CN108342434B

CN108342434B - 一种兽用腐败梭菌毒素及其制备方法与专用培养基

Info

Publication number: CN108342434B
Application number: CN201810115846.8A
Authority: CN
Inventors: 蒋玉文; 彭小兵; 李旭妮; 彭国瑞
Original assignee: China Institute of Veterinary Drug Control
Current assignee: China Institute of Veterinary Drug Control
Priority date: 2018-02-06
Filing date: 2018-02-06
Publication date: 2021-08-31
Anticipated expiration: 2038-02-06
Also published as: CN108342434A

Abstract

本发明公开了一种兽用腐败梭菌毒素及其制备方法与专用培养基。每100ml培养基由下述物质组成：示蛋白胨(proteose peptone)1.5‑2.0g，酪蛋白胨1.5‑2.0g，酵母浸粉0.5‑0.75g，ZnSO₄·7H₂O 0.14‑0.28mg，Na₂HPO₄·12H₂O 0.5‑0.75g，KH₂PO₄0.03‑0.045g，葡萄糖1‑1.5g，余量为水；所述培养基的pH值为7.5‑8.0。所述腐败梭菌毒素是将腐败梭菌生产菌株接种于培养基中，收集培养物并离心，将上清液过滤即得。按本发明方法毒力最高可提至《中国兽用生物制品规程》制苗标准的10倍，产出投入比可提高至原传统工艺的20倍。并且，用其制备的类毒素疫苗在家兔和绵羊上的相应血清中和效价也分别提高至规程标准的8和8倍。

Description

一种兽用腐败梭菌毒素及其制备方法与专用培养基

技术领域

本发明属于兽用生物制品领域，具体涉及一种兽用腐败梭菌毒素及其制备方法与专用培养基。

背景技术

羊快疫、猝狙、羔羊痢疾和肠毒血症是分别由腐败梭菌、C型产气荚膜梭菌、B型产气荚膜梭菌和腐败梭菌引起的羊常见多发性传染病(陆承平.兽医微生物学[M].北京：中国农业出版社,2013:192-202.)，它们常常合并发生，病程急剧，发病动物常常不出现症状即行死亡，死亡率高，危害大。因此，免疫接种是控制这些疫病的唯一有效途径。欧美、澳大利亚等畜牧业发达国家均把牛羊的四种疫病作为必须免疫预防的疫病，并有多种含有预防这些疫病成分的疫苗投放市场(Animal and Plant Health Inspection Service,USDA.9CFRCh.I(1-1-07Edition)[S].Washington:U.S.GOVERNMENT PRINTING OFFICE,2007.3、British Pharmacopoeia(Veterinary)[S].London:The Stationery Office,2005.)。我国也采取免疫接种的方法预防这些疫病并取得了良好的效果。我国目前用于预防这些疫病的疫苗有羊快疫、猝狙、肠毒血症三联灭活疫苗(液体苗)、羊快疫、猝狙、羔羊痢疾、肠毒血症三联四防灭活疫苗(液体苗)和羊梭菌病多联干粉疫苗(干粉苗)(中国兽药典委员会编.中华人民共和国兽药典二○一○年版三部[S].北京：中国农业出版社,2011.5、农业部兽用生物制品规程委员会编.中华人民共和国兽用生物制品规程二○○○版[S].北京：化学工业出版社,2000.)，预防效果确实。据2015年批签发统计，年产量达2.5亿头份，但实际需要远大于此。年产值约2500万元到3000万元。

然而，目前市场上使用的疫苗普遍以牛肉和肝脏的酶消化液为原材料来制备培养基，用这种方法制备培养基其制备过程繁琐、耗时长、需要人力多，尤为重要的是常因原材料质量参差不齐出现产毒性能不稳定的现象，这影响了疫苗的质量，也给疫苗生产带来了极大的浪费和高额的成本。并且，在2006年到2015年之间以血清中和法进行效力检验结果不合格的33批产品中，有15批产品的腐败梭菌组分效价不合格。因此，研发出质量可靠、产毒力高、稳定性好的腐败梭菌毒素制备方法与专用培养基显得尤为必要。

发明内容

本发明一个目的是提供一种腐败梭菌产毒培养基。

本发明提供的培养基，包括溶质；

所述溶质由如下质量分数的物质组成：1.5-2.0示蛋白胨、1.5-2.0酪蛋白胨、0.5-0.75酵母浸粉、0.00014-0.00028ZnSO₄·7H₂O、0.5-0.75Na₂HPO₄·12H₂O、0.03-0.045KH₂PO₄和1-1.5葡萄糖。

