CN105727273A - 一种用水貂绿脓杆菌sd17株制备的灭活疫苗 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种用水貂绿脓杆菌SD17株制备的灭活疫苗，包含有抗原和疫苗佐剂，其中抗原为灭活的绿脓杆菌SD17株，保藏编号为CCTCC NO：M2016069。本发明制备的灭活疫苗安全可靠，能提供有效地同源攻毒保护，免疫后能够产生较强免疫力，接种貂群的发病率和死亡率均明显减少，能够有效预防水貂出血性肺炎的流行和传播，降低本病对毛皮动物养殖业造成的经济损失，有着广阔的应用前景。

Description

一种用水貂绿脓杆菌SD17株制备的灭活疫苗
技术领域
本发明属于疫苗制备技术领域，具体涉及一种用水貂绿脓杆菌SD17株制备的灭活疫苗。
背景技术
水貂出血性肺炎又称水貂假单胞菌性肺炎，是主要发生在每年8-11月份水貂换毛季节的一种急性传染病，以出血性肺炎、急性死亡为特征，死前出现呼吸困难、鼻孔流出红色带泡沫液体等症状，死后剖检可见整个肺叶肿大并有弥漫性出血和败血症变化。本病世界各地均有发生，每年可造成养殖场20％-40％的死亡率，是危害毛皮动物养殖业的重要细菌性传染病。
该病病原为假单胞菌科(Pseudomonadaceae)假单胞菌属(Pseudomonas)中的铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginolsa)，亦称为绿脓杆菌(Bacteriumpyocyaneum)，为革兰氏阴性杆菌，两端钝圆，一端有一根鞭毛，能运动。不能形成芽孢及荚膜。在普通琼脂培养基上生长良好，形成大小不一的菌落。多数能产生色素，使菌落周围琼脂培养基着色。绿脓杆菌共有A、B、C、D、E、F、G、H、I、G、K、L、M、N等14个血清型。我国各地水貂出血性肺炎的流行血清型主要以G(6型)、B(2、5、16型)为主(括号内为对应的国际血清分型系统IATS)。
水貂出血性肺炎发病急，死亡快，发病时往往来不及治疗，常用药物替米考星、阿奇霉素、卡那霉素治疗效果不显著，而且抗生素的滥用导致绿脓杆菌已产生耐药性，因此需要有效的疫苗来预防，国外有报道将细菌细胞壁提取物(JAMESE.PENNINGTON，1979)加类毒素成分弹性蛋白酶制成免疫原，有一定的免疫效果，但制备过程复杂，成本高，不适合大量生产使用，而且免疫次数多，免疫期短，不适合临床应用，绿脓杆菌抗原型繁多，单一成分的细胞提取物往往很难达到很好的保护效果。目前各国在水貂出血性肺炎的预防中多以菌体灭活疫苗产品为主，将流行血清型的菌株灭活后制备成多价灭活疫苗，可有效预防同类血清型菌株引起的该病。
发明内容
本发明提供一种用水貂绿脓杆菌SD17株制备的灭活疫苗，从而解决水貂绿脓杆菌灭活疫苗研发中现有疫苗株免疫原性不强、各血清型之间免疫交叉保护力低的问题。
本发明提供一种用水貂绿脓杆菌SD17株制备的灭活疫苗，包含有抗原和疫苗佐剂，其中抗原为灭活的绿脓杆菌(Pseudomonasaeruginlsa)SD17株，该菌株于2016年2月22日保藏在中国武汉、武汉大学的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCCNO：M2016069。
其中灭活是采用甲醛灭活方式；
优选佐剂为蜂胶佐剂或水佐剂；
疫苗中含菌量≥4.0×109CFU/mL。
