CN104513827B - 一种猪流行性腹泻病毒株、其弱毒疫苗株及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种猪流行性腹泻病毒株（HN1301）以及由该猪流行性腹泻病毒传代致弱的弱毒株（HN1302），该猪流行性腹泻病毒弱毒株微生物保藏号为CCTCC‑V201342。该弱毒疫苗株HN1302具有安全性好、免疫保护能力强、免疫效力高等优点。

Description

一种猪流行性腹泻病毒株、其弱毒疫苗株及应用

技术领域

本发明涉及一种猪流行性腹泻病毒强毒株HN1301、由该强毒株HN1301传代致弱的弱毒疫苗株HN1302，本发明还涉及由该猪流行性腹泻病毒弱毒株HN1302制备的疫苗组合物以及该疫苗组合物的制备方法和应用，属于生物医药领域。

背景技术

猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea,PED)是由猪流行性腹泻病毒(PEDV)引起的一种以腹泻、呕吐和脱水为主要特征的猪肠道传染病。各种年龄的猪都易感,哺乳仔猪、架子猪或育肥猪的发病率可达100%,尤其哺乳仔猪受害最严重。此病毒感染已经成为猪养殖产业发展中的一个严重问题，此病已经在全球许多国家爆发并造成了严重的经济损失。本病主要发生在冬季,夏季也可发生。我国以12月至次年2月为高发季节。PEDV为冠状病毒科(Coronviridae)冠状病毒属(Coronavirus)成员。PEDV基因组是单股正链具有感染性的RNA，全长27000～33000个核苷酸（nt），分子量为6×10⁶～8×10⁶。目前已测定了PEDVCV777株完整的基因组序列，基因组全长为28033nt。与其他冠状病毒相似，PEDV基因组5′端有一个帽子结构（cap），3′端有一个Poly(A)尾。PEDV的结构蛋白与其它冠状病毒也相似,主要有糖基化纤突蛋白即S蛋白、基化囊膜蛋白即M蛋白和RNA结合的未糖基化核衣壳蛋白即N蛋白。S蛋白在受体细胞结合吸附、膜融合等方面发挥重要作用，也是诱导机体产生保护性中和抗体的主要免疫蛋白，S蛋白的变异会改变PEDV毒株的免疫原性，从而导致现有疫苗的失效。

众所周知，病毒的基因组在其增殖过程中不是一成不变的，随时可能发生变异。近几年的一些研究表明：冠状病毒S基因的变化更能够体现病毒的变异情况，通过对各地方分离的PEDV毒株的序列分析表明，PEDV毒株S基因有部分的插入、缺失和突变；同时与现用疫苗株相比，目前流行的PEDV毒株S蛋白的抗原位点糖基化位点和跨膜螺旋均有明显改变，这提示PEDV在近年呈现快速变异和进化的趋势。通过对S基因不同功能区域的研究发现，S1区域包括了S蛋白的中和表位和受体结合域，组成了暴露在PEDV病毒粒子表面的球形胞外功能区。当PEDV感染易感动物时，S1区域激活宿主的免疫系统，不同的淋巴细胞产生针对S蛋白的特异性抗体。因此，S1蛋白在病毒感染过程中起到决定性的作用。已有文献研究表明，S1蛋白可以利用分子克隆的方法进行原核和真核表达，这为我们进一步研究提供了技术支持。

采用疫苗进行免疫预防是国内外控制猪流行性腹泻的根本手段，而市场销售的商品疫苗主要是猪流行性腹泻-猪传染性胃肠炎二联灭活苗/活苗，以及猪流行性腹泻-猪传染性胃肠炎-猪轮状病毒三联灭活苗/活苗，这些疫苗的应用对猪流行性腹泻起到了一定的预防作用。如公开号为CN101117627A的专利公开了一种猪流行性腹泻病毒弱毒疫苗株及其应用，该弱毒疫苗株与PEDV CV777株ORF3的序列同源性为97.9%，从ORF3序列的ATG开始的第245位到293位一共缺失了49个核苷酸；与PEDV Brl/87株ORF3的序列同源性为97.8%，从ORF3序列的ATG开始的第245位到293位一共缺失了49个核苷酸。此外，公开号为CN102949718A的专利公开了一种猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻和猪轮状病毒的三联疫苗、公开号为CN103041385A的专利公开了一种猪传染性胃肠炎、流行性腹泻二联活疫苗及其制备方法。

