CN104258386B - 一种水貂病毒性肠炎灭活疫苗-犬瘟热活疫苗组合 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种水貂病毒性肠炎灭活疫苗‑犬瘟热活疫苗组合。本发明组合为使用烷化剂作为病毒灭活剂的水貂病毒性肠炎灭活疫苗兼作组合中犬瘟热活疫苗的稀释液；组合中两种疫苗具有特定的配比关系。该疫苗组合相比两种疫苗传统的应用方法达到一针两防(预防水貂病毒性肠炎和犬瘟热)，降低了疫苗成本、减少了动物应激反应、提高了免疫效果、减轻了饲养者的劳动强度从而取得显著的经济效益。

Description

一种水貂病毒性肠炎灭活疫苗-犬瘟热活疫苗组合

技术领域

本发明涉及一种水貂病毒性肠炎灭活疫苗及犬瘟热活疫苗组合。属于兽用生物制品领域。

背景技术

水貂病毒性肠炎是由水貂肠炎病毒(Mink Enteritis Virus，MEV)引起的一种急性、烈性和高度接触性传染病，主要以剧烈腹泻为主要特征，1949年由加拿大学者Sehofield首次发现本病(Schofield F W.Virus enteritis in mink.Am Vet,1949,30:6512654.)。1981年姜廷秀等(姜挺秀，朴厚坤，王喜龙等.疑似水貂病毒性肠炎初报.毛皮动物饲养，1981，(2):224.)首先报道了我国发生水貂病毒性肠炎，此后该病逐渐蔓延全国，给我国养貂业带来巨大的经济损失(高云，宋纯林，吴玉林等水貂病毒性肠炎(MEV)流行病学调查及防治.特产科学实验，1984，(4)33234.)。

犬瘟热是由犬瘟热病毒(Canine distemper virus，CDV)引起的犬科、鼬科和熊科动物的一种高度接触性传染病，病死率30％～80％。犬瘟热病毒为副粘病毒科麻疹病毒属，呈圆形或不整形。直径100～300nm，含有直径为15～17nm的螺旋状核衣壳，外覆一层双轮膜，膜上长1.3nm的纤突。发病率高，几乎可以达到100％，且临床症状多样，容易继发其他细菌、病毒的混合感染和二次感染，死亡率高，素有“毁灭性传染病”之称，对养犬业、毛皮动物养殖业造成巨大损失。自1809年Jeneer首次报道犬瘟热，1905年Carre通过动物接种分离的滤过性致病因子复制出病例以来，各国学者已经对犬瘟热病毒的分离培养、理化特性、流行病学以及免疫与防制作了大量的研究。近年来，其感染范围不断扩大，危害也越来越大，甚至已经有人感染犬瘟热病毒的病例。Mee等也从患Pagets疾病的病人组织中检测出犬瘟热病毒核酸，这使得犬瘟热有可能成为继狂犬病之后犬传播给人的第二种疫病。在我国，随着近几年来军犬、警犬、实验用犬和宠物犬饲养量的大幅度增加，以及异地交流的不断增多，犬瘟热在我国犬中的发病率和致死率也均有升高的趋势，而且临床症状也与以往的表现有所不同。

水貂病毒性肠炎与犬瘟热是毛皮动物养殖中发病率最高的两种疾病，均需要免疫预防，目前这两种疾病均有单独疫苗可以使用。但是由于毛皮动物养殖中，每次免疫均会对动物造成较大的应激，因而寻找一种将两种疫苗联合使用的方法极为重要。由于传统的水貂病毒性肠炎灭活疫苗使用的是甲醛溶液灭活剂，如果与犬瘟热活疫苗共同使用则会造成犬瘟热抗原的失效，无法实现联合使用。