本发明制备的灭活疫苗安全可靠，能提供有效地同源攻毒保护，免疫后能够产生较强免疫力，接种貂群的发病率和死亡率均明显减少，能够有效预防水貂出血性肺炎的流行和传播，降低本病对毛皮动物养殖业造成的经济损失，有着广阔的应用前景。
具体实施方式
为了更好的理解本发明，下面结合具体实施例来进一步说明。
实施例1：
水貂绿脓杆菌G型SD17株于2016年2月22日保藏在中国武汉、武汉大学的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCCNO：M2016069。
生产用培养基
十六烷三甲基溴化铵琼脂培养基(NAC)配制：称取4gNAC粉末加入100mL蒸馏水中，充分混匀后，121℃灭菌15min，冷却至50℃～60℃时，倾倒平板备用。
改良营养普通肉汤培养基(NB)配制：称取5gNB粉末加入100mL蒸馏水中，121℃灭菌15min。临用前加入终浓度2％胎牛血清的营养肉汤培养基，混合均匀后配制而成。
发酵培养基配制：蛋白胨2％，牛肉膏0.6％，氯化钠0.5％，葡萄糖0.5％，用去离子水配成，配完调pH值7.4～7.6，112℃30min，灭菌后按照培养基的2％加入健康胎牛血清。
1.1绿脓杆菌菌株的分离纯化
从山东省已注射过绿脓杆菌灭活疫苗，但还是发生了典型性水貂出血性肺炎的某大型水貂养猪场中选取发病水貂，无菌采集病貂的肺脏、肝脏和心血划线接种于十六烷三甲基溴化铵琼脂培养基(NAC)上，置于37℃培养箱培养16h～18h，挑取圆形、光滑、湿润、扁平的菌落革兰氏染色镜检，选取革兰氏阴性细小杆菌进行划线纯培养。
将纯培养菌株分别划线接种于鲜血琼脂平板和NAC平板，37℃培养16h～18h，选取在十六烷三甲基溴化铵培养基上产生绿色荧光色素，在血琼脂培养基上产生β溶血的小菌落进行纯化培养。
根据绿脓杆菌的生化鉴定试验要求进行鉴定，将进一步纯化培养的两株菌株，分别进行绿脓色素培养基生长、氧化酶试验、葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、木糖分解试验、硝酸盐还原试验、明胶液化试验、42℃生长试验等。结果均为表1所示。该菌株根据其病貂的来源地命名为SD17株。
表1：分离菌株生化试验结果
1.216SrRNA基因序列测定与分析
1.2.1引物设计采用细菌的16SrRNA通用引物F27(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和下游引物R1492(5’-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’)。引物送由上海生物工程技术服务有限公司合成。引物由上海生物工程有限公司合成。
1.2.2细菌DNA模板的制备过夜培养绿脓杆菌，取1ml菌液到1.5mlEP管中，8000r/min10min倒掉上清，沉淀用100μl蒸馏水悬浮，沸水煮沸15min，放在-20℃冰柜反复冻融3次。5000r/min10min，收集上清即为细菌基因组DNA。
1.2.3PCR扩增PCR扩增体系总体积为25μL，10×ExTaqBuffer2.5μL、dNTPs2μL、上下游引物(10μmol/L)各0.5μL、模板DNA1μL、ExTaqDNA聚合酶0.25μL,ddH2O18.25μL。PCR扩增条件：94℃5min；94℃1min，53℃1min，72℃2min，循环30次；72℃延伸15min。