上述培养基中，所述溶质由如下质量分数的物质组成：1.5-2.0示蛋白胨、1.5-2.0酪蛋白胨、0.5-0.75酵母浸粉、0.00014-0.00028ZnSO₄·7H₂O、0.5-0.75Na₂HPO₄·12H₂O、0.03-0.045KH₂PO₄和1葡萄糖。

上述培养基中，所述溶质由如下质量分数的物质组成：1.5示蛋白胨、1.5酪蛋白胨、0.5酵母浸粉、0.00014ZnSO₄·7H₂O、0.5Na₂HPO₄·12H₂O、0.03KH₂PO₄和1葡萄糖。

上述培养基中，所述培养基还包括溶剂；

或所述溶剂为水。

上述培养基中，所述培养基由示蛋白胨、酪蛋白胨、酵母浸粉、ZnSO₄·7H₂O、Na₂HPO₄·12H₂O、KH₂PO₄、葡萄糖和水组成；

所述示蛋白胨在所述培养基中的浓度为15-20g/l；

所述酪蛋白胨在所述培养基中的浓度为15-20g/l；

所述酵母浸粉在所述培养基中的浓度为5-7.5g/l；

所述ZnSO₄·7H₂O在所述培养基中的浓度为0.0014-0.0028g/l；

所述Na₂HPO₄·12H₂O在所述培养基中的浓度为5-7.5g/l；

所述KH₂PO₄在所述培养基中的浓度为0.3-0.45g/l；

所述葡萄糖在所述培养基中的浓度为10-15g/l；

或，所述示蛋白胨在所述培养基中的浓度为15g/l；

所述酪蛋白胨在所述培养基中的浓度为15g/l；

所述酵母浸粉在所述培养基中的浓度为5g/l；

所述ZnSO₄·7H₂O在所述培养基中的浓度为0.0014g/l；

所述Na₂HPO₄·12H₂O在所述培养基中的浓度为5g/l；

所述KH₂PO₄在所述培养基中的浓度为0.3g/l；

所述葡萄糖在所述培养基中的浓度为10g/l；

或，所述培养基的pH值为7.5-8.0。

本发明的另一个目的是提供一种制备上述的培养基的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：

将上述的培养基中除葡萄糖外其余各组分按照质量分数与水混匀，并调节pH值至7.5-8.0，灭菌后，再将葡萄糖单独配制成50％水溶液灭菌，使用前加入至所需浓度，得到培养基。

上述方法中，在溶解溶质的过程中，可通过加热的方式使物质充分溶解和/或加速溶解。

上述方法中，所述调节pH值具体可采用10M的氢氧化钠溶液进行调节。

上述方法中，所述培养基灭菌的条件为116℃灭菌30min，50％葡萄糖溶液灭菌的条件为112℃灭菌20min。

上述方法中，所述水优选为纯化水。

上述的培养基在制备腐败梭菌毒素中的应用也是本发明保护的范围。

本发明的第3个目的是提供一种制备腐败梭菌毒素的方法。

本发明提供的方法，为将腐败梭菌生产菌株在上述的培养基中发酵培养，得到发酵产物；收集发酵产物的上清液，得到腐败梭菌毒素。

腐败梭菌生产菌株具体可为兽用腐败梭菌C55-1菌株(CVCC编号：60021)，购自中国兽医微生物菌种保藏管理中心(www.cvcc.org.cn，简称CVCC)。

收集发酵产物的上清液为离心后再过滤得到上清液。

上述方法中，

所述发酵培养的条件为如下：

1)若所述发酵培养为烧瓶(如装有培养基体积为500-1000ml的容器)发酵，则所述发酵培养的条件为：35-37℃发酵培养23-25h；

2)若所述发酵培养为发酵罐(如装有培养基体积为大于或等于4000ml的容器)发酵，则所述发酵培养的条件为：35-37℃发酵培养23-25h，且发酵过程中维持pH值为7.0±0.05，且发酵培养至16h时按培养基总体积的1％加入50％葡萄糖水溶液；发酵全程控制转速为25-30rpm。

