CN110448690A - 一种鸡传染性鼻炎（a型+b型+c型）、鼻气管鸟疫杆菌病（a型）二联灭活疫苗 - Google Patents

一种鸡传染性鼻炎（a型+b型+c型）、鼻气管鸟疫杆菌病（a型）二联灭活疫苗 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种鸡传染性鼻炎(A型+B型+C型)、鼻气管鸟疫杆菌病(A型)二联灭活疫苗及其制备方法。本发明利用自行分离鉴定的副鸡禽杆菌A型、B型、C型菌种，鼻气管鸟疫杆菌A型菌株，分别接种适宜培养基培养，收获培养物，经甲醛溶液灭活后浓缩，几种抗原按照一定比例混合均匀，加入矿物油佐剂乳化制备而成。本发明所提供的疫苗能够有效预防由副鸡禽杆菌A型、B型、C型菌引起的鸡传染性鼻炎以及由鼻气管鸟疫杆菌A型菌引起的鸡鼻气管鸟疫杆菌病。这两种疫病都属于鸡呼吸系统疾病，临床症状相似，危害很大，本发明可以同时防控两种疫病，具有重要的应用前景。

Description

一种鸡传染性鼻炎(A型+B型+C型)、鼻气管鸟疫杆菌病(A型) 二联灭活疫苗
技术领域
本发明涉及一种鸡传染性鼻炎(A型+B型+C型)、鼻气管鸟疫杆菌病(A型)二联灭活疫苗及其制备方法，属于兽用生物制品领域。
背景技术
鸡传染性鼻炎是由副鸡禽杆菌(Avibacterium paragallinarum)引起的一种急性上呼吸道传染病，可以引起鸡眶下窦及周围肿胀、流鼻涕、流泪及育成鸡生长不良和产蛋鸡产蛋下降10％～ 40％，给养殖户造成严重的经济损失。
根据Page的凝集试验分型方案，副鸡禽杆菌可分为A、B、C三个血清型。A、B、C型均具有不同程度的致病性。我国于1986年由冯文达首次报道本病，用玻片凝集、HA和HI试验证明分离到的副鸡禽杆菌为血清型A型菌株(冯文达，北京鸡传染性鼻炎病原菌分离及鉴定[J]，微生物学通报，1987，5：216-219.)。此后陆续报道从我国分离鉴定出副鸡禽杆菌A型、B型、C型菌。2015年～2016年，赵国生等从全国各地送检病鸡中分离得到77株细菌，经分离鉴定、PCR方法检测确定为副鸡嗜血杆菌，进一步利用血清平板凝集试验进行分型，结果： A型10株，B型63株，C型4株(赵国生，何晓玲，关飞等，2015年以来我国部分地区鸡传染性鼻炎流行病学调查[J]，中国家禽，2016，38(16)：77-79.)。
副鸡禽杆菌分为A型、B型、C型3种血清型，不同血清型间免疫关系相距较远。2006～ 2017年间我公司实验室从山东、河北等地区分离了41株副鸡禽杆菌菌株，其中血清A型28 株、B型10株、血清C型3株。流行病学结果表明我国存在A、B、C三个血清型菌株引起的鸡传染性鼻炎，研制的疫苗中需包含三种血清型菌株。
鼻气管鸟疫杆菌病是由鼻气管鸟疫杆菌(Ornithobacterium rhinotracheale,ORT)引起的禽呼吸道细菌病。鼻气管鸟疫杆菌病主要引起鸡呼吸系统发病，临床表现精神沉郁、采食减少，一过性流鼻涕、打喷嚏、面部水肿；常发生坏死性肺炎、气囊炎、支气管炎，常合并、继发病毒、细菌和真菌感染，从而引起急性死亡，危害很大，是一种值得重视的新病。
Charlton等1993年首先对鼻气管鸟疫杆菌进行了鉴定。陈小玲等从我国分离鉴定出鼻气管鸟疫杆菌(陈小玲、宋程等，鼻气管鸟疫杆菌中国株的鉴定，中国家禽，2004年第26卷第 18期)，利用琼脂扩散和酶联免疫吸附试验，将分离株分成18个血清型，用A～R依次命名，其中血清A型是迄今最流行的血清型。鸡源分离株大多是A型，从火鸡体内分离的菌株多为 A、B和D型，所有血清型(A、B、C、D、E)都有不同程度的交叉反应(赵鹏，李佳，谢琛，等.家禽鼻气管鸟疫杆菌研究进展[J].中国家禽，2015，37(6)：37-41.)。赵鹏，李佳，谢琛等报道对我国多个地区的鸡群血清样品检测结果表明，我国不同地区和不同家禽品种均有不同程度感染。(赵鹏，李佳，谢琛，等.家禽鼻气管鸟疫杆菌研究进展[J].中国家禽，2015， 37(6)：37-41.)。