烷化剂属于细胞毒类药物，又称生物烷化剂(Bioalkylating Agengts)，在体内能形成碳正离子或其他具有活泼的亲电性基团的化合物，进而与细胞中的生物大分子中含有丰富电子的基团发生共价结合，使其丧失活性或使DNA分子发生断裂，导致细胞死亡。其中二乙烯亚胺(BEI)可以破坏病毒核酸，不改变病毒蛋白质，而且不同病毒对BEI的抵抗力不尽相同，同时BEI对核酸具有较高的诱变作用。本发明使用BEI溶液作为水貂病毒性肠炎灭活疫苗生产过程中的灭活剂，使得水貂病毒性肠炎灭活疫苗满足了作为犬瘟热活疫苗稀释液进行使用的可能，并通过各种创造性试验，实现了水貂病毒性肠炎灭活疫苗与犬瘟热活疫苗的联合应用。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种水貂病毒性肠炎灭活疫苗-犬瘟热活疫苗组合，将水貂病毒性肠炎灭活疫苗作为犬瘟热活疫苗稀释液，达到降低疫苗成本、减少动物应激、提高经济效益的目的。

为解决上述技术问题，本发明的技术方案在于：

1.一种水貂病毒性肠炎灭活疫苗-犬瘟热活疫苗组合，是由水貂病毒性肠炎灭活疫苗和犬瘟热活疫苗组成，其中水貂病毒性肠炎灭活疫苗兼作犬瘟热活疫苗的稀释剂。

2.一种水貂病毒性肠炎灭活疫苗-犬瘟热活疫苗组合中水貂病毒性肠炎灭活疫苗使用的灭活剂为烷化剂，优选灭活终浓度为0.05％～0.3％的BEI溶液。

3.一种水貂病毒性肠炎灭活疫苗-犬瘟热活疫苗组合中两种疫苗具有每3毫升水貂病毒性肠炎灭活疫苗稀释1头份犬瘟热活疫苗的配比关系，其中水貂病毒性肠炎灭活疫苗灭活前病毒含量为每毫升1.0×10^7.0TCID₅₀以上，犬瘟热活疫苗每头份病毒含量为10^4.5TCID₅₀以上。

4.一种水貂病毒性肠炎灭活疫苗-犬瘟热活疫苗组合中水貂病毒性肠炎灭活疫苗制备步骤包括：

(1)将F81细胞系或者CRFK细胞系进行传代和培养；

(2)将水貂病毒性肠炎病毒接种到长满80％的F81或者CRFK单层细胞的介质上，用维持液培养，制备生产用种毒；

(3)通过微载体平衡、细胞接种及消化转移、细胞罐放大转移使细胞培养扩大至1000L的细胞罐。当细胞密度达到1.5×10⁶cells/ml时，接种水貂肠炎病毒MEV-RC1株，得到水貂病毒性肠炎病毒抗原液；

(4)将水貂病毒性肠炎病毒抗原液分别加入BEI溶液灭活，混合均匀，加入水溶性佐剂，优选灭菌的氢氧化铝胶配苗，即得。

5.组合中水貂病毒性肠炎灭活疫苗制备中使用水貂病毒性肠炎病毒(MinkEnteritis Virus，MEV)为MEV-RC1株该毒株已于2012年04月12日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，编号为：CGMCC No.4331。

具体实施方式

一、水貂病毒性肠炎灭活疫苗

1.水貂病毒性肠炎灭活疫苗的生产制备

(1)生产用毒种制备

取生长良好的F81细胞或者CRFK细胞按常规方法传代，待细胞长成80％单层后，弃去生长液，换以含0.5％～1％MEV-RC1株毒种的维持液(含2％在56℃下灭活30分钟的新生牛血清的MEM)(MEM购自美国Gibco公司，新生牛血清购自济南劲牛生物科技有限公司)，置37℃继续培养，待80％左右的细胞出现典型拉网式病变时收获，冻融1次，定量分装，冷冻保存，注明收获日期、毒种代次等。

(2)制苗用材料的选择

选择生长良好、符合现行《中国兽药典》生产、检验用细胞标准的或者CRFK细胞做为制苗用材料，细胞代次为F6～F35代。

(3)制苗用毒液的繁殖

1)生物反应器清洗灭菌及微载体平衡

将生物反应器清洗干净，121℃灭菌30分钟。灭菌结束后，将灭菌好的微载体打入细胞培养罐中，将平衡培养基MEM打入罐中至最小培养体积，平衡20～24小时。平衡载体期间完成溶氧电极100％点的校正。

