CN105606804A - 一种猪圆环病毒灭活疫苗效力检验方法 - Google Patents

一种猪圆环病毒灭活疫苗效力检验方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种猪圆环病毒灭活疫苗效力检验方法，首先用猪圆环病毒灭活疫苗对实验用动物进行1--2次免疫，而后无菌采集动物血清，经灭活后，用维持液对无菌采集的免疫动物血清做倍比稀释，并用含200TCID50/0.1mL的猪圆环病毒抗原于37℃环境下中和30-60min，将中和液接种于生长PK-15细胞的96孔细胞板中，置37℃的CO2培养箱中培养后采用间接免疫荧光法进行染色观察，计算血清抗体的中和效价，判定猪圆环病毒灭活疫苗效价。本发明不但能定量检验出猪圆环灭活疫苗经过动物免疫接种后对动物体产生的血清中和抗体效价，而且抗原批间差异小，检验结果准确。

Description

一种猪圆环病毒灭活疫苗效力检验方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种猪圆环病毒灭活疫苗效力检验方法。
背景技术
猪圆环病毒病（PorcineCircoviralDisease，PCVD）是由猪圆环病毒2型（Porcinecircovirustype2，PCV2）引起的一系列疾病的总称。我国自从2000年证实猪群中存在PCV2感染以来，各地区已有陆续报道该病的发生，2002年由PCV2感染引起的断奶仔猪多系统衰竭综合征（PostweaningMultisystemicWastingSyndrome，PWMS）在全国呈暴发流行。据统计分析，近年来我国PCV2感染率呈逐年上升趋势，目前该病的流行范围已经波及全国各地，成为危害我国养猪业的重要免疫抑制性疫病之一。PMWS是最先被报道与PCV2相关的疾病，但随着研究的深入，研究人员发现与PCV2有关的疾病除PMWS外还有猪皮炎与肾炎综合征、呼吸道疾病综合征、仔猪先天性震颤以及繁殖障碍等。PCV2不但在环境中普遍存在，而且对消毒药物耐受力又较强，因此疫苗免疫成为控制PCVD的重要手段。
目前市场上猪圆环病毒疫苗种类繁多，疫苗免疫效果一般用ELISA检测动物抗体和仔猪攻毒试验来检验。用ELISA方法检测抗体虽然时间短，但是由于生产工艺问题，ELISA检测试剂盒不够稳定，各厂家之间的结果经常存在差异，而且只能定性检测，无法做到定量检测，而仔猪攻毒试验存在费时费力，操作复杂，而且PCV2攻毒模型建立困难，容易造成散毒等缺点。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种操作简便、抗原批间差异小、检验结果准确的猪圆环病毒灭活疫苗效力检验方法。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种猪圆环病毒灭活疫苗效力检验方法，包括以下步骤：
1)筛选猪圆环抗原抗体阴性动物作为实验动物，用猪圆环病毒灭活疫苗对实验动物进行1--2次免疫，每次1--2头份；
2)最后一次免疫后14-21天，无菌采集实验动物血清，将收集到的血清在56℃下灭活30-min，然后用维持液对血清做倍比稀释，得到不同稀释度的血清，每个稀释度的血清分别与猪圆环病毒抗原于37℃环境下中和30-60min，得到中和液；
3)用细胞板培养PK-15细胞，当生长密度达到50-80%时，弃去培养液，取0.1-0.2mL上述中和液接种于细胞板上，每个稀释度的血清对应得到的中和液分别接种6孔细胞，并在37℃下吸附30-60min，同时设不中和的病毒阳性对照细胞6孔和接种维持液的阴性对照细胞6孔；
4)在细胞板中加入维持液并置于37℃的CO2培养箱中培养24h，然后弃去细胞板中的维持液，换用新鲜的维持液，继续置于37℃的CO2培养箱中培养24h-48h；
5）弃去细胞板中的维持液，细胞采用间接免疫荧光法进行丙酮固定、然后荧光染色、按Reed-Muench法计算血清的中和抗体效价，并以此判定猪圆环病毒灭活疫苗的效价。
所述步骤1）用猪圆环病毒灭活疫苗对实验动物进行2次免疫时，2次免疫时间间隔为14-21天。