2013～2016年间，我公司实验室从广东、广西、云南、山东地区送检的病料分离出6株鼻气管鸟疫杆菌，经血清型鉴定，均为A型。
不同的鼻气管鸟疫杆菌菌株对抗生素的敏感性不同，用抗生素治疗鼻气管鸟疫杆菌感染非常困难。副鸡禽杆菌菌株对磺胺类抗生素敏感，可用抗生素治疗鸡传染性鼻炎，但易造成抗生素残留，产生耐药菌株。因此疫苗免疫是防控这两种病的优选策略。这两种病临床症状相似，都属于呼吸系统疾病，都会出现流鼻涕、鸡面部肿胀等症状，都能引起产蛋鸡产蛋率下降。为了方便临床防控这两种病，有必要研制包含流行血清型菌株的鸡传染性鼻炎、鼻气管鸟疫杆菌病二联灭活疫苗。
发明内容
本发明的目的在于提供一种鸡传染性鼻炎(A型+B型+C型)、鼻气管鸟疫杆菌病(A型)二联灭活疫苗及其制备方法，用于预防由副鸡禽杆菌A型、B型、C型菌引起的鸡传染性鼻炎以及由鼻气管鸟疫杆菌A型菌引起的鸡鼻气管鸟疫杆菌病。
本发明的技术方案
1.一种鸡传染性鼻炎(A型+B型+C型)、鼻气管鸟疫杆菌病(A型)二联灭活疫苗，其特征是该疫苗含有副鸡禽杆菌(Avibacterium paragallinarum)A型QL-Apg-3株、副鸡禽杆菌 B型QL-Apg-26株，副鸡禽杆菌C型QL-Apg-15株和鼻气管鸟疫杆菌(Ornithobacteriumrhinotracheale)A型GD05株灭活抗原；以上四株菌已分别于2019年5月16日、2019年7月 12日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号分别：QL-Apg-3株为CGMCC No.18173、QL-Apg-26 株为CGMCC No.18174、QL-Apg-15株为CGMCC No.18175和GD05株为CGMCC No.17684；
所述二联灭活疫苗能够同时预防由副鸡禽杆菌A型、B型、C型菌引起的鸡传染性鼻炎以及由鼻气管鸟疫杆菌A型菌引起的鸡鼻气管鸟疫杆菌病。
2.本发明所述一种鸡传染性鼻炎(A型+B型+C型)、鼻气管鸟疫杆菌病(A型)二联灭活疫苗，其特征在于所述疫苗的制备方法为利用副鸡禽杆菌A型QL-Apg-3株、副鸡禽杆菌B型 QL-Apg-26株、副鸡禽杆菌C型QL-Apg-15株和鼻气管鸟疫杆菌A型GD05株，分别接种适宜培养基培养，收获培养物，经甲醛溶液灭活后浓缩，几种灭活抗原按照一定比例混合均匀，加入矿物油佐剂乳化制备而成。
本发明有益效果
本发明提供一种鸡传染性鼻炎(A型+B型+C型)、鼻气管鸟疫杆菌病(A型)二联灭活疫苗及其制备方法。该疫苗是利用本发明人分离鉴定的菌种保藏号为CGMCC No.18173的副鸡禽杆菌A型QL-Apg-3株、保藏号为CGMCC No.18174的副鸡禽杆菌B型QL-Apg-26株、保藏号为CGMCC No.18175副鸡禽杆菌C型QL-Apg-15株，菌种保藏号为CGMCC No.17684 的鼻气管鸟疫杆菌A型GD05株，分别接种适宜培养基培养，收获培养物，经甲醛溶液灭活后浓缩，几种抗原按照一定比例混合均匀，加入矿物油佐剂乳化制备而成。本发明所提供的疫苗能够有效预防由副鸡禽杆菌A型、B型、C型菌引起的鸡传染性鼻炎以及由鼻气管鸟疫杆菌 A型菌引起的鸡鼻气管鸟疫杆菌病。这两种疫病都属于鸡呼吸系统疾病，临床症状相似，危害很大，本发明可以同时防控两种疫病，方便临床应用，节约成本，具有重要的应用前景。
本发明涉及的微生物资源信息
本发明涉及到副鸡禽杆菌(Avibacterium paragallinarum)A型QL-Apg-3株、B型QL-Apg-26 株、C型QL-Apg-15株和鼻气管鸟疫杆菌(Ornithobacterium rhinotracheale)A型GD05株，4株菌已分别于2019年7月12日、2019年5月16日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号分别为副鸡禽杆菌A 型QL-Apg-3株为CGMCC No.18173、副鸡禽杆菌B型QL-Apg-26株为CGMCC No.18174，副鸡禽杆菌C型QL-Apg-15株为CGMCC No.18175，鼻气管鸟疫杆菌GD05株为CGMCC No.17684。
