CN109395072B - 一种腐败梭菌α毒素基因工程疫苗及其生产方法 - Google Patents

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Abstract

本发明专利制备的腐败梭菌CSA基因工程疫苗，系采用经过密码子优化的，在含有4个氨基酸突变(C54L，N264A，H269A和W310A)的基础上缺失了11个氨基酸(第212位～第222位)的重组腐败梭菌CSA(rCSAM4Δ11)生产，即最大限度地保留天然毒素的完整性和空间构象，从而保持其免疫原性，又避免了因少数氨基酸突变带来的生物安全隐患。同时，无毒的rCSAM4Δ11能够以可溶性的形式表达，从而避免了包涵体变性复性的繁琐工艺对抗原蛋白免疫原性的影响，减少了疫苗的制备时间和生产成本。此外，该疫苗还具有免疫剂量低、免疫效力好等优点，是现行腐败梭菌毒素疫苗升级换代的理想候选疫苗。

Description

一种腐败梭菌α毒素基因工程疫苗及其生产方法
技术领域
本发明涉及一种腐败梭菌α毒素基因工程疫苗及其生产方法。属于兽用生物制品领域。
背景技术
腐败梭菌是一种能够引起人以及牛、羊、马、猪、水貂、鸡等多种动物发病的厌氧菌，对人类的健康和畜禽养殖业危害极大，羊经由消化道感染该菌，引起的羊快疫(Braxy)是一种常见、多发、非接触、急性和致死性传染病。由于腐败梭菌引起的疾病病程短促，如不及时对症治疗，动物会迅速死亡，而免疫接种是预防这类疫病最有效的途径。目前，使用的商品化疫苗主要为灭活疫苗，在预防动物腐败梭菌所致疾病方面虽然取得了一定的效果，但这些疫苗在使用过程中仍然暴露了一些缺陷，例如疫苗免疫易引起动物局部炎症及毒性反应等；其在制备过程中涉及外毒素的灭活，存在毒素外泄或灭活不彻底等生物安全隐患；此外，培养上清中的各种微小毒素以及细菌的代谢产物往往成为免疫动物的致敏原，接种动物易产生不良反应，导致免疫效果下降甚至免疫失败。因此，开发安全性好、有效抗原含量高、免疫原性强的腐败梭菌毒素基因工程疫苗，是未来的发展方向。
在腐败梭菌分泌的多种毒力因子中，α毒素(CSA)是一种关键的致死性毒力因子，并且与致病性有直接的关系。CSA由440或443个氨基酸构成，主要分为D1、D2和D3三个结构域。其中，D1结构域是一个复杂的多功能结构域，在受体结合，寡聚化和孔形成过程中均发挥作用，该结构域内45个关键性氨基酸位点突变的突变体中，有17种突变体丧失细胞溶血活性，而细胞结合活性则各不相同。根据上述的研究内容，本课题组前期申请的专利“一种腐败梭菌CSA重组亚单位疫苗及其生产方法”(申请号或专利号：201710981433.3)获得了含有4个氨基酸突变(第54位半胱氨酸突变为亮氨酸C54L，第264位天冬酰胺突变为丙氨酸N264A，第269位组氨酸突变为丙氨酸H269A，第310位色氨酸突变为丙氨酸W310A)的CSA重组蛋白(rCSAM4)，结果显示，rCSAM4以非可溶(包涵体)形式表达，经纯化复性的rCSAM4毒力基本丧失，但仍保留了较好的免疫原性。D2结构域主要参与孔形成过程，而D3结构域主要参与毒素分子的寡聚化。已有的研究发现，删除位于D2区的双亲性β发夹跨膜区内的11个氨基酸(第212位～第222位)不会明显改变CSA的正常折叠，但使CSA完全丧失细胞毒性和其在腐败梭菌病中的作用，而该重组毒素的抗原性未得到验证。
发明内容
本发明目的在于制备出腐败梭菌CSA基因工程疫苗，用于预防由腐败梭菌感染引起的疾病。
本发明技术方案
1.一种腐败梭菌CSA基因工程疫苗，其特征在于所述疫苗含有采用大肠埃希氏菌表达的重组CSA；制苗用菌种为重组表达CSA的大肠埃希氏菌被命名为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)BLc1株，该菌株已于2018年01月18日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCC No.15236。
2.本发明所述腐败梭菌CSA基因工程疫苗，其特征在于所述重组CSA，与野生型CSA成熟毒素相比，含有4个氨基酸突变，分别是：第54位半胱氨酸突变为亮氨酸，第264位天冬酰胺突变为丙氨酸，第269位组氨酸突变为丙氨酸，第310位色氨酸突变为丙氨酸；与野生型CSA成熟毒素相比，含有第212位～第222位共11个氨基酸的缺失，同时，在C末端加上6个组氨酸标签。
3.本发明所述腐败梭菌CSA基因工程疫苗，其特征在于所述重组CSA，其重组表达载体的基因序列经过密码子优化，更易于在大肠杆菌中实现高效表达与可溶性表达。
4.本发明所述腐败梭菌CSA基因工程疫苗，其特征在于所述重组CSA同时失去细胞结合活性和细胞穿孔活性，从而成为无毒突变体，大大降低了疫苗生产过程中的生物安全风险。
5.本发明所述腐败梭菌CSA基因工程疫苗，其特征在于所述重组CSA，其C末端含有6个组氨酸(6*His)标签，便于蛋白的纯化。
6.本发明所述腐败梭菌CSA基因工程疫苗的制备方法，其特征在于用所述表达CSA重组蛋白的大肠埃希氏菌BLc1株作为疫苗生产菌株，经发酵培养、诱导表达、菌体破碎、上清分离纯化后，加双相油乳佐剂混合制成。
本发明具体实施方式
1.腐败梭菌CSA基因工程疫苗的制备
(1)菌种：制苗用菌种为重组表达腐败梭菌CSA的大肠埃希氏菌BLc1株，该菌种表达的腐败梭菌CSA同时含有4个氨基酸位点的突变(C54L，N264A，H269A和W310A)和11个氨基酸的缺失(第212位～第222位)，且重组蛋白的C末端添加了6个组氨酸标签。该菌株已于2018年01月18日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCC No.15236；由中国兽医药品监察所鉴定、保管和供应。