所述实验动物为小鼠、豚鼠、猪或兔。
所述步骤1）的免疫为多点免疫，所述多点免疫为2点、3点或4点免疫。
所述步骤2)无菌采集实验动物血清的具体操作为：采集实验动物血液，在室温下静置0.5-2h，然后在2-8℃冷藏1-2h，在3000-3500r/min离心10-15min，在无菌环境下分离不少于0.5mL血清。
所述维持液为MEM维持液。
所述步骤2）的猪圆环病毒抗原的浓度为200TCID50/0.1mL。
所述步骤2）的倍比稀释，稀释至血清与维持液的比例1:1024以上。
所述步骤2）每个稀释度的血清与猪圆环病毒抗原等量混合。
所述细胞板为96孔细胞板。
本发明采用以上技术方案，首先用猪圆环病毒灭活疫苗对实验用动物进行1--2次免疫，而后无菌采集动物血清，经灭活后，用维持液对无菌采集的免疫动物血清做倍比稀释，并用含200TCID50/0.1mL的猪圆环病毒抗原于37℃环境下中和30-60min，将中和液接种于生长PK-15细胞的96孔细胞板中，置37℃的CO2培养箱中培养后染色观察，计算血清抗体的中和效价，并以此判定猪圆环病毒灭活疫苗效价。
本发明根据抗原能与相应抗体中和的原理设计检验方法，抗原与抗体发生特异性结合后产生抗原抗体复合物，如果抗原含量不足，抗体过高，那么全部抗原将被中和形成复合物，而无抗原能在细胞上增殖；反之，如果抗原含量足够，抗体不足，那将有部分抗原未被中和，只需要一点点抗原都会在细胞上增殖，从而被检测出来。本发明是结合猪圆环病毒更适于在有丝分裂过程中的PK-15细胞上复制的生长特点而设计，选用生长良好的PK-15细胞，接种已中和动物血清，本发明不但能定量检验出猪圆环灭活疫苗经过动物免疫接种后对动物体产生的中和抗体效价，而且抗原批间差异小，检验结果准确。　
具体实施方式
一种猪圆环病毒灭活疫苗效力检验方法，包括以下步骤：
1)筛选猪圆环抗原抗体阴性动物作为实验动物，用猪圆环病毒灭活疫苗对实验动物进行1--2次免疫，每次1--2头份，2次免疫时间间隔14--21天；所述免疫为2点、3点或4点免疫；
2)最后一次免疫后14-21天，通过静脉采血等方法采集实验动物血液，在室温下静置0.5-2h，然后在2-8℃冷藏1-2h，在3000-3500r/min离心10-15min，在无菌环境下分离不少于0.5mL血清，将收集到的血清在56℃下灭活30min，用MEM维持液将血清按1:4、1:8、1:16、1:32、1:1024…稀释，得到不同稀释度的血清，每个稀释度的血清分别与200TCID50/0.1mL的猪圆环病毒抗原等量混合，于37℃环境下中和30-60min，得到中和液；
3)用96孔细胞板培养PK-15细胞，当生长密度达到50-80%时，弃去培养液，取0.1-0.2mL上述中和液接种于细胞板上，每个稀释度的血清对应得到的中和液分别接种6孔细胞，并在37℃下吸附30-60min，同时设不中和的病毒阳性对照细胞6孔和接种维持液的阴性对照细胞6孔；
4)在细胞板中加入维持液并置于37℃的CO2培养箱中培养24h，然后弃去细胞板中的维持液，换用新鲜的维持液，继续置于37℃的CO2培养箱中培养24h-48h；
5）弃去细胞板中的维持液，细胞采用间接免疫荧光法进行丙酮固定、然后荧光染色、按Reed-Muench法计算血清的中和抗体效价，并以此判定猪圆环病毒灭活疫苗效价。
实施例1
一种猪圆环病毒灭活疫苗效力检验方法，包括以下步骤：
1）取清洁级18--22g猪圆环抗原抗体阴性小鼠15只，随机分成三组，每组5只，第一组、第二组经皮下免疫接种小鼠（接种疫苗为福州大北农生产的猪圆环病毒2型灭活疫苗(DBN-SX07株)，批号2015002），0.2mL/只，分2点免疫，第三组作为空白对照组；14天后，第一组按照相同的免疫途径、方法和剂量再一次免疫，第二组不做免疫；
2）第二次免疫后14天，通过眼眶静脉采血等方法采集三组小鼠血液，在室温静置1h后，置2-8℃冷藏1h，3000r/min离心10min，在无菌环境下无菌操作分离不少于0.5mL血清；