但由于目前流行的猪流行性腹泻病毒株的S基因的变异，现有的疫苗不足以对目前流行毒株产生全面的免疫保护，从而导致疫苗的免疫效果不太理想，猪流行性腹泻在中国乃至全球一些国家和地区持续爆发。因此，需要发明一种猪流行性腹泻病毒株及免疫原性物质和疫苗来解决上述问题，而且该猪流行性腹泻病毒株应该具有所有S基因突变株的共同特征，才能够在更广泛的范围内对该病起到有效的预见性防治。

发明内容

本发明提供了一种S1基因，所述S1基因实质上含有编码序列表中SEQ.NO.2所述的蛋白的核苷酸序列。

本发明提供了一种S1基因，所述S1基因实质上含有序列表中SEQ.NO.1所述的核苷酸序列。

本发明另一目的在于提供一种猪流行性腹泻病毒株，该毒株是目前猪流行性腹泻病毒的流行毒株。所述猪流行性腹泻病毒株含有编码序列表中SEQ.NO.2所述的蛋白的核苷酸序列。

该猪流行性腹泻病毒株具体获得方法如下：通过对不同地区所采集的临床病料中病毒的分离培养，得到十几株猪流行性腹泻病毒株，对这十几株病毒的S、M和ORF3基因进行RT-PCR扩增、克隆及测序，并对其序列变化、遗传进化关系、抗原位点、糖基化位点和多肽极性进行分析。这十几株分离株与其他文献报道的分离株对比结果表明，其中1株有明显的差异。该猪流行行腹泻病毒株的S基因与现在的分离株比对结果显示：（1）与疫苗株CV777相比，该毒株S基因N'端存在15个碱基的插入和7个碱基的缺失，而且存在174个核苷酸的突变；（2）遗传进化分析显示，该PEDV毒株与2007～2009年韩国毒株、2007～2008年泰国毒株、2009～2010年越南毒株、2011年日本毒株及2010～2012年中国其它地区流行毒株亲缘关系均较密切，而与欧洲株（CV777、Brl/87）、中国现用疫苗株（CV777）及2003～2007年中国分离株（LJB/03、JS-2004-2、DX、QH、LZC）亲缘关系均较远；（3）与现用疫苗株（CV777）相比，该毒株S蛋白的抗原位点、糖基化位点和跨膜螺旋均有明显改变。这些结果分析表明，该分离株有可能是目前的主要流行毒株。

将该猪流行性腹泻病毒株命名为猪流行性腹泻病毒HN1301株（Porcine epidemicdiarrhea virus，strain HN1301），保藏号为CCTCC NO.V201341；保藏于中国典型培养物保藏中心；保藏地址为湖北省武汉武汉大学，保藏日期为2013年9月16日。

根据PEDV核酸序列设计引物，用PCR方法对该HN1301株进行鉴定，结果显示阳性，证明该分离株为猪流行性腹泻病毒株。另外，对该HN1301株利用PCR方法进行外源微生物检测，结果显示PRRSV、CSFV、TGEV、PRV、BVDV、PPV、PCV2和猪轮状病毒均为阴性。

对该猪流行性腹泻病毒株HN1301的毒力测定结果表明：该HN1301株具有较强的毒力,攻毒动物发病情况符合猪流行性腹泻的典型症状，攻毒后发病或病死动物的疾病是由猪流行性腹泻病毒引起的。具体测定方法如下：将该HN1301株接种Vero细胞，按照现有的方法盲传10代后，出现典型的猪流行性腹泻病毒相同的细胞病变。为了证明该分离株HN1301的致病性，分别取第0、6、11代的病毒液，进行动物攻毒试验，观察动物发病情况，比较不同代次病毒液临床症状的差异，同时根据临床症状，从发病或病死动物中分离病毒、接种后进行序列比对。

为了实现上述目的，该分离株HN1301需要进行纯净性检测，以保证没有外源微生物的污染。另外，进行动物试验时所选用的猪均为猪流行性腹泻和猪传染性胃肠炎抗原和抗体阴性猪，并且没有能够影响本试验结果的外源微生物（PRRSV、CSFV、TGEV、PRV、BVDV、PPV、PCV2和猪轮状病毒）。

