CN109112152A

CN109112152A - 同时表达etx-csa的重组菌及相关疫苗的生产方法

Info

Publication number: CN109112152A
Application number: CN201810938913.6A
Authority: CN
Inventors: 彭小兵; 蒋玉文; 杜吉革; 李旭妮; 彭国瑞
Original assignee: China Institute of Veterinary Drug Control
Current assignee: China Institute of Veterinary Drug Control
Priority date: 2018-08-17
Filing date: 2018-08-17
Publication date: 2019-01-01

Abstract

本发明公开了同时表达ETX‑CSA的重组菌及相关疫苗的生产方法。本发明重组菌的构建方法包括：将融合蛋白ETX‑CSA的编码基因导入大肠杆菌，得到表达融合蛋白的重组菌；连接肽的氨基酸序列为SEQ ID No.1的第297‑311位。本发明方法仅发酵一株菌即可同时获得两种毒素蛋白，将其制苗后可同时预防两种疾病。将其与C型产气荚膜梭菌类毒素制成联苗后能产生优异的免疫效果，三组分(S、C、D)的家兔血清效价分别可提高至规程标准的3、4、10倍。本发明方法稳定性好、耗时短、成本低，其中S、D组分的成本降为传统工艺的1/100，三组分(S、C、D)的效价成本比可分别提高为传统工艺的344、4、993倍。

Description

同时表达ETX-CSA的重组菌及相关疫苗的生产方法

技术领域

本发明属于兽用生物制品领域，具体涉及一种同时表达ETX(产气荚膜梭菌ε毒素)-CSA(腐败梭菌α毒素)的重组菌及相关疫苗的生产方法。

背景技术

羊快疫、猝狙、羔羊痢疾和肠毒血症是分别由腐败梭菌、C型产气荚膜梭菌、B 型产气荚膜梭菌和D型产气荚膜梭菌引起的羊常见多发性传染病(陆承平.兽医微生物学[M].北京：中国农业出版社,2013:192-202.)，它们常常合并发生，病程急剧，发病动物常常不出现症状即行死亡，死亡率高，危害大。因此，免疫接种是控制这些疫病的唯一有效途径。欧美、澳大利亚等畜牧业发达国家均把牛羊的四种疫病作为必须免疫预防的疫病，并有多种含有预防这些疫病成分的疫苗投放市场(Animal and Plant Health InspectionService,USDA.9 CFR Ch.I(1-1-07 Edition)[S].Washington:U.S. GOVERNMENTPRINTING OFFICE,2007.British Pharmacopoeia(Veterinary)[S]. London:TheStationery Office,2005.)。我国也采取免疫接种的方法预防这些疫病并取得了良好的效果。我国目前用于预防这些疫病的疫苗有羊快疫、猝狙、肠毒血症三联灭活疫苗(液体苗)、羊快疫、猝狙、羔羊痢疾、肠毒血症三联四防灭活疫苗(液体苗) 和羊梭菌病多联干粉疫苗(干粉苗)(中国兽药典委员会编.中华人民共和国兽药典. 2010版,三部[S].北京：中国农业出版社,2011.农业部兽用生物制品规程委员会编. 中华人民共和国兽用生物制品规程,2000版[S].北京：化学工业出版社,2000.)，在该类疾病的控制方面发挥了积极作用。据2015年批签发统计，年产量达2.5亿头份，但实际需要远大于此。年产值约2500万元到3000万元。

然而，目前市场上使用的疫苗普遍以牛肉和肝脏的酶消化液为原材料来制备培养基，用这种方法制备培养基其制备过程繁琐、耗时长、需要人力多，尤为重要的是常因原材料质量参差不齐出现产毒性能不稳定的现象，这影响了疫苗的质量，也给疫苗生产带来了极大的浪费和高额的成本。并且，笔者在2006年到2015年之间以血清中和法进行效力检验结果不合格的33批产品中，有15批产品的腐败梭菌组分效价不合格、有21批产品的C型产气荚膜梭菌组分效价不合格，有13批产品的D型产气荚膜梭菌组分效价不合格。

腐败梭菌α毒素(CSA)和产气荚膜梭菌ε毒素(ETX)分别是腐败梭菌和D型产气荚膜梭菌最主要的致死性毒力因子和保护性抗原，以大肠杆菌表达系统分别获得这两种重组毒素蛋白，单组分经制成单苗后分别免疫动物均可产生针对各自毒素的有效免疫保护(Amimoto K,Ohgitani T,Sasaki O,et al.Protective effect of Clostridiumsepticum alpha-toxoid vaccine against challenge with spores in guinea pigs[J].J Vet Med Sci,2002,64(1):67-69.Lancto CA,Foster LK,Kromm MM,et al.Anoncytolytic α toxin recombinant protein protects turkeys against Clostridiumsepticum challenge[J].Avian Dis,2014,58(4):566-571.Marcos Roberto A Ferreira,GustavoS G Moreira, Carlos Eduardo P da Cunha,et al.Recombinant Alpha,Beta,and Epsilon Toxins of Clostridium perfringens:Production Strategies andApplications as Veterinary Vaccines[J]. Toxins,2016,340(8):1-24.)。因此，研发出成本价廉、培养工艺稳定、免疫效果确实的重组亚单位疫苗及生产方法显得尤为必要和迫切。

发明内容

本发明的目的是提供同时表达ETX-CSA的重组菌及相关疫苗的生产方法。

第一方面，本发明要求保护能够同时表达产气荚膜梭菌ε毒素和腐败梭菌α毒素的重组菌的构建方法。

本发明所提供的能够同时表达产气荚膜梭菌ε毒素和腐败梭菌α毒素的重组菌的构建方法，可包括如下步骤：将融合蛋白的编码基因导入大肠杆菌，得到表达所述融合蛋白的重组大肠杆菌，即为所述工程菌；

所述融合蛋白为将产气荚膜梭菌ε毒素和腐败梭菌α毒素通过连接肽连接而成；所述连接肽的氨基酸序列为SEQ ID No.1的第297-311位。

进一步地，所述产气荚膜梭菌ε毒素可为如下(A1)-(A3)中任一所示的蛋白质：

(A1)SEQ ID No.1的第1-296位所示的蛋白质；

(A2)将(A1)所限定的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；

(A3)与(A1)或(A2)所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质。

进一步地，所述腐败梭菌α毒素可为如下(B1)-(B3)中任一所示的蛋白质：

(B1)SEQ ID No.1的第312-720位所示的蛋白质；

(B2)将(B1)所限定的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；

(B3)与(B1)或(B2)所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质。

进一步地，所述融合蛋白可为如下(C1)-(C4)中任一所示的蛋白质：

(C1)SEQ ID No.1所示的蛋白质；

(C2)将(C1)所限定的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；

(C3)与(C1)或(C2)所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质；

(C4)在(C1)-(C3)中任一所限定的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白。

相应地，在基因水平上，所述融合蛋白的编码基因中编码所述产气荚膜梭菌ε毒素的基因具体可为如下(a1)-(a3)中任一所示的DNA分子：

(a1)核苷酸序列如SEQ ID No.2的第1-888位所示的DNA分子；

(a2)在严格条件下与(a1)限定的DNA分子杂交且编码所述产气荚膜梭菌ε 毒素的DNA分子；

(a3)与(a1)或(a2)所限定的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、 85％以上或者80％以上同源性且编码所述产气荚膜梭菌ε毒素的DNA分子。

