CN106699881A - 一种猪流行性腹泻病毒阳性血清的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种猪流行性腹泻病毒阳性血清的制备方法，首先用猪流行性腹泻病毒抗原对实验用动物进行基础免疫，再用猪流行性腹泻病毒灭活疫苗对实验用动物进行3‑5次免疫，而后无菌采集动物血清，以细胞中和抗体效价检测法检测，确认血清抗体为阳性且细胞中和抗体效价在1：256以上，即收获猪流行性腹泻病毒阳性血清。本发明是利用猪流行性腹泻病毒和实验动物兔、豚鼠，按照一定免疫程序免疫接种制备高免血清作为样品，通过对实验动物采血分离血清，血清经过辐照、过滤、检验、分装、冻干等工艺过程，并最终用于鉴别、检验和诊断过程中。本发明方法减小了用猪制备阳性血清因同源动物而引起的同源其他外源病毒污染的风险。
Description
技术领域
本发明属于兽用医药生物技术领域，具体涉及一种猪流行性腹泻病毒阳性血清的制备方法。
背景技术
流行性腹泻（Porcine Epidemic Diarrhea ofSwine，PED）是由猪流行性腹泻病毒（PEDV）引起的猪接触性肠道传染病。以呕吐、腹泻和脱水为特征，可发生于任何年龄的猪，年龄越小，症状越重，死亡率高。哺乳猪、架子猪或肥育猪的发病率很高，尤以哺乳猪受害最为严重，母猪发病率变动很大，约为15-90%。病猪是主要传染源。发病猪症状的轻重随年龄的大小而有差异，年龄越小，症状越重。一周龄内新生仔猪发生腹泻后3-4天，呈现严重脱水而死亡，死亡率可达50%，最高的死亡率达100%。断奶猪、母猪常呈精神萎顿、厌食和持续性腹泻大约一周，并逐渐恢复正常。少数猪恢复后生长发育不良。肥育猪在同圈饲养感染后都发生腹泻，一周后康复，死亡率1--3%。成年猪症状较轻，有的仅表现呕吐，重者水样腹泻3-4天可自愈。而猪流行性腹泻病毒阳性血清是目前主要应用于鉴别、检验、诊断的蛋白类物质，此免疫球蛋白（抗体）是一种能攻击异己物质（抗原）并促进嗜中性粒细胞和巨噬细胞吞噬免疫球蛋白-抗原复合物的蛋白质，因此它们在清除细菌和病毒中起着重要作用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用兔或豚鼠制备猪流行性腹泻病毒阳性血清的方法。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种猪流行性腹泻病毒阳性血清的制备方法，包括以下步骤：
1) 筛选猪流行性腹泻病毒抗原抗体阴性的动物作为实验动物，对每只实验动物进行免疫接种：
用猪流行性腹泻病毒抗原进行基础免疫：对每只实验动物皮下或肌肉注射0.5-2mL猪流行性腹泻病毒抗原进行基础免疫；
用猪流行性腹泻病毒灭活疫苗进行3-5次免疫：基础免疫7--10天后对每只实验动物进行皮下或肌肉注射猪流行性腹泻病毒灭活疫苗进行3-5次免疫接种，每次免疫接种的时间间隔为7-10天，第1次接种量为1-3头份，以后每次接种量比上一次增加2-3头份或者做倍增接种；
2）最后一次免疫后28-42天，无菌采集实验动物血清，以细胞中和抗体效价检测法检测，确认血清抗体为阳性且细胞中和抗体效价在1：256以上，即收获猪流行性腹泻病毒阳性血清。收集的猪流行性腹泻病毒阳性血清经过辐照、过滤后抽样做无菌检验、支原体检验、外源病毒检验等步骤，将无细菌、霉菌、支原体、外源病毒污染的免疫动物血清进行分装、冻干后，再次抽样检验，确认无污染的阳性血清冻存备用。