将收集的无菌血清在56℃水浴锅中灭活30min，然后用MEM维持液将血清按1:4、1:8、1:16、1:32、…1:1024稀释，得到不同稀释度的血清，每个稀释度的血清分别与猪圆环病毒抗原（200TCID50/0.1mL）等量混合，37℃中和1h，得到中和液；
3）用96孔细胞板培养PK-15细胞，当生长密度达到50-80%时，弃去培养液，取0.1mL上述中和液接种于细胞板上，每个稀释度的血清对应得到的中和液分别接种6孔细胞，并在37℃下吸附60min，同时设不中和的病毒阳性对照细胞6孔和接种0.1mL维持液的阴性对照细胞6孔；
4)在细胞板中加入维持液，并置于37℃、含5%CO2培养箱中培养24h，然后弃去细胞板中的维持液，换用新鲜的维持液，继续置于37℃的CO2培养箱中培养48h；
5）弃去细胞板中的培养液，用0.01mol/LpH值7.4PBS洗涤3次，冷丙酮（80%丙酮，20%双蒸水）固定细胞，采用间接免疫荧光法（IFA）测定每个稀释度含有PCV2阳性细胞（细胞为绿色荧光物质着染）的孔数，然后按Reed-Muench法计算血清中和抗体效价，并以此判定猪圆环病毒灭活疫苗效价。
判定标准：本实施例实验动物为清洁级小鼠，血清中和抗体效价应>1：64，即按Reed-Muench法计算出的血清中和抗体效价>1：64，则说明效力检验合格。
实施例2
一种猪圆环病毒灭活疫苗效力检验方法，包括以下步骤：
1）取SPF级18--22g猪圆环抗原抗体阴性小鼠15只，随机分成三组，每组5只，第一组、第二组经皮下免疫接种小鼠（接种疫苗为福州大北农生产的猪圆环病毒2型灭活疫苗(DBN-SX07株)，批号2015002），0.2mL/只，分3点免疫，第三组作为空白对照组；21天后，第一组按照相同的免疫途径、方法和剂量再一次免疫，第二组不做免疫；
2）第二次免疫后21天，通过眼眶静脉采血等方法采集三组小鼠血液，在室温静置2h后，置2-8℃冷藏2h，3000r/min离心10min，在无菌环境下无菌操作分离不少于0.5mL血清；
将收集的无菌血清在56℃水浴锅中灭活30min，然后用MEM维持液将血清按1:4、1:8、1:16、1:32、…1:1024稀释，得到不同稀释度的血清，每个稀释度的血清分别与猪圆环病毒抗原（200TCID50/0.1mL）等量混合，37℃中和1h，得到中和液；
3）用96孔细胞板培养PK-15细胞，当生长密度达到50-80%时，弃去培养液，取0.1mL上述中和液接种于细胞板上，每个稀释度的血清对应得到的中和液分别接种6孔细胞，并在37℃下吸附40min，同时设不中和的病毒阳性对照细胞6孔和接种0.1mL维持液的阴性对照细胞6孔；
4)在细胞板中加入维持液，并置于37℃、含5%CO2培养箱中培养24h，然后弃去细胞板中的维持液，换用新鲜的维持液，继续置于37℃的CO2培养箱中培养24h；
5）弃去细胞板中的培养液，用0.01mol/LpH值7.4PBS洗涤3次，冷丙酮（80%丙酮，20%双蒸水）固定细胞，采用间接免疫荧光法（IFA）测定每个稀释度含有PCV2阳性细胞（细胞为绿色荧光物质着染）的孔数，然后按Reed-Muench法计算血清中和抗体效价，并以此判定猪圆环病毒灭活疫苗效价。
判定标准：本实施例实验动物为SPF级小鼠，血清中和抗体效价应>1：64，即按Reed-Muench法计算出的中和抗体效价>1：64，则说明效力检验合格。
实施例3
一种猪圆环病毒灭活疫苗效力检验方法，包括以下步骤：
1）取普通级或清洁级300-400g猪圆环抗原抗体阴性豚鼠6只，随机分成三组，每组2只，第一组、第二组经肌肉注射法免疫接种豚鼠（接种疫苗为福州大北农生产的猪圆环病毒2型灭活疫苗(DBN-SX07株)，批号2015002），0.5mL/只，分4点免疫，第三组作为空白对照组；14天后，第一组按照相同的免疫途径、方法和剂量再一次免疫，第二组不做免疫；
2）第二次免疫后21天，通过心脏采血等方法采集三组豚鼠血液，在室温静置1h后，3500r/min离心15min，在无菌环境下无菌操作分离不少于0.5mL血清；
将收集的无菌血清在56℃水浴锅中灭活30min，然后用MEM维持液将血清按1:4、1:8、1:16、1:32、…1:1024稀释，得到不同稀释度的血清，每个稀释度的血清分别与猪圆环病毒抗原（200TCID50/0.1mL）等量混合，37℃中和1h，得到中和液；