本发明又一个目的是提供一种由该猪流行性腹泻病毒HN1301株传代致弱的弱毒株。

该弱毒株的制备方法如下：将所述分离株HN1301按照现有技术经过Vero细胞传代致弱，每隔10代，取病毒液进行动物攻毒试验。结果表明，传至第46代时成功致弱。将该第46代弱毒株命名为猪流行性腹泻病毒HN1302株（Porcine epidemic diarrhea virus，strainHN1302），保藏号为CCTCC NO.V201342；保藏于中国典型培养物保藏中心；保藏地址为湖北省武汉武汉大学，保藏日期为2013年9月16日。

对该弱毒株HN1302的稳定性和安全性进行试验，结果表明，该弱毒株是稳定的，其毒力减弱，安全性好，对怀孕母猪、仔猪均安全，无副作用，不会对机体造成危害。

对该弱毒株HN1302的免疫原性和保护效力进行试验，结果表明，该弱毒株具有良好的免疫原性，能够刺激机体快速地产生免疫力，且抗体持续维持在一个较高水平，能够有效地保护强毒的攻击，在激发机体产生良好的免疫保护能力的同时不对机体造成危害。

对HN1302株的基因序列分析表明，其S1基因与HN1301株一样，基因序列没有改变。

本发明还提供一种预防或治疗猪流行性腹泻的疫苗组合物及其制备方法。所述疫苗组合物含有免疫量的猪流行性腹泻病毒株，该猪流行性腹泻病毒株含有编码序列表中SEQ.NO.2所述的蛋白的核苷酸序列。

本发明所用的术语“疫苗组合物”系指含有猪流行性腹泻病毒免疫原性的药物组合物。该药物组合物可诱发、刺激或增强猪只针对猪流行性腹泻病毒的免疫反应。疫苗组合物包括免疫量的猪流行性腹泻病毒株的减毒活疫苗、灭活疫苗、亚单位疫苗、合成疫苗或基因工程疫苗。

本发明所用的术语“活疫苗”指的是以毒力已经减弱但仍可在宿主体内或细胞上复制的病毒制备的疫苗。本发明所用的术语“减毒”用于指以使病原丧失致病性、但保持免疫原性的方式对基因进行突变来人工降低病原体毒性。通常，通过UV辐射、化学处理或体外连续高阶继代培养实现减毒。人工的基因改变，例如将已知序列中的特定核苷酸缺失以使毒力减弱。

本发明所用的术语“灭活疫苗”，也称作失活疫苗，指的是用作抗原以产生免疫力的灭活病毒的混悬液。灭活疫苗的例子包括全病毒疫苗和裂解型疫苗。使用已知方法可以很容易地产生灭活疫苗。例如，通过用甲醛溶液处理病毒可获得全病毒灭活疫苗。裂解型疫苗可在用醚处理后由病毒包膜制备得到。例如用本发明的强毒株HN1301可以通过灭活的方法制备成灭活疫苗。

本发明所用的术语“亚单位疫苗”指的是利用基因工程方法将病原体的保护性抗原基因克隆到原核或真核表达系统中，使其高效表达而制成的疫苗。它比全病毒疫苗引起副反应的可能性小。例如，表达的猪流行性腹泻病病毒的S1蛋白可用于制备亚单位疫苗。

本发明所用的术语“合成肽疫苗”指的是一种仅含免疫决定簇组分的小肽,即用人工方法按天然蛋白质的氨基酸顺序合成保护性短肽,与载体连接后加佐剂所制成的疫苗。优选地，所述疫苗组合物包括免疫量的猪流行性腹泻病毒HN1301株的减毒活疫苗、灭活疫苗、亚单位疫苗、合成疫苗或基因工程疫苗。

优选地，该疫苗组合物包括免疫量的猪流行性腹泻病毒弱毒株HN1302和冻干保护剂。冻干保护剂可以保护生物制品在冻干过程中的稳定性，减少冻干过程对疫苗的生物活性的破坏。冻干保护剂可以为蔗糖、L-谷氨酸钠或水解乳蛋白。

