CN109554420B - B型产气荚膜梭菌外毒素及其制备方法、产毒培养基和应用 - Google Patents

B型产气荚膜梭菌外毒素及其制备方法、产毒培养基和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种B型产气荚膜梭菌外毒素及其制备方法、产毒培养基和应用。其中每1000ml所述产毒培养基由以下重量配比的原料制成：蛋白胨15‑25g、酵母浸粉3‑5g、NaCl 3‑4g、Na2HPO4·12H2O 5‑10g、糊精5‑10g或粗糊精5‑10g，其余为注射用水。根据本发明的方法制备得到的B型产气荚膜梭菌毒素液毒力最高可达1小鼠MLD≤0.0006mL，高出制苗标准的3.3倍。并且，用其制备的羊快疫、猝狙(或羔羊痢疾)肠毒血症三联灭活疫苗在家兔及绵羊的相应血清中和效价也达到或高于相关规程标准。

Description

B型产气荚膜梭菌外毒素及其制备方法、产毒培养基和应用
技术领域
本发明属于兽用生物制品领域，具体涉及一种B型产气荚膜梭菌外毒素及其制备方法、产毒培养基和应用。
背景技术
产气荚膜梭菌病是由梭菌属(Clostridium)中致病性菌种引起的疾病的总称。梭菌是一类厌氧性细菌，有60余种，常见的致病性菌仅10余种，多存在于土壤、污水以及人和各种动物的粪便中。革兰氏染色均为阳性，除少数菌种外，都有鞭毛，能运动和形成芽孢，其直径大于菌体。多数菌种能产生具有剧烈毒性的外毒素，它既是致病的主要因子，又是主要抗原，转变成类毒素后能刺激动物产生抗毒素，可用于预防相应的梭菌病。梭菌病发病迅速、病程短、死亡率高。家畜中多见于反刍动物如牛、羊等。
B型产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens type B)主要引起初生羔羊的一种急性毒血症，以剧烈腹泻和小肠发生溃疡为其特征。本病常可使羔羊发生大批死亡，给养羊业带来重大损失。C型产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens type C)主要引起羊猝狙。幼龄羊和成年羊均可发生，但以成年羊居多，常突然发病，在数小时内死亡，表现急性中毒的毒血症症状。而B型产气荚膜梭菌灭活疫苗既可以预防羔羊痢疾又可以预防羊猝狙病的发生。
在牧草返青、大量补饲精饲料、突然更换日粮、外伤、管理调整、寄生虫或者其它不正常的情况出现时会创造出适宜梭菌生长的环境，梭菌会制造并分泌强外毒素。通常梭菌感染预后很差，往往发现时动物就已经死亡。由于治疗成功率很低，所以该病的重点在于预防，大范围的免疫接种能够有效的降低该疾病造成的损失。目前，我国用于预防该疫病的疫苗有羊快疫、猝狙、肠毒血症三联灭活疫苗、羊快疫、猝狙、羔羊痢疾、肠毒血症三联四防灭活疫苗和羊梭菌病多联干粉疫苗。
目前业内使用的疫苗普遍以牛肉、鱼肉、牛肝等动物性原材料来制备厌气肉肝胃酶消化汤、鱼肝肉胃酶消化汤培养基，但使用这种方法制备培养基，常因原材料质量参差不齐、批间差异大，常常出现产毒性能不稳定的现象，尤其是近几年由于国内乳品业的发展，奶牛饲养量急速增加，随之而来大量的淘汰奶牛肉充斥市场更造成制备疫苗培养基的原材料质量下降；同时，牛肉、牛肝中残留的药物也常常造成抑制细菌生长，以上种种情况严重影响了疫苗的质量，并且近年来牛、羊梭菌病流行加剧也反应了疫苗质量的下降。另外，传统培养基制备过程繁琐、耗时长、需要人力多，价格高昂、回收率低，也给疫苗生产带来了极大的浪费和高额的成本，给疫苗生产企业造成极大困扰。业界急需一种取材方便，质优价廉，性能稳定的培养基与培养方法与之相适应。
发明内容
为解决现有技术中存在的一个或多个问题，本发明的一个目的是提供一种B型产气荚膜梭菌产毒培养基。
提供的B型产气荚膜梭菌产毒培养基，每1000ml培养基由以下重量配比的原料制成：蛋白胨15-25g；酵母浸粉3-5g；NaCl 3-4g；Na2HPO4·12H2O 5-10g；糊精(生物试剂)5-10g或粗糊精5-10g；其余为注射用水。
