CN102000327A

CN102000327A - 一种水貂病毒性肠炎灭活疫苗及其制备方法

Info

Publication number: CN102000327A
Application number: CN 201010566499
Authority: CN
Inventors: 禚宝山; 王蕾; 徐龙涛; 宋晓飞; 魏联果; 孙培录; 李营; 秦绪伟; 吴昊
Original assignee: Qilu Animal Health Products Co ltd
Current assignee: Qilu Animal Health Products Co ltd
Priority date: 2010-12-01
Filing date: 2010-12-01
Publication date: 2011-04-06
Anticipated expiration: 2030-12-01
Also published as: CN102000327B

Abstract

本发明涉及一种水貂病毒性肠炎灭活疫苗及其制备方法。本发明利用自行分离、鉴定、保存的一株水貂肠炎病毒MEV-RC1株作为生产疫苗的病毒株，通过在F81细胞上进行病毒繁殖，经过收获、灭活、配苗等步骤，制备出安全、有效的水貂病毒性肠炎灭活疫苗。本发明采用的制苗毒株能够针对目前疾病流行情况，有效预防水貂病毒性肠炎的发生，为毛皮动物疾病的控制创造条件。

Description

一种水貂病毒性肠炎灭活疫苗及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种水貂病毒性肠炎灭活疫苗及其制备方法，属于兽医生物制品技术领域。

背景技术

水貂病毒性肠炎是由细小病毒科细小病毒属水貂肠炎病毒(Parvoviridae Parvovirus Mink enteritis virus，MEV)引起的一种急性、高度接触性传染病，是世界上公认的危害水貂饲养业较为严重的病毒性传染病之一。病貂和耐过貂是水貂病毒性肠炎的主要传染源，本病常呈暴发性地方流行，各种年龄、性别水貂均有感染性，无明显的季节性，全年均能发生。水貂病毒性肠炎的发病率和死亡率在50％～90％左右，其中幼龄仔貂的病死率最高。水貂细小病毒病毒对外界环境有较强的抵抗力，病毒在污染的貂笼舍中，自然环境条件下能保持毒力一年。

本病在上世纪40年代末到50年代，严重的威协着国外养貂场(加拿大、丹麦、瑞典)。我国首次发生在1980年，山东省1984年(荣成)首次发生，1984-1989年该病扩散、蔓延，对我省造成很大损失。目前，全国毛皮动物的养殖量已超过9000万只，其中水貂的养殖量约占毛皮动物养殖总量的一半。由于水貂病毒性肠炎无特效的治疗方法，应用疫苗进行预防显得尤为重要。选育出毒力强、免疫原性好的水貂肠炎病毒国内流行毒株，并研制出安全、有效的水貂病毒性肠炎灭活疫苗是控制水貂病毒性肠炎的有效方法。

本发明的目的是利用本发明人自行分离、鉴定、保存的一株水貂肠炎病毒MEV-RC1株作为生产疫苗的病毒株，制备出一种安全、有效的水貂病毒性肠炎灭活疫苗。

发明内容

本发明的目的是利用本发明人自行分离、鉴定、保存的一株水貂肠炎病毒MEV-RC1株作为生产疫苗的病毒株，通过在F81在进行病毒繁殖，经过收获、灭活、配苗等步骤，制备出安全、有效的水貂病毒性肠炎灭活疫苗。

1.疫苗生产用毒株

(1)病毒来源

疫苗制造及检验用毒种为水貂肠炎病毒(Mink enteritis virus)MEV-RC1株细胞毒，由本发明人分离、鉴定、保管和供应，该株病毒已于2010年11月11日送交北京朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所内中国微生物保藏委员会普通微生物保藏中心，保臧编号为：CGMCC No.4331。

(2)病毒株特性

1)病毒含量

将毒种用含2％在56℃下灭活30min的新生牛血清的细胞营养液(MEM)作10倍系列稀释，取10^-5、10^-6、10^-7、10^-84个稀释度，各接种长成80％单层的猫肾传代细胞(F81，本发明人实验室保藏)96孔微量细胞培养板，每个稀释度接种8个孔，每孔100μl，同时设不接毒对照孔，置37℃、含5％CO₂培养箱中培养96～120小时，观察记录细胞病变(CPE)孔数，按Reed-Muench法计算TCID₅₀，每毫升病毒含量≥10^7.0TCID₅₀。

