CN110051834A

CN110051834A - 一种无毒产气荚膜梭菌和腐败梭菌融合蛋白疫苗及其生产方法

Info

Publication number: CN110051834A
Application number: CN201910178677.7A
Authority: CN
Inventors: 杜吉革; 陈小云; 刘莹; 朱真; 薛麒; 印春生; 李启红; 康凯; 姚文生
Original assignee: China Institute of Veterinary Drug Control
Current assignee: China Institute of Veterinary Drug Control
Priority date: 2019-03-11
Filing date: 2019-03-11
Publication date: 2019-07-26

Abstract

本发明涉及一种无毒产气荚膜梭菌和腐败梭菌融合蛋白疫苗及其生产方法。本发明制备的融合蛋白疫苗，系采用经过密码子优化、含有3个氨基酸突变的产气荚膜梭菌ε毒素以及含有4个氨基酸突变和11个氨基酸缺失的腐败梭菌α毒素的融合蛋白生产，即最大限度地保留天然毒素的完整性和空间构象，从而保持其免疫原性，又避免了单个氨基酸突变带来的生物安全隐患。该疫苗还具有制备工艺简单，疫苗效力优良等优点，较我国目前商品化的羊快疫和羊肠毒血症灭活疫苗大大降低了疫苗生产过程中的生物安全风险，是我国现行产气荚膜梭菌和腐败梭菌病疫苗升级换代的理想候选疫苗；而且在与其它抗原共同制备联苗时，无需增大联苗的使用剂量，即可制备联苗。

Description

一种无毒产气荚膜梭菌和腐败梭菌融合蛋白疫苗及其生产方法

技术领域

本发明涉及无毒产气荚膜梭菌和腐败梭菌融合蛋白疫苗及其生产方法。属于兽用生物制品领域。

背景技术

产气荚膜梭菌和腐败梭菌是能够引起人和多种动物发病的厌氧菌，对人类的健康和畜禽养殖业危害极大。其中，产气荚膜梭菌是创伤性气性坏疽和人类食物中毒以及羊猝疽、羔羊痢疾、牛羊坏死性肠炎、牛羊肠毒血症的主要病原之一，腐败梭菌是羊快疫的主要病原。两种梭菌的致病因素均是菌体分泌的外毒素。根据产生4种主要致死性外毒素α(CPA)、β(CPB)、ε(ETX)和ι(CPI)的种类，可将产气荚膜梭菌分为A、B、C、D、E五个毒素型(Revitt-Mills,S；Rood,J；Adams,V.Clostridium perfringens extracellular toxinsand enzymes:20and counting.Microbiol.Aust.2015,36,114-117.)，而腐败梭菌只有一种关键的致死性毒力因子，即α毒素(Tweten R K.Clostridium perfringens beta toxinand Clostridium septicum alpha toxin:their mechanisms and possible role inpathogenesis[J].Vet Microbiol,2001,82(1):1-9.)。由于产气荚膜梭菌病和腐败梭菌病具有发病急、病程短且死亡率极高的特点，一旦发病，往往还来不及治疗就因外毒素中毒而发生猝死，因此免疫接种是防控该病的有效方法(陆承平.兽医微生物学[M].北京:中国农业出版社，2013:194-196.)。目前，针对以上两种病使用的商品化疫苗主要是灭活疫苗，该类疫苗在预防动物产气荚膜梭菌和腐败梭菌所致疾病方面虽然取得了一定的效果，但这些疫苗在使用过程中仍然暴露了一些缺陷，例如疫苗免疫易引起动物局部炎症及毒性反应等；其在制备过程中涉及外毒素的灭活，存在毒素外泄或灭活不彻底等生物安全隐患；此外，培养上清中的各种微小毒素以及细菌的代谢产物往往成为免疫动物的致敏原，接种动物易产生不良反应，导致免疫效果下降甚至免疫失败。因此，开发安全性好、有效抗原含量高、免疫原性强的产气荚膜梭菌和腐败梭菌毒素基因工程疫苗，是未来的发展方向。