提供的B型产气荚膜梭菌产毒培养基，每1000ml培养基可以具体由以下重量配比的原料制成：蛋白胨25g；酵母浸粉3g；NaCl 3g；Na2HPO4·12H2O 10g；粗糊精10g；其余为注射用水。
上述提供的B型产气荚膜梭菌产毒培养基的pH值为8.1-8.3。
本发明的另一目的是提供一种上述B型产气荚膜梭菌产毒培养基的制备方法，所述方法包括以下步骤：将制备上述培养基的原料蛋白胨、酵母浸粉、NaCl、Na2HPO4·12H2O按重量配比加入总体积80％的注射用水中溶解，并调节pH值为8.1-8.3后加入重量配比的糊精(生物试剂)或粗糊精(药用)，定容，高压灭菌，得到所述培养基。通过以上方法制备B型产气荚膜梭菌产毒培养基具有以下有益效果：该培养基配制加样顺序有效地保证了营养物质在可见状态下进行溶解完全；将原料中除粗糊精外的物质进行溶解后调节pH值，此时获得的溶液有一定的缓冲能力，调节pH值之后定容基本上不会改变最终获得的培养基的pH值，这样不仅可以确保最终配比体积的准确，并便于pH值的精确调节；同时由于粗糊精属于淀粉类试剂，对pH计有粘附作用，因此选择在加入粗糊精之前进行调节pH，有利于pH计的保护。
上述调节pH值可以采用2mol/L的氢氧化钠溶液进行调节，根据本发明的公开，本领域技术人员还可以采用其他合适的试剂来调节上述培养基的pH值，这些都在本发明的保护范围之内；高压灭菌的条件可为116℃高压蒸汽灭菌30min。
本发明的另一目的是提供一种B型产气荚膜梭菌外毒素的制备方法，所述方法包括以下步骤：
种子液培养：将B型产气荚膜梭菌接种于无糖厌气肉肝汤中，在36-37℃下静置培养10-16h，制得B型产气荚膜梭菌的种子液；
发酵培养：将所述种子液接种于上述的B型产气荚膜梭菌产毒培养基中进行培养，收获一定时间段的培养物并离心，然后收集上清液并过滤，所得滤液即为所述B型产气荚膜梭菌外毒素。
上述B型产气荚膜梭菌外毒素的制备方法中，B型产气荚膜梭菌的种子液可为一级种子液，也可为二级种子液；其中一级种子液的制备方法为：将B型产气荚膜梭菌接种于无糖厌气肉肝汤中，置36-37℃静止培养10-16h，随后进行纯检，纯粹者为一级种子液。二级种子液的制备方法为：将上述一级种子液按接种量1～1.5％(v/v)接种于350ml/500ml瓶厌气肉肝汤中，置36-37℃静置培养10-16h，随后经纯粹检验合格者为二级种子液。也可以继续对上述二级种子液继续扩大培养得到的种子液也可以作为发酵培养产生B型产气荚膜梭菌外毒素的种子液，也在本发明的保护范围之内。
上述B型产气荚膜梭菌外毒素的制备方法中，B型产气荚膜梭菌接种的接种量和所述种子液接种的接种量均为1-1.5％(v/v)。
上述B型产气荚膜梭菌外毒素的制备方法中，所述发酵培养可以在500ml瓶或发酵罐中培养。发酵培养中培养条件为36-37℃静置培养12-14h；本发明人在发酵培养过程中发现，如果采用现有技术教导的发酵培养时间为10-16h，最终获得的10h发酵培养时间和16h发酵培养时间条件下的B型产气荚膜梭菌毒素毒力测定不能满足《中华人民共和国兽用生物制品规程》2000年版规定羊快疫、猝狙(或羔羊痢疾)、肠毒血症三联灭活疫苗中B型产气荚膜梭菌毒素0.001-0.002ml规定的毒力标准。而本发明优选发酵培养时间为12-14h时，即收获发酵培养12-14h任一时间的菌液获得的B型产气荚膜梭菌毒素毒力均达到甚至超过上述规程的标准。
上述B型产气荚膜梭菌外毒素的制备方法中，离心的转速为3000-4000rpm，时间为20-30min。
上述B型产气荚膜梭菌外毒素的制备方法中，过滤可采用0.22μm滤膜进行过滤。
本发明的又一目的是提供一种B型产气荚膜梭菌外毒素，其根据上述B型产气荚膜梭菌外毒素的制备方法制备而成。
上述B型产气荚膜梭菌外毒素在制备用于预防由产气荚膜梭菌引起的相关疾病的药物或疫苗中的应用也属于本发明。所述B型产气荚膜梭菌外毒素经灭活脱毒制成的类毒素在制备用于预防由产气荚膜梭菌引起的相关疾病的药物或疫苗中的应用也属于本发明。所述相关疾病选自羊快疫、猝狙、羔羊痢疾、肠毒血症中的任一种或其组合，所述疫苗选自羊快疫、猝狙(或羔羊痢疾)、肠毒血症三联灭活疫苗；羊梭菌病多联干粉灭活疫苗中的至少一种。