2)血凝性

对1％猪红细胞的HA效价≥1∶128。

3)毒力

将毒种口服接种2～10月龄健康易感水貂(抗MEV HI抗体≤1∶4)5只，每只15ml(含15×10^7.0TCID₅₀)，接种后观察10日，可全部发病。

4)免疫原性

将毒种接种F81细胞培养，收获细胞培养物，经甲醛溶液灭活后，制成氢氧化铝胶灭活疫苗，分别皮下接种2～10月龄健康易感水貂(抗MEV HI抗体≤1∶4)5只，每只1ml，同时设不接种对照水貂5只。免疫后14日采血，分离血清，分别测定抗MEV HI抗体，免疫水貂抗MEV HI抗体均≥1∶32，对照水貂抗MEV HI抗体均≤1∶4；同时所有貂口服水貂肠炎病毒MEV-RC1株病毒液15ml/只(含15×10^7.0TCID₅₀)，连续观察10日，对照水貂全部发病，免疫水貂全部健活。

5)纯净

按《中华人民共和国兽药典》(中国兽药典委员会.二○○五年版三部.中国农业出版社，2006，本发明简称为《中国兽药典》)规定方法进行检验，无细菌、霉菌、支原体及外源病毒污染。

6)特异性

将毒种用用生理盐水作1000倍稀释，与等量10倍稀释(用生理盐水)的水貂肠炎病毒特异性抗血清(由解放军军需大学提供)混合，在37℃下中和1小时，接种已长成80％单层的F81细胞24孔细胞培养板，共接种12孔，每孔0.5ml。同时设不中和对照组(将毒种作1000倍稀释与等量的MEM混合和正常细胞对照组，各接种6孔，每孔0.5ml，置37℃、含5％CO₂培养箱培养96～120小时，中和组和正常细胞对照不出现CPE，不中和对照组全部出现CPE。

7)基础种子代次

C6～C15代。

8)毒种保存

-15℃以下保存，保存期为24个月；-70℃以下保存，保存期为60个月。

2.水貂病毒性肠炎灭活疫苗的生产制备

(1)将生长良好的F81细胞按常规方法传代，待细胞长成80％单层后，倾去生长液，换以含1％毒种的维持液(含2％新生牛血清的MEM)，置37℃继续培养，转瓶转速为8～10r/h。

(2)接种后，每日观察细胞病变，当细胞病变(CPE)达80％左右时即可收获，冻融1次，置-15℃以下冻结保存，待检备用。

(3)按病毒液总量的0.3％加入甲醛溶液，充分混匀，置37℃下灭活，待温度升至37℃开始计时，灭活48小时，期间每隔4～8小时混匀1次。

(4)经过半成品检验合格后，将灭活病毒液和灭菌的氢氧化铝胶按9∶1比例进行配苗，再加入1％的硫柳汞溶液，使其终浓度为0.01％，充分混匀。

(5)定量分装，分装时，随时搅拌使其混合均匀。

3.水貂病毒性肠炎灭活疫苗的检验方法

(1)性状本品静置后，上层为粉红色液体，下层为淡粉红色沉淀，振摇后呈均匀混悬液。

(2)无菌检验按《中国兽药典》规定的方法进行检验，应无菌生长。

(3)安全检验用2～10月龄健康易感水貂5只，各皮下注射疫苗3ml，连续观察10日，应全部健活。

(4)效力检验用2～10月龄健康易感水貂5只，各皮下注射疫苗1ml，同时设不接种对照水貂5只。免疫后14日采血，分离血清，分别测定抗MEV HI抗体，免疫水貂抗MEV HI抗体均应≥1∶32，对照水貂抗MEV HI抗体均应≤1∶4。

(5)甲醛和汞类防腐剂残留量测定按《中国兽药典》附录进行测定，应符合兽用生物制品通则的规定。

4.水貂病毒性肠炎灭活疫苗安全性试验

(1)最小使用日龄水貂一次单剂量接种疫苗的安全性试验取49日龄健康易感水貂20只，随机分成4组，5只/组。前3组分别皮下接种本发明人按本发明提供的方法制备的3个批次的疫苗(第1批、第2批和第3批)，1ml/只；第4组不接种作为对照。相同条件下饲养，观察10日，每日观察水貂精神、饮食、粪便是否正常，注射部位及全身有无不良反应。