(2)一级种子繁殖及鉴定：将冻干菌种用少量LB液体培养基融解，划线接种于含卡那霉素的LB固体平板，置37℃培养12～16h，选取符合标准的单个菌落，接种含卡那霉素的LB液体培养基，置37℃培养8～12h，与50％甘油等比例混合后分装，经纯粹检验合格后，作为制苗用一级种子。
(3)二级种子繁殖及鉴定：取一级种子，按1％的量接种含卡那霉素的LB液体培养基，置37℃振荡培养8～12h，即为二级种子。
(4)制苗用抗原制备：取合格的二级种子，按培养基总量的2％接种含卡那霉素的LB液体培养基，发酵罐内培养。设置培养参数为：培养温度37℃，pH值7.0，溶氧40％。当培养物OD600值为10～15时，加入终浓度为0.5mmol/L的IPTG诱导培养4h。
(5)破菌：离心收集菌体，按每克菌体湿重加10mL裂解液(pH值7.2、0.02mol/LTris缓冲液，0.3mol/L NaCl)的比例重悬菌体，4℃条件下用低温高压均质机以800bar的压力破碎菌体3次。裂解液经4℃10000r/min离心30min，弃去沉淀，收集上清液。
(6)纯化：按向收集的上清中加入饱和硫酸铵至30％饱和度，充分混合，2～8℃静置4h，离心收集沉淀。用与硫酸铵沉淀前上清等体积的缓冲液(pH值6.0、0.01mol/L磷酸缓冲液)重悬沉淀，离心后收集上清，经0.22μm孔径滤膜过滤。
(7)蛋白含量检测：用BCA法检测蛋白含量。应不低于0.4mg/mL。经SDS-PAGE检测并对条带进行灰度扫描，蛋白纯度应不低于60％。
(8)无菌检验：按现行《中国兽药典》(中国兽药典委员会，中华人民共和国兽药典，二〇一五年版三部，中国农业出版社，2011，以下称《中国兽药典》)附录进行。应无菌生长。
(7)疫苗配制：将双相油佐剂(如201佐剂)导入油相罐内，以至少121℃高压灭菌30min，冷却至室温备用。根据蛋白含量测定结果，用PBS(pH值7.2、0.01mol/L)将检验合格的纯化蛋白适当稀释后混匀。将水相加入乳化罐内，以80～100r/min搅拌，同时按1:1(V/V)的比例，缓慢加入油相，加完后搅拌20～30min。乳化后取样进行检验，合格后分装。
2.腐败梭菌CSA基因工程疫苗的检验
(1)性状
外观 乳白色乳剂。
剂型 呈水包油包水型(W/O/W)。取一清洁吸管，吸取少量疫苗滴于清洁冷水表面，应呈云雾状扩散。
稳定性 吸取疫苗10mL加入离心管中，以3000r/min离心15min，应不破乳，并且管底析出的水相应不多于0.5mL。
黏度 按《中国兽药典》附录进行测定，应符合规定。
(2)装量检查 按《中国兽药典》附录进行检查，应符合规定。
(3)无菌检验 按《中国兽药典》附录进行检验，应无菌生长。
(4)安全检验 用体重1.5～2.0kg健康家兔4只，各肌肉或皮下注射疫苗4.0mL，观察10日。应全部健活。
(5)效力检验 用体重1.5～2.0kg健康家兔4只，各颈部皮下或肌肉注射疫苗2.0mL。接种后14日，采血，分离血清。同时，以相同剂量、相同途径对家兔进行二次免疫。二免后21日，采血，分离血清。采用下述方法，分别对一次免疫和二次免疫后，家兔血清中的毒素中和抗体效价进行测定：
将4只免疫家兔的血清等量混合，取混合血清0.4mL与0.8mL腐败梭菌毒素(含4个小鼠MLD)，混合后置37℃作用40min，然后静脉注射16～18g小鼠2只，0.3mL/只。同时各用同批小鼠2只，分别注射1个小鼠MLD的腐败梭菌毒素作对照。观察3日，判定结果。
对照鼠全部死亡，血清中和效价对腐败梭菌毒素达到1(0.1mL免疫动物血清中和1个小鼠MLD的腐败梭菌毒素)，即判为合格。
附图说明
图1：rCSAM4Δ11基因工程重组菌的SDS-PAGE鉴定结果，M1:Protein marker；PC1:BSA(1μg)；PC2:BSA(2μg)；pET:空载体pET30a，37℃、4h诱导的细胞裂解物；1:目的质粒，15℃、16h诱导的细胞裂解物；2:目的质粒，37℃、4h诱导的细胞裂解物；pET1:空载体pET30a，37℃、4h诱导的细胞裂解上清；pET2:空载体pET30a，37℃、4h诱导的细胞裂解沉淀；3:目的质粒，15℃、16h诱导的细胞裂解上清；4:目的质粒，15℃、16h诱导的细胞裂解沉淀；5:目的质粒，37℃、4h诱导的细胞裂解上清；6:目的质粒，37℃、4h诱导的细胞裂解沉淀。
图2：rCSAM4Δ11基因工程重组菌的Western blot(采用抗His抗体)鉴定结果图中：M2:Western blot marker；pET:空载体pET30a，37℃、4h诱导的细胞裂解物；1:目的质粒，15℃、16h诱导的细胞裂解物；2:目的质粒，37℃、4h诱导的细胞裂解物；pET1:空载体pET30a，37℃、4h诱导的细胞裂解上清；pET2:空载体pET30a，37℃、4h诱导的细胞裂解沉淀；3:目的质粒，15℃、16h诱导的细胞裂解上清；4:目的质粒，15℃、16h诱导的细胞裂解沉淀；5:目的质粒，37℃、4h诱导的细胞裂解上清；6:目的质粒，37℃、4h诱导的细胞裂解沉淀。
图3：rCSA基因工程重组菌的SDS-PAGE鉴定结果，M1:Protein marker；PC1:BSA(1μg)；PC2:BSA(2μg)；pET:空载体pET30a，37℃、4h诱导的细胞裂解物；1:目的质粒，15℃、16h诱导的细胞裂解物；2:目的质粒，37℃、4h诱导的细胞裂解物；pET1:空载体pET30a，37℃、4h诱导的细胞裂解上清；pET2:空载体pET30a，37℃、4h诱导的细胞裂解沉淀；3:目的质粒，15℃、16h诱导的细胞裂解上清；4:目的质粒，15℃、16h诱导的细胞裂解沉淀；5:目的质粒，37℃、4h诱导的细胞裂解上清；6:目的质粒，37℃、4h诱导的细胞裂解沉淀。