2)细胞接种及消化转移

选择生长旺盛的转瓶细胞，用EDTA-胰蛋白酶分散液消化后，用含8％新生牛血清的MEM和微载体(CytodexⅠ型微载体，购自GE公司)悬浮制成细胞悬液，接种30L细胞培养罐，接种密度5.0～6.0×10⁵cells/ml，连续培养2～3天，细胞罐培养过程中当葡萄糖含量低于500mg/L，用含5％新生牛血清的MEM培养基批次换液，当细胞密度达到2.0×10⁶cells/ml以上后进行消化转移，即培养规模的放大。转移前，将在细胞培养罐内连续培养2～3日的或者CRFK细胞取样观察并用0.1％结晶紫染色计数，细胞密度达到2×10⁶cells/ml时，按3～4倍放大到90L细胞罐。

3)细胞罐放大转移

按照上述步骤逐级放大，将90L细胞罐依次放大转移至350L、1000L细胞罐。

4)接毒及收获

1000L细胞罐培养2～3日，细胞密度达到1.5×10⁶cells/ml时，接种水貂肠炎病毒MEV-RC1株，接毒时采用含1％新生牛血清的DMEM培养基，温度37℃，接毒量为MOI＝0.1。接毒后定时取样观察细胞，待微载体表面80％细胞病变突起且有少量脱落时，连续高速搅拌10～15分钟，通过消化器滤除微载体收获病毒液，取样进行病毒含量测定后，收获的病毒液标明名称、收获日期、批号，存放-15℃低温冷库，待检备用。

(4)病毒液灭活

向病毒液中加入2％的BEI溶液，使其终浓度为0.2％，37℃灭活48小时，期间每隔4～8小时混匀1次；灭活完全后，向病毒液中添加50％的硫代硫酸钠溶液，使其终浓度为0.4％，加入后搅拌1小时。

(5)半成品检验

1)无菌检验按现行《中国兽药典》附录进行检验，应无菌生长。

2)病毒含量每毫升病毒含量应不低于10^7.0TCID₅₀。

3)灭活检验将灭活病毒液和MEM按1︰5的比例混合后接种已长成80％单层的或者CRFK单层细胞4瓶(每瓶细胞瓶底面积为5cm×7cm)，每瓶接种1ml，置37℃下吸附30分钟后，换维持液(含2％在56℃下灭活30分钟的新生牛血清的MEM)，继续培养观察4日，应无细胞病变；再盲传1代，仍应无细胞病变。取培养液作血凝试验，应为阴性。

(6)配苗将灭活病毒液和灭菌的氢氧化铝胶(附注3)按9︰1的比例进行配苗，使疫苗中氢氧化铝胶含量以氧化铝表示不超过3.9mg/ml，充分搅拌。

(7)分装定量分装。分装时，应随时搅拌使其混合均匀。

2.成品检验

(1)性状静置后，上层为粉红色液体，下层为淡粉红色沉淀，振摇后呈均匀混悬液。

(2)无菌检验按现行《中国兽药典》附录进行检验，应无菌生长。

(3)装量检查按现行《中国兽药典》附录进行检验，应符合规定。

(4)安全检验用2～10月龄健康易感水貂(MEV HI抗体效价不高于1:4)5只，各皮下注射疫苗3ml，连续观察10日，应全部健活。

(5)效力检验

取2～10月龄健康易感水貂(MEV HI抗体效价不高于1:4)5只，各皮下注射疫苗1ml，同时设不接种对照水貂5只。免疫后14日，对所有水貂分别通过口服途径攻击水貂肠炎病毒MEV-RC1株病毒液15ml(病毒含量为15×10^7.0TCID₅₀)，观察10日。对照水貂应全部发病(附注2)，免疫水貂应全部健活。

(6)汞类防腐剂残留量测定分别按现行《中国兽药典》附录进行测定，应符合兽用生物制品通则的规定。

二、犬瘟热活疫苗

1、犬瘟热活疫苗的生产制备

(1)生产用种毒的制备

犬瘟热病毒株CDV-11株接种转瓶上的Vero细胞单层，接毒量为维持液量的2％，当细胞病变达80％时即可收获，再传1代，制备生产用种毒。

(2)病毒液的繁殖

用生产用种毒，接种到转瓶上的Vero细胞单层，接毒量为细胞维持液的2％。然后将转瓶细胞置37℃培养，转速为8～10r/h。

接种后，每天观察细胞病变情况，当细胞病变达80％左右时即可收获，冻融1次，置－15℃冻结保存，此为半成品。

(3)冻干

经过半成品合格检验合格后，用常规冻干保护剂(《中国兽药典》)与病毒液的体积比按照1:1混合，分装成2ml/瓶，按照设计好的冻干曲线进行冻干，即：-65℃，维持2小时使疫苗迅速冻结，然后抽真空，当真空度达13.3Pa时，开始升温干燥，升华阶段产品温度为－20～－10℃，搁板温度为8℃，升华时间为10个小时；解析温度为30℃，2个小时。