相应地，在基因水平上，所述融合蛋白的编码基因中编码所述腐败梭菌α毒素的基因具体可为如下(b1)-(b3)中任一所示的DNA分子：

(b1)核苷酸序列如SEQ ID No.2的第934-2163位所示的DNA分子；

(b2)在严格条件下与(b1)限定的DNA分子杂交且编码所述腐败梭菌α毒素的DNA分子；

(b3)与(b1)或(b2)所限定的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、 85％以上或者80％以上同源性且编码所述腐败梭菌α毒素的DNA分子。

相应地，在基因水平上，所述融合蛋白的编码基因中编码所述连接肽的基因的核苷酸序列具体可为SEQ ID No.2的第889-933位。

相应地，在基因水平上，所述融合蛋白的编码基因具体可为如下(c1)-(c3)中任一所示的DNA分子：

(c1)核苷酸序列如SEQ ID No.2所示的DNA分子；

(c2)在严格条件下与(c1)限定的DNA分子杂交且编码所述融合蛋白的DNA 分子；

(c3)与(c1)或(c2)所限定的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、 85％以上或者80％以上同源性且编码所述融合蛋白的DNA分子。

其中，所述严格条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，2×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50 ℃，在7％SDS、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，1×SSC， 0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.5×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在65℃， 0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；也可为：在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

在所述方法中，所述融合蛋白的编码基因可通过含有所述融合蛋白的编码基因的重组载体的形式导入所述大肠杆菌中。

进一步地，所述重组载体为将所述融合蛋白的编码基因克隆到pET32a(+)载体后得到的重组质粒。

在本发明的具体实施方式中，所述重组载体为将所述融合蛋白的编码基因替换pET32a(+)载体上位于上游同源臂(CGACAAGGCCATGGCTGATATCGGATCCGAAT TC)和下游同源臂(CTCGAGCACC ACCACCACCA CCACTGAGAT CC)之间的小片段后得到的重组质粒。

在本发明的具体实施方式中，所述大肠杆菌具体为大肠杆菌BL21(DE3)。

第二方面，本发明要求保护利用前文第一方面所述方法构建得到的重组菌。

第三方面，本发明要求保护利用所述重组菌制备抗原的方法。

本发明所提供的利用所述重组菌制备抗原的方法，可包括如下步骤：

(a)将所述重组菌的单菌落接种于4～5mL(如4mL)的MDG非诱导培养基， 36～37℃(如37℃)以230～260rpm(如260rpm)振摇培养16～18h(如16h)；

(b)将步骤(a)的全部培养物接种于200～250mL(如200mL)的所述MDG 非诱导培养基中，36～37℃(如37℃)以230～260rpm(如260rpm)振摇培养10～ 12h(如10h)；

(c)将步骤(b)的培养物接种于含基础培养基的生物反应器中进行发酵培养；接种量为3～4％(体积百分含量，如0.12-0.16L培养物接种到4L基础培养基中)，发酵温度为28～30℃(如30℃)，通气量为8～10L/min(如10L/min)，搅拌速度为400～ 500rpm(如500rpm)，控制pH为7.0～7.1)(如pH为7.0)(补碱管接5M NaOH，补酸管接补料培养基)，共培养24～25h(如24h)，收获培养物，灭活(甲醛灭活，如按所述培养物总体积的0.3～0.4％，如0.4％，加入甲醛溶液(含40％甲醛，％表示质量分数)，36～37℃，如37℃，灭活48～60h，如48h)后即得所述抗原。

所述MDG非诱导培养基的溶剂为水；溶质及浓度为：25～50mM Na₂HPO₄、25～ 50mMKH₂PO₄、50～75mM NH₄Cl、5～6mM Na₂SO₄、2～3mM MgSO₄、5～7.5g/L 葡萄糖、2.5～3g/L天门冬氨酸、氨苄青霉素100～150μg/mL，pH为7.2～7.4。该培养基配方来自于此篇文章中，FWilliam Studier.Stable Expression Clones and Auto-Induction for ProteinProduction in E.coli[J].Methods in Molecular Biology,2014, 1091:1-17。

所述基础培养基溶剂为水，溶质及浓度为：20～25g/L酪蛋白胨、10～12.5g/L酵母浸出物、25～50mM Na₂HPO₄、25～50mM KH₂PO₄、50～75mM NH₄Cl、5～6mM Na₂SO₄、2～3mMMgSO₄、10～12.5g/L葡萄糖、100～150μg/mL氨苄青霉素，pH为 7.2～7.4。

所述补料培养基溶剂为水，溶质及浓度为：酪蛋白胨100～110g/L、酵母浸出物 50～55g/L、甘油250～333g/L、乳糖85～133g/L、MgSO4·7H₂O 5～8g/L、氨苄青霉素100～150μg/mL，pH为7.2～7.4。

第四方面，本发明要求保护一种抗原。

本发明所提供的抗原为灭活后的前文第二方面中所述重组菌的培养物；在所述重组菌的培养物中，所述重组菌的菌体密度A600达19～20.3，所述重组菌中所述融合蛋白的相对表达量为24.7～27.6％，所述重组菌的菌体湿重为37.2～50.6g/L。

进一步地，所述抗原可按照前文第四方面中所述方法制备得到。

第五方面，本发明要求保护如下任一方法：

方法A：一种制备能够用于预防由腐败梭菌和/或D型产气荚膜梭菌所致疾病的疫苗的方法，包括如下步骤：将前文第四方面中所述抗原与铝胶按照体积比为4:1的比例混合，得到所述疫苗。

在所述疫苗中，所述融合蛋白的终浓度可为300μg/mL。

方法B：一种制备能够用于预防由腐败梭菌、C型产气荚膜梭菌和/或D型产气荚膜梭菌所致疾病的疫苗的方法，包括如下步骤：将总抗原与铝胶按照体积比为4:1的比例混合，得到所述疫苗。

其中，所述总抗原为由前文第四方面中所述抗原与C型产气荚膜梭菌类毒素混合而成。在所述疫苗中，所述融合蛋白的终浓度可为150μg/mL，所述C型产气荚膜梭菌类毒素的含量可为400MLD/mL。

在本发明的具体实施例方式中，所述铝胶具体为SPI Pharma公司产品，货号为VAC 20HA。

第六方面，本发明要求保护如下任一疫苗：

(1)采用前文第五方面中的所述方法A制备得到的疫苗；

(2)采用前文第五方面中的所述方法B制备得到的疫苗。

第七方面，本发明要求保护如下任一应用：

(I)前文第二方面中所述的重组菌在制备前文第四方面中所述抗原中的应用；

(II)前文第二方面中所述的重组菌在制备前文第六方面中所述疫苗中的应用。

(III)前文第六方面中所述疫苗在预防由腐败梭菌、C型产气荚膜梭菌和/或D型产气荚膜梭菌所致疾病中的应用。

上述疫苗具体可选自下述至少一种：(1)羊快疫、猝狙、肠毒血症三联灭活疫苗；(2)羊快疫、猝狙、羔羊痢疾、肠毒血症三联四防灭活疫苗；(3)羊梭菌病多联干粉灭活疫苗、(4)羊黑疫、快疫二联灭活疫苗。