目前，市场用量较大的商品化的梭菌灭活苗主要是羊快疫、猝疽、羔羊痢疾、肠毒血症三联四防灭活苗以及羊梭菌病多联干粉苗。其中，羊快疫主要是由腐败梭菌分泌的α毒素(CSA)引起(Tweten R K.Clostridium perfringens beta toxin and Clostridiumsepticum alpha toxin:their mechanisms and possible role in pathogenesis[J].Vet Microbiol,2001,82(1):1-9.)，肠毒血症主要与D型产气荚膜梭菌分泌的ε毒素(ETX)有关。

CSA由440或443个氨基酸构成，主要分为D1、D2和D3三个结构域。其中，D1结构域是一个复杂的多功能结构域，在受体结合，寡聚化和孔形成过程中均发挥作用，该结构域内45个关键性氨基酸位点突变的突变体中，有17种突变体丧失细胞溶血活性，而细胞结合活性则各不相同。D2结构域主要参与孔形成过程，而D3结构域主要参与毒素分子的寡聚化。已有的研究发现，删除位于D2区的双亲性β发夹跨膜区内的11个氨基酸(第212位～第222位)不会明显改变CSA的正常折叠，但使CSA完全丧失细胞毒性和其在腐败梭菌病中的作用，而该重组毒素的抗原性未得到验证(Kennedy C L,Lyras D,Cordner L M,et al.Pore-formingactivity of alpha-toxin is essential for clostridium septicum-mediatedmyonecrosis[J].Infection&Immunity,2009,77(3):943-951.)。

ETX主要是由B型和D型产气荚膜梭菌产生，全长296个氨基酸，以前毒素的形式分泌于菌体外。前毒素被宿主的胰蛋白酶和糜蛋白酶或梭菌自身的蛋白酶作用后，去除N端11-13个以及C端22-29个氨基酸，从而活化为成熟毒素。该毒素属于β穿孔素家族成员，是产气荚膜梭菌毒素中毒力最强的毒素，其毒力仅次于肉毒杆菌素和破伤风神经毒素(Li J H,Adams V,Bannam T L,Miyamoto K,Garcia J P,Uzal F A,Rood J L,McClanea B A.Toxinplasmids of clostridium perfringens,Microbiology and Molecular BiologyReviews,2013,77(2):208-233.)。因此，实现毒素的减毒甚至无毒以及构建相关减毒或无毒体，对于开发毒素基因工程亚单位疫苗以及其作为抗原组分的多价亚单位疫苗的研究和应用就显得尤为重要。目前虽然已有产气荚膜梭菌ε毒素减毒突变体的报道，如中国农业科学院哈尔滨兽医研究所于力等(“产气荚膜梭菌ε毒素减毒突变体及其应用”，申请号：201410707351.6)将野生型产气荚膜梭菌ε毒素成熟毒素的第71位酪氨酸突变为非芳香族氨基酸，获得了对于细胞或动物体减毒的ε毒素突变体，由于该申请仅突变1个氨基酸，易发生回复突变而重新成为毒力极强的毒素，从而给未来实际的疫苗大规模生产带来严重的生物安全风险。中国动物疫病预防控制中心宋晓晖等(“抑制产气荚膜梭菌感染的重组ε蛋白及其制备方法与应用”，申请号：201610301989.9)设计了3种重组ε毒素蛋白，但均缺失了野生型ε毒素蛋白的前50个氨基酸残基，这种采用蛋白片段作为免疫原的策略，很可能会导致抗原蛋白的抗原性不完整，从而影响其免疫原性。

发明内容

本发明目的在于制备出产气荚膜梭菌ETX突变体和腐败梭菌CSA突变体的融合蛋白(rETX_m3CSA_M4△11)，一方面最大限度地保持相应毒素的免疫原性，又避免了单个氨基酸突变带来的生物安全隐患。同时，该疫苗还具有制备工艺简单、免疫剂量低、免疫效力好等优点，用于预防羊快疫、肠毒血症。