2、犬瘟热活疫苗的成品检验

(1)无菌检验应无菌生长。按《中国兽药典》中的规定进行检验。

(2)支原体检验按《中国兽药典》中的规定进行检验，应无支原体生长。

(3)鉴别检验将疫苗作10^-2稀释，与等量10^-1稀释的犬瘟热阳性血清混合，经37℃中和30分钟，接种Vero细胞4瓶，同时设病毒对照组2瓶，置37℃培养，连续观察CPE 96～120小时。

(4)外源病毒检验按《中国兽药典》中的规定进行检验，应无外源病毒。

(5)安全检验将每头份疫苗用1ml生理盐水溶化后，肌肉接种2～3月龄易感犬(SN抗体效价≤1:4)5只，10头份/只，观察21日。

(6)效力检验用含2％新生牛血清的MEM将疫苗溶化，使每1ml疫苗含1头份，然后作10倍递进稀释，取10^-2、10^-3、10^-4、10^-54个稀释度，分别接种已长成单层的Vero细胞96孔微量细胞培养板，每个稀释度接种8个孔，每孔100μl，同时设不接毒对照，置37℃、5％二氧化碳培养箱中培养，观察96～120小时，记录细胞病变(CPE)孔数，按Reed-Muench法计算TCID₅₀，应达到10^4.5TCID₅₀。

(7)剩余水分测定每批冻干制品任抽4个样品，各样品剩余水分均不应超过4％。如果有超过时，可重检1次，重检后如有1个样品超过规定，该批制品应判为不合格(《中国兽药典》)。

(8)真空度测定包装前测定真空度，无真空的制品，应予剔除报废，不得重抽空出售(《中国兽药典》)。

三、组合方法

按照3毫升水貂病毒性肠炎灭活疫苗稀释1头份犬瘟热活疫苗(本发明人自行生产，生产批准文号：兽药生字(2010)150256017)的比例，将水貂病毒性肠炎灭活疫苗做为犬瘟热活疫苗的稀释液，配比后进行使用。

其中，水貂病毒性肠炎灭活疫苗灭活前病毒含量为每毫升1.0×10^7.0TCID₅₀/ml以上；犬瘟热活疫苗病毒含量为10^4.5TCID₅₀/头份以上。

本发明涉及的微生物菌种

本发明涉及到的水貂病毒性肠炎病毒(Mink Enteritis Virus，MEV)MEV-RC1株已于2012年04月12日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，编号为：CGMCC No.4331；

本发明涉及到的犬瘟热病毒(Canine distemper virus，CDV)CDV-11株已于2009年07月15日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，编号为：CGMCC No.3201。

本发明的积极意义

本发明提供一种水貂病毒性肠炎灭活疫苗及犬瘟热活疫苗组合。本发明利用BEI灭活后可以用硫代硫酸钠中和的特点，使用BEI灭活剂灭活水貂病毒性肠炎灭活疫苗，并按一定比例稀释犬瘟热活疫苗进行组合，达到了降低疫苗成本、减少动物应激、提高经济效益、减轻了饲养者的劳动强度的目的。该发明有以下优点：

1.犬瘟热活疫苗的目前应用中，往往是冻干产品，需要单独配制适用的疫苗稀释液；水貂病毒性肠炎灭活疫苗的目前应用中，往往是甲醛灭活的液体疫苗，也只能是单独使用。

而本发明中，两种疫苗产品的应用采用BEI灭活的水貂病毒性肠炎灭活疫苗稀释犬瘟热活疫苗的方法，直接省去了犬瘟热活疫苗的疫苗稀释液，降低了疫苗成本。

2.与传统生产工艺相比，水貂病毒性肠炎灭活疫苗灭活剂由甲醛溶液改为BEI溶液，BEI作用于病毒核酸，不破坏病毒的抗原蛋白，不影响病毒免疫原性。由于采用BEI对病毒也进行灭活后，可以使用硫代硫酸钠将BEI灭活剂中和，因此灭活病毒后无残留，相比甲醛溶液灭活，对动物应激小、安全性好。