具体实施方式
1.疫苗生产及检验用副鸡禽杆菌菌种
(1)菌种来源
由临床分离的A型、B型、C型副鸡禽杆菌进行毒力试验、免疫原性试验，从中筛选出毒力较强、免疫原性好的副鸡禽杆菌A型QL-Apg-3株、B型QL-Apg-26株和C型QL-Apg-15 株菌株作为疫苗生产及检验用菌株。
(2)菌种特性
1)形态和生化特性三株菌均为革兰氏阴性，球杆菌或小杆菌形态，间有长而弯曲如丝状菌。生化特性符合细菌分类学中本菌的特性。
2)培养特性三株菌在营养琼脂平板上均不生长；在含NADH(辅酶Ⅰ)和健康鸡血清的副嗜血杆菌液体培养基中，37℃静置培养，均呈均匀一致的混浊状生长；在含NADH(辅酶Ⅰ)和健康鸡血清的副嗜血杆菌平板上，置37℃、含5％CO2培养箱中培养18～24小时，均形成直径0.3mm左右、圆形、光滑、灰白色、半透明、露滴状菌落。
3)血清学特性用血凝(HA)和血凝抑制(HI)试验方法进行鉴定，副鸡禽杆菌QL-Apg-3 株为血清A型，QL-Apg-26株为血清B型，QL-Apg-15株为血清C型。
4)毒力
①副鸡禽杆菌A型QL-Apg-3株用9～12周龄SPF鸡10只，分别眶下窦内注射副鸡禽杆菌A型QL-Apg-3株培养菌液0.2ml，攻毒后连续观察14日。应至少8只发病(发病标准：面部一侧或两侧眶下窦及周围肿胀或流鼻涕或兼有流泪，下同)。
②副鸡禽杆菌B型QL-Apg-26株用9～12周龄SPF鸡10只，分别眶下窦内注射副鸡禽杆菌B型QL-Apg-26株培养菌液0.2ml，攻毒后连续观察14日。应至少8只发病。
③副鸡禽杆菌C型QL-Apg-15株用9～12周龄SPF鸡10只，分别眶下窦内注射副鸡禽杆菌C型QL-Apg-15株培养菌液0.2ml，攻毒后连续观察14日。应至少8只发病。
5)免疫原性
①副鸡禽杆菌A型QL-Apg-3株配制疫苗含副鸡禽杆菌A型QL-Apg-3株菌数不低于20亿CFU/ml的单价疫苗。用5～8周龄SPF鸡10只，分别颈背部皮下注射疫苗0.5ml，免疫 28日后，连同条件相同的对照SPF鸡10只，分别眶下窦内注射副鸡禽杆菌A型QL-Apg-3株菌液0.2ml(含活菌数约30万CFU/只)，攻毒后连续观察14日。对照组SPF鸡应至少8只发病(发病标准：面部一侧或两侧眶下窦及周围肿胀或流鼻涕或兼有流泪，下同)，免疫组SPF 鸡应至少8只保护。
②副鸡禽杆菌B型QL-Apg-26株配制疫苗含副鸡禽杆菌B型QL-Apg-26株菌数不低于 10亿CFU/ml的单价疫苗。用5～8周龄SPF鸡10只，分别颈背部皮下注射疫苗0.5ml，免疫28日后，连同条件相同的对照SPF鸡10只，分别眶下窦内注射副鸡禽杆菌B型QL-Apg-26 株菌液0.2ml(含活菌数约10万CFU/只)，攻毒后连续观察14日。对照组SPF鸡应至少8只发病，免疫组SPF鸡应至少8只保护。
③副鸡禽杆菌C型QL-Apg-15株配制疫苗含副鸡禽杆菌C型QL-Apg-15株菌数不低于 10亿CFU/ml的单价疫苗。用5～8周龄SPF鸡10只，分别颈背部皮下注射疫苗0.5ml，免疫28日后，连同条件相同的对照SPF鸡10只，分别眶下窦内注射副鸡禽杆菌C型QL-Apg-15 株菌液0.2ml(含活菌数约10万CFU/只)，攻毒后连续观察14日。对照组SPF鸡应至少8只发病，免疫组SPF鸡应至少8只保护。
2.疫苗生产及检验用鸡鼻气管鸟疫杆菌
(1)菌株来源
2013～2016年间，本申请人从广东、广西、云南、山东等地区送检的病料分离、筛选到1 株毒力较强、免疫原性好、国内流行的血清A型鼻气管鸟疫杆菌，命名为鼻气管鸟疫杆菌GD05 株，作为疫苗生产及检验用菌种。