本发明分别在家兔和绵羊上对疫苗的效果进行了评价。结果显示：用本发明制备的疫苗，可产生确实的免疫效果，血清中和效价显著超过了《中国兽药典》的相应标准。

本发明具有如下优点：

1、本发明首次用序列为GGGGSGGGGSGGGGS的linker将产气荚膜梭菌ε毒素基因和腐败梭菌α毒素基因串联构建于pET32a(+)载体中，并转入BL21(DE3)中。故，本发明方法仅发酵一株菌即可同时获得两种毒素蛋白，将其制苗后可同时预防两种疾病。

2、本发明将其与C型产气荚膜梭菌类毒素(C)制成联苗后能产生优异的免疫效果，三种组分(S、C、D)的家兔血清效价分别可提高至规程标准的3、4、10倍。

3、本发明的生产方法稳定性好、耗时短、成本低，其中S、D组分的成本分别降为传统工艺的1/100，三种组分(S、C、D)的“效价成本比”可分别提高为传统工艺的344、4、993倍。

4、本发明采用“基因工程方法制备ETX和CSA重组抗原”替代“传统的培养致病性梭菌制备毒素再灭活脱毒的办法”，大大降低了生产过程中的生物安全风险。

5、本发明与C型产气荚膜梭菌一起配制成联苗时，并未对S、C、D三组分的效价产生影响，而传统工艺由于三种组分之间的竞争干扰会导致血清效价大大降低。

总之，本发明用于替代传统工艺制造梭菌疫苗具有广阔的应用前景，并在制造联苗方面展现了优势。

附图说明

图1为两个靶标片段的单独扩增的PCR结果。M为DNA Marker，由上至下依次为3000、2000、1500、1000、800、600、400、300、200bp；1为编码ETX基因片段的扩增结果；2为编码CSA基因片段的扩增结果。

图2为两个靶标片段的融合扩增的PCR结果。M为DNA Marker，由上至下依次为3000、2000、1500、1000、800、600、400、300、200、100bp；A为两个靶标片段的融合扩增的PCR结果

图3为OEPR法构建重组质粒的PCR结果。M为DNA Marker，由上至下依次为 15000、10000、7500、5000、2500、1000、250bp；1为OEPR法构建重组质粒的PCR 结果；红色框显示靶标重组质粒条带的位置。

图4为重组质粒pET-EA插入载体的融合基因片段的核苷酸序列与预期序列同源性为100％。A为重组质粒5’端的测序峰图，红色标记及左侧为载体序列，绿色标记及右侧为插入的编码ETX的基因序列；B为重组质粒3’端的测序峰图，红色标记及右侧为载体序列，绿色标记及左侧为插入的编码CSA的基因序列。

图5为重组大肠杆菌BL21-pET-EA的蛋白电泳图。M为蛋白Marker，从上至下依次为140、115、80、65、50、40、30、25、15kDa；1为培养12h的全菌；2为培养12h的沉淀；3为培养12h的上清；4为培养16h的全菌；5为培养16h的沉淀；6 为培养16h的上清；7为培养20h的全菌；8为培养20h的沉淀；9为培养20h的上清； 10为培养24h的全菌；11为培养24h的沉淀；12为培养24h的上清；红色框显示靶标重组蛋白所在的位置。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中所用的腐败梭菌毒素制备用菌株具体为兽用腐败梭菌C55-1菌株(CVCC编号：60021)，C型产气荚膜梭菌毒素制备用菌株具体为兽用产气荚膜梭菌 C59-2菌株(CVCC编号：60102)，D型产气荚膜梭菌毒素制备用菌株具体为兽用产气荚膜梭菌C60-3菌株(CVCC编号：82)，均购自中国兽医微生物菌种保藏管理中心 (www.cvcc.org.cn，简称CVCC)。

下述实施例中所采用的厌气肉肝汤组成如表1所示。

表1厌气肉肝汤组成

牛肉	250g
		肝(牛、羊或猪)	250g
蛋白胨	10g
		氯化钠	5g
葡萄糖	2g
		蒸馏水加至	1000ml

厌气肉肝汤制备方法如下：

1、取牛肉除去脂肪和筋膜，用绞肉机绞碎，与切成100g左右的牛肝块混合，加蒸馏水，充分搅拌后，冷浸20-24小时。

2、煮沸20-60分钟，补足失去的水分，用白布滤过，弃去肉渣，取出肝块。

3、滤液加入蛋白胨和氯化钠，加热融化，以氢氧化钠溶液调整pH 7.8-8.0，加热煮沸10-20分钟。

4、用滤纸或绒布滤过，加入葡萄糖搅拌，使其融化。

5、将煮过的肝块洗净，切成小方块，用蒸馏水充分冲洗后，分装于试管或中性玻璃瓶内，其量为预计分装肉肝汤量的1/10。

6、将滤液分装于含有肝块的中性容器中(如为试管，还应加入适量液体石蜡)，以116℃灭菌30-40分钟。

该厌气肉肝汤供一般厌气菌培养及检验用。用于菌种保存时，不加葡萄糖。

下述实施例中所采用的明胶缓冲液组分如表2所示。

表2明胶缓冲液组分

蒸馏水	1000ml
		明胶	2g
Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>·12H<sub>2</sub>O	9.25g
		NaH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>·2H<sub>2</sub>O	8.34g

明胶缓冲液配制方法：明胶蒸汽融化后，混合、煮开、滤过，116℃灭菌30分钟备用。

实施例1、同时表达ETX-CSA的重组大肠杆菌BL21-pET-EA的构建

一、设计引物

根据NCBI上公开的产气荚膜梭菌ε毒素和腐败梭菌α毒素的核苷酸序列分别设计引物，并加入linker，linker序列为“GGTGGCGGGGGTAGCGGCGGTGGCGGTTCTGGTGGCGGTGGCTCC”。设计引物具体如表3所示。

表3目的片段扩增及质粒构建用引物表

二、目的片段的扩增

1、两个靶标片段的单独扩增

PCR反应体系如表4所示。

表4 PCR反应体系1

总体积	50μl
		2×A8 FastHiFi PCR MasterMix	25μl
D型产气荚膜梭菌C60-3基因组或腐败梭菌C55-1基因组	1μl
		F_32acpe(用于扩增ETX)或F_L_csa(用于扩增CSA)	1μl
R_L_cpe(用于扩增ETX)或R_32acsa(用于扩增CSA)	1μl
		ddH<sub>2</sub>O	22μl

PCR反应条件：98℃3min；95℃10s，50℃15s，72℃30s，30个循环；72℃2min。

PCR扩增结果：如图1所示，M为DNA Marker，由上至下依次为3000、2000、 1500、1000、800、600、400、300、200bp；1为ETX基因片段的扩增结果；2为CSA 基因片段的扩增结果。由图可见，成功扩增出带有同源臂和Linker序列的ETX基因 (967bp)和CSA基因(1304bp)标靶片段。