1.2.4凝胶电泳将PCR产物加上样缓冲液后，用1％琼脂糖凝胶进行电泳，然后用凝胶成像仪分析结果。经测定G型SD17株的16SrRNA基因片段大小为1502bp。用DNA快速回收试剂盒回收PCR产物，-20℃保存备用。
1.2.516SrRNA扩增产物的克隆与测序将回收的PCR产物与pMD19-T在16℃连接30min，转化DH5α感受态细菌，37℃过夜培养12h～16h。挑取平板上的单菌落于氨苄青霉素抗性的LB液体培养基中37℃过夜振荡培养，次日应用菌液PCR的方法扩增16SrRNA基因筛选阳性克隆，鉴定为阳性的菌液提取质粒交由青岛华大基因科技股份有限公司测序。将序列在GenBank中进行BLAST比对，与已发布的绿脓杆菌相应序列的同源性最高，但也存在上序列上的差异。
1.3绿脓杆菌RC株的血清学鉴定
绿脓杆菌血清分型按日本生研株式会社铜绿假单胞菌标准阳性血清试剂盒附带的说明书进行操作:
1.3.1抗原的制备将被检菌株划线接种于NAC培养基上，置37℃培养24小时，再挑取单个菌落接种于普通琼脂培养基上，37℃培养24小时。取单个菌落溶于100μL生理盐水，置于EP管中，制成抗原备用。
1.3.2玻板凝集反应取10μL抗原与20μL血清在洁净的玻板上充分混合，同时取10μL抗原与20μL生理盐水混合作为空白对照。结果判定:在1min内，在透明的背景下观察到有凝集块，空白对照为阴性的为凝集反应阳性。可见SD17株于G型血清与抗原之间出现明显的凝集反应，故判定水貂绿脓杆菌SD17株为血清G型。
1.4动物攻毒试验
1.4.1攻毒菌液的制备水貂绿脓杆菌G型SD17株菌种划线接种于含十六烷三甲基溴化铵平板上，37℃培养16h～18h，然后挑选10个左右典型菌落，分别接种含0.3％牛肉膏和2％胎牛血清斜面若干支，37℃培养16h～18h，进行活菌计数。
1.4.2动物攻毒试验结果选取非疫区21～42日龄健康易感水貂20头，经抗体效价测定，其凝集法测抗体效价均≤1:4，随机分为4组，每组5头。将水貂绿脓杆菌G型SD17株菌液稀释为2.0×106CFU、5.0×106CFU/ml、8.0×106CFU/ml三个梯度，接种5头试验貂1.0ml/只，另外1组注射灭菌生理盐水1.0mL作为对照，观察14日，记录临床发病情况。攻毒组大部分水貂出现体温升高1～2℃，维持2～3天，食欲减退，咳嗽，呼吸困难，呈腹式呼吸，咳血或鼻孔流出红色泡沫性液体等水貂出血性肺炎临床症状或死亡的，判为发病。攻毒组水貂的发病率和死亡率如表2所示。对照组水貂的体温无明显变化，亦无临床症状和死亡。
表2：水貂绿脓杆菌G型SD17株毒力试验结果
毒力试验结果表明，水貂绿脓杆菌G型SD17株生产菌种能使21～42日龄健康易感貂5/5发病的最小发病量为8.0×106CFU/ml。
1.5免疫原性的测定
以水貂绿脓杆菌G型SD17株的生产菌种制备灭活疫苗进行免疫原性鉴定。取21～42日龄健康易感水貂10头，每组各5头。试验组经颈部皮下注射水貂绿脓杆菌G型SD17株灭活疫苗1.0ml，14日后连同条件相同的对照貂，分别注射一个最小发病剂量的水貂绿脓杆菌G型SD17株菌液1.0ml(约含活菌8.0×106CFU/ml)，观察14日，记录对照组及免疫组试验貂免疫保护及发病情况。
表3：水貂绿脓杆菌G型SD17株免疫原性试验结果
免疫原性试验结果表明，14日后对免疫试验貂连同对照试验貂各进行攻毒试验，对照组5/5发病，并有部分死亡，免疫试验组水貂G型SD17株攻毒为5/5保护，说明水貂绿脓杆菌G型SD17株对同型菌株具有良好的免疫原性。