3.本发明利用了使用BEI灭活剂灭活病毒后无残留的特点，使得灭活疫苗与活疫苗的组合后共同使用成为了可能，且疫苗组合免疫效果优于原两种单苗分别免疫的效果。

4.本发明两种疫苗产品的组合，能够将以往两种疫苗产品单独应用时饲养者需要一次捕抓动物注射两针降低为注射1针，减轻了疫苗免疫的劳动强度。

实施例

以下实施例进一步说明本发明。

实施例1

——生产用毒种制备

1、毒种繁殖取生长良好的F81细胞或者CRFK细胞按常规方法传代，待细胞长成80％单层后，弃去生长液，换以含1％毒种的维持液(含2％在56℃下灭活30分钟的新生牛血清的MEM)，置37℃继续培养，待80％左右的细胞出现典型拉网式病变时收获，冻融1次，定量分装，冷冻保存，注明收获日期、毒种代次等。

2、毒种鉴定符合以上标准的毒种作为生产用毒种。

3、毒种继代不超过3代。

4、毒种保存-15℃以下保存，有效期为24个月。

实施例2

——水貂病毒性肠炎灭活疫苗的制造

1、制苗用材料的选择

选择生长良好、符合现行《中国兽药典》生产、检验用细胞标准的F81细胞或者CRFK细胞做为制苗用材料，细胞代次为F6～F35代。

2、制苗用毒液的繁殖

(1)生物反应器清洗灭菌及微载体平衡将生物反应器清洗干净，121℃灭菌30分钟。灭菌结束后，将灭菌好的微载体打入细胞培养罐中，将平衡培养基MEM打入罐中至最小培养体积，平衡24小时。平衡载体期间完成溶氧电极100％点的校正。

(2)细胞接种及消化转移选择生长旺盛的转瓶细胞，用EDTA-胰蛋白酶分散液消化后，用含8％新生牛血清的MEM悬浮制成细胞悬液，接种30L细胞培养罐，接种密度5.0×10⁵cells/ml，连续培养3天，细胞罐培养过程中当葡萄糖含量低于500mg/L，用含5％新生牛血清的MEM培养基批次换液，当细胞密度达到2.0×10⁶cells/ml以上后进行消化转移，即培养规模的放大。转移前，将在细胞培养罐内连续培养，或者CRFK细胞取样观察并用0.1％结晶紫染色计数，细胞密度达到2×10⁶cells/ml时，按3倍放大到90L细胞罐。

(3)细胞罐放大转移按照上述步骤逐级放大，将90L细胞罐依次放大转移至350L、1000L细胞罐。

(4)接毒及收获1000L细胞罐培养至细胞密度达到1.5×10⁶cells/ml时，接种水貂肠炎病毒MEV-RC1株，接毒时采用含1％新生牛血清的DMEM培养基，温度37℃，接毒量为MOI＝0.1。接毒后定时取样观察细胞，待微载体表面80％细胞病变突起且有少量脱落时，连续高速搅拌15分钟，通过消化器滤除微载体收获病毒液，取样进行病毒含量测定后，收获的病毒液标明名称、收获日期、批号，存放-15℃低温冷库，待检备用。

3、灭活向病毒液中加入2％的BEI溶液，使其终浓度为0.2％，37℃灭活48小时，期间每隔4～8小时混匀1次；灭活完全后，向病毒液中添加50％的硫代硫酸钠溶液，使其终浓度为0.4％，加入后搅拌1小时。