(2)菌种特性
1)形态及生化特性本菌为革兰氏阴性多形态杆菌。生化特性符合细菌分类学中本菌的特性。
2)培养特征在麦康凯琼脂平板上不生长；在含5％新生牛血清的胰酪胨大豆肉汤琼脂培养基(TSA)平板上，置37℃、含5％CO2培养箱中培养24～48小时，形成圆形、凸起、边缘整齐、灰色或灰白色小菌落；在含2％新生牛血清的BHI培养基中均匀浑浊，无菌膜。
3)血清型鉴定用玻片凝集试验进行鉴定，鼻气管鸟疫杆菌GD05株与A型定型血清产生凝集反应，判定为血清A型。
4)分子生物学鉴定参考李瑶瑶，刁有祥发表的文献“鼻气管鸟杆菌PCR诊断方法的建立与应用”(福建农业学报24(1):19～23,2009)合成一对引物(序列1和序列2)，经PCR扩增出鼻气管鸟疫杆菌特异性片段(序列3)的条带，经序列测定、同源性分析和Blast比较，结果与GenBank中收录的鼻气管鸟疫杆菌相应序列同源性为99.2％。
上游引物ort1F(序列1)：5’-atagcccggg gaaactcgga tt-3’22bp
下游引物ort1R(序列2)：5’-ggcatcgttt actgcgtgga ct-3’22bp
序列3：
5)毒力用9～12周龄SPF鸡10只，分别滴鼻、眶下窦内注射鼻气管鸟疫杆菌GD05 株菌液各0.5ml(含活菌数约为10亿CFU/ml)连续观察10日，记录死亡率，攻毒10日后剖检所有鸡，观察其内脏器官病变，根据病变计分标准，对病变进行计分并比较分析。
病变计分参考标准如下：胸腔气囊：无异常病变记为0；一侧气囊有纤维素性渗出物记为 1；两侧气囊有纤维素性渗出物记为2。腹腔气囊：无异常病变记为0；一侧气囊有纤维素性渗出物记为1；两侧气囊有纤维素性渗出物记为2。肺脏：无异常病变记为0；单侧性肺炎记为1；双侧性肺炎记为2。气管：无异常病变记为0；气管环出血记为1。肝脏：无异常病变记为0；肝周炎记为1。心脏：无异常病变记为0；纤维素性心包炎记为1。
结果10只鸡均有不同程度发病，平均计分7.6。
6)免疫原性将鼻气管鸟疫杆菌GD05株菌种接种BHI培养基，培养的菌液加入终浓度为0.2％的甲醛溶液进行灭活。灭活完全的菌液离心、浓缩，浓缩菌泥用PBS(pH值为7.2，0.01mol/L)重悬制备菌悬液。将菌悬液适当稀释，取菌液96份，灭菌吐温-80 4份于灭菌容器内充分混匀制备水相。取油相(油佐剂)2份，徐徐加入水相1份，乳化制备疫苗，使每毫升疫苗含鼻气管鸟疫杆菌GD05株菌数为20亿CFU。用5～8周龄SPF鸡10只，分别颈背部皮下注射疫苗0.5ml，免疫28日后，连同条件相同的对照SPF鸡10只，分别滴鼻、眶下窦内注射鼻气管鸟疫杆菌GD05株菌液各0.5ml(含活菌数约为10亿CFU/ml)，攻毒后连续观察10 日，记录死亡率，攻毒10日后剖检所有鸡，观察其内脏器官病变，根据病变计分标准，对病变进行计分并比较分析(病变计分参考标准见菌种毒力部分，下同)。
结果免疫鸡平均计分0.8，对照组平均计分8.2。
3.鸡传染性鼻炎(A型+B型+C型)、鼻气管鸟疫杆菌病(A型)二联灭活疫苗的生产制备
(1)副鸡禽杆菌半成品制备以副鸡禽杆菌A型QL-Apg-3株、B型QL-Apg-26株和C 型QL-Apg-15株作为疫苗生产用菌种。副嗜血杆菌液体培养基作为生产用培养基，三株菌分别在发酵罐中进行发酵培养。发酵罐中装入适量的副嗜血杆菌液体培养基和消泡剂，将种子液按培养基总量的2.5％接种副嗜血杆菌液体培养基中。用培养瓶培养时每隔4小时摇匀一次，用发酵罐培养时采用微通气方法，37℃培养12～16h。
(2)副鸡禽杆菌半成品灭活及浓缩发酵的3种菌液分别按体积比例加入0.15％甲醛溶液，搅拌均匀后2～8℃灭活7日，每日搅拌两次。灭活结束后，取样进行灭活检验。将灭活检验合格的菌液用连续流离心机离心浓缩。浓缩菌泥用PBS(pH值为7.2，0.01mol/L)重悬，制备菌悬液。