本发明技术方案

1.一种无毒产气荚膜梭菌和腐败梭菌融合蛋白疫苗，其特征在于所述疫苗含有的融合蛋白系由重组表达rETX_m3CSA_M4△11的大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)，被命名为大肠埃希氏菌BL/EC株制备的，该菌株已于2019年01月11日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCC No.17165；

所述融合蛋白的编码基因，是根据产气荚膜梭菌ETX和腐败梭菌CSA的天然基因序列，经密码子优化后，将含有多个氨基酸突变的ETX编码基因以及含有多个氨基酸突变和氨基酸缺失的CSA编码基因进行串联，并在其C端添加氨基酸标签编码基因构建而成，进而通过宿主细胞表达获得了对于动物体无毒的融合蛋白。

2.本发明所述产气荚膜梭菌和腐败梭菌融合蛋白疫苗，其特征在于所述融合蛋白rETX_m3CSA_M4△11，与野生型产气荚膜梭菌成熟ETX相比，含有多个氨基酸的突变，优选的为3个氨基酸突变，分别为第30位酪氨酸突变为丙氨酸Y30A，第106位组氨酸突变为脯氨酸H106P，以及第196位酪氨酸突变为丙氨酸Y196A；与野生型腐败梭菌成熟CSA相比，D1结构域含有多个氨基酸的突变，优选的为4个氨基酸突变，分别为：第54位半胱氨酸突变为亮氨酸C54L，第264位天冬酰胺突变为丙氨酸N264A，第269位组氨酸突变为丙氨酸H269A，第310位色氨酸突变为丙氨酸W310A。同时，D2结构域含有多个氨基酸缺失，优选的11个氨基酸的缺失，即第212位～第222位氨基酸。

3.本发明所述产气荚膜梭菌和腐败梭菌融合蛋白疫苗，其特征在于所述融合蛋白rETX_m3CSA_M4△11其编码基因序列经过密码子优化，更易于在大肠杆菌中实现高表达。

4.本发明所述产气荚膜梭菌和腐败梭菌融合蛋白疫苗，其特征在于所述融合蛋白rETX_m3CSA_M4△11为无毒蛋白，大大降低了疫苗生产过程中的生物安全风险。

5.本发明所述产气荚膜梭菌和腐败梭菌融合蛋白疫苗，其特征在于所述融合蛋白在大肠杆菌BL(DE3)中为可溶性表达，既可最大限度地保留天然毒素蛋白的空间构象，从而保持其免疫原性；又避免了包涵体变性复性的繁琐工艺对抗原蛋白免疫原性的影响，减少了疫苗的制备时间和生产成本。

6.本发明所述产气荚膜梭菌和腐败梭菌融合蛋白疫苗，其特征在于所述所述融合蛋白带有便于纯化的氨基酸标签，优化的为在rETX_m3CSA_M4△11的C端含有6个组氨酸(6*His)标签，便于蛋白的纯化。

7.本发明所述产气荚膜梭菌和腐败梭菌融合蛋白疫苗，其特征在于其制备方法：通过宿主细胞表达融合蛋白。如本文所用，术语“宿主细胞”涵盖原核细胞和或真核细胞，可以是产抱子梭菌、丙酮丁醇梭菌、蜡样芽胞杆菌、苏云金芽抱杆菌、曹状芽抱杆菌、嗜热溶蛋白芽胞杆菌、炭疽芽抱杆菌、巨大芽抱杆菌、枯草芽抱杆菌、大肠杆菌或酵母细胞。优选地，宿主细胞是大肠杆菌宿主细胞，特别是大肠杆菌BL21(DE3)或Rosetta(DE3)。本发明用表达融合蛋rETX_m3CSA_M4△11的埃希氏大肠菌BL21(DE3)，命名为BL/EC株作为疫苗生产菌株，经发酵培养、诱导表达、菌体破碎、可溶性抗原蛋白分离纯化后，加双相油乳佐剂混合制成。