所述实验动物为小鼠、豚鼠或兔。作为实验用的动物，首先采集其血清检测，验证其均不具有猪流行性腹泻病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、猪细小病毒、猪Ⅱ型圆环病毒、猪伪狂犬病毒、口蹄疫病毒等的抗原、抗体。
所述步骤1）的免疫为多点免疫，所述多点免疫为2点、3点或4点免疫。
所述步骤2) 无菌采集实验动物血清的具体操作为：采集实验动物血液，在室温下静置0.5-2h，然后在2-8℃冷藏1-2h，在3000-3500r/min离心10-15min，在无菌环境下分离血清。
本发明所述中和抗体效价的测定方法如下：
S1： 将采集的实验动物血清在56℃下灭活30min，然后用维持液对血清做倍比稀释，得到不同稀释度的血清，每个稀释度的血清分别与猪流行性腹泻病毒抗原于37℃环境下中和60min以上，得到中和液；
S2：用细胞板培养VERO细胞，当VERO细胞生长24小时以上，细胞密度达到致密单层时，弃去培养液，取0.1mL上述中和液接种于细胞板上，每个稀释度的血清中和液分别接种6孔细胞，同时设不中和的病毒阳性对照细胞6孔和接种维持液的阴性对照细胞6孔；
S3：将细胞板置于37℃的CO2培养箱中培养120h，并每天观察细胞病变情况，以细胞不产生病变的最高稀释度为阳性血清的中和抗体效价。
所述步骤S1的维持液为DMEM维持液。
所述步骤S1的猪流行性腹泻病毒抗原的浓度为200TCID50/0.1mL。
所述步骤S1的倍比稀释，稀释至血清与维持液的比例1:256以上。
所述步骤S1每个稀释度的血清与猪流行性腹泻病毒抗原等量混合。
所述细胞板为96孔细胞板。
本发明采用以上技术方案，首先用猪流行性腹泻病毒抗原对实验用动物进行基础免疫，再用猪流行性腹泻病毒灭活疫苗对实验用动物进行3-5次免疫，而后无菌采集动物血清，以细胞中和抗体效价检测法检测，确认血清抗体为阳性且细胞中和抗体效价在1：512以上，即收获猪流行性腹泻病毒阳性血清。本发明首次免疫采用猪流行性腹泻病毒抗原，接下来的3-5次免疫采用猪流行性腹泻病毒灭活疫苗，其中活抗原是为了加强细胞免疫，灭活疫苗是为了更好地提高抗体水平。
本发明所涉及的阳性血清是利用猪流行性腹泻病毒和实验动物兔、豚鼠，按照一定免疫程序免疫接种制备高免血清作为样品，通过对实验动物采血分离血清，血清经过辐照、过滤、检验、分装、冻干等工艺过程，并最终用于鉴别、检验和诊断过程中。本发明方法不仅降低了成本，也减小了用猪制备阳性血清因同源动物而引起的同源其他外源病毒污染的风险，为猪流行性腹泻病毒阳性血清的制备提供了新的思路。
具体实施方式
本发明的实验动物为豚鼠或兔。选用的豚鼠为350-400g、符合国家规定的清洁级实验动物，选用的兔为2.25--3.0Kg、符合国家规定的清洁级实验动物。作为实验用的动物，首先采集其血清检测，验证其均不具有猪流行性腹泻病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、猪细小病毒、猪Ⅱ型圆环病毒、猪伪狂犬病毒、口蹄疫病毒等的抗原、抗体。
本发明猪流行性腹泻病毒阳性血清的制备方法，包括以下步骤：
1) 预实验
筛选猪流行性腹泻病毒抗原抗体阴性的动物作为实验动物，对每只实验动物进行免疫接种：
用猪流行性腹泻病毒抗原进行基础免疫：对每只实验动物皮下或肌肉注射0.5-2mL猪流行性腹泻病毒抗原进行基础免疫；