上述方法中，将腐败梭菌生产菌株在上述的培养基中发酵培养包括如下步骤：

1)获得种子液；

2)再将种子液接种于上述的培养基。所述种子液的接种量为2-3％。

所述种子液的制备方法为：

将真空度良好的含有冻干菌种的安瓿，无菌操作打开，接种厌气肉肝汤，置37℃培养17-24小时，经纯粹检验合格者作为一级种子。

将一级种子按2-3％接种量接种厌气肉肝汤，置37℃培养17-24小时，经纯粹检验合格者作为二级种子，即为所述种子液。

由上述方法制备得到的腐败梭菌毒素。

上述的腐败梭菌毒素在制备腐败梭菌类毒素疫苗中的应用也是本发明保护的范围。

上述腐败梭菌类毒素疫苗具体选自下述至少一种：(1)羊快疫、猝狙、肠毒血症三联灭活疫苗；(2)羊快疫、猝狙、羔羊痢疾、肠毒血症三联四防灭活疫苗；(3)羊梭菌病多联干粉灭活疫苗、(4)羊黑疫、快疫二联灭活疫苗。

或本发明提供一种腐败梭菌类毒素疫苗，是将上述的腐败梭菌毒素经灭活脱毒后加铝胶佐剂得到的。

本发明以商品化蛋白胨、酵母粉等成品作为原材料替代原有质量不可控的牛肉、牛肝等原材料，通过筛选培养基配方并优化产毒素培养条件，使培养基的产毒能力达到甚至超过原有规程标准并具备较高的可重复性，来制备兽用腐败梭菌毒素。

本发明通过筛选获得了以下述各组分物质的质量配比(按生产1000mL培养基成品计算)为基础的产毒培养基：示蛋白胨(proteose peptone)15-20g，酪蛋白胨15-20g，酵母浸粉5.0-7.5g，ZnSO₄·7H₂O 1.4-2.8mg，Na₂HPO₄·12H₂O 5.0-7.5g、KH₂PO₄ 0.3-0.45g、葡萄糖10-15g纯化水加至1000mL。该培养基发酵罐培养产毒能力强，产毒性能稳定，质量可控，配制使用方便，价格低廉。

本发明分别在家兔和绵羊上对疫苗的效果进行了评价。结果用本发明制备的腐败梭菌类毒素疫苗，可保护家兔和绵羊免受该型毒素的攻击，血清中和效价也超过了《中国兽药典》的相应标准。

本发明具有如下优点：

本发明涉及兽用腐败梭菌毒素及其制备方法与应用。本发明所使用的培养基及使用方法，配制简单(由原胰酶消化牛肉汤所需12小时缩减为5小时即可)，成本降低(综合成本为原传统工艺的0.51倍，原材料成本为原传统工艺的0.3倍)。按本发明方法毒力最高可提至《中国兽用生物制品规程》制苗标准的10倍。所研制的培养基用用发酵罐培养毒力可达到1000MLD/mL(C55-1菌株)，超过了《兽用生物制品规程》的制苗标准(0.005-0.01ml/MLD)。本发明的产出投入比提高至原传统工艺的20倍。并且，用其制备的类毒素疫苗可以在家兔和绵羊上产生有效的免疫保护，在家兔和绵羊上的相应血清中和效价也均提高至规程标准的8倍。本发明用于替换现有胰酶消化牛肉汤用于羊快疫灭活疫苗的生产具有广阔的前景。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下面通过具体实施例对本发明的方法进行说明，但本发明并不局限于此，凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

下述实施例中所用的腐败梭菌生产菌株具体可为兽用腐败梭菌C55-1菌株(CVCC编号：60021)，购自中国兽医微生物菌种保藏管理中心(www.cvcc.org.cn，简称CVCC)。