PCR产物的纯化回收：制备1％的TAE琼脂糖凝胶，取50μl PCR扩增产物与6μl 10×上样缓冲液均匀混合后加样，120V电压电泳30分钟左右。在紫外灯下，切下目的片段的胶块，放在一个Eppendorf管内，使用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收目的片段。

2、两个靶标片段的融合扩增

PCR反应体系如表5所示。

表5 PCR反应体系2

总体积	50μl
		2×A8 FastHiFi PCR MasterMix	25μl
编码CSA基因片段的回收产物	1μl
		编码ETX基因片段的回收产物	1μl
F_32acpe	1μl
		R_32acsa	1μl
ddH<sub>2</sub>O	22μl

PCR反应条件：98℃3min；95℃10s，50℃15s，72℃50s，30个循环；72℃2min。

PCR扩增结果：如图2所示，M为DNA Marker，由上至下依次为3000、2000、1500、1000、800、600、400、300、200、100bp；A为两个靶标片段的融合扩增的 PCR结果。

PCR产物的纯化回收：同步骤1中相关步骤。

3、重组菌BL21-pET-EA的构建

OEPR法构建重组质粒，反应体系如表6所示。

表6 OEPR法构建重组质粒反应体系

总体积	25μl
		2×A9 LongHiFi PCR MasterMix	12.5μl
ETX-CSA回收产物	3μl
		Riverse_32a	0.5μl
pET-32a(+)质粒	0.5μl
		ddH<sub>2</sub>O	8.5μl

反应条件：98℃3min；95℃10s，50℃15s，72℃210s，35个循环；72℃5min。

PCR扩增结果：如图3所示，M为DNA Marker，由上至下依次为15000、10000、 7500、5000、2500、1000、250bp；1为OEPR法构建重组质粒的PCR结果。

向OEPR法反应产物中加入DMT酶(10U/μL)0.5μL，37℃孵育过夜。取10μL 消化产物，转化Trans1-T1Phage Resistant克隆感受态细胞，铺于LB(Amp⁺，100μg/mL) 平板上，37℃培养12h，挑菌落进行PCR鉴定，并将阳性克隆菌送测序公司进行DNA 测序鉴定。将SEQ IDNo.2所示DNA片段替换pET32a(+)载体上位于上游同源臂 (CGACAAGGCCATGGCTGATATCGGATCCGAAT TC)和下游同源臂(CTCGAG CACC ACCACCACCA CCACTGAGAT CC)之间的小片段后得到的重组质粒为阳性质粒，命名为pET-EA。其中，SEQ ID No.2为将产气荚膜梭菌ε毒素(ETX)的编码基因和腐败梭菌α毒素(CSA)的编码基因通过linker连接而成的融合基因，编码SEQ ID No.1所示的融合蛋白。SEQ ID No.2的第1-888位为ETX的编码基因(编码SEQ IDNo.1 的第1-296位)，第889-933位为linker(编码SEQ ID No.1的第297-311位)，第934-2163 位为CSA的编码基因(编码SEQ ID No.1的第312-720位，另加一个终止密码子TAA)。

测序结果表明，重组质粒pET-EA构建成功，阅读框正确，未发生移码，插入载体的融合基因片段的核苷酸序列与预期序列同源性为100％(图4)。

将构建成功的重组质粒pET-EA转化BL21(DE3)感受态细胞，将获得的重组菌命名为BL21-pET-EA。

实施例2、含有重组质粒pET-EA的重组大肠杆菌BL21-pET-EA的诱导表达及高密度发酵

MDG非诱导培养基的溶剂为水；溶质及浓度为：25mM Na₂HPO₄、25mM KH₂PO₄、 50mMNH₄Cl、5mM Na₂SO₄、2mM MgSO₄、5g/L葡萄糖、2.5g/L天门冬氨酸、氨苄青霉素100μg/mL，pH为7.4。该培养基配方来自于此篇文章中，F William Studier.Stable Expression Clonesand Auto-Induction for Protein Production in E.coli[J].Methods in MolecularBiology,2014,1091:1-17。

ZYM-5052自诱导培养基的溶剂为水；溶质及浓度为：10g/L酪蛋白胨、5g/L酵母浸出物、25mM Na₂HPO₄、25mM KH₂PO₄、50mM NH₄Cl、5mM Na₂SO₄、2mM MgSO₄、5g/L甘油、0.5g/L葡萄糖、2g/Lα-乳糖、氨苄青霉素100μg/mL，pH为 7.4。该培养基配方来自于此篇文章中，FWilliam Studier.Stable Expression Clones and Auto-Induction for ProteinProduction in E.coli[J].Methods in Molecular Biology,2014, 1091:1-17。

基础培养基溶剂为水，溶质及浓度为：20g/L酪蛋白胨、10g/L酵母浸出物、25mMNa₂HPO₄、25mM KH₂PO₄、50mM NH₄Cl、5mM Na₂SO₄、2mM MgSO₄、10g/L葡萄糖、 100μg/mL氨苄青霉素，pH为7.4。

补料培养基溶剂为水，溶质及浓度为：酪蛋白胨100g/L、酵母浸出物50g/L、甘油333g/L、乳糖133g/L、MgSO4·7H₂O 8g/L、氨苄青霉素100μg/mL，pH为7.4。

1、摇瓶振荡培养

挑重组菌单菌落，接种于2mL的MDG非诱导培养基(Amp⁺)中，37℃以260rpm 振摇培养10h；将全部培养物接种于100mL的ZYM-5052自诱导培养基(Amp⁺)中， 30℃以260rpm振摇培养24h。收获培养物，测定光密度A600，并进行蛋白电泳，用 Quanitity one软件分析靶蛋白的相对表达量。

2、生物反应器高密度发酵

挑重组菌单菌落，接种于4mL的MDG非诱导培养基(Amp⁺)中，37℃以260rpm 振摇培养16h；将全部培养物接种于200mL的MDG非诱导培养基(Amp⁺)中，37 ℃以260rpm振摇培养10h。将培养物接种于含4L的基础培养基(Amp⁺)的生物反应器中进行发酵培养，接种量为4％(0.16L培养物接种到4L基础培养基中)，发酵温度为30℃，通气量为10L/min，搅拌速度为500r/m，控制pH为7.0(补碱管接5M NaOH，补酸管接补料培养基)，共培养24h。培养结束后收获培养物，测定光密度 A600。对发酵后菌液进行10倍稀释，进行蛋白电泳，用Quanitityone软件分析靶蛋白的相对表达量。

3、结果

采用摇瓶振荡培养重组大肠杆菌BL21-pET-EA，30℃260rpm培养24h，结果菌体密度A600为4.81，经SDS-PAGE后软件测算目的蛋白(SEQ ID No.1所示融合蛋白)的相对表达量为17.9％，C值(C＝A600×相对表达量)为0.86。采用生物反应器高密度发酵重组大肠杆菌BL21-pET-EA，30℃培养24h，结果菌体密度A600达19-20.3，相对表达量为24.7-27.6％，C值为4.69-5.60，菌体湿重为37.2-50.6g/L。具体见表7。蛋白电泳图如图5所示。