本发明的又一目的是提供一种由上述B型产气荚膜梭菌外毒素制备得到的B型产气荚膜梭菌类毒素疫苗。
上述疫苗是由B型产气荚膜梭菌外毒素经灭活脱毒后与氢氧化铝胶均匀混合而成，例如按体积为5:1均匀混合而成。
上述疫苗是由经灭活脱毒的D型产气荚膜梭菌外毒素:B型产气荚膜梭菌外毒素:腐败梭菌外毒素按1:2:1的比例混合后与氢氧化铝胶按体积比为5:1均匀混合而成。
上述D型产气荚膜梭菌外毒素毒力为1MLD≤0.00025ml，所述B型产气荚膜梭菌外毒素毒力为1MLD≤0.001ml，和所述腐败梭菌外毒素毒力为1MLD≤0.005ml。
采用以上方案，本发明制备得到的B型产气荚膜梭菌产毒培养基产毒性能稳定且由于不含有传统培养基原料所携带的药物残留等，对培养产毒细菌无抑制作用，同时其制备方法简单、取材方便、质优价廉，通过其获得的B型产气荚膜梭菌外毒素相对于传统培养基制备得到的毒素毒力效果更加稳定，利用其制备得到的疫苗质量更高，解决了现有技术中存在的所有问题。具有以下优点：
(1)本发明以商品化蛋白胨、酵母浸粉等成品作为原材料替代原有质量不可控的牛肉、牛肝等原材料，通过筛选培养基配方及各组分最佳含量并优化产毒培养条件，使培养基的产毒能力达到甚至超过相关规程标准并几乎无批间差，用以制备兽用B型产气荚膜梭菌类毒素。
(2)本发明通过筛选获得的培养基无论用500ml瓶或发酵罐培养，均具有较强的产毒能力，并且产毒性能稳定，质量可控，另外配制使用方便，价格低廉。
(3)本发明在家兔及绵羊上对本发明制备的B型产气荚膜梭菌类毒素疫苗的效果进行了评价。结果用本发明制备的羊快疫、猝狙(或羔羊痢疾)、肠毒血症三联四防灭活疫苗，血清中和效价也达到甚至超过了相关规程的相应标准。
(4)本发明所使用的产毒培养基及其配制方法，取材方便、配制简单、省去了厌气肉肝胃酶消化汤、鱼肝肉胃酶消化汤的消化过程，大大缩短了制备时间，成本降低为原厌气肉肝胃酶消化汤的1/5。按本发明方法制备得到的B型产气荚膜梭菌外毒素毒力最高可提至《中国兽用生物制品规程》制苗标准的3.3倍。并且，用其制备的灭活疫苗在家兔及绵羊的相应血清中和效价也提高至规程标准的3-4倍。同时本发明的产毒培养基由于不含有动物性原材料残渣和药物残留，降低了研制、生产低免疫剂量类毒素灭活疫苗在纯化浓缩时的压力。本发明用于替代现有厌气肉肝胃酶消化汤、鱼肝肉胃酶消化牛肉汤培养基，用于羊梭菌多联灭活疫苗的生产具有广阔的前景。
具体实施方式
本发明针对现有技术中适用于B型产气荚膜梭菌的厌气肉肝胃酶消化汤等培养基原料取材不便、制备过程繁琐、耗时耗力，成本较高，并且产毒能力低、产毒效果不稳定等缺点，通过试验摸索，提供了一种更加适用于B型产气荚膜梭菌培养的产毒培养基，其取材方便、制备方法简单快捷、成本也较低，并且发酵培养获得的B型产气荚膜梭菌外毒素毒力高、产毒效果稳定，可以大范围推广使用。
同时，基于本发明提供的B型产气荚膜梭菌产毒培养基，本发明提供一种毒力水平较高的B型产气荚膜梭菌外毒素，并基于该外毒素获得一种B型产气荚膜梭菌灭活疫苗，其血清中和效价也达到甚至超过了相关规程的相应标准。
下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。
下文的公开提供了许多不同的实施方式或例子用来实现本发明的不同方面。本发明提供了各种特定的工艺和材料的例子，但是本领域普通技术人员可以意识到其他工艺的应用和/或其他材料的使用。
以下以具体实施例详述本发明。实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的公开内容不限于下述的实施例。
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。
本发明中所采用的B型产气荚膜梭菌生产菌株为兽用B型产气荚膜梭菌C58-2菌株，菌种编号CVCC60082 C58-2 2009.03.17，购自中国兽医微生物菌种保藏管理中心。
实施例中采用的糊精为生物试剂，粗糊精为药用粗制糊精。
本发明中提及的厌气肉肝汤按《中国兽用生物制品规程》的组成及制备方法制备，组成如下表1所示：
表1：厌气肉肝汤组成