(3)鼻气管鸟疫杆菌半成品制备以鼻气管鸟疫杆菌GD05株作为疫苗生产用菌种，BHI 培养基为生产用培养基，分别在发酵罐中进行发酵培养。发酵罐中装入适量的BHI培养基和消泡剂，灭菌后按培养基总量的2％加入新生牛血清，并按培养基总量的5％接入制备好的二级种子液，37℃培养18h。
(4)鼻气管鸟疫杆菌半成品灭活及浓缩菌液培养完成后，取样分别进行纯粹检验和活菌计数。按照菌液体积比例加入0.2％甲醛溶液，搅拌均匀后37℃灭活24小时。将灭活检验合格的菌液用连续流离心机离心浓缩。浓缩菌泥用PBS(pH值为7.2，0.01mol/L)重悬，制备菌悬液。
(5)鸡传染性鼻炎(A型+B型+C型)、鼻气管鸟疫杆菌病(A型)二联灭活疫苗乳化制备
1)油相制备注射用白油94份，司本-80 6份，混合均匀，加入硬脂酸铝0.5份，加热完全溶解后，灭菌备用。
2)水相制备将灭活检验合格的副鸡禽杆菌A型QL-Apg-3株、B型QL-Apg-26株、C 型QL-Apg-15株重悬菌液和鸡鼻气管鸟疫杆菌A型GD05株按1:1:1:1的比例混合均匀，取混合菌液96份，灭菌吐温-80 4份，于灭菌容器内充分混匀。
3)乳化取油相2份，徐徐加入水相1份，加完后乳化(每毫升疫苗含副鸡禽杆菌A 型QL-Apg-3株菌数不少于20亿CFU、含副鸡禽杆菌B型QL-Apg-26株菌数不少于10亿CFU、含副鸡禽杆菌C型QL-Apg-15株菌数不少于10亿CFU、含鸡鼻气管鸟疫杆菌A型GD05株 20亿CFU)。
4.鸡传染性鼻炎(A型+B型+C型)、鼻气管鸟疫杆菌病(A型)二联灭活疫苗检验
(1)性状
外观为均匀乳剂。
剂型为油包水型。取一清洁吸管，吸取少量疫苗滴于冷水表面，除第1滴外，均应不扩散。
稳定性检验为吸取疫苗10ml加入离心管中，经3000r/min离心15min，管底析出的水相应不超过0.5ml。
黏度检验按现行《中国兽药典》附录进行，应符合规定。
(2)无菌检验按现行《中国兽药典》(中国兽药典委员会，中华人民共和国兽药典，二〇一五年版三部，中国农业出版社，2016，以下称《中国兽药典》)附录进行检验，应无菌生长。
(3)安全检验用5～8周龄SPF鸡10只，每只颈背部皮下注射疫苗1.0ml，连续观察14日，应全部健活，且不出现因疫苗引起的任何局部和全身不良反应。
(4)效力检验
1)鸡传染性鼻炎部分用5～8周龄SPF鸡30只，分别颈背部皮下注射疫苗0.5ml，同时设30只条件相同的SPF鸡不接种作为对照。免疫28日后，取免疫组和对照组SPF鸡各10只，每只鸡各眶下窦内注射副鸡禽杆菌A型QL-Apg-3株菌液0.2ml(含活菌数约30万CFU/只)；另取免疫组和对照组SPF鸡各10只，每只鸡各眶下窦内注射副鸡禽杆菌B型QL-Apg-26株菌液0.2ml(含活菌数约10万CFU/只)；免疫组和对照组SPF鸡各剩余10只，每只鸡各眶下窦内注射副鸡禽杆菌C型QL-Apg-15株菌液0.2ml(含活菌数约10万CFU/只)。攻毒后连续观察14日。对照组SPF鸡应至少8只发病，免疫组SPF鸡应至少8只保护。
2)鸡鼻气管鸟杆菌部分用5～8周龄SPF鸡10只，颈背部皮下注射疫苗0.5ml，同时设10只条件相同的SPF鸡不接种作为对照。免疫28日后，取免疫组和对照组SPF鸡，分别滴鼻、眶下窦内注射鼻气管鸟疫杆菌GD05株菌液各0.5ml(含活菌数约为10亿CFU/ml)，攻毒后连续观察10日，记录死亡率，攻毒10日后剖检所有鸡，观察病变，根据病变计分标准，对病变进行计分并比较分析(病变计分参考标准见菌种毒力部分)。免疫鸡平均计分应不高于 2，对照组平均计分应不低于7。
(5)甲醛、汞类防腐剂残留量测定按现行《中国兽药典》规定方法进行测定，应符合规定。
实施例
以下实施例为进一步说明本发明，不对本发明构成限制，
实施例1——副鸡禽杆菌半成品制备
副鸡禽杆菌A型QL-Apg-3株、B型QL-Apg-26株和C型QL-Apg-15株分别进行培养。