优选地，所述疫苗组合物中病毒含量≥10^7.0TCID₅₀/ml。

该疫苗组合物免疫机体后能够产生较高的中和保护抗体，具有较高的保护效力，从而达到全面保护仔猪和母猪免受猪流行性腹泻的感染、全面有效地防治目前猪流行性腹泻的流行的目的。

上述包括猪流行性腹泻病毒弱毒株HN1302和冻干保护剂的疫苗组合物的具体制备方法为：

1）将长满致密单层的非洲绿猴肾细胞（Vero细胞，购自上海生化所），按维持液量的3%接种本发明弱毒株HN1302，置于37℃、5%CO₂培养箱中静置培养，每天观察CPE，至48～72小时。

2）当细胞出现肿胀、变圆、融合、脱落，细胞融合性病变达80%时收获。反复冻融2次后，冻于-20℃保存，备用。

3）对收获的病毒液进行病毒含量和纯净性检验，病毒含量≥10^7.5TCID₅₀/ml，纯净性检验合格的病毒用于配苗。

4）将检验合格的病毒液按1∶1体积比例与冻干保护剂混合。

此外，本发明的猪流行性腹泻疫苗可与其他失活病原体或抗原组合使用以制备抵抗包括猪流行性腹泻病的各种疾病的联合疫苗或复合疫苗。

本发明所用的术语“联合疫苗”用于指从本发明的猪流行性腹泻病病毒与至少一种不同病毒的病毒混合物制备的疫苗。术语“复合疫苗”指的是从病毒和细菌制备的疫苗。例如，本发明的猪流行性腹泻病毒可与猪轮状病毒、传染性胃肠炎、猪圆环病毒和/或大肠杆菌、支原体混合或组合。

本发明的又一目的在于提供上述疫苗组合物在制备预防和治疗猪流行性腹泻的药物中的应用。

本发明的又一目的还在于提供一种猪流行性腹泻病毒HN1301株S1蛋白及其制备方法。

所述HN1301株S1蛋白实质上含有序列表中SEQ.NO.2所述的氨基酸序列。该HN1301株S1蛋白的制备方法包括如下步骤：

1）克隆HN1301S1基因；

2）制备HN1301-S1-pFastBac I重组质粒；

3）制备重组Bacmid DNA;

4）重组阳性杆粒HN1301-S1-Bacmid转染Sf-9细胞；

5）获得S1蛋白。

对该HN1301株S1蛋白的免疫原性进行试验，结果表明该S1蛋白与全病毒的免疫原性相当，高于CV777。

本发明的又一目的在于提供另外一种预防或治疗猪流行性腹泻的疫苗组合物。该疫苗组合物包括免疫量的HN1301株S1蛋白和佐剂。佐剂可以保护疫苗不受体内破坏和/或非特异性地刺激免疫系统，从而有助于增强对所述疫苗的免疫反应。该疫苗组合物具有较高的免疫原性，能够有效防治猪流行性腹泻的发生。

本发明的又一目的在于提供所述的包括免疫量的HN1301株S1蛋白和佐剂的疫苗组合物在制备预防和治疗猪流行性腹泻的药物中的应用。

本发明所用的术语“免疫原性”指猪流行性腹泻病毒弱毒株或猪流性腹泻病毒蛋白刺激机体后，机体免疫系统形成特异抗体或致敏淋巴细胞的能力。

本发明所用的术语“预防”指通过给予根据本发明的疫苗组合物抑制猪流行性腹泻或推迟疾病发作的所有行为。术语“治疗”指通过给予根据本发明的疫苗组合物使猪流行性腹泻病毒感染引起的症状减轻或好转的所有行为。

序列表中：

SEQ.NO.1为HN1301株S1基因的核苷酸序列；

SEQ.No.2为HN1301株S1基因的编码氨基酸序列。

具体实施方式

实施例一：猪流行性腹泻病毒HN1301株的分离、检测与繁殖

1.猪流行性腹泻病毒HN1301株的分离

将从河南临床采集的猪流行性腹泻典型发病的小肠连同肠内容物，用无菌的剪刀剪碎，按质量体积比1:3加入无菌的PBS（pH7.4），用无菌研磨器在冰上小心研磨完全。收集研磨后的液体，按照下面的步骤进行梯度离心：3000rpm4℃离心15min，5000rpm4℃离心15min，7000rpm4℃离心15min，10000rpm4℃离心15min。取离心后的上清，接种Vero细胞，置于37℃、5%CO₂培养，3天后收毒冻于-20℃，收获的病毒液即为分离的猪流行性腹泻病毒HN1301株。