4、配苗将灭活病毒液和灭菌的氢氧化铝胶(附注3)按9︰1(V/V)比例进行配苗，使疫苗中氢氧化铝胶含量以氧化铝表示不超过3.9mg/ml，充分搅拌。

5、分装、贴签、入库保存。

实施例3

——水貂病毒性肠炎灭活疫苗的成品检验

(1)性状静置后，上层为粉红色液体，下层为淡粉红色沉淀，振摇后呈均匀混悬液。

(2)无菌检验无菌生长。

(3)装量检查按现行《中国兽药典》附录进行检验，均符合规定。

(4)安全检验用5月龄健康易感水貂(MEV HI抗体效价不高于1︰4)5只，各皮下注射疫苗3ml，连续观察10日，均未出现异常，全部健活。

(5)效力检验

取5月龄健康易感水貂(MEV HI抗体效价不高于1︰4)5只，各皮下注射疫苗1ml，同时设不接种对照水貂5只。免疫后14日，对所有水貂分别通过口服途径攻击水貂肠炎病毒MEV-RC1株病毒液15ml(病毒含量为15×10^7.0TCID₅₀)，观察10日。对照水貂全部发病，免疫水貂全部健活。

(6)汞类防腐剂残留量测定分别按现行《中国兽药典》附录进行测定，测定结果为：未检出。

实施例4

——犬瘟热活疫苗的制备

1、生产用种毒的制备

犬瘟热病毒株CDV-11株接种转瓶上的Vero细胞单层，接毒量为维持液量的2％，当细胞病变达80％时即可收获，再传1代，制备生产用种毒。

2、病毒液的繁殖

用生产用种毒，接种到转瓶上的Vero细胞单层，接毒量为细胞维持液的2％。然后将转瓶细胞置37℃培养，转速为10r/h。

接种后，每天观察细胞病变情况，当细胞病变达80％左右时即可收获，冻融1次，置-15℃冻结保存，此为半成品。

3、冻干

经过半成品合格检验合格后，用常规冻干保护剂(《中国兽药典》)与病毒液的体积比按照1:1混合，分装成2ml/瓶，按照设计好的冻干曲线进行冻干，即：-65℃，维持2小时使疫苗迅速冻结，然后抽真空，当真空度达13.3Pa时，开始升温干燥，升华阶段产品温度为-20～-10℃，搁板温度为8℃，升华时间为10个小时；解析温度为30℃，2个小时。

实施例5

——犬瘟热活疫苗的成品检验

(1)无菌检验无菌生长。

(2)支原体检验无支原体生长。

(3)鉴别检验将疫苗作10^-2稀释，与等量10^-1稀释的犬瘟热阳性血清混合，经37℃中和30分钟，接种Vero细胞4瓶，同时设病毒对照组2瓶，置37℃培养，连续观察CPE 96～120小时。中和组和细胞对照组均未出现CPE，不中和对照组全部出现CPE。

(4)外源病毒检验按《中国兽药典》中的规定进行检验，均无外源病毒。

(5)安全检验将每头份疫苗用1ml生理盐水溶化后，肌肉接种3月龄易感犬(SN抗体效价≤1:4)5只，10头份/只，观察21日，5只接种易感犬均未出现异常反应。

(6)效力检验每头份疫苗病毒含量为10^5.57TCID₅₀。

(7)剩余水分测定4个样品结果为：1.84％、1.81％、1.73％、1.80％。

实施例6

——水貂病毒性肠炎灭活疫苗加倍剂量安全性比较试验

取2月龄水貂30只，随机分为3组。第1组后腿部肌肉注射一针本发明疫苗组合3ml(10头份犬瘟热活疫苗用3ml水貂病毒性肠炎灭活疫苗稀释)，第2组左右后腿内侧肌肉分别免疫犬瘟热活疫苗10头份和水貂病毒性肠炎灭活疫苗3ml作为疫苗对照，第3组不免疫作为空白对照。分别隔离饲养，观察10日，观察水貂精神、饮食变化。并在14日时将所有水貂剖杀作病理学检查。

结果一针两防免疫组接种水貂精神、饮食均正常；体温无明显变化，均在正常38.5℃～39.4℃范围内，与对照水貂各项指标无明显差别；接种部位没有出现肿胀、坏死，无全身不良反应；免疫后14日将所有水貂剖杀，免疫组接种部位均未出现肿块和溃疡等不良反应。

