CN108251341A - 一种铜绿假单胞菌以及含该菌的海洋哺乳动物疫苗 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种铜绿假单胞菌及含该菌的海洋哺乳动物疫苗。其中使用的菌株为从海洋哺乳动物中分离的铜绿假单胞菌DCP1株，保藏编号为CGMCC NO.15418。本发明还保护一种海洋哺乳动物疫苗，其活性成分为灭活后的海洋哺乳动物的铜绿假单胞菌抗原。本发明还保护一种海洋哺乳动物疫苗的制备方法，包括菌株的分离、鉴定、纯化、抗原制备和疫苗制备等过程。本发明制备的铜绿假单胞菌灭活疫苗安全可靠，能够显著提高抗体水平，有着广泛的应用前景。

Description

一种铜绿假单胞菌以及含该菌的海洋哺乳动物疫苗

技术领域

本发明涉及疫苗技术领域，具体涉及一种铜绿假单胞菌以及将其灭活后制备得到的海洋哺乳动物疫苗。

背景技术

随着人民生活水平的提高，物质需求向精神需求的转变，促进了国内水族馆行业飞速发展，对海洋哺乳动物资源的需求随之越来越多，尤其是具有展演展示天赋的海洋哺乳动物，如瓶鼻海豚、白鲸等，在国内各水族馆饲养的数量不断攀升。当海洋哺乳动物被从宽广的野生海洋环境转入人工饲养环境，受生活空间的大大缩小，食物，水质，海流，水温等等因素的限制，生活环境的严格限制以及人工饲养条件与天然生活巨大差别，不可避免的给动物带来巨大的应激和压力，从而导致动物免疫力低下，容易罹患疾病，巨大的参观人流造成室内或外部空气质量的污浊，更加导致海洋哺乳动物患呼吸系统疾病的风险不断增加。由于海洋哺乳动物罹患疾病具有隐蔽性及诊断治疗方面的困难，海洋哺乳动物的死亡率一直很高，这是困扰世界水族馆业的重要问题。

铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)属假单胞菌属(pseudomonas)，为革兰氏阴性杆菌，两端钝圆，一端有一根鞭毛，能运动，不能形成芽孢及荚膜。在普通琼脂培养基上生长良好，形成大小不一的菌落。是在土壤、水中等自然环境中广泛分布的革兰氏阴性杆菌，能引起人类和动物的化脓性病变。感染后因脓汁和渗出液等病料呈绿色，故又名铜绿假单胞菌。铜绿假单胞菌还是导致海洋哺乳动物发生细菌性支气管肺炎和皮炎甚至引起死亡的重要原因。

随着抗生素不合理的应用，铜绿假单胞菌对抗菌药的耐药性呈现逐年上升的趋势，并且开始产生对3类或3类以上抗菌药均表现耐药的多重耐药，甚至泛耐药的现象。铜绿假单胞菌因耐药率高导致抗菌药物治疗困难的现状已成为目前国内外临床抗感染治疗的棘手问题，鉴于铜绿假单胞菌日益严重的耐药现状，迫使我们急切需要寻求抗菌药物之外的其他手段来治疗和预防铜绿假单胞菌感染。免疫预防一直都是人们防治疾病的一个重要手段，因此研究有效的疫苗成为防治铜绿假单胞菌感染的重要策略之一。

发明内容

本发明旨在针对目前海洋哺乳动物中缺乏一种有效的细菌性肺炎疫苗进行疾病防护的技术问题，提供一种铜绿假单胞菌以及将其灭活得到的海洋哺乳动物疫苗。

为实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案：

一种铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa DCP1菌株，菌种保藏号为：CGMCCNO.15418。

本发明中，所述菌株为从海洋哺乳动物中分离得到，所述海洋哺乳动物为海豚、海鲸、海狮或海象。

一种海洋哺乳动物疫苗，所述疫苗包括抗原液，所述抗原液为权利要求1所述铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa DCP1菌株的灭活浓缩菌液，菌液浓度≥6×10⁹个细菌/mL。

进一步地，所述疫苗还包括疫苗佐剂，抗原液：疫苗佐剂的质量比为70：30～60：40。

优选地，所述疫苗的剂型为皮下注射剂或肌肉注射剂。

优选地，所述灭活浓缩菌液的制备方法包括如下步骤：

1)从海洋哺乳动物的气孔喷出物中分离出铜绿假单胞菌，通过培养、纯化、分子生物学和生化鉴定符合铜绿假单胞菌的特征，命名为铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosaDCP1菌株；