实施例2：
水貂绿脓杆菌G型SD17株在制备灭活疫苗中的应用。
取水貂绿脓杆菌G型SD17株，活化后分别接种培养基，培养后收集菌液，经甲醛溶液灭活，与蜂胶佐剂混合配制成灭活蜂胶疫苗。
优选操作步骤如下：
2.1菌种选择
制苗用菌种为水貂绿脓杆菌G型SD17株，其菌落形态、菌体特征、生化特性、培养特性均稳定，对水貂有较强的致病性，1.0mL菌液(8.0×106CFU/mL)注射即可导致100％的21～42日龄水貂发病。水貂绿脓杆菌G型SD17株的免疫原性良好，最低免疫剂量应≥4.0×109。
2.2生产用菌种制备
2.2.1一级种子繁殖与鉴定：取冻干的G型SD17株菌种，用营养肉汤溶解后，分别接种于含十六烷三甲基溴化铵的斜面培养基上，37℃培养16小时，取培养物分别划线接种于含十六烷三甲基溴化铵的平板上，37℃培养16～18小时，然后按1.2.1和1.2.2项标准，各选5～10个典型菌落，分别接种含十六烷三甲基溴化铵斜面若干支，37℃培养16～18小时，经纯粹检验合格后，作为一级种子。在2-8℃保存，应不超过7日。在培养基上传代，不超过3代。
2.2.2二级种子繁殖：取一级种子，分别接种于含0.3％牛肉膏和2％小牛血清的营养肉汤培养基，37℃培养16～18小时，取样经纯粹检验合格后，作为二级种子。置2～8℃保存，应不超过7日。
2.3制苗用培养基：为添加0.3％牛肉膏和2％胎牛血清的营养肉汤培养基。
2.4制苗用菌液制备
2.4.1菌液培养
两种菌液采用微生物发酵罐分别进行培养。
按发酵罐容积总量装入70％的培养基与0.01％的消泡剂。培养基蒸汽高压灭菌后，待其温度降至37～38℃时，按培养基总量的2％～3％加入二级种子液，开始小量通气，逐渐增大通气量，调整pH为7.2～7.6，通气量为5～6L/min，搅拌速度控制在100～150转/分，37℃培养16～18小时，收获菌液，置2-8℃备用。
2.4.2纯粹检验与活菌计数
菌液培养完成后，分别取样用适宜培养基进行纯粹检验，应纯粹。同时取样进行活菌计数，每种菌液含活菌数应≥4.0×109CFU/ml。
2.4.3灭活
检验合格的菌液，按菌液总量的0.2％缓慢加入甲醛溶液，充分混合，37℃灭活24小时，期间搅拌4～6次。
2.4.4半成品检验
2.4.4.1无菌检验
按现行《中国兽药典》附录进行，应无菌生长。
2.4.4.2灭活检验
灭活完成后，取灭活菌液1.0ml接种于含0.3％牛肉膏和2％胎牛血清的100ml营养肉汤培养基中，37℃培养24小时，应无菌生长。
3蜂胶灭活疫苗的制备
3.1蜂胶的纯化
将蜂胶置-15℃冷冻至少24小时，再用冷冻粉碎机磨碎过筛，按1:4(W/V)的比例加入95％乙醇，37℃浸提48～72小时，冷却、过滤，即得纯净蜂胶乙醇浸出液(透明栗色溶液)，蜂胶含量在50％以上即可使用。
3.2疫苗配制
按每ml疫苗含灭活的G型SD17株菌数均≥4.0×109CFU/ml，蜂胶干物质含量为8～15mg标准，根据预配苗的总量、菌液的菌数结果以及蜂胶乙醇浸出液的浓度，分别计算出所需绿脓杆菌G型SD17株菌液、蜂胶乙醇浸出液及注射用水的量。先将所需量的注射用水置配苗乳化罐中，然后加入所需量的绿脓杆菌G型SD17株菌液，低速(2000rpm)搅拌5分钟，然后缓慢加入蜂胶乙醇浸出液继续(2000rpm)搅拌15～20分钟，使其充分混合乳化。
3.3半成品检验：按现行《中国兽药典》附录进行，应无菌生长。