将该猪流行性腹泻病毒株命名为猪流行性腹泻病毒HN1301株（Porcine epidemicdiarrhea virus，strain HN1301），保藏号为CCTCC NO.V201341；保藏于中国典型培养物保藏中心；保藏地址为湖北省武汉武汉大学，保藏日期为2013年9月16日。

2.猪流行性腹泻病毒HN1301株的检测

根据PEDV核酸序列分别设计引物，用PCR方法进行对猪流行性腹泻病毒HN1301株进行定性检测和外源微生物检测，所用引物序列如下：

上游：5'-GAAATAACCAGGGTCGTGGA-3'

下游：5'-GCTCACGAACAGCCACATTA-3'

结果显示：猪流行性腹泻病毒HN1301株为PEDV阳性，证实了该分离株确实为猪流行性腹泻毒株；同时，该分离株的PRRSV、CSFV、PPV、PCV2、PRV、BVDV、TGEV、轮状病毒盒支原体均为阴性(猪蓝耳病病毒RT-PCR检测试剂盒、猪瘟病毒RT-PCR检测试剂盒、猪细小病毒PCR检测试剂盒、猪圆环PCR检测试剂盒和猪流行性腹泻PCR检测试剂盒均为北京世纪元亨动物防疫技术有限公产品；BVDV、TGEV和轮状病毒检测为实验室自建方法），表明该毒种纯净。

3.猪流行性腹泻病毒HN1301株的繁殖

将分离株HN1301的病毒液按照维持液体积的1%接种Vero细胞，吸附1h后，补加维持液至适当体积后静置于37℃、5%CO₂培养，盲传10代后，出现PEDV典型的细胞病变：细胞颗粒增多，出现含7-8个以上多核的融合细胞，并可见有空斑样小区，后期细胞逐渐脱落。细胞病变达到80%以上时收获。病毒含量应不低于10^7.0TCID₅₀/ml。

4.病毒TCID₅₀测定

Vero细胞传代后，按照2万细胞/孔，铺96孔细胞板，每孔100μl。置于37℃、5%CO₂培养箱培养3天，细胞长成单层。将收获的病毒液用维持液进行10倍系列稀释（10-1、10-2…10-7），取10-3、10-4、10-5、10-6、10-7五个稀释度，加入到长成单层细胞的96孔细胞板中，每个稀释度做8个重复，每孔100μl，置于37℃、5%CO₂培养箱培养5天，每天观察细胞病变。根据细胞病变孔数，按照Reed-Muench方法计算病毒毒价。PEDV TCID₅₀可达10^7.5/ml以上。

实施例二：猪流行性腹泻病毒HN1301株的序列分析

根据GenBank中发表的PEDV CV777株（AF353511）的序列设计一对引物，用于扩增本发明的猪流行性腹泻病毒HN1301株，引物如下：

上游：5'-GGTAAGTTGCTAGTGCGTAA-3'

下游：5'-CACAGAAAGAACTAAACCC-3'

测序结果分析表明，本发明所述的分离株HN1301基因组全长28047nt，S1基因全长为762bp。

本发明分离毒株与2007～2009年韩国毒株、2007～2008年泰国毒株、2009～2010年越南毒株、2011年日本毒株及2010～2012年中国其它地区流行毒株亲缘关系均较密切，而与欧洲株（CV777、Brl/87）、中国现用疫苗株（CV777）及2003～2007年中国分离株（LJB/03、JS-2004-2、DX、QH、LZC）亲缘关系均较远。

实施例三：猪流行性腹泻病毒HN1301株的毒力测定试验

1.PEDV毒株取实施例一中分离的猪流行性腹泻病毒HN1301株。

2.细胞系Vero细胞，来源于上海生化所。

3.病毒培养

选用生长良好的Vero细胞单层，倒掉培养液，按维持液量的1%接种实施例一中分离的猪流行性腹泻病毒HN1301株病毒液置于37℃、5%CO₂培养箱中静置培养，每天观察细胞病变（CPE），至48-72小时，当CPE达到80%以上时，即可收获，经过2次冻融后，置于-20℃保存。