2)对分离纯化得到的铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa DCP1菌株进行扩大培养、灭活、浓缩得到灭活浓缩菌液。

本发明还提供上述海洋哺乳动物疫苗的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：

将抗原液和疫苗佐剂按照比例进行搅拌乳化，即得到海洋哺乳动物疫苗。

优选地，所述将抗原液和疫苗佐剂按照比例进行搅拌乳化具体为：

将疫苗佐剂倒入容器中，以1000rpm/min的转速进行搅拌10s～60s，再将抗原液缓慢加入疫苗佐剂中后将转速增加到5000～10000rpm/min，保持3～20min。

本发明还提供了上述铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa DCP1菌株在制备海洋哺乳动物疫苗中的应用。

本发明所提供的一种海洋哺乳动物疫苗，其活性成分为灭活后的DCP1菌株，按照一定比例加入佐剂乳化后得到。具体来说，所述灭活后的DCP1菌液浓度≥6×10⁹个细菌/mL。

本发明“灭活后的菌株”可通过将所述菌株进行甲醛灭活得到，具体通过如下方法得到：取菌液加入37％-40％甲醛溶液并使甲醛浓度为0.2％～0.5％(体积比)，37℃、150rpm/min振荡孵育36-48h，离心(离心参数具体可为：4℃、6500rpm/min离心15min收集菌体)收集菌体，用灭菌后的PBS缓冲液洗涤菌体，然后用灭菌后的PBS缓冲液悬浮菌体，得到“灭活后的菌株”(含细菌6×10⁹CFU/ml)。

本发明中所用到的佐剂为Seppic公司Montanide^TM ISA 763 A VG佐剂或铝胶佐剂，本领域技术人员还可以选择其他合适的佐剂。

所述疫苗具体可为DCP1株灭活疫苗或DCP1株与其他细菌制备的联苗。

本发明提供的DCP1菌株全称为铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa DCP1菌株。P3代DCP1菌株已于2018年3月6日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所)，保藏号为CGMCC NO.15418。

本发明制备的灭活疫苗安全可靠，能提供有效地同源攻毒保护，免疫后能够产生较强免疫力。

附图说明

图1为实施例1中细菌活菌数与时间对应关系的生长曲线；

图2为实施例1中细菌OD₅₄₀值与时间对应关系的生长曲线；

图3为实施例1中铜绿假单胞菌对小鼠的致病性试验攻毒后小鼠的存活率。

具体实施方式

本说明书中公开的任一特征，除非特别叙述，均可被其他等效或具有类似目的的替代特征加以替换。除非特别叙述，每个特征只是一系列等效或者类似特征中的一个例子而已。所述仅仅是为了帮助理解本发明，不应该视为对本发明的具体限制。

以下的实施例将对本发明的具体实施方式进行详细描述。除有定义外，以下实施例中所有的技术和科学术语具有与本发明所属技术领域技术人员普遍理解的相同含义。

Montanide^TM ISA 763 A VG佐剂：是一种油基佐剂，研制用于生产油包水乳剂。它含可注射降解的油(不含矿物油)以及从甘露醇中精炼和纯化植物来源油酸的乳化剂和一种从来源于植物的甘露醇和纯油酸中提取并特别精炼的乳化剂，购于Seppic公司。Balb/C小鼠(5周龄)：购自军事医学科学院实验动物中心。新西兰兔(1.5Kg)：购于北京芳元缘养殖厂。

实施例1、菌株的获得和保藏

一、从某大型海洋馆，无菌采集海洋哺乳动物的气孔喷出物于无菌塑料小瓶中，划线接种于十六烷三甲基溴化铵琼脂培养基(NAC)上。取圆形、光滑、湿润、扁平的菌落革兰氏染色镜检，选取革兰氏阴性细小杆菌进行划线纯培养，根据铜绿假单胞菌的生化鉴定试验要求进行鉴定，将进一步纯化培养的菌株进行绿脓色素培养基生长、氧化酶试验、甘露醇、硝酸盐还原试验、明胶液化试验、42℃生长试验等。结果如表1所示。该菌株命名为铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa DCP1菌株。