下述实施例中所采用的厌气肉肝汤组成如表1所示，制备方法如下：

表1为厌气肉肝汤组成

牛肉	250g
		肝(牛、羊或猪)	250g
蛋白胨	10g
		氯化钠	5g
葡萄糖	2g
		蒸馏水加至	1000ml

厌气肉肝汤制备方法如下：

1、取牛肉除去脂肪和筋膜，用绞肉机绞碎，与切成100g左右的牛肝块混合，加蒸馏水，充分搅拌后，冷浸20-24小时。

2、煮沸20-60分钟，补足失去的水分，用白布滤过，弃去肉渣，取出肝块。

3、滤液加入蛋白胨和氯化钠，加热融化，以氢氧化钠溶液调整pH 7.8-8.0，加热煮沸10-20分钟。

4、用滤纸或绒布滤过，加入葡萄糖搅拌，使其融化。

5、将煮过的肝块洗净，切成小方块，用蒸馏水充分冲洗后，分装于试管或中性玻璃瓶内，其量为预计分装肉肝汤量的1/10。

6、将滤液分装于含有肝块的中性容器中(如为试管，还应加入适量液体石蜡)，以116℃灭菌30-40分钟。

该厌气肉肝汤供一般厌气菌培养及检验用。用于菌种保存时，不加葡萄糖。

下述实施例中所采用的明胶缓冲液组分如表2所示，配制方法如下：

表2为明胶缓冲液组分

蒸馏水	1000ml
		明胶	2g
Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>·12H<sub>2</sub>O	9.25g
		NaH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>·2H<sub>2</sub>O	8.34g

明胶缓冲液配制方法：明胶蒸汽融化后，混合、煮开、滤过，116℃灭菌30分钟备用。

实施例1、腐败梭菌产毒培养基的筛选

1、设计了三种不同的产毒培养基配方：

配方1：大豆蛋白胨15g，酪蛋白胨15g，酵母浸粉5g，葡萄糖5g，纯化水加至1000mL。

配方2：示蛋白胨10g，酪蛋白胨10g，酵母浸粉15g，氯化钠4g，碳酸钠0.6g，氯化钙0.1g，胱氨酸2g，糊精10g，纯化水加至1000mL。

配方3：示蛋白胨15g，酪蛋白胨15g，酵母浸粉5g，Na₂HPO₄·12H₂O 5g，KH₂PO₄ 0.3g，ZnSO₄·7H₂O 1.4mg和葡萄糖10g，纯化水加至1000mL。

2、配制培养基

除糊精、葡萄糖外，按上述含量分别称取或量取各组分物质，加入纯化水，加热充分溶解，添加纯化水将其定容至配制所需的终体积，用10M氢氧化钠调pH值至7.5-8.0。

配方2按需要量加入糊精，充分搅匀。116℃灭菌30min。

葡萄糖按终浓度在接种前加入所需体积的50％葡萄糖水溶液(单独配，112℃灭菌20min)。

3、细菌培养及毒素的制备

1)细菌培养

将真空度良好的含有冻干兽用腐败梭菌C55-1菌种的安瓿，无菌操作打开，接种厌气肉肝汤，置37℃培养24小时，经纯粹检验合格者作为一级种子。

将一级种子按2％接种量接种厌气肉肝汤，置37℃培养24小时，经纯粹检验合格者作为二级种子。

将二级种子以2％的接种量分别接种上述1的三种不同配方的产毒培养基，置37℃培养24小时，得到三种不同配方的产毒培养基获得的发酵产物。

2)毒素的制备

上述1)培养完成后将发酵产物3000r/min离心30min，弃菌体沉淀留上清，将上清用0.22μm滤膜过滤，过滤后的滤液经接种厌气肉肝汤无菌生长，则该过滤后的滤液即作为毒素(若有菌生长，再次过滤，直到无菌生长。)，分装成1mL的小份置-80℃冰冻保存，每次取1小份冷水浴融化后用于测毒。得到三种不同配方的产毒培养基获得的毒素。

4、测定培养完成后菌液中毒素对小白鼠的毒力

取上述3得到的三种不同配方的产毒培养基获得的毒素冷水浴融化后，用明胶缓冲液按如下表3所示的方法稀释，得到三种不同配方的产毒培养基获得的毒素稀释液。

将三种不同配方的产毒培养基获得的毒素稀释液尾静脉注射清洁级16-18g ICR小白鼠，每滴度注射2只，每只注射0.2mL，观察小鼠在注射后72h内的死亡情况。能使小鼠发生2/2死亡的最小毒素量即为腐败梭菌毒素对小鼠的MLD。

表3为明胶缓冲液稀释毒素

结果如表4所示：

表4为三种不同配方的产毒结果汇总

由以上结果可知，配方1、2、3分别经8次重复试验的毒力为≥0.02mL、≥0.02mLmL、0.0025-0.005mL毒素原液，配方3产毒能力最强、配方2次之、配方1最弱。配方1、2均未达到原《中华人民共和国兽用生物制品规程》二○○○年版规定羊三联四防苗中“1个小鼠MLD为腐败梭菌0.005-0.01mL毒素原液”的制苗标准，而配方3产毒能力最强甚至超过了《规程》的“1个小鼠MLD为腐败梭菌0.005-0.01mL毒素原液”的毒力标准。