将上述猪流行性腹泻病毒HN1301株在Vero细胞上传代，取第11代的病毒液，对动物进行攻毒试验。

4.攻毒试验方法

4.1毒株纯净性检验

病毒株应无细菌、霉菌（按照《中华人民共和国兽用生物制品规程》附录（以下简称“附录”）第50页进行）、支原体（按照附录第53页进行）及其他外源病毒污染（按照附录第54页进行）。

4.2试验动物

怀孕母猪采血进行PEDV抗原和中和抗体以及TGEV检测，选取PEDV抗原、抗体以及TGEV阴性的母猪所产仔猪用于本试验，仔猪不吃初乳。

4.3攻毒试验

选用3日龄未吃初乳的仔猪20只，分为4组，每组5只。第一组口服接种HN1301P11代病毒液4ml；第二组口服接种HN1301P11代病毒液2ml；第三组口服接种HN1301P11代病毒液1ml；第四组为空白对照组，口服接种DMEM培养液2ml。病毒液TCID₅₀不低于10^7.0/ml。每天观察临床症状。

4.4病理分析

被攻毒猪只出现临床症状后，进行剖检以观察其脏器组织的病理变化。取发病猪的小肠及其内容物，按照实施例一中的方法分离病毒，提取病毒RNA，进行PCR检测。同时将分离的病毒按照实施例一中相同的方法接种Vero细胞，观察细胞病变。

5.试验结果

5.1HN1301株纯净性检验

用PCR方法对HN1301P11代病毒液进行检测，未见外源微生物，病毒液纯净，可以用于攻毒试验。

5.2攻毒试验结果

表1 HN1301株攻毒试验结果

攻毒试验的结果见表1。可见，本发明所述的分离株HN1301为猪流行性腹泻强毒株。

5.3对从被剖检猪只中分离的病毒进行PCR分析，结果显示为PEDV阳性；TGEV、轮状病毒和猪细小病毒阴性。同时将上述分离的病毒液接种Vero细胞，出现与实施例一中相同的细胞病变。这表明本试验中引起仔猪腹泻的确实为猪流行性腹泻病毒。

实施例四：猪流行性腹泻病毒弱毒株HN1302的培养以及稳定性和安全性试验

1.HN1302弱毒株的培养

将本发明分离株HN1301通过Vero细胞传代，传至46代时成功致弱，致弱方法与PEDV CV777株的致弱方法一致，参照文献（《中国畜禽传染病》20卷（6），329-332）。

2.HN1301株传代致弱后弱毒株的稳定性试验

2.1试验方法用HN1301株传代致弱后的第46、48、50、52、54代弱毒株即HN1301P46、P48、P50、P52、P54代弱毒株口服接种3日龄PEDV、TEEGV抗原抗体阴性仔猪，临床观察，48小时后，分别剖杀取小肠制作病理切片，同时分离病毒，接种Vero细胞复制细胞病变，进行PCR鉴定。对HN1301P46代弱毒株及其S1基因序列进行测序，并与HN1301株对比。。

2.2试验结果

试验结果见表2。可见，接种后仔猪偶见食欲下降，精神不振，且呈一过性表现；小肠绒毛镜下观察正常；接种Vero细胞后均能出现相同的细胞病变，且PCR结果均为PEDV阳性，证明HN1301株传代致弱后的弱毒株是稳定的。

对HN1301P46代弱毒株及其S1基因序列的测序结果表明，其S1基因序列与HN1301株一样，没有改变。

表2 HN1301株传代致弱后弱毒株的稳定性试验结果

3.HN1301株传代致弱后弱毒株的安全性试验

3.1仔猪安全性试验

用检验纯净的HN1301P46、P48、P50、P52、P54代弱毒株接种PEDV、TEGV抗原和抗体阴性的3日龄未吃初乳的仔猪，进行病毒的大剂量安全试验，接种剂量为4ml/头（病毒液TCID₅₀不低于10^7.0/ml），每组5头，同时设立对照组2头，接种等量的DMEM培养基。