表1分离菌株的生化试验结果

生化试验项目	结果	生化试验项目	结果
				绿脓色素培养基	+	明胶液化	+
甘露醇	+	硝酸盐还原	+
				氧化酶	+	42℃生长试验	+

二、生产菌种的制备

1、一级种子制备

将铜绿假单胞菌DCP1株(原代菌株)按照一定比例接种至BHI液体培养基，于37℃，150rpm/min振荡培养5～18小时，然后在培养后的菌液中加入灭菌后的甘油使其终浓度为20％～30％之间，分装于冻存管(定义为P1代)，-20℃以下保存。

2、二级种子制备

取步骤1得到的冻存菌液，室温解冻，按照一定比例接种至BHI液体培养基，于37℃，150rpm/min振荡培养5～18小时，然后在培养后的菌液中加入灭菌后的甘油使其终浓度为20％～30％之间，分装于冻存管(定义为P2代)，-20℃以下保存。

三、基因序列测定及结果分析

将实施例1的步骤二的2得到的冻存菌液室温解冻，按照一定比例接种于BHI液体培养基，37℃培养5～18小时后，通过煮沸法提取细菌的基因组DNA。用16S rRNA通用引物进行序列扩增。通用引物采用细菌的16S rRNA通用引物，上游引物F27(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)，下游引物R1492(5’-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’)。

按如下的顺序加样进行PCR反应Promega GoTaq(Mix)12.5μL；ddH₂O 9.5μL；上游引物1μL；下游引物1μL；TemPlate 1μL。混匀后，稍微离心迅速置于冰上，进行下列循环反应：94℃反应3min使模板变性。循环为30个，在每一循环中，94℃变性30s，55℃复性30s，72℃延伸1min，循环结束后，72℃终延伸10min。产物交由ThermoFisher Scientific公司测序，测序结果通过NCBI Blast和DNAStar软件进行序列的比对和同源性分析。

对分离株进行PCR扩增，用16S rRNA通用引物的扩增出1500bp左右的片段，将PCR产物回收后测序，并将测序结果与NCBI上的铜绿假单胞菌的序列用DNAStar软件进行比对分析，表明该菌株与铜绿假单胞菌的同源性在99％以上，表明该菌株为铜绿假单胞菌。

四、细菌的生长曲线的测定

将实施例1的步骤二的2得到的冻存菌液室温解冻，按照一定比例接种于BHI液体培养基，37℃培养5～18小时，此菌液即为种子培养液。将培养后的种子液按照5％的比例接种100ml BHI液体培养基中，取样测定OD₅₄₀值。将接种后菌液置于恒温培养振荡器上37℃，170rpm/min培养，并于培养后每小时取样测定菌液的OD₅₄₀值，直至接种后9小时。记录每次测得的数据。分别以测定的时间为横坐标轴，OD₅₄₀值为纵坐标绘制铜绿假单胞菌的生长曲线，如图2所示。并以细菌数对数为纵坐标，时间为横坐标，作图绘制生长曲线，如图1所示。取对数生长期中的一段按照下述公式计算世代时间。

g为世代时间；t为培养时间；M0为开始时的活菌数；Mt为经t时间培养后的活菌数。

从图1和图2可以看出，用活菌计数法测定铜绿假单胞菌DCP1株的生长曲线，并计算细菌的世代时间为60min。由于种子液活化后接种到培养基中，在很短的时间内即可进入对数生长期，对数生长期维持时间为4～6h。在培养5小时后，活菌数即可达到2×10⁹以上，OD₅₄₀值可达到1.2～1.8之间。通过生长曲线能够更好的判断菌株的生长情况，为选择活力高和活菌数高的细菌生长时期提供依据。

五、菌株的致病性鉴定

将鉴定合格的冻存菌液室温解冻，按照一定比例接种于BHI液体培养基，37℃培养5～18小时后得到P3代菌液，将菌液经10倍，100倍和1000倍稀释后，分别注射给4-5周龄Balb/C小鼠(每只通过腹腔注射0.5ml)，观察DCP1株对小鼠的致病情况，分组和死亡率结果如表2所示，小鼠的生存曲线如图3所示。

表2铜绿假单胞菌对小鼠的致病性

*i.p.表示腹腔注射

从表2和图3可以看出，观察表征发现DCP1菌株可使Balb/C小鼠1周内发病死亡，分别取发病小鼠的肝脏和肺脏等器官进行病原菌重分离，将重分离得到的菌株进行细菌鉴定和16SrRNA测序，均鉴定为铜绿假单胞菌感染。

六、菌株的保藏

DCP1菌株全称为铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)DCP1株。P3代DCP1菌株已于2018年3月6日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所)，保藏号为CGMCC NO.15418。