Figure BDA0001892651850000061
制法：
1.取牛肉除去脂肪和筋膜，用绞肉机绞碎，与切成100g左右的肝块混合，加蒸馏水，充分搅拌后，冷浸20-24小时。
2.煮沸20-60分钟，补足失去的水份，用白布滤过，弃去肉渣，取出肝块。
3.滤液加入蛋白胨和氯化钠，加热融化，用氢氧化钠溶液调整pH 7.8-8.0，加热煮沸10-20分钟。
4.用滤纸或绒布滤过，加入葡萄糖搅拌，使其融化。
5.将滤过的肝块洗净，切成小方块，用蒸馏水充分冲洗后，分装于试管或中性玻璃瓶内，其量约为预计分装肉肝汤量的1/10。
6.将滤液分装于含有肝块的中性容器中(如为试管，还应加入适量液体石蜡)，以116℃高压蒸汽灭菌30-40分钟。
7.用途：供一般厌气菌培养及检验用。用于菌种保存时，不加葡萄糖。
实施例中所采用的稀释液(蛋白胨水)组分及配制方法《中国兽用生物制品规程》如下表2所示：
表2：蛋白胨水组分
Figure BDA0001892651850000071
制法：
1.将以上材料混合，加热溶解，用氢氧化钠溶液调整pH值6.8-7.2。
2.煮沸滤过，分装于中性容器中。
3.116℃高压蒸汽灭菌20分钟。
4.用途：供无菌检验稀释液(含蛋白胨1g)，及细菌计数稀释液和糖发酵(含蛋白胨10g)。
本发明中所提及的厌气肉肝胃酶消化汤根据《中国兽用生物制品规程》的组成及制备方法制备，组成如下表3所示：
表3：厌气肉肝胃酶消化汤组成
Figure BDA0001892651850000072
制法：
1.在65℃左右温水内加入盐酸和绞碎的牛肉、肝，充分搅匀，再加入胃蛋白酶充分搅拌，混合后的温度应在56-58℃。
2.置53-55℃条件下消化22-24小时，前10小时每小时充分搅拌一次。
3.提取上清液，加热至80℃，然后加入蛋白胨煮开，调pH至7.6-7.8。煮沸10分钟，滤过或经沉淀后取上清液，按量加入糊精溶解后分装。
4.116℃高压蒸汽灭菌40分钟。
5.用途：供制造梭菌疫苗用。
比较例：B型产气荚膜梭菌在传统厌气肉肝胃酶消化汤中培养效果评价
一、菌种培养及毒素制备：
将真空度良好的含有冻干B型产气荚膜梭菌菌种的安瓶，以无菌炸裂的方法打开，抽取适量无菌营养肉汤溶解冻干菌块，接种于无糖厌气肉肝汤6分试管中，接种量为1-1.5％(v/v)，置36-37℃静止培养10-16h，将培养物进行纯检，纯粹者为一级种子液。
将一级种子液按接种量1-1.5％(v/v)接种于350ml/500ml瓶厌气肉肝胃酶消化汤培养基中，置36-37℃静置培养12-16h，随后收集培养物并离心，离心的转速可以为3000rpm，时间可以为30min；收集上清液并过滤，采用0.22μm滤膜进行过滤，所得滤液取样测毒合格即为B型产气荚膜梭菌毒素。
二、毒素效果测定
本发明人应用传统厌气肉肝胃酶消化汤制备B型产气荚膜梭菌毒素共进行了36批次实验，测毒效果如下表4所示：
表4：B型产气荚膜梭菌在传统厌气肉肝胃酶消化汤中测毒结果
Figure BDA0001892651850000081
由上表4可知，通过测毒，由传统厌气肉肝胃酶消化汤培养制备B型产气荚膜梭菌毒素效果较差，在进行的36批次实验中，仅合格5批，不合格者多达31批，证明传统厌气肉肝胃酶消化汤培养基产毒效果不稳定且效果较差。本发明人采用合格批次灭活脱毒菌液配制羊三联四防灭活疫苗。检测结果为B型血清中和效价≥1MLD，C型血清中和效价≤1MLD，判定不合格。因此也证明了由传统厌气肉肝胃酶消化汤培养基制备得到的疫苗质量不高。
实施例1：B型产气荚膜梭菌产毒培养基筛选
一、制备B型产气荚膜梭菌产毒培养基
配方1：B型产气荚膜梭菌产毒培养基的配制
1.注射用水800mL，加入蛋白胨25g，酵母浸粉5g，氯化钠4g，Na2HPO4·12H2O 10g，使溶解。
2.用2mol/L NaOH调节pH 8.1-8.3。
3.加入10g粗糊精(药用)后，注射用水定容至1000ml。以116℃高压蒸汽灭菌30分钟，备用。
配方2：B型产气荚膜梭菌产毒培养基的配制
1.注射用水800mL，加入蛋白胨25g，酵母浸粉5g，氯化钠4g，Na2HPO4·12H2O 10g，使溶解。