图4：rCSA基因工程重组菌的Western blot(采用抗His抗体)鉴定结果图中：M2:Western blot marker；pET:空载体pET30a，37℃、4h诱导的细胞裂解物；1:目的质粒，15℃、16h诱导的细胞裂解物；2:目的质粒，37℃、4h诱导的细胞裂解物；pET1:空载体pET30a，37℃、4h诱导的细胞裂解上清；pET2:空载体pET30a，37℃、4h诱导的细胞裂解沉淀；3:目的质粒，15℃、16h诱导的细胞裂解上清；4:目的质粒，15℃、16h诱导的细胞裂解沉淀；5:目的质粒，37℃、4h诱导的细胞裂解上清；6:目的质粒，37℃、4h诱导的细胞裂解沉淀。
本发明涉及生物材料资源信息
本发明涉及的微生物为：同时含有4个氨基酸的突变(C54L，N264A，H269A和W310A)和11个氨基酸的缺失(第212位～第222位丙氨酸)，且重组蛋白的C末端添加了6个组氨酸标签的重组表达腐败梭菌CSA的大肠埃希氏菌BLc1株。该菌株已于2018年01月18日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCC No.15236。
本发明的积极意义
本发明涉及一种腐败梭菌CSA基因工程疫苗及其生产方法。本发明将野生型腐败梭菌CSA成熟毒素的4个氨基酸进行突变(C54L，N264A，H269A和W310A)，并缺失第212～222位的氨基酸，使毒素同时失去细胞结合活性和细胞穿孔活性，从而获得了对于动物体无毒的CSA突变体rCSAM4Δ11。同时，在重组蛋白的C末端加上6个组氨酸标签，作为制苗用抗原。本发明进一步公开了含有所述CSA无毒突变体编码基因的重组表达载体和重组宿主细胞。与本课题组前期申请的专利“一种腐败梭菌CSA重组亚单位疫苗及其生产方法”(申请号或专利号：201710981433.3)获得的rCSAM4相比，无毒的rCSAM4Δ11能够以可溶性的形式表达，从而避免了包涵体变性复性的繁琐工艺对抗原蛋白免疫原性的影响，减少了疫苗的制备时间和生产成本。此外，rCSAM4Δ11在家兔模型中呈现良好的免疫原性和免疫保护性，效果明显高于rCSAM4。本发明的rCSAM4Δ11或其编码基因能够应用于制备预防腐败梭菌的CSA亚单位疫苗。采用本发明提出的腐败梭菌CSA基因工程疫苗，较我国目前商品化的腐败梭菌CSA灭活疫苗具有明显的优势，不但大大降低了疫苗生产过程中的生物安全风险，而且所制备的疫苗效力远高于现有疫苗。此外，凭借疫苗半成品蛋白浓度高的优势，在与其它抗原共同制备联苗时，无需增大联苗的使用剂量，即可制备联苗，极大方便了联苗的开发。
实施例
以下实施例为更好说明本发明的技术方案，但不对本发明技术方案构成限制。
实施例1
——同时含有4氨基酸突变和11氨基酸缺失的CSA突变体(rCSAM4Δ11)表达载体的构建、表达及鉴定
1.基因合成
本申请根据天然CSA的基因序列，经密码子优化后，设计了4个氨基酸的突变(C54L，N264A，H269A和W310A)和11个氨基酸(第212～222位)的缺失，从而获得了对于动物体无毒的rCSAM4Δ11。同时，重组蛋白的C末端加上6个组氨酸标签。用化学合成的方法，合成了该段基因序列，共包含1221个核苷酸。其中，第1～1200位为CSA成熟毒素序列(含4个氨基酸的突变和11个氨基酸的缺失)，第1201～1218位为6个组氨酸标签序列。具体的核酸序列如SEQ ID No.1所示，氨基酸序列见SEQ ID No.2所示。
Figure BDA0001846390740000061
Figure BDA0001846390740000071
Figure BDA0001846390740000081
2.非融合表达载体的构建
以人工合成的CSA基因为模板，采用引物对1F/1R(序列3/序列4)进行PCR扩增。
其中上游引物1F序列为：
5’-cgccatatga ctaatctgga ggaag-3’25(序列3)，其5’端引入限制性内切酶NdeⅠ位点及保护性碱基；
下游引物1R序列为：
5’-ccgaagcttt tagtggtgat gatg-3’24(序列4)，其5’端引入限制性内切酶Hindш位点及保护性碱基。
PCR体系为：
Figure BDA0001846390740000082
(Mg2+plus)10μL，dNTPs 4μL，上、下游引物各1μL，
Figure BDA0001846390740000091
聚合酶1μL，DNA模板2μL，补充dd H2O至50μL体系。PCR反应条件为：98℃预变性1min；98℃变性10s，56℃退火30s，72℃延伸2min，共33个循环；最后72℃环延伸10min。
扩增得到的目的DNA条带，经回收后，采用NdeⅠ/Hindш双酶切消化，与经过相同酶切消化的pET30a载体连接，得到插入腐败梭菌CSA突变体基因的阳性克隆pET30-CSAM4Δ11。将连接好的质粒转化DH5α感受态细胞，挑取单克隆至含有卡那霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜，提取质粒备用。
3.重组表达rCSAM4Δ11的基因工程菌株的构建
将提取的质粒，转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，挑取单克隆至含有卡那霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜，经PCR鉴定含有目的DNA片段后，命名为大肠埃希氏菌(E.coli)BLc1株，并加入等体积的50％甘油LB，-70℃冻存，该菌株已于2018年01月18日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCC No.15236(本发明中该菌株又称为：腐败梭菌CSA的4氨基酸突变和11氨基酸缺失突变体)。