用猪流行性腹泻病毒灭活疫苗进行3-5次免疫：基础免疫7--10天后对每只实验动物进行皮下或肌肉注射猪流行性腹泻病毒灭活疫苗进行3-5次免疫接种，每次免疫接种的时间间隔为7-10天，第1次接种量为1-3头份，以后每次接种量比上一次增加2-3头份或者做倍增接种；
所述免疫为2点、3点或4点免疫；
最后1次免疫10天后每隔4--7天采血一次，用细胞中和抗体效价检测法，做相对定量的检测（血清做1:64、1:128、1:256、1:512、1:1024......等对倍的稀释），以确定细胞中和抗体效价测定在1:256以上的收获血清时间，为最后1次免疫后的28--42天；
2）正式试验：
重复以上对实验动物的免疫程序，并全部采集最后1次免疫后28--42天的免疫动物血清（具体操作为：最后一次免疫后28-42天，无菌采集实验动物血液，在室温下静置0.5-2h，然后在2-8℃冷藏1-2h，在3000-3500r/min离心10-15min，在无菌环境下分离血清），以细胞中和抗体效价检测法检测，确认血清抗体为阳性且细胞中和抗体效价在1：256以上，即收获猪流行性腹泻病毒阳性血清。收集的猪流行性腹泻病毒阳性血清经过辐照、过滤后抽样做无菌检验、支原体检验、外源病毒检验等步骤，将无细菌、霉菌、支原体、外源病毒污染的免疫动物血清进行分装、冻干后，再次抽样检验，确认无污染的阳性血清冻存备用。
其中，中和抗体效价的测定方法如下：
S1： 将采集的实验动物血清在56℃下灭活30min，然后用DMEM维持液对血清做倍比稀释（稀释至血清与维持液的比例1:256以上），得到不同稀释度的血清，每个稀释度的血清分别与浓度为200TCID50/0.1mL的猪流行性腹泻病毒抗原等量混合，于37℃环境下中和60min以上，得到中和液；
S2：用96孔细胞板培养VERO细胞，当VERO细胞生长24小时以上，细胞密度达到致密单层时，弃去培养液，取0.1mL上述中和液接种于细胞板上，每个稀释度的血清中和液分别接种6孔细胞，同时设不中和的病毒阳性对照细胞6孔和接种维持液的阴性对照细胞6孔；
S3：将细胞板置于37℃的CO2培养箱中培养120h，并每天观察细胞病变情况，以细胞不产生病变的最高稀释度为阳性血清的中和抗体效价。
实施例1
一种猪流行性腹泻病毒阳性血清的制备方法，包括以下步骤：
1) 选用350-400g豚鼠，并且其为符合国家规定的清洁级实验动物，同时满足猪流行性腹泻病毒抗原抗体阴性，然后用PEDV活毒抗原0.5mL对豚鼠进行首免，10天后再用PEDV灭活疫苗对豚鼠进行5次免疫，第一次1头份，第2--5次接种量均比前次增加2头份，免疫时间间隔7天；
2) 最后一次免疫后33-35天，无菌采集豚鼠血清，将收集到的血清在56℃下灭活30min，然后用DMEM维持液对血清做倍比稀释（血清做1:64、1:128、1:256、1:512、1:1024.......等倍比稀释），每个稀释度的血清分别与浓度为200TCID50/0.1mL的PEDV抗原等量混合，于37℃环境下中和60min以上，得到中和液；
3) 用细胞板培养VERO细胞，当生长24-小时以上，密度达到致密单层时，弃去培养液，取0.1mL上述中和液接种于细胞板上，每个稀释度的血清中和液分别接种6孔细胞，同时设不中和的病毒阳性对照细胞6孔和接种维持液的阴性对照细胞6孔；
