份有限公司

<120> 抗猪传染性胃肠炎病毒与猪流行性腹泻病毒卵黄抗体及其制备方法

<130>

<160> 11

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ggatactttg gcctcttgtg 20

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

cgcactcgga ttactcacag c 21

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gtcttacatg cgaattgacc 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ggcatagaga gataatggca 20

<210> 5

<211> 681

<212> DNA

<213> PEDV M基因

<400> 5

atgtctaacg gttttattcc cgttgatgag gtgattgaac accttagaaa ctggaatttc 60

acatggaata tcatactgac gatactactt gtagtgcttc agtatggcca ttacaagtac 120

tctgtgttct tgtatggtgt caagatggct attctatgga tactttggcc tcttgtgttg 180

gcactgtcac tttttgatgc atgggctagc ttccaggtca actgggtctt tttcgctttc 240

agcatcctta tggcttgcat cactcttatg ctgtggataa tgtattttgt caatagcatt 300

cggttgtggc gcaggacaca ttcttggtgg tctttcaatc ctgaaactga cgcgcttctc 360

actacttctg tgatgggccg acaggtctgc attccagtgc ttggagcacc aactggtgta 420

acgctaacac tccttagtgg tacattgttt gtagagggct ataaggttgc tactggcgta 480

caggtaagtc aattgcctga tttcgtcaca gtcgccaagg ccactacaac aattgtctat 540

ggacgtgttg gtcgttcagt caatgcttca tctggcactg gttgggcttt ctatgtccgg 600

tcaaaacacg gcgactactc agctgtgagt aatccgagtg cggttctcac agatagtgag 660

aaagtgcttc atttagtcta a 681

<210> 6

<211> 626

<212> DNA

<213> PEDV ZJ08 ORF3

<400> 6

atgtttcttg gactttttca atacacgatt gacacagttg tcaaagatgt ctcaaagtct 60

gctaacttgt ctttggatgc tgtccaagag ttggagctca atgtagttcc aattagacaa 120

gcttcaaatg tgacgggttt tcttttcacc agtgttttta tctacttctt tgcactgttt 180

aaagcgtctt ctttgaggcg caattatatt atgttggcag cgcgttttgc tgtcattgtt 240

ctttttgttg cacacttatt ggcaggcttt gtttagtctg cttttactcc tggcgctata 300

aaaatgcgct ctttattatc tttaatacta cgacactttc tttcctcaat ggtaaagcag 360

cttattatga cggcaaatcc attgtgattt tagaaggtgg tgaccattac atcacttttg 420

gcaactcttt tgttgctttc gttagtagca ttgacttgta tctagctata cgtgggcggc 480

aagaagccga cctacagctg ttgcgaactg ttgagcttct tgatggcaag aagctttatg 540

tcttttcgca acatcaaatt gttggcatta ctaatgctgc atttgactca attcaactag 600

acgagtatgc tacaattagt gaatga 626

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

tatttgtggt yttggtygta atgc 24

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

ggctgtttgg taactaattt rcca 24

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

aattgaaaaa gtgcacgtcc 20

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

caacaggaac cagaaaaatg a 21

<210> 11

<211> 1121

<212> DNA

<213> TGEV ORF3

<400> 11

attgaaaaag tgcacgtcca ttaaatttaa aatgttaatt ttattatctg ctataatagc 60

atttgttgtt aaggatgatg aataaagtcc ttaagacttg attgtgcata ctttgctgta 120

actcttaaag tagaatttaa gactggtaaa ttacttgtgt gtataggttt tggtgacaca 180

cttcttgcgg ctagggataa agcatatgct aagcttggtc tctccattat tgaagaagta 240

aacacacaaa atccaaagca ttaagtgtta caaaacaatt aaagagagat tatagaaaaa 300

ctgtcattct aaacttcatg cgaaaatgat tggtggactt tttcttaata ctctgagttt 360

tgtaattgtt agtaaccatt ctattgttaa taacacagca aatgtgcatc atataaaaca 420

agaacgtgtt atagtacaac agcatcaggt tgttagtgct agaacacaaa attattaccc 480

agagttcagc atcgctgtac tttttgtatc ttttctagct ttgtaccgta gtacaaactt 540

taagacgtgt gtcggcatct taatgtttaa gattttatca atgacacttt taggacctat 600

gcttatagca tatggttact acattgatgg cattgttaca acaactgtct tatctttaag 660

atttgcctac ttagcatact tttggtatgt taatagtagg tttgaattta ttttatacaa 720

tacaacgaca ctcatgtttg tacatggcag agctgcaccg tttaagagaa gttctcacag 780

ctctatttat gtcacattgt atggtggcat aaattatatg tttgtgaatg acctcacgtt 840

gcattttgta gaccctatgc ttgtaagcat agcaatacgt ggcttagctc atgctgatct 900

aactgtagtt agagcagttg aacttctcaa tggtgatttt atttatgtat tttcacagga 960

gcccgtagtc ggtgtttaca atgcagcctt ttctcaggcg gttctaaacg aaattgactt 1020

aaaagaagaa gaagaagacc gtacctatga cgtttcctag ggcattgact gtcatagatg 1080

acactggaat ggtcattagc atcattttct gggtcctgtt g 1121

Claims

1.抗猪传染性胃肠炎病毒与猪流行性腹泻病毒卵黄抗体，其特征在于，以猪传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒的二联灭活疫苗为免疫原，免疫产蛋鸡，再从卵黄中纯化出卵黄抗体而成，其中，所述的猪传染性胃肠炎病毒为猪传染性胃肠炎病毒HB08株，其保藏号为CGMCC No. 7807，所述的猪流行性腹泻病毒为猪流行性腹泻病毒ZJ08株，保藏号CGMCCNo.7806。

2.如权利要求1所述的卵黄抗体，其特征在于，所述的二联灭活疫苗为弗氏完全佐剂疫苗或弗氏不完全佐剂疫苗。

3.权利要求1或2所述的卵黄抗体的制备方法，其包括如下步骤：

2）动物免疫：免疫方式均为胸部肌肉分点注射，共免疫五次，首免、二免、三免均间隔两周，三免后一个月四免，四免后两周五免，首次免疫lml TGEV-PEDV 二联弗氏完全佐剂疫苗，二免、三免和四免均接种TGEV-PEDV 二联弗氏不完全佐剂疫苗，剂量分别为2ml 、4ml和2ml，五免接种2ml TGEV-PEDV 二联病毒液；

2）抗体效价测定：第五次免疫后1周开始每隔7日收集高免蛋，并利用琼脂扩散试验检测高免卵黄抗体效价，待卵黄抗体效价达到1:64时收集卵黄；

3）卵黄抗体的纯化：无菌条件下收集卵黄，先后加入2倍体积的0.01M，pH7.2的PBS缓冲液和1/2 体积氯仿充分振荡，离心后收集上清液，先后用50% 和35% 硫酸铵沉淀卵黄抗体，最后溶于与原卵黄量等体积的PBS缓冲液中，4℃透析24小时, 即为提纯卵黄抗体。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，将猪流行性腹泻病毒ZJ08株与细胞维持液按1:50~1:100的比例接种到已长满单层的ST细胞上，将猪传染性胃肠炎病毒HB08株与细胞维持液按1:50~1:100的比例接种到已长满单层的Vero E6细胞上，两种病毒均置于35℃~38℃培养，待80%细胞出现病变时收获病毒，病毒量为≥10^7.0TCID₅₀/ml。

5.权利要求1或2所述的卵黄抗体在制备治疗猪传染性胃肠炎病毒和/或猪流行性腹泻病毒感染引起的疾病的药物中的应用。