4.目的蛋白的表达与鉴定
将重组表达rCSAM4Δ11的基因工程菌大肠埃希氏菌(E.coli)BLc1株接种于100mL含有卡那霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养4h后，加入终浓度为0.5mmol/L的IPTG溶液诱导培养4h。菌液培养完成后离心收集菌体，按每克菌体加10mL裂解液[0.02mol/L Tris缓冲液(pH值7.2)，0.3mol/L NaCl]的比例重悬菌体，在冰水浴中超声破碎菌体30min，破碎条件为：工作9s，间歇9s，超声功率为400W。将破碎后的菌液于4℃，以12000r/min离心30min，弃去沉淀，收集上清液。取30μL上清加入10μL的4×SDS-PAGE上样缓冲液，70℃作用10min，进行12％SDS-PAGE电泳，结果见图1。从图1可以看出，rCSAM4Δ11大量存在于菌体裂解液的上清中，呈可溶性表达，表达量良好，表达量可达30mg/L。目的蛋白的最适诱导表达条件为37℃，诱导表达4h。
5.rCSAM4Δ11的Western blot鉴定
采用上述步骤中不同诱导条件下的目的蛋白表达产物，采用抗His抗体，对rCSAM4Δ11进行Western blot鉴定，结果见图2。从图2可知，37℃、4h诱导的细胞上清和裂解沉淀中rCSAM4Δ11的表达比例大体相同，由于细胞裂解上清中呈可溶性表达的目的蛋白，空间结构与野生型毒素最为接近。综合SDS-PAGE和Western blot鉴定结果，进一步确定目的蛋白的最适诱导表达条件为37℃，诱导表达4h。
实施例2
——rCSAM4Δ11对小鼠的毒力试验
通过测定rCSAM4Δ11对小鼠的毒力，以验证该突变体在动物体内的实际减毒效果。将rCSAM4Δ11以及无氨基酸突变的重组CSA(rCSA)，分别以不同的剂量，经尾静脉接种16～18g小鼠，每剂量注射5只，0.2mL/只。结果当接种剂量为0.1mg时，所有小鼠均健活且无不良反应，而rCSA在接种46.88ng时即可导致小鼠5/5死亡。该结果表明，rCSAM4Δ11在小鼠体内是无毒的，被确定为CSA无毒突变体。
表1 rCSAM4Δ11对小鼠的毒力
Figure BDA0001846390740000101
实施例3
——rCSAM4Δ11的免疫原性试验
(1)菌液培养：将重组表达rCSAM4Δ11的大肠埃希氏菌BLc1株培养菌液，按培养基总量的2％接种含卡那霉素的LB液体培养基，发酵罐内培养。设置培养参数为：培养温度37℃，pH值7.0，溶氧40％。当培养物OD600值为10～15时，加入终浓度为0.5mmol/L的IPTG诱导培养4h。
(2)破菌：离心收集菌体，按每克菌体湿重加10mL裂解液(pH值7.2、0.02mol/LTris缓冲液，0.3mol/L NaCl)的比例重悬菌体，4℃的条件下用低温高压均质机以800bar的压力破碎菌体3次。裂解液经4℃10000r/min离心30min，弃去沉淀，收集上清液。
(3)纯化：按向收集的上清中加入饱和硫酸铵至30％饱和度，充分混合，2～8℃静置4h，离心收集沉淀。用与硫酸铵沉淀前上清等体积的缓冲液(pH值6.0、0.01mol/L磷酸缓冲液)重悬沉淀，离心后收集上清，经0.22μm孔径滤膜过滤。
(4)蛋白含量检测：用BCA法检测蛋白含量。结果蛋白含量为5.6mg/mL。经SDS-PAGE检测并对条带进行灰度扫描，蛋白纯度为73％。
(5)无菌检验：按现行《中国兽药典》附录进行。结果均无菌生长。
(6)疫苗配制：将双相油佐剂(如201佐剂)导入油相罐内，以至少121℃高压灭菌30min，冷却至室温备用。根据蛋白含量测定结果，用PBS(pH值7.2、01mol/L)将检验合格的纯化蛋白稀释至终浓度为50μg/mL后混匀。将水相加入乳化罐内，以80～100r/min搅拌，同时按1:1(V/V)的比例，缓慢加入油相，加完后搅拌20～30min。乳化后取样进行检验，合格后分装。
(7)免疫原性试验：按照《中国兽药典》规定的方法进行。具体试验方法为：用体重1.5～2.0kg健康家兔4只，各颈部皮下或肌肉注射疫苗2.0mL。接种后14日，采血，分离血清。同时，以相同剂量、相同途径对家兔进行二次免疫。二免后21日，采血，分离血清。采用下述方法，分别对一次免疫和二次免疫后，家兔血清中的毒素抗体效价进行测定：
将4只免疫家兔的血清等量混合，取混合血清0.4mL与0.8mL腐败梭菌CSA(含4个小鼠MLD)，混合后置37℃作用40min，然后静脉注射16～18g小鼠2只，0.3mL/只。同时各用同批小鼠2只，分别注射1个小鼠MLD的腐败梭菌毒素作对照。观察3日，判定结果。若对照鼠全部死亡，血清中和效价对腐败梭菌CSA达到1(0.1mL免疫动物血清中和1个小鼠MLD的腐败梭菌毒素)，即判为合格。
经测定，一次免疫后，家兔血清中的毒素中和抗体效价为12(即0.1mL家兔血清可中和12个小鼠MLD的腐败梭菌毒素)；二次免疫后，家兔血清中的毒素中和抗体效价为40(即0.1mL家兔血清可中和40个小鼠MLD的腐败梭菌毒素)。
《中国兽药典》规定，家兔血清中的毒素中和抗体效价对腐败梭菌毒素达到1，即可判为疫苗中腐败梭菌毒素部分为合格。因此，本申请生产的疫苗，在抗原含量低至50μg/mL的情况下，无论是对家兔一次免疫，还是二次免疫，均超过了现行《中国兽药典》的规定，证明该疫苗具有良好的免疫原性。
鉴于我国现有商品化梭菌毒素疫苗须采用甲醛灭活脱毒，存在生物安全隐患，也影响了疫苗在田间使用的安全性；同时现行商品化疫苗在生产过程中，还存在产毒不稳定，导致疫苗效力不稳定的问题。因此，本申请生产的疫苗是我国现行腐败梭菌灭活疫苗升级换代的理想候选疫苗。
实施例4