实施例7

——疫苗组合与各自单苗对水貂免疫效力比较试验

取2月龄水貂30只，随机分为3组。第1组(疫苗组合免疫组)腿部肌肉注射一针两防疫苗1ml(1头份犬瘟热活疫苗用3ml水貂病毒性肠炎灭活疫苗稀释)，第2组(免疫对照组)两侧腿部肌肉分别免疫2种疫苗(福尔马林灭活的水貂肠炎灭活疫苗1ml、犬瘟热活疫苗0.33头份/1ml)，第3组不免疫作为空白对照。免疫后21天，采血，分别测定犬瘟热、水貂病毒性肠炎病毒抗体效价。

结果显示一针两防免疫方式抗MEV HI值与CDVSN抗体值均达到保护要求，且均高于两种疫苗分别注射免疫方式。具体结果见表1。

表1疫苗组合与各自单苗对水貂免疫效力比较试验结果

注：水貂病毒性肠炎灭活疫苗免疫剂量：水貂每头份1ml，狐狸每头份3ml；犬瘟热活疫苗免疫剂量：水貂每头份1/3头份，狐狸每头份1头份。

结果显示该疫苗组合一针两防免疫组抗MEV HI值与CDVSN抗体值均高于两种疫苗分别注射免疫方式。

实施例8

——BEI灭活制备的水貂病毒性肠炎灭活疫苗与甲醛溶液灭活制备的水貂病毒性肠炎灭活疫苗应用比较试验

分别用BEI灭活制备的水貂病毒性肠炎灭活疫苗、甲醛溶液灭活制备的水貂病毒性肠炎灭活疫苗以及犬瘟热活疫苗专用稀释液(对照)将犬瘟热活疫苗进行稀释，稀释完毕后分别于25℃、37℃各放置30分钟、1小时、2小时、4小时，放置时间结束后立即进行犬瘟热活疫苗病毒含量测定。

具体结果见表2。

表2犬瘟热活疫苗中病毒含量测定结果

注：“BEI灭活”表示用BEI灭活的水貂病毒性肠炎灭活疫苗稀释犬瘟热活疫苗；“甲醛灭活”表示甲醛溶液灭活的水貂病毒性肠炎灭活疫苗稀释犬瘟热活疫苗；“稀释液”表示犬瘟热活疫苗专用稀释液稀释犬瘟热活疫苗。

结果表明，用BEI灭活的水貂病毒性肠炎灭活疫苗稀释犬瘟热活疫苗，病毒含量与用犬瘟热专用稀释液稀释无显著差异，用甲醛溶液灭活的水貂病毒性肠炎灭活疫苗稀释犬瘟热活疫苗，病毒含量为0，表明BEI灭活的水貂病毒性肠炎灭活疫苗稀释犬瘟热活疫苗(一针两防)安全、高效。

附注

1.水貂肠炎病毒血凝(HA)试验和血凝抑制(HI)试验操作方法

(1)1％猪红细胞悬液的制备采集健康青年猪血液，与等量阿氏液混合，用生理盐水反复洗涤3次，每次以1500r/min离心10分钟，将沉积的红细胞用PBS(pH值为6.4)配制成1％红细胞悬液(每次现用现配)。

(2)HA试验

1)在微量板上，从第1孔至第12孔，每孔用移液器加入0.025ml PBS(pH值6.4)，用移液器吸取抗原液0.025ml加入第1孔，依次作2倍系列稀释，至最后1个孔，弃去移液器内0.025ml液体。

2)每孔加入1％猪红细胞悬液0.025ml，并设不加抗原液的红细胞对照孔，立即将微量板在振荡器上摇匀，在2～8℃下静置30分钟后判定结果。

3)以使50％红细胞凝集的最高稀释度作为判定终点。

(3)HI试验

1)8单位抗原的配制举例：如果抗原凝集价测定结果为1︰1024，8个血凝单位(即8HA)＝1024/8＝128(即1︰128)。取生理盐水12.7ml，加抗原0.lml，使抗原最终浓度为1︰128。

2)HI试验

①将血清在56℃下灭能30分钟后，取0.1ml，加入0.2ml PBS(pH值为6.4)和0.1ml25％白陶土溶液，在室温下作用20分钟后，以3000r/min离心15分钟，除去沉积的白陶土，取0.05ml猪红血球泥，加至处理过的血清中，轻轻摇动，室温下吸附1小时，以3000r/min离心15分钟，收集上清液，作为原始血清样品的1︰4稀释液。