3.2怀孕母猪安全性试验

用检验纯净的HN1301P46、P50、P54代弱毒株接种PEDV、TEGV抗原和抗体阴性的怀孕母猪，进行病毒的大剂量安全试验，接种剂量为4ml/头（病毒液TCID₅₀不低于10^7.0/ml），每组5头，同时设立对照组2头，接种等量的DMEM培养基。接种后观察体温、食欲，以及是否呕吐、腹泻等。连续观察28天后剖检观察病例变化。

3.3试验结果

表3 HN1301株传代致弱后弱毒株的大剂量安全试验结果（仔猪）

试验结果见表3和表4。可见，接种HN1301P46代弱毒株的仔猪有1头出现体温升高的症状，接种HN1301P48代弱毒株的仔猪有1头于接种当天出现呕吐现象，上述这些症状在1-2天内恢复正常；其他仔猪均无反应。上述试验表明，大剂量的免疫接种对仔猪无任何不良影响。另外，对怀孕母猪接种HN1301株传代致弱后弱毒株，试验结果显示接种HN1301P46代弱毒株的怀孕母猪有一头出现食欲下降，2天后食欲逐渐恢复，其他无明显异常。这证明本发明疫苗在怀孕母猪上应用不会造成母猪的流产、死胎、弱胎等繁殖障碍，试验组与对照组无显著差异，证明本发明疫苗是安全的。

表4 HN1301株传代致弱后弱毒株的大剂量安全试验结果（怀孕母猪）

安全性试验结果表明，本发明HN1301株传代致弱后弱毒株对仔猪和怀孕母猪均安全，无副作用。

实施例五：猪流行性腹泻病毒HN1301株S1蛋白的制备

1.HN1301S1基因的克隆

根据GeneBank公布的PEDV-S基因序列,设计一对特异性引物,扩增HN1301株S1基因,并于上、下游引物分别引入BamHⅠ、SacⅠ酶切位点,引物的核苷酸序列如下:

F:5'-CGCGGATCCACAAGATGTCTATAG-3'BamHⅠ

R:5'-GCGGAGCTCATATTAAACCTCAGA-3'SacⅠ

以实施例一中的分离株HN1301的S基因全序列为模板,扩增出S1基因片段。PCR反应参数为:94℃预变性5min,94℃变性30s,55℃退火30s,72℃延伸30min,30个循环后,72℃延伸5min;反应结束后用1%的琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行鉴定,用DNA片段纯化试剂盒(DNA Fragment Purification Kit)回收和纯化DNA,于-20℃保存备用。

2.HN1301-S1-pFastBac I重组质粒的制备

用限制性内切酶BamH I、Sal I对HN1301S1-T和pFastbac I载体同时进行双酶切。取酶切产物进行琼脂糖电泳，胶回收目的片段，用T4DNA Ligase进行HN1301S1基因与pFastbac I载体连接，转化DH5α感受态细胞，并进行酶切鉴定。该重组质粒命名为HN1301-S1-pFastBac I重组质粒。

3.重组Bacmid DNA的获得

取pFastbac1-PPV-VP2重组供体质粒转化DH10Bac感受态细胞，进行蓝白斑菌落筛选，白斑应为阳性。挑取单个白斑菌落于LB液体培养基进行培养，按照Baculovirus Expression Systems CAT说明书的方法提取重组Bacmid DNA，并进行PCR鉴定。

4.重组阳性杆粒HN1301-S1-Bacmid转染Sf-9细胞

按照脂质体转染的方法进行转染昆虫细胞Sf-9，27℃培养箱中孵育72h，观察细胞出现病毒感染迹象。72h细胞出现病变，收集上清液，这时的病毒称为P1代。通过提取病毒DNA，进行RT-PCR鉴定表明，转染成功。

5.S1蛋白的获得

取P1代接种Sf-9细胞，培养3天后收获P2代。P2代冻融一次后，弃去培养上清液，用pH7.4的PBS液冲洗，将细胞完全冲洗下来，超声裂解后，即获得存在于细胞中的S1蛋白。