表7重组大肠杆菌DE3-pET-EA高密度发酵结果

实施例3、重组大肠杆菌BL21-pET-EA的高密度发酵制成的疫苗在动物上的免疫效果

一、制苗

取实施例2获得的生物反应器培养物，按总体积的0.4％加入甲醛溶液(含40％甲醛，％表示质量分数)量，37℃灭活48h。经灭活脱毒检验合格后，以抗原(上述灭活后的生物反应器培养物)：铝胶(SPI Pharma公司产品，货号为VAC 20HA比例为 4：1(体积比)来制备疫苗，使所得疫苗中靶蛋白(SEQ ID No.1所示融合蛋白)的终浓度为300μg/mL。

二、疫苗在家兔上的免疫效果

免疫前每只家兔耳中动脉采血5mL，分离血清，按《中国兽药典》的方法测定血清对腐败梭菌毒素和D型产气荚膜梭菌毒素的中和效价。血清效价是指“0.1mL血清能中和的小鼠MLD(最小致死剂量)数”。将疫苗用20％铝胶盐水(配制方法：20ml 铝胶加生理盐水至100ml，121℃灭菌20分钟所得)稀释后，分别以300μg、150μg、 75μg和37.5μg的剂量皮下注射家兔各5只，免疫后21日进行第二次免疫(免疫剂量及接种方式同首免)，首免后21日、35日对每只家兔进行耳中动脉采血5mL，分离血清，测定每组5只家兔混合血清分别对腐败梭菌毒素和D型产气荚膜梭菌毒素的中和效价(具体参见：中国兽药典委员会编.中华人民共和国兽药典2015年版三部 [S].北京：中国农业出版社,2016:44-49.)。

对免疫前家兔血清进行测定，结果显示对腐败梭菌毒素和D型产气荚膜梭菌毒素中和效价均小于1，均为抗体阴性兔。将不同抗原剂量的疫苗分别免疫家兔后，测定每组5只家兔混合血清分别对腐败梭菌毒素和D型产气荚膜梭菌毒素的中和效价。结果(表8)表明：在一定范围内抗原剂量与免疫效果呈正相关；一免、二免血清中和效价均达到或显著高于《中国兽药典》相关产品合格的标准“即血清中和效价对腐败梭菌毒素应达到1，对D型产气荚膜梭菌毒素应达到3”。对于腐败梭菌毒素组分，一免血清效价为药典合格标准的1-4倍，二免血清效价大幅提高为药典合格标准的3-15 倍，增至一免效价的2-5倍。对于D型产气荚膜梭菌毒素组分，一免血清效价为药典合格标准的10倍，二免血清效价大幅提高为药典合格标准的17-67倍，增至一免效价的1.7-6.7倍。综合一免及二免血清中和效价测定结果可知，在300μg·只^-1时，家兔免疫效果最好，一免血清效价对腐败梭菌毒素和D型产气荚膜梭菌毒素分别可达到药典合格标准的4、10倍，而二免效价则分别可达到药典合格标准的15、67倍。

表8 BL21-pET-EA重组灭活苗在家兔上血清效价测定结果

三、疫苗在绵羊上的免疫效果

免疫前每只绵羊颈静脉采血5mL，分离血清，按《中国兽药典》的方法测定血清对对腐败梭菌毒素和D型产气荚膜梭菌毒素的中和效价。血清效价是指“0.1mL血清能中和的小鼠MLD数”。将疫苗用20％铝胶盐水(同上)稀释后，分别以300μg、 150μg、75μg和37.5μg的剂量皮下注射绵羊各5只，免疫后21日进行第二次免疫(免疫剂量及接种方式同首免)，首免后21日、35日对每只绵羊进行颈静脉采血5mL，分离血清，测定每组5只绵羊混合血清分别对腐败梭菌毒素和D型产气荚膜梭菌毒素的中和效价。

对免疫前绵羊血清进行测定，结果显示对腐败梭菌毒素和D型产气荚膜梭菌毒素中和效价均小于1，均为抗体阴性绵羊。将不同抗原剂量的疫苗分别免疫绵羊后，测定每组5只家兔混合血清分别对腐败梭菌毒素和D型产气荚膜梭菌毒素的中和效价。结果(表9)表明：在一定范围内抗原剂量与免疫效果呈正相关；一免、二免血清中和效价均达到或显著高于《中国兽药典》相关产品合格的标准“即血清中和效价对腐败梭菌毒素应达到1，对D型产气荚膜梭菌毒素应达到3”。对于腐败梭菌毒素组分，一免血清效价为药典合格标准的1-4倍，二免血清效价大幅提高为药典合格标准的2-12 倍，增至一免效价的2-6倍。对于D型产气荚膜梭菌毒素组分，一免血清效价为药典合格标准的1.7-10倍，二免血清效价大幅提高为药典合格标准的16.7-83.3倍，增至一免效价的5-10倍。综合一免及二免血清中和效价测定结果可知，在300μg·只^-1时，绵羊免疫效果最好，一免血清效价对腐败梭菌毒素和D型产气荚膜梭菌毒素分别可达到药典合格标准的2、10倍，而二免效价则分别可达到药典标准的12、83.3倍。

表9 BL21-pET-EA重组灭活苗在绵羊上血清效价测定结果

实施例4、用重组大肠杆菌BL21-pET-EA的高密度发酵产物及C型产气荚膜梭菌类毒素制成的联苗在动物上的免疫效果

一、制苗

取与实施例3同批的BL21-pET-EA发酵抗原和C型产气荚膜梭菌类毒素，按总抗原(实施例3步骤一灭活后的生物反应器培养物和C型产气荚膜梭菌类毒素的混合物)：铝胶(SPI Pharma公司产品，货号为VAC 20HA)比例为4：1(体积比)来制备疫苗，使所得疫苗中重组靶蛋白(SEQ ID No.1所示融合蛋白)的终浓度为150μg/mL，使C型产气荚膜梭菌类毒素的含量为400MLD/ml。

二、疫苗在家兔上的免疫效果

免疫前每只家兔耳中动脉采血5mL，分离血清，按《中国兽药典》的方法测定血清对腐败梭菌毒素、C型产气荚膜梭菌毒素和D型产气荚膜梭菌毒素的中和效价。血清效价是指“0.1mL血清能中和的小鼠MLD数”。将疫苗以0.5ml的剂量皮下注射家兔各5只，免疫后21日进行第二次免疫(免疫剂量及接种方式同首免)，首免后21 日、35日对每只家兔进行耳中动脉采血5mL，分离血清，测定每组5只家兔混合血清分别对腐败梭菌毒素、C型产气荚膜梭菌毒素、D型产气荚膜梭菌毒素的中和效价。