3）用96孔细胞板培养PK-15细胞，当生长密度达到50-80%时，弃去培养液，取0.1mL上述中和液接种于细胞板上，每个稀释度的血清对应得到的中和液分别接种6孔细胞，并在37℃下吸附40min，同时设不中和的病毒阳性对照细胞6孔和接种0.1mL维持液的阴性对照细胞6孔；
4)在细胞板中加入维持液，并置于37℃、含5%CO2培养箱中培养24h，然后弃去细胞板中的维持液，换用新鲜的维持液，继续置于37℃的CO2培养箱中培养24h；
5）弃去细胞板中的培养液，用0.01mol/LpH值7.4PBS洗涤3次，冷丙酮（80%丙酮，20%双蒸水）固定细胞，采用间接免疫荧光法（IFA）测定每个稀释度含有PCV2阳性细胞（细胞为绿色荧光物质着染）的孔数，然后按Reed-Muench法计算血清中和抗体效价，并以此判定猪圆环病毒灭活疫苗效价。
判定标准：本实施例实验动物为普通级或清洁级300-400g猪圆环抗原抗体阴性豚鼠，血清中和抗体效价应>1：64，即按Reed-Muench法计算出的血清中和抗体效价>1：64，则说明效力检验合格。
实施例4
一种猪圆环病毒灭活疫苗效力检验方法，包括以下步骤：
1）取清洁级300-400g猪圆环抗原抗体阴性豚鼠6只，随机分成三组，每组2只，第一组、第二组经肌肉注射法免疫接种豚鼠（接种疫苗为福州大北农生产的猪圆环病毒2型灭活疫苗(DBN-SX07株)，批号2015002），1mL/只，分4点免疫，第三组作为空白对照组；14天后，第一组按照相同的免疫途径、方法和剂量再一次免疫，第二组不做免疫；
2）第二次免疫后14天，通过心脏采血等方法采集三组豚鼠血液，在室温静置1h后，置2-8℃冷藏1h，3000r/min离心20min，在无菌环境下无菌操作分离不少于0.5mL血清；
将收集的无菌血清在56℃水浴锅中灭活30min，然后用MEM维持液将血清按1:4、1:8、1:16、1:32、…1:2048稀释，得到不同稀释度的血清，每个稀释度的血清分别与猪圆环病毒抗原（200TCID50/0.1mL）等量混合，37℃中和0.5h，得到中和液；
3）用96孔细胞板培养PK-15细胞，当生长密度达到50-80%时，弃去培养液，取0.1mL上述中和液接种于细胞板上，每个稀释度的血清对应得到的中和液分别接种6孔细胞，并在37℃下吸附60min，同时设不中和的病毒阳性对照细胞6孔和接种0.1mL维持液的阴性对照细胞6孔；
4)在细胞板中加入维持液，并置于37℃、含5%CO2培养箱中培养24h，然后弃去细胞板中的维持液，换用新鲜的维持液，继续置于37℃的CO2培养箱中培养48h；
5）弃去细胞板中的培养液，用0.01mol/LpH值7.4PBS洗涤3次，冷丙酮（80%丙酮，20%双蒸水）固定细胞，采用间接免疫荧光法（IFA）测定每个稀释度含有PCV2阳性细胞（细胞为绿色荧光物质着染）的孔数，然后按Reed-Muench法计算血清中和抗体效价，并以此判定猪圆环病毒灭活疫苗效价。
判定标准：本实施例实验动物为清洁级300-400g猪圆环抗原抗体阴性豚鼠，血清中和抗体效价应>1：64，即按Reed-Muench法计算出的血清中和抗体效价>1：64，则说明效力检验合格。
实施例5
一种猪圆环病毒灭活疫苗效力检验方法，包括以下步骤：
1)用14-21日龄PCV2抗原和PCV2ELISA抗体阴性的健康易感仔猪15头，随机分为3组，每组5头，第1组肌肉注射疫苗1.0mL（疫苗为福州大北农生产的猪圆环病毒2型灭活疫苗(DBN-SX07株)，批号2015002），14日后用相同剂量进行二次免疫；第2组接种安慰剂（生理盐水）；第3组不接种，作为空白对照，3组猪分别隔离饲养；
2）第二次免疫后21天，通过前腔静脉或心脏采血等方法采集三组猪的血液，在室温静置0.5h后，3000r/min离心10min，在无菌环境下无菌操作分离不少于0.5mL血清；
将收集的无菌血清在56℃水浴锅中灭活30min，然后用MEM维持液将血清按1:4、1:8、1:16、1:32、…1:2048稀释，得到不同稀释度的血清，每个稀释度的血清分别与猪圆环病毒抗原（200TCID50/0.1mL）等量混合，37℃中和0.5h，得到中和液；