结果表明，配方3培养基产毒能力最强，重复性好，可作为腐败梭菌制苗用首选产毒培养基。

实施例2、腐败梭菌产毒培养基配制及使用方法的优化

1、三角瓶培养条件的优化

以三角瓶静置培养的方式分别对培养温度、初始pH值、培养时间进行优化，确定最优条件为“培养基初始pH值为7.5-8.0，以37℃培养24h”。

2、发酵罐培养条件的优化

以发酵罐培养的方式分别对控制pH值、培养时间、补糖进行优化，确定最优培养工艺为“培养基初始葡萄糖浓度为1.0％，初始pH值为7.5-8.0，发酵全过程控制pH值为7.0，培养至16h时按培养基总体积的1％加入50％葡萄糖水溶液，发酵全程控制转速为25-30rpm，以37℃共培养24h”。

3、腐败梭菌最优产毒培养基和最优发酵条件

1)最优产毒培养基的配制

按照实施例1的配方3配制腐败梭菌最优产毒培养基。

2)发酵罐发酵制备毒素

(1)发酵

将二级种子以2％的接种量接种在含有最优产毒培养基的发酵罐中，培养基初始葡萄糖浓度为1.0％，初始pH值为7.5-8.0，发酵全过程控制pH值为7.0，培养至16h时按培养基总体积的1％加入50％葡萄糖水溶液，发酵全程控制转速为25-30rpm，以37℃共培养24h，得到发酵产物。

(2)毒素的制备

上述(1)得到的发酵产物3000r/min离心30min，弃菌体沉淀留上清，将上清用0.22μm滤膜过滤，过滤后的滤液经接种厌气肉肝汤无菌生长，则该过滤后的滤液即作为毒素(若有菌生长，再次过滤，直到无菌生长。)，分装成1mL的小份置-80℃冰冻保存，每次取1小份冷水浴融化后用于测毒。

3)测定毒素对小白鼠的毒力

取上述2)得到的毒素用明胶缓冲液稀释，得到毒素稀释液。

将毒素稀释液尾静脉注射清洁级16-18g ICR小白鼠，每滴度注射2只，每只注射0.2mL，观察小鼠在注射后72h内的死亡情况。能使小鼠发生2/2死亡的最小毒素量即为腐败梭菌毒素对小鼠的MLD。

结果如表5所示，

表5为优化后的条件进行发酵罐培养的毒力结果表

由上表可知，按本发明方法毒力最高可提至规程标准(小白鼠MLD为0.005-0.01mL)的10倍，且在不同单位(或场所)以不同的培养总量发酵均获得了毒力高的素素，表明本发明方法重复性好、稳定性高。

实施例3、腐败梭菌类毒素疫苗的制备及效力评价

1、腐败梭菌类毒素疫苗的制备

1)腐败梭菌毒素脱毒

将实施例2中在最优发酵罐发酵条件下和最优产毒培养基中37℃发酵培养24h得到的发酵产物，按体积加入0.7％甲醛水溶液(40％)，加10M氢氧化钠调pH值至6.8，置35℃灭活脱毒3天，得到灭活脱毒后菌液。

2)腐败梭菌毒素灭活脱毒效果检测

取上述灭活脱毒后菌液分别接种厌气肉肝汤、普通肉汤、普通琼脂斜面，观察5日均无菌生长表明灭活完全；

同时将灭活脱毒后菌液3000r/min离心30min，弃菌体沉淀留上清，将上清用0.22μm滤膜过滤，收集滤液，再尾静脉注射16-18g小白鼠2只，每只注射原液0.4ml，观察3日均健活表明脱毒完全。

3)腐败梭菌类毒素疫苗的制备

取上述1)得到的灭活脱毒完全的菌液，3000r/min离心30min，弃沉淀，留上清，得到腐败梭菌类毒素，置4℃保存备用。

取腐败梭菌类毒素加入装有高压灭菌铝胶的瓶中，再添加生理盐水定容至所需体积，调PH值至6.8，使铝胶的终浓度为20％，使类毒素的含量为200MLD/ml。振摇混匀，置4℃冰箱保存备用，得到腐败梭菌类毒素疫苗。