对免疫前家兔血清进行测定，结果显示对腐败梭菌毒素、C型产气荚膜梭菌毒素、D型产气荚膜梭菌毒素中和效价均小于1，均为抗体阴性兔。将不同抗原剂量的疫苗分别免疫家兔后，测定每组5只家兔混合血清分别对腐败梭菌毒素、C型产气荚膜梭菌毒素和D型产气荚膜梭菌毒素的中和效价。结果一免家兔血清对腐败梭菌毒素、C 型产气荚膜梭菌毒素、D型产气荚膜梭菌毒素中和效价分别为3、4、30，二免家兔血清对腐败梭菌毒素、C型产气荚膜梭菌毒素、D型产气荚膜梭菌毒素中和效价分别为 10、30、125。以一免效价来比较，腐败梭菌毒素、C型产气荚膜梭菌毒素、D型产气荚膜梭菌毒素三种组分的血清中和效价分别提高为原合格标准的3、4、10倍。

实施例5、本发明方法与传统工艺比较

按照表13中传统工艺中所采用的胰酶消化牛肉汤制备方法制备，得到胰酶消化牛肉汤，按照表18中传统工艺中所采用的肉肝胃酶消化汤制备方法制备，得到肉肝胃酶消化汤。传统疫苗制备方法详见《中国兽用生物制品规程》二○○○年版48-51页。

将本发明的方法与传统工艺进行比较，结果如表10-12和17所示。

表10本发明方法与传统工艺相关参数比较

表11本发明方法成本核算

表12传统工艺(胰酶消化牛肉汤)成本核算

表13传统工艺中所采用的胰酶消化牛肉汤组成

胨水	500ml
		牛肉汤	500ml
磷酸氢二钠	5g
		硫酸二氢钾	5g
活性炭	1g
		硫酸锌	1.4mg
葡萄糖	10g
		蒸馏水加至	1000ml

上述传统工艺中所采用的胰酶消化牛肉汤制法：

1、取胨水，加热至80℃，用20％氢氧化钠溶液调pH为7.0-7.2，加热煮沸5分钟。

2、将煮沸的胨水和牛肉汤等量混合，按总量0.5％加入磷酸氢二钠和磷酸二氢钾，煮沸10分钟。

3、用20％氢氧化钠溶液调pH至8.0-8.2，补加失去的水分，煮沸20分钟，滤过。

4、按总量0.1％加活性炭。

5、按总量每1ml加硫酸锌1.4μg。

6、分装。110℃灭菌30分钟，pH应为7.7-7.9。

7、50％葡萄糖溶液，110℃灭菌30分钟，临用时加入，使培养基含糖量为1％。

8、用途供制造羊快疫疫苗用。

其中，表13中的胨水的组成如表14所示；牛肉汤组成如表16所示。

表14胨水的组成

牛肉	180g
		蒸馏水	1000ml
胰酶粉(1：250)	3-4g
		或胰脏浸出液(1：130，表15)	40ml
冰醋酸	10ml

上述胨水制法如下：

1、绞碎的牛肉180g，加蒸馏水500ml，加热至80℃，再加蒸馏水500ml，使温度由80℃降至50℃左右，用20％碳酸钠或20％氢氧化钠溶液调pH为8.2-8.4。

2、加胰酶粉(或胰脏浸出液)，充分摇匀，置48-50℃水浴，第1小时后每15分钟调pH 1次，第2小时后每30分钟调pH 1次。直至pH稳定在8.0左右。

3、消化5.5小时后，加入1％冰醋酸，100℃加热10分钟后停止消化，滤过，2-8 ℃保存备用。

其中，表14中的胰脏浸出液的组成如表15所示。

表15胰脏浸出液的组成

牛肉	180g
		胰脏(猪、牛、羊)	1份
蒸馏水(或去离子水)	3份
		无水乙醇	1份

胰脏浸出液制备方法如下：将胰脏绞碎，加水1粉，充分搅拌均匀，补加水2份、乙醇1份，置室温浸泡3日，每日摇3次，按全量0.1％加盐酸，粗滤纸(布)滤过，即得。

2-8℃保存，可备用3-6个月。

表16牛肉汤的组成

上述牛肉汤制法如下：

1、将牛肉除去脂肪、筋膜，用绞肉机绞碎，按肉、水比例混合，搅拌均匀。

2、用不锈钢或耐酸搪瓷双层锅，加温至65-75℃，保持45分钟，继续加热至沸，保持1小时，全部过程均应不断搅拌。

3、煮沸完成后，捞出肉渣，沉淀30分钟，抽上清液经绒布滤过，将滤过的肉汤与从肉渣中压榨出的肉汤混合即成。

4、制成的肉汤，即可与猪胃消化液混合配制成马丁肉汤；或分装经116℃灭菌30-40 分钟，贮存备用。

5、制备少量肉汤时，也可采用4-18℃浸泡12-24小时，再煮沸30分钟，分装灭菌后备用。

表17传统工艺(肉肝胃酶消化汤)的成本核算

表18传统工艺使用的厌气肉肝胃酶消化汤组成

牛肉	200g
		肝(牛、羊、猪)	50g
胃蛋白酶(1：3000)	3～4g
		盐酸	10～11ml
蛋白胨	10g
		葡萄糖	10g
蒸馏水加至	1000ml