2.用2mol/L NaOH调节pH 8.1-8.3。
3.加入10g糊精(生物试剂)后，注射用水定容至1000ml。以116℃高压蒸汽灭菌30分钟，备用。
二、菌种培养及毒素制备
将真空度良好的含有冻干B型产气荚膜梭菌菌种的安瓶，以无菌炸裂的方法打开，抽取适量无菌营养肉汤溶解冻干菌块，接种于无糖厌气肉肝汤6分试管中，置37℃静止培养16h。同时纯检，纯粹者为一级种子液。
将一级种子液按接种量1-1.5％(v/v)接种于350ml/500ml瓶中的B型产气荚膜梭菌产毒培养基中，置37℃静置培养12-16h，随后同步分别收集不同配方培养基的培养物并离心，离心的转速可以为3000rpm，时间可以为30min；收集上清液并过滤，采用0.22μm滤膜进行过滤，所得滤液取样测毒合格即为B型产气荚膜梭菌毒素。
三、两种B型产气荚膜梭菌产毒培养基产毒效果对比结果见下表5。
表5：两种B型产气荚膜梭菌产毒培养基产毒效果对比
Figure BDA0001892651850000091
表5数据表明，无论是配方1的粗糊精组，还是配方2的糊精组，通过配比各自适量的蛋白胨，获得的产毒效果均能达到《兽用生物制品规程》规定的小鼠1MLD≤0.002ml的水平，相对于比较例中的结果，本发明的培养基产毒效果更加稳定，并使得该实施例在制备培养基原料的选择上扩宽的思路，无需局限于传统厌气肉肝胃酶消化汤培养基使用的牛肉、牛肝等不易储存且成本高昂、取材不便的原料，该实施例选择使用市场上容易获得的产品作为制备B型产气荚膜梭菌产毒培养基，不仅原料易得，制备过程简单方便，并且大大节约制备培养基的时间，成本降低为传统厌气肉肝胃酶消化汤的1/5。另外，采用粗糊精的配方1与采用糊精的配方2相比，根据上表5数据，三次实验中有一次两者产毒效果相当，两次配方1较配方2更好，因此配方1粗糊精组的效果相对较好，确定配方中采用粗糊精为优选实施例，后续扩大培养试验均采用粗糊精作为培养基的组分进行制备本发明的B型产气荚膜梭菌产毒培养基。
实施例2：制备B型产气荚膜梭菌产毒培养基
采用与实施例1中配方1相同的制备方法，按下表6所列配方制备B型产气荚膜梭菌产毒培养基，并对其产毒效果进行评价。
表6：B型产气荚膜梭菌产毒培养基配方(1000ml)
Figure BDA0001892651850000101
在该实施例中，本发明人按照上表6中所列配方利用上述实施例1中所述的方法制备B型产气荚膜梭菌产毒培养基备用，随后将真空度良好的含有冻干B型产气荚膜梭菌菌种的安瓶，以无菌炸裂的方法打开，抽取适量无菌营养肉汤溶解冻干菌块，接种于无糖厌气肉肝汤6分试管中，置37℃静止培养16h。同时纯检，纯粹者为一级种子液。
将一级种子液按接种量1-1.5％(v/v)分别接种于350ml/500ml三角瓶中的根据配方3、4和5制备的B型产气荚膜梭菌产毒培养基中，置37℃静置培养12-16h，取样测毒合格即为B型产气荚膜梭菌毒素，并对其产毒效果进行评价。结果表明上表6中所列培养基配方3、4、5制备得到的培养基的产毒效果均能达到上述实施例1中配方1的产毒效果，即上表5中所列配方1粗糊精组培养基所达到的产毒效果。
实施例3：B型产气荚膜梭菌外毒素的制备及产毒效果评价
一、B型产气荚膜梭菌二级种子液外毒素的制备及产毒效果评价
将一级种子液按接种量1-1.5％(v/v)接种350ml/500ml瓶厌气肉肝汤中，置37℃静置培养16h，经纯粹检验合格者作为二级种子液。
将合格的二级种子液按接种量1-1.5％(v/v)接种于B型产气荚膜梭菌产毒培养基40000ml中，置37℃静置培养12-16h。
分别于培养12h、14h、16h取样，将样品菌液3000rpm/min离心30min，抽取上清用0.22μm滤器过滤，即作为B型产气荚膜梭菌外毒素，稀释后测毒。
并测定培养不同时间段菌液中毒素对小白鼠的毒力，以确定最佳产毒时间。
取过滤后毒素，用1％蛋白胨水按如下表7所示方法稀释后尾静脉注射16-20gKM小白鼠，每滴度注射2只，每只注射0.2mL，观察小鼠在注射后24h内的死亡情况。能使小鼠发生2/2死亡的最小毒素量即为B型产气荚膜梭菌毒素对小鼠的MLD。第1次和第2次实验产毒结果如下表8和9所示，其中0/2+表示注射2只小白鼠，有0只死亡；1/2+表示注射2只小白鼠，有1只死亡。2/2+表示注射2只小白鼠，有2只死亡。