4) 将细胞板置37℃的CO2培养箱中培养120h，并每天观察细胞病变情况，以细胞不产生病变的最高稀释度为阳性血清的中和抗体效价，收集该中和抗体效价的血清即为猪流行性腹泻病毒阳性血清。
实施例2
一种猪流行性腹泻病毒阳性血清的制备方法，包括以下步骤：
1) 选用350-400g豚鼠，并且其为符合国家规定的清洁级实验动物，同时满足猪流行性腹泻病毒抗原抗体阴性，然后用PEDV活毒抗原0.6ml对豚鼠进行首免，10天后再用PEDV灭活疫苗对豚鼠进行3次免疫，第一次2头份，第2、3次接种量均比前次增加3头份，免疫时间间隔9天；
2) 最后一次免疫后36-38天，无菌采集豚鼠血清，将收集到的血清在56℃下灭活30min，然后用DMEM维持液对血清做倍比稀释（血清做1:64、1:128、1:256、1:512、1:1024.......等倍比稀释），每个稀释度的血清分别与PEDV抗原于37℃环境下中和60min以上，得到中和液；
3) 用细胞板培养VERO细胞，当生长近48小时，密度达到致密单层时，弃去培养液，取0.2mL上述中和液接种于细胞板上，每个稀释度的血清中和液分别接种6孔细胞，同时设不中和的病毒阳性对照细胞6孔和接种维持液的阴性对照细胞6孔；
4) 置37℃的CO2培养箱中培养120h，并每天观察细胞病变情况，以细胞不产生病变的最高稀释度为阳性血清的中和抗体效价，收集该中和抗体效价的血清即为猪流行性腹泻病毒阳性血清。
实施例3
1)选用2.25-3.0kg的兔，并且其为符合国家规定的清洁级实验动物，同时满足猪流行性腹泻病毒抗原抗体阴性，PEDV活毒抗原0.8ml对兔进行首免，10天后再用PEDV灭活疫苗对兔进行4次免疫，第一次3头份，第2--4次接种量分别为6、10、15头份，免疫时间间隔10天；
2) 最后一次免疫后32-33天，无菌采集兔血清，将收集到的血清在56℃下灭活30min，然后用DMEM维持液对血清做倍比稀释（血清做1:64、1:128、1:256、1:512、1:1024.......等倍比稀释），每个稀释度的血清分别与PEDV抗原于37℃环境下中和60min以上，得到中和液；
3) 用细胞板培养VERO细胞，当生长36小时以上，密度达到致密单层时，弃去培养液，取0.2mL上述中和液接种于细胞板上，每个稀释度的血清中和液分别接种6孔细胞，同时设不中和的病毒阳性对照细胞6孔和接种维持液的阴性对照细胞6孔；
4) 置37℃的CO2培养箱中培养120h，并每天观察细胞病变情况，以细胞不产生病变的最高稀释度为阳性血清的中和抗体效价，收集该中和抗体效价的血清即为猪流行性腹泻病毒阳性血清。
实施例4
1) 选用2.25-3.0kg的兔，并且其为符合国家规定的清洁级实验动物，同时满足猪流行性腹泻病毒抗原抗体阴性，然后用PEDV活毒抗原0.7ml对兔进行首免，10天后再用PEDV灭活疫苗对兔进行5次免疫，第一次2头份，第2--5次接种量分别为5、8、11、15头份，免疫时间间隔8天；
2) 最后一次免疫后34-36天，无菌采集兔血清，将收集到的血清在56℃下灭活30min，然后用DMEM维持液对血清做倍比稀释（血清做1:64、1:128、1:256、1:512、1:1024.......等倍比稀释），每个稀释度的血清分别与PEDV抗原于37℃环境下中和60min以上，得到中和液；
3) 用细胞板培养VERO细胞，当生长36-48小时，密度达到致密单层时，弃去培养液，取0.2mL上述中和液接种于细胞板上，每个稀释度的血清中和液分别接种6孔细胞，同时设不中和的病毒阳性对照细胞6孔和接种维持液的阴性对照细胞6孔；