——腐败梭菌CSA无氨基酸突变重组蛋白(rCSA)表达载体的构建、表达、鉴定及毒力和免疫原性分析。
1.基因合成
本申请根据天然CSA的基因序列，经密码子优化后，从而获得了重组腐败梭菌CSA，rCSA。同时，在重组蛋白的C末端加上6个组氨酸标签。用化学合成的方法，合成了该段基因序列，共包含1254个核苷酸。其中，第1～1233位为CSA成熟毒素序列，第1234～1251位为6个组氨酸标签序列。具体的核酸序列如SEQ ID No.5所示，氨基酸序列见SEQ ID No.6所示。
2.非融合表达载体的构建
以人工合成的CSA基因为模板，采用引物对1F/1R(序列3/序列4)进行PCR扩增。
其中上游引物1F序列为：
5’-cgccatatga ctaatctgga ggaag-3’25(序列3)，其5’端引入限制性内切酶NdeⅠ位点及保护性碱基；
下游引物1R序列为：
5’-ccgaagcttt tagtggtgat gatg-3’24(序列4)，其5’端引入限制性内切酶Hindш位点及保护性碱基。
PCR体系为：
Figure BDA0001846390740000121
(Mg2+plus)10μL，dNTPs 4μL，上、下游引物各1μL，
Figure BDA0001846390740000122
聚合酶1μL，DNA模板2μL，补充dd H2O至50μL体系。PCR反应条件为：98℃预变性1min；98℃变性10s，56℃退火30s，72℃延伸2min，共33个循环；最后72℃环延伸10min。
扩增得到的目的DNA条带，经回收后，采用NdeⅠ/Hindш双酶切消化，与经过相同酶切消化的pET30a载体连接，得到插入腐败梭菌CSA基因的阳性克隆pET30-CSA。将连接好的质粒转化DH5α感受态细胞，挑取单克隆至含有卡那霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜，提取质粒备用。
3.重组表达CSA的基因工程菌株的构建
将提取得到的质粒，转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，挑取单克隆至含有卡那霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜，经PCR鉴定含有目的DNA片段后，命名为大肠埃希氏菌(E.coli)BL/CSA株，并加入等体积的50％甘油LB，-70℃冻存(本发明中该菌株又称为：重组腐败梭菌CSA菌)。
4.目的蛋白的表达与鉴定
将重组表达CSA的基因工程菌大肠埃希氏菌(E.coli)BL/CSA株接种于100mL含有卡那霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养4h后，加入终浓度为0.5mmol/L的IPTG溶液诱导培养4h。菌液培养完成后离心收集菌体，按每克菌体加10mL裂解液[0.02mol/L Tris缓冲液(pH值7.2)，0.3mol/L NaCl]的比例重悬菌体，在冰水浴中超声破碎菌体30min，破碎条件为：工作9s，间歇9s，超声功率为400W。将破碎后的菌液于4℃，以12000r/min离心30min，弃去沉淀，收集上清液。取30μL上清加入10μL的4×SDS-PAGE上样缓冲液，70℃作用10min，进行12％SDS-PAGE电泳，结果见图3。从图3可以看出，rCSA大量存在于菌体裂解液的上清中，呈可溶性表达，表达量良好，表达量可达10mg/L。目的蛋白的最适诱导表达条件为37℃，诱导表达4h。
5.rCSA的Western blot鉴定
采用上述步骤中不同诱导条件下的目的蛋白表达产物，采用抗His抗体，对rCSA进行Western blot鉴定，结果见图4。从图4可知，37℃、4h诱导的细胞上清和裂解沉淀中rCSA的表达比例大体相同，由于细胞裂解上清中呈可溶性表达的目的蛋白，空间结构与野生型毒素最为接近。综合SDS-PAGE和Western blot鉴定结果，进一步确定目的蛋白的最适诱导表达条件为37℃，诱导表达4h。
6.rCSA的纯化向上述步骤4收集的上清中，加入饱和硫酸铵至30％饱和度，充分混合，2～8℃静置4h，离心收集沉淀。用与硫酸铵沉淀前上清等体积的缓冲液(0.01mol/L磷酸缓冲液(pH值6.0))重悬沉淀，离心后收集上清，经0.22μm孔径滤膜过滤，即为初步纯化的目的蛋白。
7.rCSA对小鼠毒力的测定本专利根据《中华人民共和国兽药典》(2015年版)三部(中国兽药典委员会，中华人民共和国兽药典，二〇一五年版三部，中国农业出版社，2015，以下称《中国兽药典》)中的规定，选择尾静脉注射的方法来检测重组蛋白对小鼠的毒力。首先设置6μg、3μg和1.5μg三个剂量梯度，根据小鼠的存活状况再进行倍比稀释。同时，设置蛋白洗脱液、胃肝肉酶消化汤两个阴性对照和1个小鼠MLD的腐败梭菌毒素作为阳性对照。结果显示，以6μg、3μg以及1.5μg的rcsa三个剂量注射组的5只小鼠在10min之内全部死亡，随后，对1.5μg的剂量组作2倍系列稀释，并测定各稀释度对小鼠的毒力，0.04688μg的rCSA注射组的5只小鼠在3d内全部死亡，而0.02344μg的rCSA注射组小鼠在3d内死亡2只。为此，我们判定rCSA对ICR小鼠的MLD约为1.302～1.465μg.kg-1。
8.rCSA的免疫原性试验：按照《中国兽药典》规定的方法进行。rCSA在制备疫苗前，采用终浓度为0.8％的多聚甲醛溶液脱毒，并验证脱毒效果。具体试验方法为：用体重1.5～2.0kg健康家兔4只，各颈部皮下或肌肉注射疫苗2.0mL。接种后14日，采血，分离血清。同时，以相同剂量、相同途径对家兔进行二次免疫。二免后21日，采血，分离血清。采用下述方法，分别对一次免疫和二次免疫后，家兔血清中的毒素中和抗体效价进行测定：