3.4分装
经无菌检验合格后，定量分装，分装时应随时搅拌，使其混合均匀，加盖密封，并粘贴标签。
4成品检验
4.1物理性状
本品为乳黄色混悬液，久置后底部有沉淀，振摇后即成均匀混悬液。
4.2无菌检验
按现行《中国兽药典》附录进行，应无菌生长。
4.3装量检验
按现行《中国兽药典》附录进行，应符合有关规定。
4.4安全检验
用21～42日龄健康易感貂5头(凝集法测抗体效价≤1:4)，各肌肉注射疫苗2.0ml，观察14日，注射水貂无不良反应，全部健活。
4.5效力检验
(1)免疫攻毒法用21～42日龄健康易感水貂6头(凝集法测抗体效价≤1:4)，各肌肉注射疫苗1.0ml，21日后，连同条件相同的对照貂5头，分别接种一个最小致死剂量的G型SD17株菌液0.2ml，进行攻毒，观察14日，免疫组全部存活，对照组则全部死亡。
而且，对比实验表明，用目前市场上出售的水貂绿脓杆菌疫苗进行免疫，再用本发明筛选的SD17菌株进行攻毒实验；结果表明目前市场上出售的疫苗的免疫效果远低于本发明SD17株制成的灭活疫苗的效果。推测是由于SD17菌株基因发生变异导致目前疫苗的免疫效果降低。
(2)血清学方法用21～42日龄健康易感水貂6头(凝集法测抗体效价≤1:4)，各肌肉注射疫苗1.0ml，21日后，连同条件相同的对照貂5头，采血测定血清中G型水貂绿脓杆菌抗体效价，免疫貂均≥1:16，对照貂≤1:4。
4.6甲醛残留量测定按现行《中国兽药典》附录进行，甲醛残留符合兽用生物制品通则的有关规定。
实施例3：
水貂绿脓杆菌G型SD17株在制备灭活疫苗中的应用。
取水貂绿脓杆菌G型SD17株，活化后分别接种培养基，培养后收集菌液，经甲醛溶液灭活，与水佐剂混合配制成灭活疫苗。
优选操作步骤如下：
2.1菌种选择
制苗用菌种为水貂绿脓杆菌G型SD17株，其菌落形态、菌体特征、生化特性、培养特性均稳定，对水貂有较强的致病性，1.0mL菌液(8.0×106CFU/mL)注射即可导致100％的21～42日龄水貂发病。水貂绿脓杆菌G型SD17株的免疫原性良好，最低免疫剂量应≥4.0×109。
2.2生产用菌种制备
2.2.1一级种子繁殖与鉴定：取冻干的G型SD17株菌种，用营养肉汤溶解后，分别接种于含十六烷三甲基溴化铵的斜面培养基上，37℃培养16小时，取培养物分别划线接种于含十六烷三甲基溴化铵的平板上，37℃培养16～18小时，然后按1.2.1和1.2.2项标准，各选5～10个典型菌落，分别接种含十六烷三甲基溴化铵斜面若干支，37℃培养16～18小时，经纯粹检验合格后，作为一级种子。在2-8℃保存，应不超过7日。在培养基上传代，不超过3代。
2.2.2二级种子繁殖：取一级种子，分别接种于含0.3％牛肉膏和2％小牛血清的营养肉汤培养基，37℃培养16～18小时，取样经纯粹检验合格后，作为二级种子。置2～8℃保存，应不超过7日。
2.3制苗用培养基：为添加0.3％牛肉膏和2％胎牛血清的营养肉汤培养基。
2.4制苗用菌液制备
2.4.1菌液培养
两种菌液采用微生物发酵罐分别进行培养。
按发酵罐容积总量装入70％的培养基与0.01％的消泡剂。培养基蒸汽高压灭菌后，待其温度降至37～38℃时，按培养基总量的2％～3％加入二级种子液，开始小量通气，逐渐增大通气量，调整pH为7.2～7.6，通气量为5～6L/min，搅拌速度控制在100～150转/分，37℃培养16～18小时，收获菌液，置2-8℃备用。
2.4.2纯粹检验与活菌计数