1.一级种子繁殖将基础菌种划线接种鸡肉汤琼脂平板，置37℃、含5％CO2培养箱中培养18～24h，挑取数个荧光性强的典型菌落，用副嗜血杆菌液体培养基悬浮，卵黄囊内接种5～6日龄SPF鸡胚，0.2ml/胚，37℃继续孵育，收集24～30h内死亡鸡胚的卵黄液，作为一级种子液。
2.二级种子繁殖将一级种子划线接种鸡肉汤琼脂平板，置37℃、含5％CO2培养箱中培养18～24h，挑选数个荧光性强的典型菌落接种副嗜血杆菌液体培养基中，37℃培养12～ 16h，作为二级种子液。
3.菌液培养将副嗜血杆菌液体培养基装入发酵罐中，116℃灭菌40min。待培养基温度冷却至37℃左右时，将二级种子液按培养基总量的2.5％接种副嗜血杆菌液体培养基，采用微通气方法，37℃培养12～16h。
4.菌液灭活菌液中按体积加入0.15％甲醛溶液，充分混匀，2～8℃灭活7日，每日搅拌两次。灭活结束后，取样用副嗜血杆菌培养基平板进行灭活检验。
5.菌液浓缩将灭活检验合格的菌液分别用连续流离心机离心浓缩(转速为14000r/min，进料速率为700ml/min)进行离心，菌泥用PBS(pH值为7.2，0.01mol/L)重悬，根据吸光度值法细菌计数结果制备菌悬液。
实施例2——鼻气管鸟疫杆菌半成品制备
鼻气管鸟疫杆菌GD05株为疫苗生产用菌种，脑心浸液培养基(BHI，商品化培养基)为生产用培养基，分别在发酵罐中进行培养；
1.一级种子繁殖鼻气管鸟疫杆菌GD05株将菌种划线接种在含5％新生牛血清的胰酪胨大豆肉汤琼脂培养基(TSA)平板上，置37℃、含5％CO2培养箱中培养24～48h，挑取数个菌落密集划线接种于含5％新生牛血清的TSA培养基，置37℃、含5％CO2培养箱中培养24h，用PBS洗涤菌苔，收集菌液，经纯粹检验合格后作为一级种子。
2.二级种子繁殖取一级种子液按总体积2％的量接种于BHI培养基，添加新生牛血清至终浓度为2％。37℃180r/min振荡培养16～18h，经纯粹检验(镜检无杂菌污染)合格后，作为二级种子。
3.制苗用菌液制备用发酵罐通气培养，将二级种子液按培养基量的5％接种于BHI培养基，加入适量消泡剂，加入新生牛血清至终浓度为2％。以逐渐增大通气量的方法，37℃培养 16～18小时收获菌液。
4.菌液灭活菌液中加入甲醛溶液，使其最终浓度为0.2％，充分混匀，置37℃灭活24 小时。取灭活菌液，按现行《中国兽药典》附录进行检验，应无茵生长。
5.菌液浓缩将灭活检验合格的菌液用连续流离心机离心浓缩(转速为14000r/min，进料速率为700ml/min)。浓缩菌泥用PBS(pH值为7.2，0.01mol/L)重悬，制备菌悬液。
实施例3——疫苗制备
1.疫苗一：鸡传染性鼻炎组分疫苗
取实施例1中制备的三种菌的菌悬液制备水相，与油相混合乳化制备鸡传染性鼻炎三价灭活疫苗。
油相制备注射用白油94份，司本-80 6份，混合均匀，加入硬脂酸铝0.5份，加热完全溶解后，灭菌备用。
水相制备将灭活检验合格的副鸡禽杆菌A型QL-Apg-3株、B型QL-Apg-26株和C型QL-Apg-15株重悬菌液按1:1:1的比例混合均匀，取混合菌液96份，灭菌吐温-80 4份，于灭菌容器内充分混匀。
疫苗乳化取油相2份，徐徐加入水相1份，加完后乳化。每毫升疫苗含副鸡禽杆菌A型QL-Apg-3株菌数不少于20亿CFU、含副鸡禽杆菌B型QL-Apg-26株菌数不少于10亿CFU、含副鸡禽杆菌C型QL-Apg-15株菌数不少于10亿CFU。
2.疫苗二：鸡鼻气管鸟疫杆菌病组分疫苗
取实施例2中制备的鼻气管鸟疫杆菌菌悬液制备水相，与油相混合乳化制备鸡鼻气管鸟疫杆菌病灭活疫苗。
油相制备注射用白油94份，司本-80 6份，混合均匀，加入硬脂酸铝0.5份，加热完全溶解后，灭菌备用。
水相制备取灭活检验合格的鼻气管鸟疫杆菌GD05株重悬菌液96份，灭菌吐温-804份，于灭菌容器内充分混匀。