将4只免疫家兔的血清等量混合，取混合血清0.4mL与0.8mL腐败梭菌毒素(含4个小鼠MLD)，混合后置37℃作用40min，然后静脉注射16～18g小鼠2只，0.3mL/只。同时各用同批小鼠2只，分别注射1个小鼠MLD的腐败梭菌毒素作对照。观察3日，判定结果。若对照鼠全部死亡，血清中和效价对腐败梭菌毒素达到1(0.1mL免疫动物血清中和1个小鼠MLD的腐败梭菌毒素)，即判为合格。
经测定，一次免疫后，家兔血清中的毒素中和抗体效价为10(即0.1mL家兔血清可中和10个小鼠MLD的腐败梭菌毒素)；二次免疫后，家兔血清中的毒素中和抗体效价为36(即0.1mL家兔血清可中和36个小鼠MLD的腐败梭菌毒素)。
序列表
<110> 中国兽医药品监察所
<120> 一种腐败梭菌α毒素基因工程疫苗及其生产方法
<141> 2018-10-30
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1221
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<220>
<221> allele
<222> ()..()
<223> 对人工序列的描述：rCSAM4△11的核苷酸序列
<400> 1
actaatctgg aggaaggtgg ttacgcgaat cataacaacg catctagcat taagatcttc 60
ggctacgaag ataacgagga tctgaaagcc aagatcattc aggacccaga gttcattcgc 120
aactgggcaa acgtggcaca cagcctgggt ttcggttggc tgggtggcac cgcgaaccca 180
aacgtgggcc agggtttcga gttcaaacgc gaggttggtg caggtggcaa ggtgtcctac 240
ctgctgtctg ctcgctataa cccaaacgac ccgtacgcca gcggttatcg tgctaaagat 300
cgcctgtcca tgaagatttc taacgtgcgt ttcgttatcg acaacgattc tatcaaactg 360
ggcactccga aggttaagaa actggctccg ctgaacagcg ccagcttcga tctgattaac 420
gagagcaaga ccgagtctaa actgtccaag acctttaact acactacctc taagaccgtg 480
tccaagactg acaacttcaa attcggcgag aagatcggcg taaagacctc tttcaaggta 540
ggtctggaag ctatcgctga cagcaaagtg tggtccaata ccaactctac taccgaaacc 600
aaacaggagt ccactactta cactgcgact gtttctccgc aaactaagaa acgtctgttt 660
ctggacgtac tgggcagcca gattgacatt ccatacgaag gtaagatcta catggaatac 720
gacatcgaac tgatgggctt tctgcgctat actggtgcgg cacgtgaaga tgcaactgag 780
gaccgtccaa ccgtgaaact gaaattcggc aagaacggta tgtctgctga agagcatctg 840
aaagacctgt attctcacaa gaacatcaac ggctatagcg aatgggattg gaaagctgtt 900
gatgagaagt ttggctacct gtttaagaac tcctatgatg ctctgaccag ccgcaagctg 960
ggtggcatta tcaaaggttc cttcaccaac atcaacggta ctaagatcgt tatccgtgaa 1020
ggcaaagaaa ttccgctgcc ggacaagaaa cgtcgtggca aacgctctgt agattctctg 1080
gacgcacgtc tgcaaaatga aggtatccgt attgagaaca ttgaaaccca ggacgtgcca 1140
ggtttccgcc tgaactctat cacctacaac gataagaaac tgattctgat caacaacatc 1200
catcaccatc atcaccacta a 1221
<210> 2
<211> 406
<212> PRT
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<220>
<221> CONFLICT
<222> ()..()
<223> 对人工序列的描述：rCSAM4△11的氨基酸序列
<400> 2
Thr Asn Leu Glu Glu Gly Gly Tyr Ala Asn His Asn Asn Ala Ser Ser
1 5 10 15
Ile Lys Ile Phe Gly Tyr Glu Asp Asn Glu Asp Leu Lys Ala Lys Ile
20 25 30
Ile Gln Asp Pro Glu Phe Ile Arg Asn Trp Ala Asn Val Ala His Ser
35 40 45
Leu Gly Phe Gly Trp Leu Gly Gly Thr Ala Asn Pro Asn Val Gly Gln
50 55 60
Gly Phe Glu Phe Lys Arg Glu Val Gly Ala Gly Gly Lys Val Ser Tyr