表7：毒素稀释路径
Figure BDA0001892651850000111
表8：第1次实验产毒结果(40000ml规模)
Figure BDA0001892651850000112
由上表8可知：培养12h取样测定毒力1MLD≤0.0008ml；培养14h取样测定毒力1MLD≤0.001ml；培养16h取样测定毒力1MLD≤0.002ml。
表9：第2次实验产毒结果(40000ml规模)
Figure BDA0001892651850000113
Figure BDA0001892651850000121
由上表9可知，培养12h取样测定毒力1MLD≤0.0008ml；培养14h取样测定毒力1MLD≤0.001ml；培养16h取样测定毒力1MLD≤0.01ml。
二、B型产气荚膜梭菌三级种子液外毒素的制备及产毒效果评价
将一级种子液按接种量1-1.5％接种350ml/500ml瓶厌气肉肝汤，置37℃静止培养16小时，经纯粹检验合格者作为二级种子液。
将二级种子液按接种量1-1.5％接种8000mL/10000ml瓶厌气肉肝汤中，置37℃静止培养16小时，经纯粹检验合格者作为三级种子液。
将合格的三级种子液按接种量1-1.5％接种于B型产气荚膜梭菌产毒培养400000ml中，置37℃静止培养12-16h。
分别于培养12h、14h、16h取样，将样品菌液3000rpm/min离心30min，抽取上清用0.22μm滤器过滤，即作为毒素，稀释后测毒。
并测定培养不同时间段菌液中毒素对小白鼠的毒力，以确定最佳产毒时间。
取过滤后毒素，用1％蛋白胨水按上表7所示的方法稀释后尾静脉注射16-20gKM小白鼠，每滴度注射2只，每只注射0.2ml，观察小鼠在注射后24h内的死亡情况。能使小鼠发生2/2死亡的最小毒素量即为B型产气荚膜梭菌毒素对小鼠的MLD。第3次实验产毒结果见下表10。
表10：第3次实验产毒结果(400000ml规模)
Figure BDA0001892651850000122
由上表10可知，培养12h取样测定毒力1MLD≤0.0008ml；培养14h取样测定毒力1MLD≤0.001ml；培养16h取样测定毒力1MLD≤0.01ml。
由以上结果可知，本发明采用B型产气荚膜梭菌产毒培养基分别经3次重复扩大培养进行发酵培养B型产气荚膜梭菌，当发酵培养时间为12h和14h时，发酵培养获得的B型产气荚膜梭菌毒素的的毒力为1MLD≤0.001ml，均超过了《中华人民共和国兽用生物制品规程》(以下简称《规程》)2000年版规定羊快疫、猝狙(或羔羊痢疾)、肠毒血症三联灭活疫苗中B型产气荚膜梭菌毒素0.001-0.002ml规定的毒力标准。但是当发酵培养时间为16h时，三次扩大培养试验中仅有一次获得的B型产气荚膜梭菌毒素的毒力达到1MLD≤0.002ml，其余两次的测定毒力为1MLD≤0.01ml，未达到《规程》2000年版规定羊快疫、猝狙(或羔羊痢疾)、肠毒血症三联灭活疫苗中B型产气荚膜梭菌毒素0.001-0.002ml规定的毒力标准。本发明人也在发酵培养时间10h取样测定，但获得的B型产气荚膜梭菌毒素毒力测定结果远远不能满足《规程》规定的毒力标准，故不提供检测数据。因此，在发酵培养B型产气荚膜梭菌时优选发酵培养时间为12-14h，从培养12h-14h任一时间的菌液中得到的B型产气荚膜梭菌的毒素不仅可以达到或超过《规程》规定的毒力标准，还证明了利用本发明的B型产气荚膜梭菌产毒培养基产毒效果稳定，得到的B型产气荚膜梭菌毒素毒力稳定且较强，能够有效用于B型产气荚膜梭菌灭活脱毒疫苗的制备。
实施例4：羊快疫、猝狙(或羔羊痢疾)、肠毒血症三联灭活疫苗的制备及效力评价
一、羊快疫、猝狙(或羔羊痢疾)肠毒血症三联四防灭活疫苗的制备：