3）用96孔细胞板培养PK-15细胞，当生长密度达到50-80%时，弃去培养液，取0.1mL上述中和液接种于细胞板上，每个稀释度的血清对应得到的中和液分别接种6孔细胞，并在37℃下吸附60min，同时设不中和的病毒阳性对照细胞6孔和接种0.1mL维持液的阴性对照细胞6孔；
4)在细胞板中加入维持液，并置于37℃、含5%CO2培养箱中培养24h，然后弃去细胞板中的维持液，换用新鲜的维持液，继续置于37℃的CO2培养箱中培养24-48h；
5）弃去细胞板中的培养液，用0.01mol/LpH值7.4PBS洗涤3次，冷丙酮（80%丙酮，20%双蒸水）固定细胞，采用间接免疫荧光法（IFA）测定每个稀释度含有PCV2阳性细胞（细胞为绿色荧光物质着染）的孔数，然后按Reed-Muench法计算血清中和抗体效价，并以此判定猪圆环病毒灭活疫苗效价。
判定标准：本实施例实验动物为14-21日龄PCV2抗原和PCV2ELISA抗体阴性的健康易感仔猪1，血清中和抗体效价应>1：64，即按Reed-Muench法计算出的血清中和抗体效价>1：64，则说明效力检验合格。

Claims (10)

1.一种猪圆环病毒灭活疫苗效力检验方法，其特征在于：其包括以下步骤：
1)筛选猪圆环抗原抗体阴性动物作为实验动物，用猪圆环病毒灭活疫苗对实验动物进行1-2次免疫，每次1-2头份；
2)最后一次免疫后14-21天，无菌采集实验动物血清，将收集到的血清在56℃下灭活30min，然后用维持液对血清做倍比稀释，得到不同稀释度的血清，每个稀释度的血清分别与猪圆环病毒抗原于37℃环境下中和30-60min，得到中和液；
3)用细胞板培养PK-15细胞，当生长密度达到50-80%时，弃去培养液，取0.1-0.2mL上述中和液接种于细胞板上，每个稀释度的血清中和液分别接种6孔细胞，并在37℃下吸附40-60min，同时设不中和的病毒阳性对照细胞6孔和接种维持液的阴性对照细胞6孔；
4)在细胞板中加入维持液并置于37℃的CO2培养箱中培养24h，然后弃去细胞板中的维持液，换用新鲜的维持液，继续置于37℃的CO2培养箱中培养24h-48h；
5）弃去细胞板中的维持液，细胞采用间接免疫荧光法进行丙酮固定、然后荧光染色、按Reed-Muench法计算血清的中和抗体效价，并以此判定猪圆环病毒灭活疫苗的效价。
2.根据权利要求1所述的一种猪圆环病毒灭活疫苗效力检验方法，其特征在于：所述步骤1）用猪圆环病毒灭活疫苗对实验动物进行2次免疫时，2次免疫时间间隔为14-21天。
3.根据权利要求1所述的一种猪圆环病毒灭活疫苗效力检验方法，其特征在于：所述实验动物为小鼠、豚鼠、猪或兔。
4.根据权利要求1所述的一种猪圆环病毒灭活疫苗效力检验方法，其特征在于：所述步骤1）的免疫为多点免疫，所述多点免疫为2点、3点或4点免疫。
5.根据权利要求1所述的一种猪圆环病毒灭活疫苗效力检验方法，其特征在于：所述步骤2)无菌采集实验动物血清的具体操作为：采集实验动物血液，在室温下静置0.5-2h，然后在2-8℃冷藏1-2h，在3000-3500r/min离心10-15min，在无菌环境下分离不少于0.5mL血清。
6.根据权利要求1所述的一种猪圆环病毒灭活疫苗效力检验方法，其特征在于：所述维持液为MEM维持液。
7.根据权利要求1所述的一种猪圆环病毒灭活疫苗效力检验方法，其特征在于：所述步骤2）的猪圆环病毒抗原的浓度为200TCID50/0.1mL。
8.根据权利要求1所述的一种猪圆环病毒灭活疫苗效力检验方法，其特征在于：所述步骤2）的倍比稀释，稀释至血清与维持液的比例1:1024以上。
9.根据权利要求1所述的一种猪圆环病毒灭活疫苗效力检验方法，其特征在于：所述步骤2）每个稀释度的血清与猪圆环病毒抗原等量混合。
10.根据权利要求1所述的一种猪圆环病毒灭活疫苗效力检验方法，其特征在于：所述细胞板为96孔细胞板。
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