2、腐败梭菌类毒素疫苗的效力评价

1)类毒素疫苗在家兔上的效力评价

取上述1制备好的腐败梭菌类毒素疫苗，颈背部皮下注射1.5-2.0kg家兔，每滴度注射4只，共四个滴度组：0.3ml(60MLD)、0.5ml(100MLD)、0.75ml(150MLD)、1.0ml(200MLD)。免疫后18日，对家兔进行耳中动脉采血制备血清，用血清中和法测定对腐败梭菌毒素的血清中和效价。免疫后21日，对家兔耳静脉注射攻击1MLD的腐败梭菌毒素(本方法制备的毒素)，观察5日，记录攻毒保护结果。

结果如表6所示，

表6为腐败梭菌类毒素对家兔的效力评价结果

2)类毒素疫苗在绵羊上的效力评价

取上述1制备好的腐败梭菌类毒素疫苗，颈部肌肉注射5-6月龄绵羊，每滴度注射5只，共三个滴度组：0.5ml(100MLD)、1.0ml(200MLD)、1.5ml(300MLD)。免疫后18日，对绵羊进行颈静脉采血制备血清，用血清中和法测定对腐败梭菌毒素的血清中和效价。免疫后21日，对绵羊颈静脉注射攻击1MLD的腐败梭菌毒素，观察5日，记录攻毒保护结果。结果如表7所示，

表7为腐败梭菌类毒素对绵羊的效力评价结果

综合血清中和法和免疫攻毒法结果，可以看出，用最优产毒培养基及制造使用方法制备的腐败梭菌类毒素疫苗，家兔免疫100MLD的类毒素、绵羊免疫300MLD的类毒素即可保护动物免受该毒素的攻击，血清中和效价也可分别达到8、8，超过了《中国兽药典》所规定的“达到1”的标准，可作为研制类毒素疫苗免疫接种时的参考剂量。

实施例4、本发明方法与传统工艺比较

按照表11中传统工艺中所采用的胰酶消化牛肉汤制备方法制备，得到胰酶消化牛肉汤。传统疫苗制备方法详见《中国兽用生物制品规程》二○○○年版48-51页。

经本发明的方法与传统工艺进行比较，结果如表8-10所示。

表8为本发明方法与传统工艺相关参数比较

表9为本发明方法成本核算

表10为传统工艺(胰酶消化牛肉汤)成本核算

表11为传统工艺中所采用的胰酶消化牛肉汤组成

胨水	500ml
		牛肉汤	500ml
磷酸氢二钠	5g
		硫酸二氢钾	5g
活性炭	1g
		硫酸锌	1.4mg
葡萄糖	10g
		蒸馏水加至	1000ml

上述传统工艺中所采用的胰酶消化牛肉汤制法：

1、取胨水，加热至80℃，用20％氢氧化钠溶液调pH为7.0-7.2，加热煮沸5分钟。

2、将煮沸的胨水和牛肉汤等量混合，按总量0.5％加入磷酸氢二钠和磷酸二氢钾，煮沸10分钟。

3、用20％氢氧化钠溶液调pH至8.0-8.2，补加失去的水分，煮沸20分钟，滤过。

4、按总量0.1％加活性炭。

5、按总量每1ml加硫酸锌1.4μg。

6、分装。110℃灭菌30分钟，pH应为7.7-7.9。

7、50％葡萄糖溶液，110℃灭菌30分钟，临用时加入，使培养基含糖量为1％。

8、用途供制造羊快疫疫苗用。

表12为胨水制备组成

上述胨水制法如下：绞碎的牛肉180g，加蒸馏水500ml，加热至80℃，再加蒸馏水500ml，使温度由80℃降至50℃左右，用20％碳酸钠或20％氢氧化钠溶液调pH为8.2-8.4。