传统工艺使用的厌气肉肝胃酶消化汤的制法：

1、在65℃左右温水内加入盐酸和绞碎的牛肉、肝，充分搅匀，再加入胃蛋白酶充分搅拌，混合后的温度应在56～58℃。

2、置53～55℃消化22～24小时。前10小时每小时充分搅拌1次。

3、提取上清液，加热至80℃，然后加入蛋白胨煮开，调pH 7.6～7.8。煮沸10 分钟，滤过或经沉淀后取上清液，按量加入葡萄糖溶解后分装。

4、116℃灭菌40分钟。

<110> 中国兽医药品监察所

<120> 同时表达ETX-CSA的重组菌及相关疫苗的生产方法

<130> GNCLN181714

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 720

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 1

Lys Glu Ile Ser Asn Thr Val Ser Asn Glu Met Ser Lys Lys Ala Ser

1 5 10 15

Tyr Asp Asn Val Asp Thr Leu Ile Glu Lys Gly Arg Tyr Asn Thr Lys

20 25 30

Tyr Asn Tyr Leu Lys Arg Met Glu Lys Tyr Tyr Pro Asn Ala Met Ala

35 40 45

Tyr Phe Asp Lys Val Thr Ile Asn Pro Gln Gly Asn Asp Phe Tyr Ile

50 55 60

Asn Asn Pro Lys Val Glu Leu Asp Gly Glu Pro Ser Met Asn Tyr Leu

65 70 75 80

Glu Asp Val Tyr Val Gly Lys Ala Leu Leu Thr Asn Asp Thr Gln Gln

85 90 95

Glu Gln Lys Leu Lys Ser Gln Ser Phe Thr Cys Lys Asn Thr Asp Thr

100 105 110

Val Thr Ala Thr Thr Thr His Thr Val Gly Thr Ser Ile Gln Ala Thr

115 120 125

Ala Lys Phe Thr Val Pro Phe Asn Glu Thr Gly Val Ser Leu Thr Thr

130 135 140

Ser Tyr Ser Phe Ala Asn Thr Asn Thr Asn Thr Asn Ser Lys Glu Ile

145 150 155 160

Thr His Asn Val Pro Ser Gln Asp Ile Leu Val Pro Ala Asn Thr Thr

165 170 175

Val Glu Val Ile Ala Tyr Leu Lys Lys Val Asn Val Lys Gly Asn Val

180 185 190

Lys Leu Val Gly Gln Val Ser Gly Ser Glu Trp Gly Glu Ile Pro Ser

195 200 205

Tyr Leu Ala Phe Pro Arg Asp Gly Tyr Lys Phe Ser Leu Ser Asp Thr

210 215 220

Val Asn Lys Ser Asp Leu Asn Glu Asp Gly Thr Ile Asn Ile Asn Gly

225 230 235 240

Lys Gly Asn Tyr Ser Ala Val Met Gly Asp Glu Leu Ile Val Lys Val

245 250 255

Arg Asn Leu Asn Thr Asn Asn Val Gln Glu Tyr Val Ile Pro Val Asp

260 265 270

Lys Lys Glu Lys Ser Asn Asp Ser Asn Ile Val Lys Tyr Arg Ser Leu

275 280 285

Ser Ile Lys Ala Pro Gly Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

290 295 300

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Leu Thr Asn Leu Glu Glu Gly Gly Tyr