实施例六：猪流行性腹泻病毒HN1301株传代致弱后弱毒株以及HN1301株S1蛋白的免疫原性试验

1.试验方法

1.1HN1301株传代致弱后弱毒株取通过Vero细胞传代致弱的HN1301P46、P48、P50、P52和P54代弱毒株。

1.2分别用HN1301P46、P48、P50、P52、P54代弱毒株和CV777疫苗株、HN1301株S1蛋白接种PEDV、TEGV抗原和抗体阴性的3日龄未吃初乳的仔猪。接种剂量为2ml/头（病毒液TCID₅₀不低于10^7.0/ml），每组5头，同时设立对照组2头，接种等量的DMEM培养基。接种后14天，用本发明的HN1301P11代强毒株进行攻击，每头口服2ml（病毒液TCID₅₀不低于10^7.0/ml）。

2.试验结果

表5 HN1301株传代致弱后弱毒株的免疫原性试验

试验结果见表5。可见，接种HN1301P46、P48代弱毒株的仔猪未见明显临床症状；接种HN1301P50、P52代弱毒株的仔猪分别在攻毒后18h、20h出现呕吐和腹泻现象；接种HN1301P54代弱毒株的仔猪在攻毒后20h出现呕吐和腹泻现象，20-30h内死亡1头；对照组仔猪在攻毒后12小时内均出现严重的腹泻，之后24h内全部死亡。试验结果表明，传代至54代之后，HN1301株传代致弱后弱毒株在强毒攻击时不能全部保护仔猪。根据本试验结果，选用HN1301P46代弱毒株（即HN1302株）的病毒液作为疫苗代次。

接种HN1301P46代弱毒株和HN1301株S1蛋白的仔猪有一过性食欲下降，接种CV777的仔猪有1头呕吐，1头腹泻，1头死亡。结果对比表明，HN1301株S1蛋白与全病毒的免疫原性相当，高于CV777。

实施例七：猪流行性腹泻病毒弱毒株HN1302的保护效力试验

1.试验方法

选用PEDV、TEGV抗原和抗体阴性的3日龄未吃初乳的仔猪用于本试验，分别口服接种传代致弱的HN1302株病毒液（病毒液TCID₅₀不低于10^7.0/ml）和CV777疫苗毒（病毒液TCID₅₀不低于10^7.0/ml）各2ml，每组3头；同时设立空白对照组2头，口服接种2ml DMEM。观察临床症状，每周采血，分离血清，用中和试验法检测血清中的中和抗体效价。

2.试验结果

表6弱毒株HN1302保护效力试验结果

试验结果见表6。可见，攻毒后第14天，血清中中和抗体水平逐渐升高，多数达到1:32的水平，之后随着攻毒时间的增加，中和抗体水平增高，在攻毒后第28天达到最高。试验数据表明，与CV777相比，本发明弱毒株HN1302产生免疫效力较快，且能维持在一个较高的水平，能够充分保护猪流行性腹泻的攻击。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种S1基因，所述S1基因为编码序列表中SEQ.NO.2所示蛋白的核苷酸序列。

2.一种猪流行性腹泻病毒株，所述猪流行性腹泻病毒株含有编码序列表中SEQ.NO.2所示的蛋白的核苷酸序列。

3.一种猪流行性腹泻病毒株HN1301，所述猪流行性腹泻病毒微生物保藏号为CCTCCNO:V201341。

4.一种猪流行性腹泻病毒弱毒株HN1302，所述猪流行性腹泻病毒弱毒株微生物保藏号为CCTCC NO:V201342。

5.一种疫苗组合物，所述疫苗组合物包括免疫量的权利要求2所述的猪流行性腹泻病毒株的减毒活疫苗、灭活疫苗、亚单位疫苗、合成疫苗或基因工程疫苗。

6.根据权利要求5所述的疫苗组合物，其特征在于，所述疫苗组合物包括免疫量的权利要求4所述的猪流行性腹泻病毒弱毒株。

7.根据权利要求5或6所述的疫苗组合物在制备预防和治疗猪流行性腹泻的药物中的应用。

8.一种S1蛋白，所述S1蛋白为序列表中SEQ.NO.2所示氨基酸序列的蛋白。

9.一种疫苗组合物，所述疫苗组合物包括权利要求8所述的S1蛋白和佐剂。

10.根据权利要求9所述的疫苗组合物在制备预防和治疗猪流行性腹泻的药物中的应用。