疫苗乳化取油相2份，徐徐加入水相1份，加完后乳化。使得每毫升疫苗含鼻气管鸟疫杆菌GD05株菌数为20亿CFU。
3.疫苗三：鸡传染性鼻炎(A型+B型+C型)、鼻气管鸟疫杆菌病(A型)二联灭活疫苗取实施例1制备的鸡传染性鼻炎三种菌悬液，实施例2中鼻气管鸟疫杆菌菌悬液按比例混合制备水相，与油相混合乳化制备鸡传染性鼻炎(A型+B型+C型)、鼻气管鸟疫杆菌病(A 型)二联灭活疫苗。
油相制备注射用白油94份，司本-80 6份，混合均匀，加入硬脂酸铝0.5份，加热完全溶解后，灭菌备用。
水相制备将灭活检验合格的副鸡禽杆菌A型QL-Apg-3株、B型QL-Apg-26株、C型QL-Apg-15株重悬菌液和鸡鼻气管鸟疫杆菌A型GD05株按1:1:1:1的比例混合均匀，取混合菌液96份，灭菌吐温-80 4份，于灭菌容器内充分混匀。
疫苗乳化取油相2份，徐徐加入水相1份，加完后乳化(每毫升疫苗含副鸡禽杆菌A型QL-Apg-3株菌数不少于20亿CFU、含副鸡禽杆菌B型QL-Apg-26株菌数不少于10亿CFU、含副鸡禽杆菌C型QL-Apg-15株菌数不少于10亿CFU、含鸡鼻气管鸟疫杆菌A型GD05株 20亿CFU)。
实施例4——疫苗检验
取实施例3中制备的疫苗一、疫苗二、疫苗三分别进行检验，以确定不同组分间的抗原相容性。
1.性状检验外观均为均匀乳剂。
2.剂型均为油包水型。取一清洁吸管，吸取少量疫苗滴于冷水表面，除第1滴外，均不扩散。
3.稳定性检验为吸取疫苗10ml加入离心管中，经3000r/min离心15min，管底析出的水相均不超过0.5ml。
4.黏度检验按现行《中国兽药典》附录进行，均符合规定。
5.无菌检验按现行《中国兽药典》附录进行检验，均无菌生长。
6.安全检验用5～8周龄SPF鸡10只，每只颈背部皮下注射疫苗1.0ml，连续观察14日。三种疫苗试验鸡均全部健活，均未出现因疫苗引起的任何局部和全身不良反应，注射部位吸收良好。
7.效力检验
(1)鸡传染性鼻炎三价灭活疫苗效力检验用5～8周龄SPF鸡30只，分别颈背部皮下注射疫苗0.5ml，同时设30只条件相同的SPF鸡不接种作为对照。免疫28日后，免疫组和对照组各取10只SPF鸡，分别眶下窦内注射副鸡禽杆菌A型QL-Apg-3株菌液0.2ml(含活菌数约为30万CFU)；免疫组和对照组各另取10只SPF鸡，分别眶下窦内注射副鸡禽杆菌B型 QL-Apg-26株菌液0.2ml(含活菌数约为10万CFU)；免疫组和对照组各剩余的10只SPF鸡，分别眶下窦内注射副鸡禽杆菌C型QL-Apg-15株菌液0.2ml(含活菌数约为10万CFU)。攻毒后连续观察14日，记录试验鸡发病情况(发病标准：面部一侧或两侧眶下窦及周围肿胀或流鼻涕或兼有流泪，下同)。具体结果见表1。
表1鸡传染性鼻炎三价灭活疫苗效力检验结果
(2)鸡鼻气管鸟疫杆菌病灭活疫苗效力检验用5～8周龄SPF鸡10只，颈背部皮下注射疫苗0.5ml，同时设10只条件相同的SPF鸡不接种作为对照。免疫28日后，取免疫组和对照组SPF鸡，分别滴鼻、眶下窦内注射鼻气管鸟疫杆菌GD05株菌液各0.5ml(含活菌数约为 10亿CFU/ml)，攻毒后连续观察10日，记录死亡率，攻毒10日后剖检所有鸡，观察其大体病变，根据病变计分标准，对病变进行计分并比较分析(病变计分参考标准见具体实施方式菌种毒力部分，下同)。免疫鸡平均计分应不高于2，对照组平均计分应不低于7。具体结果见表2。
表2鸡鼻气管鸟疫杆菌病灭活疫苗效力检验结果
(3)鸡传染性鼻炎(A型+B型+C型)、鼻气管鸟疫杆菌病(A型)二联灭活疫苗效力检验
1)疫苗免疫用5～8周龄SPF鸡40只，分别颈背部皮下注射疫苗0.5ml，同时设40只条件相同的SPF鸡不接种作为对照。