本发明的有益效果

本发明涉及一种无毒产气荚膜梭菌和腐败梭菌融合蛋白疫苗及其生产方法。本发明将含有ETX突变体(含有3个氨基酸突变，简称为ETX_m3)和CSA突变体(同时含有4个氨基酸突变和11个氨基酸的缺失，简称为CSA_M4△11)进行串联表达，从而获得了对小鼠无毒的融合蛋白rETX_m3CSA_M4△11，该融合蛋白在大肠杆菌BL(DE3)中为可溶性表达，既可最大限度地保留天然毒素的空间构象，从而保持其免疫原性，又避免了单个氨基酸突变带来的生物安全隐患，在家兔模型中呈现良好的安全性和免疫保护性。与我国目前商品化的羊梭菌灭活疫苗相比，该疫苗免疫剂量低、免疫效力好，疫苗生产工艺简单，且大大降低了疫苗生产过程中的生物安全风险等优点，而且所制备的疫苗一免后的血清中和效价远远高于目前商品化疫苗标准，是我国现行羊梭菌类疫苗升级换代的理想候选疫苗。

鉴于我国现有商品化梭菌疫苗须采用甲醛灭活脱毒，存在生物安全隐患，也影响了疫苗在田间使用的安全性；同时现行商品化疫苗在生产过程中，还存在产毒不稳定，导致疫苗效力不稳定的问题。因此，本申请生产的疫苗是我国现行羊梭菌类灭活疫苗升级换代的理想候选疫苗。

附图说明

图1：rETX_m3CSA_M4△11表达的SDS-PAGE鉴定结果，M₁:Protein marker；1:BSA(1μg)；2:BSA(2μg)；3:空载体pET30a诱导的细胞裂解物；4:目的质粒诱导的细胞裂解物；5:空载体pET30a诱导的细胞裂解上清；6:目的质粒诱导的细胞裂解上清；7:空载体pET30a诱导的细胞裂解沉淀；8:目的质粒诱导的细胞裂解沉淀。

图2：rETX_m3CSA_M4△11表达的Western blot(采用抗His抗体)鉴定结果图中：M2:Western blot marker；1:空载体pET30a诱导的细胞裂解物；2:目的质粒诱导的细胞裂解物；3:目的质粒诱导的细胞裂解上清；4:目的质粒诱导的细胞裂解沉淀。

图3：rETX_m3CSA_M4△11的纯化M₁:Protein marker；M₁:Protein marker；；1：IPTG诱导后的细胞裂解液；2：IPTG诱导后的细胞裂解上清3：流穿液；4：20mM Imidazole的洗脱液；5:50mM Imidazole的洗脱液；6:300mM Imidazole的洗脱液；7：Ni-IDA介质。

图4：rETX_m3CSA_M4△11免疫家兔和绵羊血清对毒素的中和效价图中1：D型产气荚膜梭菌毒素；2：腐败梭菌毒素。

本发明涉及生物材料资源信息

本发明涉及的微生物为：表达含有3个氨基酸突变的ETX突变体、4个氨基酸突变和11个氨基酸缺失的CSA突变体、融合蛋白C端含有6个组氨酸(6*His)标签的融合蛋白rETX_m3CSA_M4△11的大肠埃希氏菌(Escherichia coli)BL21(DE3)，该菌株被命名为大肠埃希氏菌BL/EC株(株制备的，该菌株已于2019年01月11日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCC No.17165。

本发明具体实施方式

1.无毒产气荚膜梭菌和腐败梭菌融合蛋白表达载体的构建

(1)基因合成：根据产气荚膜梭菌ETX和腐败梭菌CSA的天然基因序列，经密码子优化后，将含有多个氨基酸突变的ETX编码基因以及含有多个氨基酸突变和氨基酸缺失的CSA编码基因进行串联。同时，在融合蛋白C端添加纯化所用氨基酸标签编码基因。用化学合成的方法，合成该段基因序列(序列1和序列2)。