65 70 75 80
Leu Leu Ser Ala Arg Tyr Asn Pro Asn Asp Pro Tyr Ala Ser Gly Tyr
85 90 95
Arg Ala Lys Asp Arg Leu Ser Met Lys Ile Ser Asn Val Arg Phe Val
100 105 110
Ile Asp Asn Asp Ser Ile Lys Leu Gly Thr Pro Lys Val Lys Lys Leu
115 120 125
Ala Pro Leu Asn Ser Ala Ser Phe Asp Leu Ile Asn Glu Ser Lys Thr
130 135 140
Glu Ser Lys Leu Ser Lys Thr Phe Asn Tyr Thr Thr Ser Lys Thr Val
145 150 155 160
Ser Lys Thr Asp Asn Phe Lys Phe Gly Glu Lys Ile Gly Val Lys Thr
165 170 175
Ser Phe Lys Glu Thr Ser Phe Glu Phe Asn Ala Glu Gln Gly Trp Ser
180 185 190
Asn Thr Asn Ser Thr Thr Glu Thr Lys Gln Glu Ser Thr Thr Tyr Thr
195 200 205
Ala Thr Val Ser Pro Gln Thr Lys Lys Arg Leu Phe Leu Asp Val Leu
210 215 220
Gly Ser Gln Ile Asp Ile Pro Tyr Glu Gly Lys Ile Tyr Met Glu Tyr
225 230 235 240
Asp Ile Glu Leu Met Gly Phe Leu Arg Tyr Thr Gly Ala Ala Arg Glu
245 250 255
Asp Ala Thr Glu Asp Arg Pro Thr Val Lys Leu Lys Phe Gly Lys Asn
260 265 270
Gly Met Ser Ala Glu Glu His Leu Lys Asp Leu Tyr Ser His Lys Asn
275 280 285
Ile Asn Gly Tyr Ser Glu Trp Asp Trp Lys Ala Val Asp Glu Lys Phe
290 295 300
Gly Tyr Leu Phe Lys Asn Ser Tyr Asp Ala Leu Thr Ser Arg Lys Leu
305 310 315 320
Gly Gly Ile Ile Lys Gly Ser Phe Thr Asn Ile Asn Gly Thr Lys Ile
325 330 335
Val Ile Arg Glu Gly Lys Glu Ile Pro Leu Pro Asp Lys Lys Arg Arg
340 345 350
Gly Lys Arg Ser Val Asp Ser Leu Asp Ala Arg Leu Gln Asn Glu Gly
355 360 365
Ile Arg Ile Glu Asn Ile Glu Thr Gln Asp Val Pro Gly Phe Arg Leu
370 375 380
Asn Ser Ile Thr Tyr Asn Asp Lys Lys Leu Ile Leu Ile Asn Asn Ile
385 390 395 400
His His His His His His
405
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<220>
<221> allele
<222> ()..()
<223> 对人工序列的描述：扩增GCSA△11/GCSA的上游引物1F
<400> 3
cgccatatga ctaatctgga ggaag 25
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<220>
<221> allele
<222> ()..()
<223> 对人工序列的描述：扩增GCSA△11/GCSA的下游引物1R
<400> 4
ccgaagcttt tagtggtgat gatg 24
<210> 5
<211> 1254
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<220>
<221> allele
<222> ()..()
<223> 对人工序列的描述：GCSA的核苷酸序列
<400> 5
actaatctgg aggaaggtgg ttacgcgaat cataacaacg catctagcat taagatcttc 60
ggctacgaag ataacgagga tctgaaagcc aagatcattc aggacccaga gttcattcgc 120
aactgggcaa acgtggcaca cagcctgggt ttcggttggt gcggtggcac cgcgaaccca 180
aacgtgggcc agggtttcga gttcaaacgc gaggttggtg caggtggcaa ggtgtcctac 240
ctgctgtctg ctcgctataa cccaaacgac ccgtacgcca gcggttatcg tgctaaagat 300
cgcctgtcca tgaagatttc taacgtgcgt ttcgttatcg acaacgattc tatcaaactg 360