2)鸡传染性鼻炎部分效力检验攻毒免疫28日后，免疫组和对照组各取10只SPF鸡，分别眶下窦内注射副鸡禽杆菌A型QL-Apg-3株菌液0.2ml(含活菌数约为30万CFU)；免疫组和对照组各另取10只SPF鸡，分别眶下窦内注射副鸡禽杆菌B型QL-Apg-26株菌液0.2ml (含活菌数约为10万CFU)；免疫组和对照组各剩余的10只SPF鸡，分别眶下窦内注射副鸡禽杆菌C型QL-Apg-15株菌液0.2ml(含活菌数约为10万CFU)。攻毒后连续观察14日，记录试验鸡发病情况。具体结果见表3。
3)鸡鼻气管鸟疫杆菌部分效力检验攻毒免疫28日后，取免疫组和对照组SPF鸡各取 10只，分别滴鼻、眶下窦内注射鼻气管鸟疫杆菌GD05株菌液各0.5ml(含活菌数约为10亿CFU/ml)，攻毒后连续观察10日，记录死亡率，攻毒10日后剖检所有鸡，观察其大体病变，根据病变计分标准，对病变进行计分并比较分析。免疫鸡平均计分应不高于2，对照组平均计分应不低于7。具体结果见表4。
表3鸡传染性鼻炎部分效力检验攻毒结果
表4鸡鼻气管鸟疫杆菌部分效力检验攻毒结果
8.甲醛和汞类防腐剂残留量测定按现行《中国兽药典》附录进行测定，均符合规定。
序列表
<110> 齐鲁动物保健品有限公司
<120> 一种鸡传染性鼻炎（A型+B型+C型）、鼻气管鸟疫杆菌病（A型）二联灭活疫苗
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成(ort1F)
<400> 1
atagcccggg gaaactcgga tt 22
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成(ort1R)
<400> 2
ggcatcgttt actgcgtgga ct 22
<210> 3
<211> 670
<212> DNA
<213> Ornithobacterium rhinotracheale
<400> 3
atagcccggg gaaactcgga ttaatacctc ttaaattttt agttggcatc gattaaattg 60
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aaatgcatag atattacaca gaacaccgat tgcgaaggca ggttactaag tattaactga 600
cgctgaagga cgaaagcgtg gggagcgaac aggattagat accctggtag tccacgcagt 660
aaacgatgct 670

Claims (2)

1.一种鸡传染性鼻炎(A型+B型+C型)、鼻气管鸟疫杆菌病(A型)二联灭活疫苗，其特征是该疫苗含有副鸡禽杆菌A型QL-Apg-3株、副鸡禽杆菌B型QL-Apg-26株，副鸡禽杆菌C型QL-Apg-15株和血清A型鼻气管鸟疫杆菌GD05株菌的灭活抗原；以上四株菌已分别于2019年7月12日、2019年5月16日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号分别：QL-Apg-3株为CGMCCNo.18173、QL-Apg-26株为CGMCC No.18174、QL-Apg-15株为CGMCC No.18175和GD05株为CGMCC No.17684；
所述二联灭活疫苗能够有效预防由副鸡禽杆菌A型、B型、C型菌引起的鸡传染性鼻炎以及由鼻气管鸟疫杆菌A型菌引起的鸡鼻气管鸟疫杆菌病。
2.如权利要求1所述一种鸡传染性鼻炎(A型+B型+C型)、鼻气管鸟疫杆菌病(A型)二联灭活疫苗，其特征在该灭活疫苗的制备方法为利用自行分离鉴定的副鸡禽杆菌A型QL-Apg-3株、副鸡禽杆菌B型QL-Apg-26株、副鸡禽杆菌C型QL-Apg-15株和鼻气管鸟疫杆菌A型GD05株，分别接种适宜培养基培养，收获培养物，经甲醛溶液灭活后浓缩，几种灭活抗原按照一定比例混合均匀，加入矿物油佐剂乳化制备而成。
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