(1)融合蛋白表达载体的构建

以人工合成的基因为模板，采用设计的引物对(序列3和序列4)进行PCR扩增到的目的DNA条带，经回收后，与原核表达载体同时采用双酶切消化后进行连接，得到插目的基因的原核表达载体。将连接好的质粒转化DH5α感受态细胞，挑取单克隆至含有卡那霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜，提取质粒备用。

2.表达融合蛋白的基因工程菌株的构建。

将提取得到的质粒，转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，挑取单克隆至含有卡那霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜，经PCR鉴定，含有目的DNA片段后，获得阳性菌株，并加入等体积的50％甘油LB，-70℃冻存。

3.融合蛋白疫苗的制备

(1)菌种：制苗用菌种为表达融合蛋白的大肠埃希氏菌BL/EC株。

(2)一级种子繁殖及鉴定：将冻干菌种用少量LB液体培养基融解，划线接种于含卡那霉素的LB固体平板，置37℃培养12～16小时，选取符合标准的单个菌落，接种含卡那霉素的LB液体培养基，置37℃培养8～12小时，与50％甘油等比例混合后分装，置-15℃以下保存，经纯粹检验合格后，作为制苗用一级种子。

(3)二级种子繁殖及鉴定：取一级种子，按1％的量接种含卡那霉素的LB液体培养基，置37℃振荡培养8～12小时，即为二级种子。

(4)制苗用抗原制备：取合格的二级种子，按培养基总量的2％接种含卡那霉素的LB液体培养基，培养温度37℃，pH值7.0。当培养物OD₆₀₀值为1.2～1.6时，加入终浓度为0.5M的IPTG诱导培养4h。

(5)破菌：以5000r/min离心5min收集菌体，按每克菌体湿重加10mL裂解液(pH值7.2 0.02mol/L Tris缓冲液，0.3mol/L NaCl)的比例重悬菌体，用高压均质机以800bar的压力破碎菌体，离心收集上清。

(6)纯化：按照Ni-IDA亲和层析介质试剂盒(南京金斯瑞)的使用说明书对菌体裂解上清中呈可溶性表达的目的蛋白进行纯化，经0.22μm孔径滤膜过滤，-80℃保存备。

(7)蛋白含量检测：用BCA法检测蛋白含量(PierceTM BCA Protein Assay Kit，TG268883)。

(8)无菌检验：按现行《中国兽药典》(中国兽药典委员会，中华人民共和国兽药典，二〇一五年版三部，中国农业出版社，2016，以下称《中国兽药典》)附录进行。应无菌生长。

(7)疫苗配制：将双相油佐剂(如201佐剂)导入油相罐内，以至少121℃高压灭菌30min，冷却至室温备用。根据蛋白含量测定结果，用PBS(pH值7.2 0.01mol/L)将检验合格的纯化蛋白进行一定比例的稀释。将稀释好的水相分别加入乳化罐内，以80～100r/min搅拌，同时按1:1(V/V)的比例，缓慢加入油相，加完后搅拌20～30min。乳化后取样进行检验，合格后分装。

4.无毒产气荚膜梭菌和腐败梭菌融合蛋白疫苗的检验

(1)性状

外观乳白色乳剂。

剂型呈水包油包水型(W/O/W)。取一清洁吸管，吸取少量疫苗滴于清洁冷水表面，应呈云雾状扩散。

稳定性吸取疫苗10mL加入离心管中，以3000r/min离心15min，应不破乳，并且管底析出的水相应不多于0.5mL。

黏度按《中国兽药典》附录进行测定，应符合规定。

(2)装量检查按《中国兽药典》附录进行检查，应符合规定。

(3)无菌检验按《中国兽药典》附录进行检验，应无菌生长。

(4)安全检验用体重1.5～2.0kg健康家兔4只，各肌肉或皮下注射疫苗4.0mL，观察10日。应全部健活。

(5)效力检验

血清中和法：选取对D型产气荚膜梭菌毒素和腐败梭菌毒素中和效价均小于1，即均为抗体阴性的、体重1.5～2.0kg健康家兔4只和6～12月龄、体重30～40kg的绵羊4只，各颈部皮下或肌肉注射疫苗2.0mL。接种后14～21日，采血，分离血清，各取0.4mL分别与D型产气荚膜梭菌毒素(含12个及以上小鼠MLD)和腐败梭菌(含4个及以上小鼠MLD)，混合后置37℃作用40min，然后静脉注射16～18g小鼠2只，0.3mL/只。同时各用同批小鼠2只，分别注射1MLD与毒素血清混合物相同的毒素作对照。检测腐败梭菌的小鼠观察3日，检测D型产气荚膜梭菌的观察1日，判定结果。