取事先培养完成的各型菌(D型产气荚膜梭菌、B型产气荚膜梭菌、腐败梭菌)培养物，按体积加入0.8％甲醛溶液(40％浓度)，置37℃灭活脱毒3～4日(搅拌4次/日)。取灭活脱毒菌液接种厌气肉肝汤、TSB、酪胨琼脂斜面，观察5日均无菌生长表明灭活完全；同时灭活菌液3000rpm/min离心30min，弃菌体沉淀吸取上清，将上清用0.22μm滤膜过滤，尾静脉注射16～20gKM小白鼠2只，每只注射0.4ml，观察24h均健活表明脱毒完全。
取灭活脱毒完全的各型菌液，过滤于装有200目铜纱的灭菌容器内，置2～8℃保存备用。
取适量氢氧化铝胶置玻瓶中，并补加适量注射用水(灭菌蒸发量)，灭菌，备用。
取适量脱毒完全，2～8℃保存的D型产气荚膜梭菌菌液(D，1MLD≤0.00025ml)、B型产气荚膜梭菌菌液(B，1MLD≤0.001ml)及腐败梭菌菌液(S，1MLD≤0.005ml)，分别置灭菌玻甁中，分别以2mol/L无菌氢氧化钠溶液调整pH至6.8～7.2。按D:B:S＝1:2:1的比例加入灭菌氢氧化铝胶甁中。使菌液与铝胶比例为5:1。振摇混匀，配制成羊快疫、猝狙(或羔羊痢疾)肠毒血症三联四防灭活疫苗。置2～8℃保存备用。
二、羊快疫、猝狙(或羔羊痢疾)肠毒血症三联灭活疫苗的安全、效力评价：
准备14只1.5～2kg北京大耳白兔，其中2只用于采集阴性对照血清，另12只用于安全、效力评价。
在北京大耳白兔中的安全检验：
取制备好的三联四防灭活疫苗，颈背部皮下注射1.5～2kg北京大耳白家兔4只，5ml/只。观察10日，结果见于下表11中。
表11：羊快疫、猝狙(或羔羊痢疾)肠毒血症三联灭活疫苗的安全评价结果
Figure BDA0001892651850000141
由上表11可知，注射的4只北京大耳白兔在观察的10日内均健活，并且注射部位未发生坏死反应，说明配制的羊快疫、猝狙(或羔羊痢疾)肠毒血症三联灭活疫苗的安全检验符合规定。
3ml/只免疫剂量下羊快疫、猝狙(或羔羊痢疾)肠毒血症三联灭活疫苗在北京大耳白兔上的效力评价：
取制备好的三联四防灭活疫苗，颈背部皮下注射1.5～2kg北京大耳白家兔8只，3ml/只。免疫后21日后对家兔随机抽取4只进行耳中动脉采血并制备混合血清，用血清中和法分别取0.4ml混合血清，测定各型产气荚膜梭菌毒素及腐败梭菌毒素的血清中和效价(0.1ml血清中和小鼠MLD数)。结果见于下表12中。
表12：3ml/只免疫剂量下羊快疫、猝狙(或羔羊痢疾)肠毒血症三联灭活疫苗在北京大耳白兔上的效力评价结果
Figure BDA0001892651850000142
Figure BDA0001892651850000151
根据《中国兽用生物制品规程》2000年版规定：B型产气荚膜梭菌血清中和效价达到1个小鼠MLD，即判定合格。而根据表12中的数据，表明该实施例中使用利用产毒培养基发酵培养得到的B型产气荚膜梭菌灭活菌液配制的羊快疫、猝狙(或羔羊痢疾)肠毒血症三联灭活疫苗，家兔血清中和效价最高可达4个小鼠MLD，达到或超过了《中国兽用生物制品规程》标准。且该培养基成本低廉、产毒性能稳定、减少或杜绝了大规模生产中不合格菌液的产生。
2ml/只免疫剂量下羊快疫、猝狙(或羔羊痢疾)肠毒血症三联灭活疫苗在绵羊上的效力评价：
颈部肌肉注射6-12月龄，体重30-40kg无相应中和抗体的健康绵羊6只，2ml/只，免疫后21日后，对绵羊进行颈静脉采血制备血清后随机抽取4只绵羊血清等量混合，分别取0.4ml混合血清，测定各型产气荚膜梭菌及腐败梭菌毒素血清中和效价(0.1ml血清中和小鼠MLD数)。结果见于下表13中。
表13：2ml/只免疫剂量下羊快疫、猝狙(或羔羊痢疾)肠毒血症三联灭活疫苗在绵羊上的效力评价结果
Figure BDA0001892651850000152
上表13中数据结果显示，各型菌毒素中和效价均大于或等于1MLD，D型产气荚膜梭菌中和效价高达6MLD。
根据《中国兽用生物制品规程》2000年版规定：羊快疫、猝狙(或羔羊痢疾)肠毒血症三联灭活疫苗，5ml/只免疫剂量，B型、C型、S型血清中和效价大于1MLD、D型大于3MLD即判定合格。而根据上表13中的数据可知，利用本发明的产毒培养基制备的B型产气荚膜梭菌灭活菌液配制的羊快疫、猝狙(或羔羊痢疾)肠毒血症三联灭活疫苗，2ml/羊免疫剂量即达到或超过了规程标准，证明本发明的B型产气荚膜梭菌产毒培养基产毒效果较强，经其配制的疫苗质量较高，能够有效用于大规模的疫苗生产应用，且质量稳定可控。