加胰酶粉(或胰脏浸出液)，充分摇匀，置48-50℃水浴，第1小时后每15分钟调pH 1次，第2小时后每30分钟调pH 1次。直至pH稳定在8.0左右。

消化5.5小时后，加入1％冰醋酸，100℃加热10分钟后停止消化，滤过，2-8℃保存备用。

表13为胰脏浸出液制备组成

牛肉	180g
		胰脏(猪、牛、羊)	1份
蒸馏水(或去离子水)	3份
		无水乙醇	1份

胰脏浸出液制备方法如下：将胰脏绞碎，加水1粉，充分搅拌均匀，补加水2份、乙醇1份，置室温浸泡3日，每日摇3次，按全量0.1％加盐酸，粗滤纸(布)滤过，即得。

2-8℃保存，可备用3-6个月。

表14为牛肉汤制备组成

牛肉	500g
		水(蒸馏水或去离子水)	1000ml

上述牛肉汤制法如下：

1)将牛肉除去脂肪、筋膜，用绞肉机绞碎，按肉、水比例混合，搅拌均匀。

2)用不锈钢或耐酸搪瓷双层锅，加温至65-75℃，保持45分钟，继续加热至沸，保持1小时，全部过程均应不断搅拌。

3)煮沸完成后，捞出肉渣，沉淀30分钟，抽上清液经绒布滤过，将滤过的肉汤与从肉渣中压榨出的肉汤混合即成。

4)制成的肉汤，即可与猪胃消化液混合配制成马丁肉汤；或分装经116℃灭菌30-40分钟，贮存备用。

5)制备少量肉汤时，也可采用4-18℃浸泡12-24小时，再煮沸30分钟，分装灭菌后备用。

Claims

1.一种腐败梭菌产毒培养基，包括溶质；

所述溶质由如下质量分数的物质组成：1.5-2.0示蛋白胨、1.5-2.0酪蛋白胨、0.5-0.75酵母浸粉、0.00014-0.00028 ZnSO₄·7H₂O、0.5-0.75 Na₂HPO₄·12H₂O、0.03-0.045 KH₂PO₄和1葡萄糖。

2.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于：所述溶质由如下质量分数的物质组成：1.5示蛋白胨、1.5酪蛋白胨、0.5酵母浸粉、0.00014 ZnSO₄·7H₂O、0.5 Na₂HPO₄·12H₂O、0.03KH₂PO₄和1葡萄糖。

3.根据权利要求1或2所述的培养基，其特征在于：所述培养基还包括溶剂。

4.根据权利要求3所述的培养基，其特征在于：所述溶剂为水；

所述培养基由示蛋白胨、酪蛋白胨、酵母浸粉、ZnSO₄·7H₂O、Na₂HPO₄·12H₂O、KH₂PO₄、葡萄糖和水组成；

所述示蛋白胨在所述培养基中的浓度为15-20g/l；

所述酪蛋白胨在所述培养基中的浓度为15-20g/l；

所述酵母浸粉在所述培养基中的浓度为5-7.5 g/l；

所述ZnSO₄·7H₂O在所述培养基中的浓度为0.0014-0.0028 g/l；

所述Na₂HPO₄·12H₂O在所述培养基中的浓度为5-7.5 g/l；

所述KH₂PO₄在所述培养基中的浓度为0.3-0.45 g/l；

所述葡萄糖在所述培养基中的浓度为10-15 g/l。

5.根据权利要求4所述的培养基，其特征在于：所述示蛋白胨在所述培养基中的浓度为15g/l；

所述酪蛋白胨在所述培养基中的浓度为15g/l；

所述酵母浸粉在所述培养基中的浓度为5 g/l；

所述ZnSO₄·7H₂O在所述培养基中的浓度为0.0014g/l；

所述Na₂HPO₄·12H₂O在所述培养基中的浓度为5 g/l；

所述KH₂PO₄在所述培养基中的浓度为0.3 g/l；

所述葡萄糖在所述培养基中的浓度为10g/l。

6.根据权利要求1或2所述的培养基，其特征在于：所述培养基的pH值为7.5-8.0。

7.一种制备权利要求1-6中任一所述的培养基的方法，包括如下步骤：

将权利要求1-6中任一所述的培养基中除葡萄糖外其余各组分按照质量分数与水混匀，并调节pH值至7.5-8.0，灭菌后，再将葡萄糖单独配制成50%水溶液灭菌，使用前加入至所需浓度，得到培养基。

8.权利要求1-6中任一所述的培养基在制备腐败梭菌毒素中的应用。

9.一种制备腐败梭菌毒素的方法，其特征在于：

将腐败梭菌生产菌株在权利要求1-6中任一所述的培养基中发酵培养，得到发酵产物；收集发酵产物的上清液，得到腐败梭菌毒素。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：

所述发酵培养的条件为如下：

1）若所述发酵培养为烧瓶发酵，则所述发酵培养的条件为：35-37℃发酵培养23-25h；

2）若所述发酵培养为发酵罐发酵，则所述发酵培养的条件为： 35-37℃发酵培养23-25h，且发酵过程维持pH值为7.0±0.05，且发酵培养至16h时按培养基总体积的1%加入50%葡萄糖水溶液，发酵全程控制转速为25-30rpm。