经皮下途径一次单剂量接种水貂后，水貂精神状态、饮食、粪便均正常，注射部位及全身未见不良反应，所有水貂均健活。具体试验结果如表1：

表1 疫苗对最小使用日龄水貂一次单剂量接种的安全性试验结果

(2)单剂量重复接种疫苗的安全性试验取49日龄健康易感水貂20只，随机分成4组，5只/组。前3组分别皮下接种以上本发明人制备的3个批次的疫苗，1ml/只，14日后加强免疫一次，1ml/只；第4组不接种作为对照。相同条件下饲养，观察10日，每日观察水貂精神、饮食、粪便是否正常，注射部位及全身有无不良反应。

经皮下途径重复接种疫苗后，水貂精神状态、饮食、粪便均正常，注射部位及全身未见不良反应，所有水貂均健活。具体试验结果见表2：

表2 单剂量重复接种疫苗的安全性试验结果

(3)一次超剂量接种疫苗的安全性试验取49日龄健康易感水貂20只，随机分成4组，5只/组。前3组分别皮下接种3个批次疫苗，3ml/只；第4组不接种作为对照。相同条件下饲养，观察10日，每日观察水貂精神、饮食、粪便是否正常，注射部位及全身有无不良反应。

经皮下途径一次超剂量接种水貂后，水貂精神状态、饮食、粪便均正常，注射部位及全身未见不良反应，所有水貂均健活，具体试验结果见表3。

表3 一次超剂量接种疫苗的安全性试验结果

(4)疫苗对怀孕母貂的安全性试验取怀孕母貂10只，随机分成2组，5只/组。第1组于产前20日皮下接种疫苗，3ml/只；第2组不接种作为对照。相同条件下饲养，观察10日，每日观察水貂精神、饮食、粪便是否正常，注射部位及全身有无不良反应，并跟踪观察其产仔情况。

怀孕母貂于产前20日经皮下超剂量接种后，母貂精神状态、饮食、粪便均正常，注射部位及全身末见不良反应，所有水貂均健活，且产仔正常。具体结果见表4。

表4 疫苗对怀孕母貂一次超剂量接种的安全性试验结果

(5)结论

用3批水貂病毒性肠炎灭活疫苗(MEV-RC1株)进行了一次单剂量接种的安全试验、单剂量重复接种的安全性试验、一次超剂量接种的安全试验及对怀孕母貂一次超剂量接种的安全性试验，结果均是安全的。表明该疫苗用于免疫接种水貂是安全的。

5.水貂病毒性肠炎灭活疫苗效力试验

取以上本发明人制备的3批水貂病毒性肠炎灭活疫苗(MEV-RC1株)，使用前将疫苗分别用铝胶水稀释至一定剂量。

取健康易感水貂20只，随机分为4组，5只/组。1、2、3组水貂分别皮下免疫3批疫苗1.0ml/只，对照组不进行免疫。3个免疫组和对照组在免疫后14日口服细胞培养MEV-RC1株强毒液15ml(含15×10^7.0TCID₅₀)攻毒，观察10日，记录发病情况。

3批疫苗试验结果无明显差异。疫苗免疫后14日，对水貂肠炎病毒MEV-RC1株强毒的攻毒保护率均为100％，具体结果见表5。

表5 疫苗效力试验结果

本发明的优点

本发明是利用本发明人自行分离、鉴定、保存的一株貂肠炎病毒MEV-RC1株作为生产疫苗的病毒株，通过在F81细胞上进行病毒繁殖，经过收获、灭活、配苗等步骤，制备出安全、有效的水貂病毒性肠炎灭活疫苗。本发明采用的制苗毒株能够针对目前疾病流行情况，有效预防水貂病毒性肠炎的发生，为毛皮动物疾病的控制创造条件。

实施例

以下实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。

实施例1

病毒毒种的纯净性检验

1.无菌检验按《中国兽药典》规定的方法对水貂肠炎病毒MEV-RC1株C1代～C20代毒种进行无菌检验，各代毒种无菌检验结果均合格，表明水貂肠炎病毒MEV-RC1株毒种未受细菌和霉菌污染。

2.支原体检验按《中国兽药典》规定的方法对水貂肠炎病毒MEV-RC1株C2代原始种毒，C6、C10和C15代基础种毒进行支原体检验，经过5日、10日、15日培养，观察液体培养基无颜色变化，再经移植后培养14日观察，支原体液体培养基仍然无颜色变化；接种毒种的琼脂平板上均未出现支原体菌落。表明水貂肠炎病毒MEV-RC1株毒种无支原体污染。