对照鼠全部死亡，血清中和效价对D型产气荚膜梭菌和腐败梭菌毒素分别达到3及以上(0.1mL免疫动物血清中和3及以上MLD毒素)和1及以上(0.1mL免疫动物血清中和1及以上MLD毒素)，即判为合格。

免疫攻毒法：用体重1.5～2.0kg健康家兔12只，分为两组，分组6只，其中每组的4只家兔颈部皮下或肌肉注射疫苗2.0mL，接种后14～21日，分别静脉注射1MLD的D型产气荚膜梭菌和腐败梭菌毒素，观察3～5日。对照组家兔应该全部死亡，免疫组家兔至少保护3只。

实施例

以下实施例为更好说明本发明的技术方案，但不对本发明技术方案构成限制。

实施例1

——大肠埃希氏菌BL/EC株的构建及鉴定

1.基因合成

本申请根据产气荚膜梭菌ETX和腐败梭菌CSA的天然基因序列，经密码子优化后，将含有3个氨基酸突变(Y30A，H106P和Y196A)的ETX编码基因、含有4个氨基酸突变(C54L，N264A，H269A和W310A)和11个氨基酸缺失的CSA编码基因进行串联。同时，在融合蛋白C端添加6×His标签的编码基因。用化学合成的方法，合成了该段基因序列GETX_m3CSA_M4△11，共包含2166个核苷酸，对应的蛋白被称为rETX_m3CSA_M4△11。具体的核酸序列如SEQ ID No.1所示，氨基酸序列见SEQ ID No.2所示。

序列1：

序列2：

2.表达rETX_m3CSA_M4△11的原核表达载体的构建

以人工合成的GETX_m3CSA_M4△11为模板，采用引物对1F/1R(序列3/序列4)进行PCR扩增。

其中上游引物1F序列为：

5’-ggcatatgaa agaaatctcc aac-3’23(序列3)，其5’端引入限制性内切酶NdeⅠ位点及保护性碱基；

下游引物1R序列为：

5’-ggaagctttt agtggtgatg at-3’22(序列4)，其5’端引入限制性内切酶HindIII位点及保护性碱基。

PCR体系为：(Mg2+plus)10μL，dNTPs 4μL，上、下游引物各1μL，聚合酶1μL，DNA模板2μL，补充ddH₂O至50μL体系。PCR反应条件为：98℃预变性1min；98℃变性10s，56℃退火30s，72℃延伸2min，30s，共33个循环；最后72℃延伸10min。

扩增得到的目的DNA条带，经回收后，采用NdeⅠ/HindIII双酶切消化，与经过相同酶切消化的pET30a载体连接，得到插入GETX_m3CSA_M4△11基因阳性克隆pET30a-ETX_m3CSA_M4△11。将连接好的质粒转化DH5α感受态细胞，挑取单克隆至含有卡那霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜，提取质粒备用。

3.表达rETX_m3CSA_M4△11的基因工程菌BL/EC株的构建

将提取得到的质粒，转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，挑取单克隆至含有卡那霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜，经PCR鉴定，含有目的DNA片段后，命名为大肠埃希氏菌BL/EC株，并加入等体积的50％甘油LB，-70℃冻存。