305 310 315 320

Ala Asn His Asn Asn Ala Ser Ser Ile Lys Ile Phe Gly Tyr Glu Asp

325 330 335

Asn Glu Asp Leu Lys Ala Lys Ile Ile Gln Asp Pro Glu Phe Ile Arg

340 345 350

Asn Trp Ala Asn Val Ala His Ser Leu Gly Phe Gly Trp Cys Gly Gly

355 360 365

Thr Ala Asn Pro Asn Val Gly Gln Gly Phe Glu Phe Lys Arg Glu Val

370 375 380

Gly Ala Gly Gly Lys Val Ser Tyr Leu Leu Ser Ala Arg Tyr Asn Pro

385 390 395 400

Asn Asp Pro Tyr Ala Ser Gly Tyr Arg Ala Lys Asp Arg Leu Ser Met

405 410 415

Lys Ile Ser Asn Val Arg Phe Val Ile Asp Asn Asp Ser Ile Lys Leu

420 425 430

Gly Thr Pro Lys Val Lys Lys Leu Ala Pro Leu Asn Ser Ala Ser Phe

435 440 445

Asp Leu Ile Asn Glu Ser Lys Thr Glu Ser Lys Leu Ser Lys Thr Phe

450 455 460

Asn Tyr Thr Thr Ser Lys Thr Val Ser Lys Thr Asp Asn Phe Lys Phe

465 470 475 480

Gly Glu Lys Ile Gly Val Lys Thr Ser Phe Lys Val Gly Leu Glu Ala

485 490 495

Ile Ala Asp Ser Lys Val Glu Thr Ser Phe Glu Phe Asn Ala Glu Gln

500 505 510

Gly Trp Ser Asn Thr Asn Ser Thr Thr Glu Thr Lys Gln Glu Ser Thr

515 520 525

Thr Tyr Thr Ala Thr Val Ser Pro Gln Thr Lys Lys Arg Leu Phe Leu

530 535 540

Asp Val Leu Gly Ser Gln Ile Asp Ile Pro Tyr Glu Gly Lys Ile Tyr

545 550 555 560

Met Glu Tyr Asp Ile Glu Leu Met Gly Phe Leu Arg Tyr Thr Gly Asn

565 570 575

Ala Arg Glu Asp His Thr Glu Asp Arg Pro Thr Val Lys Leu Lys Phe

580 585 590

Gly Lys Asn Gly Met Ser Ala Glu Glu His Leu Lys Asp Leu Tyr Ser

595 600 605

His Lys Asn Ile Asn Gly Tyr Ser Glu Trp Asp Trp Lys Trp Val Asp

610 615 620

Glu Lys Phe Gly Tyr Leu Phe Lys Asn Ser Tyr Asp Ala Leu Thr Ser

625 630 635 640

Arg Lys Leu Gly Gly Ile Ile Lys Gly Ser Phe Thr Asn Ile Asn Gly

645 650 655

Thr Lys Ile Val Ile Arg Glu Gly Lys Glu Ile Pro Leu Pro Asp Lys

660 665 670

Lys Arg Arg Gly Lys Arg Ser Val Asp Ser Leu Asp Ala Arg Leu Gln

675 680 685

Asn Glu Gly Ile Arg Ile Glu Asn Ile Glu Thr Gln Asp Val Pro Gly

690 695 700

Phe Arg Leu Asn Ser Ile Thr Tyr Asn Asp Lys Lys Ile Asp Ile Asn

705 710 715 720

<210> 2

<211> 2163

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 2

aaggaaatat ctaatacagt atctaatgaa atgtccaaaa aagcttctta tgataatgta 60

gatacattaa ttgagaaagg aagatataat acaaaatata attacttaaa gagaatggaa 120

aaatattatc ctaatgctat ggcatatttt gataaggtta ctataaatcc acaaggaaat 180

gatttttata ttaataatcc taaagttgaa ttagatggag aaccatcaat gaattatctt 240

gaagatgttt atgttggaaa agctctctta actaatgata ctcaacaaga acaaaaatta 300

aaatcacaat cattcacttg taaaaatact gatacagtaa ctgcaactac tactcatact 360

gtgggaactt cgatacaagc aactgctaag tttactgttc cttttaatga aacaggagta 420

tcattaacta ctagttatag ttttgcaaat acaaatacaa atactaattc aaaagaaatt 480

actcataatg tcccttcaca agatatacta gtaccagcta atactactgt agaagtaata 540

gcatatttaa aaaaagttaa tgttaaagga aatgtaaagt tagtaggaca agtaagtgga 600

agtgaatggg gagagatacc tagttattta gcttttccta gggatggtta taaatttagt 660

ttatcagata cagtaaataa gagtgattta aatgaagatg gtactattaa tattaatgga 720

aaaggaaatt atagtgcagt tatgggagat gagttaatag ttaaggttag aaatttaaat 780

acaaataatg tacaagaata tgtaatacct gtagataaaa aagaaaaaag taatgattca 840

aatatagtaa aatataggag tctttctatt aaggcaccag gaataaaagg tggcgggggt 900

agcggcggtg gcggttctgg tggcggtggc tcccttacaa atcttgaaga ggggggatat 960

gcaaatcata ataatgcttc ttcaattaaa atatttggat atgaagacaa tgaagattta 1020

aaagctaaaa ttattcaaga tccagagttt ataagaaatt gggcaaatgt agctcattca 1080

ttaggatttg gatggtgcgg tggaacggct aatccaaacg ttggacaagg ttttgaattt 1140

aaaagagaag ttggggcagg tggaaaagta tcttatttat tatctgctag atacaatcca 1200

aatgatcctt atgcaagtgg gtatcgtgca aaagatagac tttctatgaa aatatcaaat 1260

gttagatttg ttattgataa tgattctata aaattaggta cacctaaagt gaaaaaatta 1320

gcacctttaa actctgctag ttttgattta ataaatgaaa gtaaaactga gtctaaatta 1380

tcaaaaacat ttaattatac aacttctaaa acagtttcta aaacagataa ctttaaattt 1440

ggagaaaaaa taggagtaaa aacatcattt aaagtaggtc ttgaagctat agctgacagt 1500

aaagttgaga caagctttga atttaatgca gaacaaggtt ggtcaaatac aaatagtact 1560

actgaaacta aacaagaaag tactacatat actgcaacag tttctccaca aactaaaaag 1620

agattattcc tagatgtgtt aggatcacaa attgatattc cttatgaagg aaaaatatat 1680

atggaatacg acatagaatt aatgggattt ttaagatata caggaaatgc tcgtgaagat 1740

catactgaag atagaccaac agttaaactt aaatttggta aaaacggtat gagtgctgag 1800

gaacatctta aagatttata tagtcataag aatattaatg gatattcaga atgggattgg 1860

aaatgggtag atgagaaatt tggttattta tttaaaaatt catacgatgc tcttactagt 1920

agaaaattag gaggaataat aaaaggctca tttactaaca ttaatggaac aaaaatagta 1980

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Claims

1.能够同时表达产气荚膜梭菌ε毒素和腐败梭菌α毒素的重组菌的构建方法，包括如下步骤：将融合蛋白的编码基因导入大肠杆菌，得到表达所述融合蛋白的重组大肠杆菌，即为所述工程菌；

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述产气荚膜梭菌ε毒素为如下(A1)-(A3)中任一所示的蛋白质：

(A1)SEQ ID No.1的第1-296位所示的蛋白质；

(A3)与(A1)或(A2)所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质；

和/或

所述腐败梭菌α毒素为如下(B1)-(B3)中任一所示的蛋白质：

(B1)SEQ ID No.1的第312-720位所示的蛋白质；

(B3)与(B1)或(B2)所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质；

和/或

所述融合蛋白为如下(C1)-(C4)中任一所示的蛋白质：

(C1)SEQ ID No.1所示的蛋白质；

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述融合蛋白的编码基因中编码所述产气荚膜梭菌ε毒素的基因为如下(a1)-(a3)中任一所示的DNA分子：

(a1)核苷酸序列如SEQ ID No.2的第1-888位所示的DNA分子；

(a2)在严格条件下与(a1)限定的DNA分子杂交且编码所述产气荚膜梭菌ε毒素的DNA分子；

(a3)与(a1)或(a2)所限定的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且编码所述产气荚膜梭菌ε毒素的DNA分子；

和/或

所述融合蛋白的编码基因中编码所述腐败梭菌α毒素的基因为如下(b1)-(b3)中任一所示的DNA分子：

(b1)核苷酸序列如SEQ ID No.2的第934-2163位所示的DNA分子；

(b3)与(b1)或(b2)所限定的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且编码所述腐败梭菌α毒素的DNA分子；

和/或

所述融合蛋白的编码基因中编码所述连接肽的基因的核苷酸序列为SEQ ID No.2的第889-933位；

和/或

所述融合蛋白的编码基因为如下(c1)-(c3)中任一所示的DNA分子：

(c1)核苷酸序列如SEQ ID No.2所示的DNA分子；

(c2)在严格条件下与(c1)限定的DNA分子杂交且编码所述融合蛋白的DNA分子；

(c3)与(c1)或(c2)所限定的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且编码所述融合蛋白的DNA分子。

4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：所述融合蛋白的编码基因是通过含有所述融合蛋白的编码基因的重组载体的形式导入所述大肠杆菌中的；

进一步地，所述重组载体为将所述融合蛋白的编码基因克隆到pET32a(+)载体后得到的重组质粒；

和/或

所述大肠杆菌为大肠杆菌BL21(DE3)。

5.利用权利要求1-4所述方法构建得到的重组菌。

6.利用权利要求5所述重组菌制备抗原的方法，包括如下步骤：

(a)将所述重组菌的单菌落接种于4～5mL的MDG非诱导培养基，36～37℃以230～260rpm振摇培养16～18h；

(b)将步骤(a)的全部培养物接种于200～250mL的所述MDG非诱导培养基中，36～37℃以230～260rpm振摇培养10～12h；

(c)将步骤(b)的培养物接种于含基础培养基的生物反应器中进行发酵培养；接种量为3～4％体积百分含量，发酵温度为28～30℃，通气量为8～10L/min，搅拌速度为400～500rpm，控制pH为7.0～7.1，共培养24～25h，收获培养物，灭活后即得所述抗原；

所述MDG非诱导培养基的溶剂为水；溶质及浓度为：25～50mM Na₂HPO₄、25～50mMKH₂PO₄、50～75mM NH₄Cl、5～6mM Na₂SO₄、2～3mM MgSO₄、5～7.5g/L葡萄糖、2.5～3g/L天门冬氨酸、氨苄青霉素100～150μg/mL，pH为7.2～7.4；

所述基础培养基溶剂为水，溶质及浓度为：20～25g/L酪蛋白胨、10～12.5g/L酵母浸出物、25～50mM Na₂HPO₄、25～50mM KH₂PO₄、50～75mM NH₄Cl、5～6mM Na₂SO₄、2～3mM MgSO₄、10～12.5g/L葡萄糖、100～150μg/mL氨苄青霉素，pH为7.2～7.4；

所述补料培养基溶剂为水，溶质及浓度为：酪蛋白胨100～110g/L、酵母浸出物50～55g/L、甘油250～333g/L、乳糖85～133g/L、MgSO4·7H₂O 5～8g/L、氨苄青霉素100～150μg/mL，pH为7.2～7.4。

7.抗原，为灭活后的权利要求5所述重组菌的培养物；在所述重组菌的培养物中，所述重组菌的菌体密度A600达19～20.3，所述重组菌中所述融合蛋白的相对表达量为24.7～27.6％，所述重组菌的菌体湿重为37.2～50.6g/L；

进一步地，所述抗原按照权利要求6所述方法制备得到。

8.如下任一方法：

方法A：一种制备能够用于预防由腐败梭菌和/或D型产气荚膜梭菌所致疾病的疫苗的方法，包括如下步骤：将权利要求7所述抗原与铝胶按照体积比为4:1的比例混合，得到所述疫苗；

方法B：一种制备能够用于预防由腐败梭菌、C型产气荚膜梭菌和/或D型产气荚膜梭菌所致疾病的疫苗的方法，包括如下步骤：将总抗原与铝胶按照体积比为4:1的比例混合，得到所述疫苗；

所述总抗原为由权利要求7所述抗原与C型产气荚膜梭菌类毒素混合而成；

在所述疫苗中，所述融合蛋白的终浓度为150μg/mL，所述C型产气荚膜梭菌类毒素的含量为400MLD/mL。

9.疫苗，为如下任一：

(1)采用权利要求8中的所述方法A制备得到的疫苗；

(2)采用权利要求8中的所述方法B制备得到的疫苗。

10.如下任一应用：

(I)权利要求5所述的重组菌在制备权利要求7所述抗原中的应用；

(II)权利要求5所述的重组菌在制备权利要求9所述疫苗中的应用。

(III)权利要求9所述疫苗在预防由腐败梭菌、C型产气荚膜梭菌和/或D型产气荚膜梭菌所致疾病中的应用。