3.外源病毒检验按照《中国兽药典》要求，对水貂肠炎病毒MEV-RC1株C2代原始种毒，C6、C10和C15代基础种毒进行了狂犬病病毒、牛病毒性腹泻病毒、阿留申病毒、腺病毒、犬瘟热病毒的检测。

采用免疫荧光法检测BVDV，结果未发现BVDV荧光细胞颗粒，表明水貂肠炎病毒MEV-RC1株无BVDV污染；用间接免疫荧光法检测狂犬病病毒(RV)，结果未发现狂犬病病毒(RV)荧光细胞颗粒，表明水貂肠炎病毒MEV-RC1株无RV污染；通过F81细胞、MDCK细胞、Vero细胞三种单层细胞检验阿留申病毒、腺病毒、犬瘟热病毒，结果表明水貂肠炎病毒MEV-RC1株中无阿留申病毒、腺病毒、犬瘟热病毒污染。红细胞吸附试验结果表明无吸附红细胞的外源病毒污染。

以上结果表明，水貂肠炎病毒MEV-RC1株毒种无外源病毒污染。

实施例2

疫苗的制造

1.毒种繁殖

将生长良好的F81细胞按常规方法传代，待细胞长成80％单层后，倾去生长液，换以含1％毒种的维持液(含2％灭能新生牛血清的MEM)，置37℃继续培养，待80％左右的细胞出现典型拉网式病变时收获，冻融1次，定量分装，冷冻保存，注明收获日期、毒种代次等。

2.制苗用材料的选择

选择生长良好的F81细胞做为制苗用材料。

3.制苗用毒液的繁殖

将生长良好的F81细胞按常规方法传代，待细胞长成80％单层后，倾去生长液，换以含1％毒种的维持液(含2％灭能新生牛血清的MEM)，置37℃继续培养，转瓶转速为8～10r/h。接种后，每日观察细胞病变，当细胞病变(CPE)达80％左右时即可收获，冻融1次，置-15℃以下冻结保存，待检备用。

4.灭活

按病毒液总量的0.3％加入甲醛溶液，充分混匀，置37℃下灭活，待温度升至37℃开始计时，灭活48小时，期间每隔4～8小时混匀1次。

5.半成品检验

无菌检验按《中国兽药典》附录进行检验，无菌生长。

病毒含量测定病毒液每毫升病毒含量≥10^7.0TCID₅₀。

灭活检验将灭活病毒液和MEM按1∶5的比例稀释后接种已长成80％单层的F81细胞4瓶(每瓶细胞瓶底面积为5cm×7cm)，每瓶接种1ml，置37℃下吸附30min，换维持液(含2％灭能新生牛血清的MEM)，继续培养观察4日，无细胞病变；再盲传1代，仍无细胞病变。取培养液作血凝试验，为阴性。

6、配苗

将灭活病毒液和灭菌的氢氧化铝胶按9∶1比例进行配苗，再加入1％的硫柳汞溶液，使其终浓度为0.01％，充分混匀。

7、分装

定量分装。分装时，应随时搅拌使其混合均匀。

实施例3

疫苗的成品检验

1.性状本品静置后，上层为粉红色液体，下层为淡粉红色沉淀，振摇后呈均匀混悬液。

2.无菌检验按《中国兽药典》附录进行检验，无菌生长。

3.安全检验用2～10月龄健康易感水貂5只，各皮下注射疫苗3ml，连续观察10日，全部健活。

4.效力检验用2～10月龄健康易感水貂5只，各皮下注射疫苗1ml，同时设不接种对照水貂5只。免疫后14日采血，分离血清，分别测定抗MEV HI抗体，免疫水貂抗MEV HI抗体均≥1∶32，对照水貂抗MEV HI抗体均≤1∶4。

5.甲醛和汞类防腐剂残留量测定按《中国兽药典》附录进行测定，符合兽用生物制品通则的规定。

Claims

1.一种水貂病毒性肠炎灭活疫苗，其特征是本疫苗含有保藏号为CGMCC No.4331的水貂肠炎病毒，该病毒已于2010年11月11日送交北京朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所内中国微生物保藏委员会普通微生物保藏中心保藏。

2.一种用于水貂病毒性肠炎灭活疫苗的制备方法，其特征是将CGMCC No.4331的水貂肠炎病毒接种F81细胞37℃培养，当接毒细胞有80％出现病变时，收获病毒细胞培养液，经过0.3％甲醛灭活，最终将灭活病毒液和灭菌的氢氧化铝胶按9∶1比例进行配苗制备成水貂病毒性肠炎灭活疫苗。