4.rETX_m3CSA_M4△11的表达与鉴定

将大肠埃希氏菌BL/EC株接种于3mL含有卡那霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养4h后，加入终浓度为0.5M的IPTG溶液诱导培养4h。菌液培养完成后离心收集菌体，按每克菌体加10mL裂解液[0.02mol/L Tris缓冲液(pH值7.2)，0.3mol/L NaCl]的比例重悬菌体，在冰水浴中超声破解菌体30min，破碎条件为：工作9s，间歇9s，超声功率为400W。将破解后的菌液于4℃，以12000r/min离心30min，弃去沉淀，收集上清液。取30μL上清加入10μL的4×SDS-PAGE上样缓冲液，70℃作用10min，进行12％SDS-PAGE电泳，结果见图1。从图1可以看出，rETX_m3CSA_M4△11大量存在于菌体裂解液的上清中，呈可溶性表达，表达量良好。

5.rETX_m3CSA_M4△11的Western blot鉴定

采用上述步骤中得到的融合蛋白，采用抗His抗体，对其进行Western blot鉴定，结果见图2。从图2可知，细胞上清和裂解沉淀中融合蛋白的表达比例大体相同，由于细胞裂解上清中呈可溶性表达的融合蛋白，空间结构与野生型毒素最为接近，为此，我们将对上清融合蛋白进行纯化。

6.rETX_m3CSA_M4△11的纯化将大肠埃希氏菌BL/EC株接种于1L含有卡那霉素的LB液体培养基中发酵培养，37℃振荡培养OD₆₀₀为1.2～1.6时，加入终浓度为0.5M的IPTG溶液诱导培养4h。菌液培养完成后离心收集菌体，按照步骤4中的方法收集上清。向上述步骤4收集的上清中，按照Ni-IDA亲和层析介质试剂盒的使用说明书对菌体裂解上清中呈可溶性表达的融合蛋白进行纯化，经0.22μm孔径滤膜过滤，即为初步纯化的融合蛋白。

7.rETX_m3CSA_M4△11对小鼠毒力的测定本专利根据《中华人民共和国兽药典》(2015年版)三部(中国兽药典委员会，中华人民共和国兽药典，二〇一五年版三部，中国农业出版社，2016，以下称《中国兽药典》)中的规定，选择尾静脉注射的方法来检测融合蛋白对小鼠的毒力。同时，设置蛋白洗脱液、胃肝肉酶消化汤两个阴性对照和无突变的重组ETX(rETX)和CSA(rCSA)作为阳性对照。结果显示，当融合蛋白的接种剂量为100μg时，所有小鼠均健活且无不良反应，而rETX和rCSA分别在接种0.005μg和0.04688μg时即可导致小鼠5/5死亡。该结果表明，rETX_m3CSA_M4△11在小鼠体内是无毒的，被确定为无毒融合蛋白。

表1 rETX_m3CSA_M4△11对小鼠的毒力

8.rETX_m3CSA_M4△11的免疫原性试验：按照《中国兽药典》规定的方法进行。

(1)血清中和法：选取对D型产气荚膜梭菌和腐败梭菌毒素毒素中和效价均小于1，即均为抗体阴性的、体重1.5～2.0kg健康家兔4只和6～12月龄、体重30～40kg的绵羊4只，各颈部皮下或肌肉注射疫苗2.0mL。接种后21日，采血，分离血清，各取0.4mL分别与D型产气荚膜梭菌毒素(含12个及以上小鼠MLD)和腐败梭菌(含4个及以上小鼠MLD)，混合后置37℃作用40min，然后静脉注射16～18g小鼠2只，0.3mL/只。同时各用同批小鼠2只，分别注射1MLD与毒素血清混合物相同的毒素作对照。检测腐败梭菌的小鼠观察3日，检测D型产气荚膜梭菌的观察1日，判定结果。

(2)免疫攻毒法：用体重1.5～2.0kg健康家兔12只，分为两组，分组6只，其中每组的4只家兔颈部皮下或肌肉注射疫苗2.0mL，接种后21日，分别静脉注射1MLD的D型产气荚膜梭菌和腐败梭菌毒素，观察3～5日。对照组家兔应该全部死亡，免疫组家兔至少保护3只。