②血凝抑制试验取V型96孔微量血凝板1块，用移液器向第1排的1～12孔内各加稀释液0.025ml，用移液器将待检血清0.025ml加入第1孔，混匀后移至第2孔，如此逐孔稀释到第10孔。第11孔不加待检血清，作为病毒对照，第12孔不加待检血清，作为红细胞对照。除第12孔外，再向每孔加8单位血凝抗原0.025ml，振荡混匀后于37℃感作1小时，再加1％猪红细胞悬液0.025ml，经振荡混匀，在2～8℃下静置30分钟后判定。以100％抑制红细胞凝集的最高血清稀释度作为该血清的血凝抑制效价。

2.水貂病毒性肠炎发病标准

①腹泻，粪便稀软、呈黄色、灰白或粉红色甚至煤焦油状。

②体温升高至40℃以上，并持续2日以上。

③精神沉郁，食欲减退或废绝。

④粪便对猪红细胞血凝(HA)效价不低于1︰128。

具备第①项和②～④项中任何两项时，判为发病。

3.氢氧化铝胶质量标准

(1)性状淡灰白色、无臭、细腻的胶体，薄层呈半透明，静置能析出少量水分，不得含有异物，不应有霉菌生长或变质。

(2)胶态将灭菌后的铝胶，用去离子水稀释至终浓度为0.4％(按铝胶中所含氧化铝量计算)，取25ml装入直径17mm的平底量筒或有刻度的平底玻璃管中，室温中静置24小时，其沉淀物应不少于4ml。

(3)酸碱度取灭菌后的铝胶用去离子水作5倍稀释，用酸度计或比色法测定，pH值应为6.0～7.2。

(4)吸附力准确称取灭菌后的铝胶2g，于1000ml带磨口玻塞的三角瓶中，加0.077％刚果红(刚果红标准品统一由中监所发给)溶液40ml，猛烈振荡5分钟，以定性滤纸(由中国兽医药品监察所指定)滤入50ml之纳氏比色管中。滤液应为透明无色；若有颜色，其颜色与1500倍稀释的标准管比较，不得更红。

(5)氧化铝含量铝胶中氧化铝的含量按照《中华人民共和国兽药典》氢氧化铝含量测定项下的方法测定，应不高于3.9％。

(6)硫酸盐含量按照《中华人民共和国兽药典》方法测定，应不高于0.4％。

(7)氯化物含量按照《中华人民共和国兽药典》方法测定，应不高于0.3％。

(8)砷盐含量按照《中华人民共和国兽药典》方法测定，应不高于0.8％。

(9)重金属含量按照《中华人民共和国兽药典》方法测定，应不高于5％。

(10)含氨量应不高于0.01％。

4.二乙烯亚胺(BEI)溶液制备

BEA2.05g+100ml 0.2M浓度的NaOH溶液，37℃水浴1小时，环化成2％的BEI溶液。

Claims (4)

1.一种水貂病毒性肠炎灭活疫苗-犬瘟热活疫苗组合，其特征在于该组合是由水貂病毒性肠炎灭活疫苗和犬瘟热活疫苗组成，其中使用灭活剂为烷化剂的水貂病毒性肠炎灭活水溶性佐剂疫苗兼作犬瘟热活疫苗的稀释剂。

2.权利要求1所述的一种水貂病毒性肠炎灭活疫苗-犬瘟热活疫苗组合，其特征在于组合中两种疫苗具有每3毫升水貂病毒性肠炎灭活疫苗稀释1头份犬瘟热活疫苗的配比关系，其中水貂病毒性肠炎灭活疫苗灭活前病毒含量为每毫升1.0×10^7.0TCID₅₀以上、犬瘟热活疫苗每头份病毒含量为10^4.5TCID₅₀以上。

3.权利要求1所述的水貂病毒性肠炎灭活疫苗-犬瘟热活疫苗组合，其特征在于所述烷化剂为灭活终浓度为0.05％～0.3％的BEI溶液。

4.权利要求1所述的水貂病毒性肠炎灭活疫苗-犬瘟热活疫苗组合，其特征在于是其中的水貂病毒性肠炎病毒为MEV-RC1株，保藏号为CGMCC No.4331。