4) 置37℃的CO2培养箱中培养120h，并每天观察细胞病变情况，以细胞不产生病变的最高稀释度为阳性血清的中和抗体效价，收集该中和抗体效价的血清即为猪流行性腹泻病毒阳性血清。
Claims (10)
1.一种猪流行性腹泻病毒阳性血清的制备方法，其特征在于：其包括以下步骤：
1) 筛选猪流行性腹泻病毒抗原抗体阴性的动物作为实验动物，对每只实验动物进行免疫接种：
用猪流行性腹泻病毒抗原进行基础免疫：对每只实验动物皮下或肌肉注射0.5-2mL猪流行性腹泻病毒抗原进行基础免疫；
用猪流行性腹泻病毒灭活疫苗进行3-5次免疫：基础免疫7--10天后对每只实验动物进行皮下或肌肉注射猪流行性腹泻病毒灭活疫苗进行3-5次免疫接种，每次免疫接种的时间间隔为7-10天，第1次接种量为1-3头份，以后每次接种量比上一次增加2-3头份或者做倍增接种；
2）最后一次免疫后28-42天，无菌采集实验动物血清，以细胞中和抗体效价检测法检测，确认血清抗体为阳性且细胞中和抗体效价在1：256以上，即收获猪流行性腹泻病毒阳性血清。
2.根据权利要求1所述的一种猪流行性腹泻病毒阳性血清的制备方法，其特征在于：所述中和抗体效价的测定方法如下：
S1： 将采集的实验动物血清在56℃下灭活30min，然后用维持液对血清做倍比稀释，得到不同稀释度的血清，每个稀释度的血清分别与猪流行性腹泻病毒抗原于37℃环境下中和60min以上，得到中和液；
S2：用细胞板培养VERO细胞，当VERO细胞生长24小时以上，细胞密度达到致密单层时，弃去培养液，取0.1mL上述中和液接种于细胞板上，每个稀释度的血清中和液分别接种6孔细胞，同时设不中和的病毒阳性对照细胞6孔和接种维持液的阴性对照细胞6孔；
S3：将细胞板置于37℃的CO2培养箱中培养120h，并每天观察细胞病变情况，以细胞不产生病变的最高稀释度为阳性血清的中和抗体效价。
3.根据权利要求1所述的一种猪流行性腹泻病毒阳性血清的制备方法，其特征在于：所述实验动物为豚鼠或兔。
4.根据权利要求1所述的一种猪流行性腹泻病毒阳性血清的制备方法，其特征在于：所述步骤1）的免疫为多点免疫，所述多点免疫为2点、3点或4点免疫。
5.根据权利要求1所述的一种猪流行性腹泻病毒阳性血清的制备方法，其特征在于：所述步骤2) 无菌采集实验动物血清的具体操作为：采集实验动物血液，在室温下静置0.5-2h，然后在2-8℃冷藏1-2h，在3000-3500r/min离心10-15min，在无菌环境下分离血清。
6.根据权利要求2的一种猪流行性腹泻病毒阳性血清的制备方法，其特征在于：所述步骤S1的维持液为DMEM维持液。
7.根据权利要求2所述的一种猪流行性腹泻病毒阳性血清的制备方法，其特征在于：所述步骤S1的猪流行性腹泻病毒抗原的浓度为200TCID50/0.1mL。
8.根据权利要求21述的一种猪流行性腹泻病毒阳性血清的制备方法，其特征在于：所述步骤S1的倍比稀释，稀释至血清与维持液的比例1:256以上。
9.根据权利要求2所述的一种猪流行性腹泻病毒阳性血清的制备方法，其特征在于：所述步骤S1每个稀释度的血清与猪流行性腹泻病毒抗原等量混合。
10.根据权利要求2所述的一种猪流行性腹泻病毒阳性血清的制备方法，其特征在于：所述细胞板为96孔细胞板。
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