经测定，结果如图4所示，一次免疫后，家兔血清中的毒素中和抗体效价对D型产气荚膜梭菌和腐败梭菌毒素分别达到25～35MLD(0.1mL免疫动物血清中和25～35MLD毒素)和6～10(0.1mL免疫动物血清中和6～10MLD毒素)，绵羊血清中的毒素中和抗体效价对D型产气荚膜梭菌和腐败梭菌毒素分别达到8～15MLD(0.1mL免疫动物血清中和8～15MLD毒素)和5～8(0.1mL免疫动物血清中和5～8MLD毒素)。攻毒结果显示，对照组家兔全部死亡，免疫组家兔100％保护。《中国兽药典》规定，家兔血清中的毒素抗体效价对D型产气荚膜梭菌和腐败梭菌毒素分别达到3(0.1mL免疫动物血清中和3MLD毒素)和1(0.1mL免疫动物血清中和1MLD毒素)，即判为合格。因此，本申请生产的疫苗对家兔和绵羊的一次免疫后血清中和效价均超过了现行《中国兽药典》的规定，证明该疫苗具有良好的免疫原性。

Claims

1.一种无毒产气荚膜梭菌和腐败梭菌融合蛋白疫苗，其特征在于该疫苗含大肠埃希氏菌表达的产气荚膜梭菌ε毒素(ETX)突变体和腐败梭菌α毒素(CSA)突变体的融合蛋白；制苗用菌种为表达融合蛋白的大肠埃希氏菌，被命名为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)BL/EC株，该菌株已于2019年01月11日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号：CGMCC No.17165；该疫苗用于同时预防由产气荚膜梭菌和腐败梭菌感染和引起的羊快疫和肠毒血症。

2.如权利要求1所述一种无毒产气荚膜梭菌和腐败梭菌融合蛋白疫苗，其特征在于所述融合蛋白，与野生型成熟ETX相比，含有多个氨基酸突变，优选的为以下3个氨基酸突变：第30位酪氨酸突变为丙氨酸，第106位组氨酸突变为脯氨酸，以及第196位酪氨酸突变为丙氨酸；与野生型成熟CSA相比，含有多个氨基酸突变，优选的为以下4个氨基酸突变：第54位半胱氨酸突变为亮氨酸，第264位天冬酰胺突变为丙氨酸，第269位组氨酸突变为丙氨酸，第310位色氨酸突变为丙氨酸；同时，缺失多个氨基酸，优选的为缺失11个氨基酸(第212位～第222位)。

3.如权利要求1所述一种无毒产气荚膜梭菌和腐败梭菌融合蛋白疫苗，其特征在在于所述融合蛋白的编码基因序列经过密码子优化，更易于在大肠杆菌中实现高表达。

4.如权利要求1所述一种无毒产气荚膜梭菌和腐败梭菌融合蛋白疫苗，其特征在于所述融合蛋白没有毒力，大大降低了疫苗生产过程中的生物安全风险。

5.如权利要求1所述一种无毒产气荚膜梭菌和腐败梭菌融合蛋白疫苗，其特征在于所述融合蛋白，在大肠杆菌BL21(DE3)中可以实现可溶性表达，既可最大限度地保留天然毒素的空间构象，从而保持其免疫原性；又避免了包涵体变性复性的繁琐工艺对抗原蛋白免疫原性的影响，减少了疫苗的制备时间和生产成本。

6.如权利要求1所述一种无毒产气荚膜梭菌和腐败梭菌融合蛋白疫苗，其特征在于所述融合蛋白，其C端添加便于蛋白的纯化的标签，优选为6个组氨酸(6*His)标签。

7.如权利要求1所述一种无毒产气荚膜梭菌和腐败梭菌融合蛋白疫苗的制备方法，其特征在于用所述表达融合蛋白的大肠埃希氏菌BL/EC株作为疫苗生产菌株，经发酵培养、诱导表达、菌体破碎、可溶性抗原蛋白分离纯化后，加双相油佐剂混合制成。