3ml/只免疫剂量下羊快疫、猝狙(或羔羊痢疾)肠毒血症三联灭活疫苗在绵羊上的效力评价：
颈部肌肉注射6-12月龄，体重30-40Kg无相应中和抗体的健康绵羊6只，3ml/只，免疫后21日后，对绵羊进行颈静脉采血制备血清后随机抽取4只绵羊血清等量混合，分别取0.4ml混合血清，测定各型产气荚膜梭菌及腐败梭菌毒素血清中和效价(0.1ml血清中和小鼠MLD数)。结果见于下表14中。
表14：3ml/只免疫剂量下羊快疫、猝狙(或羔羊痢疾)肠毒血症三联灭活疫苗在绵羊上的效力评价：
Figure BDA0001892651850000161
上表14中数据结果显示，各型菌毒素中和效价均大于或等于1MLD，D型产气荚膜梭菌中和效价高达12MLD。
根据《中国兽用生物制品规程》2000年版规定：羊快疫、猝狙(或羔羊痢疾)肠毒血症三联灭活疫苗，5ml/羊免疫剂量，B型、C型、S型血清中和效价大于1MLD、D型大于3MLD即判定合格。由上表14中数据可知，利用本发明的产毒培养基制备的B型产气荚膜梭菌灭活菌液配制的羊快疫、猝狙(或羔羊痢疾)肠毒血症三联灭活疫苗，3ml/只免疫剂量即达到或超过了规程标准。且该培养基成本低廉、产毒性能稳定、减少或杜绝了大规模生产中不合格菌液的产生。证明本发明的B型产气荚膜梭菌产毒培养基产毒效果较强，经其配制的疫苗质量较高，能够有效用于大规模的疫苗生产应用，且质量稳定可控。
同时，本发明的B型产气荚膜梭菌产毒培养基的制备方法与现有技术内的培养基的制备方法相比还具有下表15中所示的优点，其中以制备10000ml培养基为例进行对比说明。
表15：本发明方法与传统工艺相关参数对比(10000ml)
Figure BDA0001892651850000171
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.B型产气荚膜梭菌产毒培养基，其特征在于，每1000ml所述培养基由以下重量配比的原料制成：
蛋白胨15-25g；
酵母浸粉3-5g；
NaCl 3-4g；
Na2HPO4·12H2O 5-10g；
糊精5-10g或粗糊精5-10g；
其余为注射用水。
2.根据权利要求1所述的B型产气荚膜梭菌产毒培养基，其特征在于，所述培养基的pH值为8.1-8.3。
3.权利要求1或2所述的B型产气荚膜梭菌产毒培养基的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：将制备所述培养基的所述原料蛋白胨、酵母浸粉、NaCl、Na2HPO4·12H2O按重量配比加入总体积80％的注射用水中溶解，调节pH值为8.1-8.3后加入重量配比的糊精或粗糊精，定容，高压灭菌，得到所述培养基；所述高压灭菌的条件为116℃高压蒸汽灭菌30min。
4.根据权利要求3所述的B型产气荚膜梭菌产毒培养基的制备方法，其特征在于，所述调节pH值采用2mol/L的氢氧化钠溶液进行调节。
5.B型产气荚膜梭菌外毒素的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
种子液培养：将B型产气荚膜梭菌接种于无糖厌气肉肝汤中，在36-37℃下静置培养12-16h，制得B型产气荚膜梭菌的种子液；
发酵培养：将所述种子液接种于权利要求1或2所述的B型产气荚膜梭菌产毒培养基中进行培养，收获一定时间段的培养物并离心，然后收集上清液并过滤，所得滤液即为所述B型产气荚膜梭菌外毒素；所述发酵培养中所述培养条件为36-37℃静置培养12-14h。
6.根据权利要求5所述的B型产气荚膜梭菌外毒素的制备方法，其特征在于，所述B型产气荚膜梭菌接种的接种量和所述种子液接种的接种量均为1-1.5％(v/v)；和/或
所述发酵培养中所述培养在瓶或发酵罐中培养；和/或
所述离心的转速为3000-4000rpm，时间为20-30min；和/或
所述过滤采用0.22μm滤膜进行过滤。
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