实施例2、疫苗的制备

将实施例1的步骤二的2得到的冻存菌液室温解冻，将P2代菌株进行如下步骤：

一、抗原的制备

1、取P2代DCP1株冻存菌液，室温解冻，按照1％～10％的体积比接种BHI液体培养基，于37℃，150rpm/min振荡培养5～18小时。取上述活化的菌液按照1％～10％的比例接种BHI培养基，于37℃，150rpm/min振荡培养5～18小时，按现行《中华人民共和国兽药典》附录进行检验。并用活菌计数的方法计算活菌数。

2、将上述培养后的菌液加入37-40％甲醛溶液并使甲醛浓度为0.2％～0.5％(体积比，37℃、150rpm/min振荡孵育36h-48h)，

3、然后4℃、6500rpm/min离心15min收集菌体，用灭菌后的PBS缓冲液洗涤菌体，然后用灭菌后的PBS缓冲液悬浮菌体(使得浓缩后菌液浓度均为6×10⁹个细菌/ml)。

4、取上述抗原按照《中华人民共和国兽药典》的方法进行灭活和无菌检验结果均合格。

二、疫苗的制备

将步骤一的3得到的抗原液和Montanide^TM ISA 763 A VG佐剂佐剂按照质量比为70：30的比例进行乳化得到疫苗Ⅰ，具体步骤如下：将佐剂按照比例倒入烧杯中，在乳化机上以1000rpm/min的转速进行搅拌10s～60s，并将抗原液缓慢加入佐剂中后将转速增加到5000～10000rpm/min，保持3～20min。

将步骤一的3得到的铜绿假单胞菌的抗原液和金黄色葡萄球菌的抗原液按照1：1的比例进行混合后即为二联苗的抗原液Ⅱ。将抗原液Ⅱ分别Montanide^TM ISA 763 A VG佐剂按照质量比为70：30的比例进行乳化得到疫苗Ⅱ，具体步骤如下：将佐剂按照比例倒入烧杯中，在乳化机上以1000rpm/min的转速进行搅拌10s～60s，并将抗原液缓慢加入佐剂中后将转速增加到5000～10000rpm/min，保持3～20min。

实施例3、疫苗的检验

一、剂型

取一支1ml一次性移液管，吸取少量实施例2制备的各个疫苗滴于装在90mm一次性平皿的冷水表面，除第一滴外，均不扩散。

二、疫苗的稳定性

取实施例2制备的各个疫苗10ml加入到10ml离心管，3500r/min离心15分钟，管底析出的水相不多于0.5ml。取实施例2制备的各个疫苗于2-8℃放置24个月、37℃放置1个月或25℃放置3个月无变色，分层和破乳等现象。

三、疫苗的无菌检验

1、取上述抗原按照《中华人民共和国兽药典》的方法进行无菌检验结果无细菌生长。

实施例4、疫苗的安全性试验

一、溶血性试验

1、取体重为350g左右的豚鼠，采集新鲜血液1ml，分离血细胞。

2、用PBS缓冲液洗涤血细胞，然后用PBS缓冲液制备细胞悬液(血细胞与PBS缓冲液的体积比为2:98)。

3、用PBS缓冲液分别制备实施例2制备的各个疫苗的2倍稀释液、4倍稀释液和8倍稀释液。

4、将1体积份步骤2得到的细胞悬液和1体积份步骤3得到的疫苗稀释液混合，室温静置8小时，然后进行判定(完全溶血：溶液澄明、红色、管底无细胞残留；部分溶血：溶液澄明、红色或棕色、管底有部分红细胞残留；无溶血：红细胞完全沉淀，上层液体颜色澄明)。结果显示：均未发生血球破裂，无溶血现象。

二、急性毒性试验

体重为12～18g Balb/C小鼠：单次腹腔注射实施例2制备的各个疫苗，每只小鼠0.5ml，连续2周观察小鼠的活动状态、体重变化和存活率，14天后处死进行解剖检查；小鼠全部存活，没有出现竖毛、精神萎靡、行动迟缓等不良症状，体重呈现增加，未见脏器有病理改变。

三、超剂量安全性试验

取新西兰兔：单次肌肉注射实施例2制备的各个疫苗，每只兔子3ml，连续观察兔子的活动状态，体重变化和存活率。14天后处死进行解剖检查；兔子全部存活，无精神萎靡，拉稀粪等不良症状，体重呈现增加，未见脏器有病理性变化。