菌液培养完成后，分别取样用适宜培养基进行纯粹检验，应纯粹。同时取样进行活菌计数，每种菌液含活菌数应≥4.0×109CFU/ml。
2.4.3灭活
检验合格的菌液，按菌液总量的0.2％缓慢加入甲醛溶液，充分混合，37℃灭活24小时，期间搅拌4～6次。
2.4.4半成品检验
2.4.4.1无菌检验
按现行《中国兽药典》附录进行，应无菌生长。
2.4.4.2灭活检验
灭活完成后，取灭活菌液1.0ml接种于含0.3％牛肉膏和2％胎牛血清的100ml营养肉汤培养基中，37℃培养24小时，应无菌生长。
3疫苗配制
按每ml疫苗含灭活的G型SD17株菌数均≥4.0×109CFU/ml标准，根据预配苗的总量、菌液的菌数结果分别计算出所需绿脓杆菌G型SD17株菌液、佐剂及注射用水的量。先将所需量的注射用水置配苗乳化罐中，然后加入所需量的绿脓杆菌G型SD17株菌液，低速(2000rpm)搅拌5分钟，然后缓慢加入水佐剂继续(2000rpm)搅拌15～20分钟，使其充分混合乳化。
3.1半成品检验：按现行《中国兽药典》附录进行，应无菌生长。
3.2分装
经无菌检验合格后，定量分装，分装时应随时搅拌，使其混合均匀，加盖密封，并粘贴标签。
4成品检验
4.1物理性状
本品为乳黄色混悬液，久置后底部有沉淀，振摇后即成均匀混悬液。
4.2无菌检验
按现行《中国兽药典》附录进行，应无菌生长。
4.3装量检验
按现行《中国兽药典》附录进行，应符合有关规定。
4.4安全检验
用21～42日龄健康易感貂5头(凝集法测抗体效价≤1:4)，各肌肉注射疫苗2.0ml，观察14日，注射水貂无不良反应，全部健活。
4.5效力检验
(1)免疫攻毒法用21～42日龄健康易感水貂6头(凝集法测抗体效价≤1:4)，各肌肉注射疫苗1.0ml，21日后，连同条件相同的对照貂5头，分别接种一个最小致死剂量的G型SD17株菌液0.2ml，进行攻毒，观察14日，免疫组全部存活，对照组则全部死亡。
而且，对比实验表明，用目前市场上出售的水貂绿脓杆菌疫苗进行免疫，再用本发明筛选的SD17菌株进行攻毒实验；结果表明目前市场上出售的疫苗的免疫效果远低于本发明SD17株制成的灭活疫苗的效果。推测是由于SD17菌株基因发生变异导致目前疫苗的免疫效果降低。
(2)血清学方法用21～42日龄健康易感水貂6头(凝集法测抗体效价≤1:4)，各肌肉注射疫苗1.0ml，21日后，连同条件相同的对照貂5头，采血测定血清中G型水貂绿脓杆菌抗体效价，免疫貂均≥1:16，对照貂≤1:4。
4.6甲醛残留量测定按现行《中国兽药典》附录进行，甲醛残留符合兽用生物制品通则的有关规定。

Claims (6)

1.一种灭活疫苗，其特征在于，所述的灭活疫苗包含有抗原和疫苗佐剂，其中抗原为灭活的绿脓杆菌(Pseudomonasaeruginlsa)SD17株。
2.如权利要求1所述的灭活疫苗，其特征在于，所述的SD17株的保藏编号为CCTCCNO：M2016069。
3.如权利要求1所述的灭活疫苗，其特征在于，所述的灭活是用甲醛进行灭活的。
4.如权利要求1所述的灭活疫苗，其特征在于，所述的佐剂为蜂胶佐剂(或水佐剂)。
5.如权利要求1所述的灭活疫苗，其特征在于，所述疫苗中绿脓杆菌的含菌量不少于4.0×109CFU/mL。
6.权利要求1所述的灭活疫苗在预防水貂出血性肺炎中的应用。
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