实施例5、疫苗的免疫原性

一、兔子实验

采用新西兰兔，分成3组，每组10只，分组免疫如下(肌肉注射)：

第一组：实验第1天和实验第28天各免疫一次疫苗Ⅰ，每次免疫1毫升；

第二组：实验第1天和实验第28天各免疫一次疫苗Ⅱ，每次免疫1毫升；

第三组(阴性对照)：实验第1天和实验第28天各免疫一次PBS缓冲液，每次免疫1毫升。

实验第42天，耳静脉取血并分离血清。分别用ELISA方法和抗原凝集方法检测血清抗体的效价。

通过抗原凝集检测血清抗体效价取血清0.5ml为第一管，二倍倍比稀释至第9管，第10管为无血清对照管，于各管中加入等量的0.5ml菌液(为100℃隔水煮沸30min的DCP1株菌悬液，菌液浓度相当于9亿/ml)摇匀后置于37℃，24h观察结果，观察方法同肥达氏反应。第一组和第二组实验动物得到的血清的效价均大于2⁴，第三组实验动物得到的血清的效价为0。

二、海洋哺乳动物试验

馆养海豚，分成3组，每组2只，分组免疫如下(肌肉注射)：

第一组：实验第1天和实验第28天各免疫一次疫苗Ⅰ，每次免疫1毫升；

第二组：实验第1天和实验第28天各免疫一次疫苗Ⅱ，每次免疫1毫升；

第三组(阴性对照)：实验第1天和实验第28天各免疫一次PBS缓冲液，每次免疫1毫升。

实验第42天，尾静脉取血并分离血清。用抗原凝集方法检测血清抗体的效价。

通过抗原凝集检测血清抗体效价取血清0.5ml为第一管，二倍倍比稀释至第9管，第10管为无血清对照管，于各管中加入等量的0.5ml菌液(为100℃隔水煮沸30min的DCP1株菌悬液，菌液浓度相当于9亿/ml)摇匀后置于37℃，24h观察结果，观察方法同肥达氏反应。第一组和第二组实验动物得到的血清的效价均大于2⁴，第三组实验动物得到的血清的效价为0。

最后所应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制。尽管参照实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应该理解，对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，都不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (10)

1.一种铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa DCP1菌株，菌种保藏号为：CGMCCNO.15418。

2.根据权利要求1所述的铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa DCP1菌株，其特征在于，所述菌株为从海洋哺乳动物中分离得到。

3.根据权利要求2所述的铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa DCP1菌株，其特征在于，所述海洋哺乳动物为海豚、海鲸、海狮或海象。

4.一种海洋哺乳动物疫苗，其特征在于，所述疫苗包括抗原液，所述抗原液为权利要求1所述铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa DCP1菌株的灭活浓缩菌液，菌液浓度≥6×10⁹个细菌/mL。

5.根据权利要求4所述的海洋哺乳动物疫苗，其特征在于，所述疫苗还包括疫苗佐剂，抗原液：疫苗佐剂的质量比为70：30～60：40。

6.根据权利要求4所述的海洋哺乳动物疫苗，其特征在于，所述疫苗的剂型为皮下注射剂或肌肉注射剂。

7.根据权利要求4所述的海洋哺乳动物疫苗，其特征在于，所述灭活浓缩菌液的制备方法包括如下步骤：

1)从海洋哺乳动物的气孔喷出物中分离出铜绿假单胞菌，通过培养、纯化、分子生物学和生化鉴定符合铜绿假单胞菌的特征，命名为铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosaDCP1菌株；

2)对分离纯化得到的铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa DCP1菌株进行扩大培养、灭活、浓缩得到灭活浓缩菌液。

8.权利要求5所述海洋哺乳动物疫苗的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：

将抗原液和疫苗佐剂按照比例进行搅拌乳化，即得到海洋哺乳动物疫苗。

9.根据权利要求8所述海洋哺乳动物疫苗的制备方法，其特征在于，所述将抗原液和疫苗佐剂按照比例进行搅拌乳化具体为：

将疫苗佐剂倒入容器中，以1000rpm/min的转速进行搅拌10s～60s，再将抗原液缓慢加入疫苗佐剂中后将转速增加到5000～10000rpm/min，保持3～20min。

10.权利要求1所述铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa DCP1菌株在制备海洋哺乳动物疫苗中的应用。