ggcactccga aggttaagaa actggctccg ctgaacagcg ccagcttcga tctgattaac 420
gagagcaaga ccgagtctaa actgtccaag acctttaact acactacctc taagaccgtg 480
tccaagactg acaacttcaa attcggcgag aagatcggcg taaagacctc tttcaaggta 540
ggtctggaag ctatcgctga cagcaaagtg gagacttcct ttgagttcaa cgcggagcag 600
ggttggtcca ataccaactc tactaccgaa accaaacagg agtccactac ttacactgcg 660
actgtttctc cgcaaactaa gaaacgtctg tttctggacg tactgggcag ccagattgac 720
attccatacg aaggtaagat ctacatggaa tacgacatcg aactgatggg ctttctgcgc 780
tatactggta atgcacgtga agatcatact gaggaccgtc caaccgtgaa actgaaattc 840
ggcaagaacg gtatgtctgc tgaagagcat ctgaaagacc tgtattctca caagaacatc 900
aacggctata gcgaatggga ttggaaatgg gttgatgaga agtttggcta cctgtttaag 960
aactcctatg atgctctgac cagccgcaag ctgggtggca ttatcaaagg ttccttcacc 1020
aacatcaacg gtactaagat cgttatccgt gaaggcaaag aaattccgct gccggacaag 1080
aaacgtcgtg gcaaacgctc tgtagattct ctggacgcac gtctgcaaaa tgaaggtatc 1140
cgtattgaga acattgaaac ccaggacgtg ccaggtttcc gcctgaactc tatcacctac 1200
aacgataaga aactgattct gatcaacaac atccatcacc atcatcacca ctaa 1254
<210> 6
<211> 417
<212> PRT
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<220>
<221> CONFLICT
<222> ()..()
<223> 对人工序列的描述：rCSA的氨基酸序列
<400> 6
Thr Asn Leu Glu Glu Gly Gly Tyr Ala Asn His Asn Asn Ala Ser Ser
1 5 10 15
Ile Lys Ile Phe Gly Tyr Glu Asp Asn Glu Asp Leu Lys Ala Lys Ile
20 25 30
Ile Gln Asp Pro Glu Phe Ile Arg Asn Trp Ala Asn Val Ala His Ser
35 40 45
Leu Gly Phe Gly Trp Cys Gly Gly Thr Ala Asn Pro Asn Val Gly Gln
50 55 60
Gly Phe Glu Phe Lys Arg Glu Val Gly Ala Gly Gly Lys Val Ser Tyr
65 70 75 80
Leu Leu Ser Ala Arg Tyr Asn Pro Asn Asp Pro Tyr Ala Ser Gly Tyr
85 90 95
Arg Ala Lys Asp Arg Leu Ser Met Lys Ile Ser Asn Val Arg Phe Val
100 105 110
Ile Asp Asn Asp Ser Ile Lys Leu Gly Thr Pro Lys Val Lys Lys Leu
115 120 125
Ala Pro Leu Asn Ser Ala Ser Phe Asp Leu Ile Asn Glu Ser Lys Thr
130 135 140
Glu Ser Lys Leu Ser Lys Thr Phe Asn Tyr Thr Thr Ser Lys Thr Val
145 150 155 160
Ser Lys Thr Asp Asn Phe Lys Phe Gly Glu Lys Ile Gly Val Lys Thr
165 170 175
Ser Phe Lys Val Gly Leu Glu Ala Ile Ala Asp Ser Lys Val Glu Thr
180 185 190
Ser Phe Glu Phe Asn Ala Glu Gln Gly Trp Ser Asn Thr Asn Ser Thr
195 200 205
Thr Glu Thr Lys Gln Glu Ser Thr Thr Tyr Thr Ala Thr Val Ser Pro
210 215 220
Gln Thr Lys Lys Arg Leu Phe Leu Asp Val Leu Gly Ser Gln Ile Asp
225 230 235 240
Ile Pro Tyr Glu Gly Lys Ile Tyr Met Glu Tyr Asp Ile Glu Leu Met
245 250 255
Gly Phe Leu Arg Tyr Thr Gly Asn Ala Arg Glu Asp His Thr Glu Asp
260 265 270
Arg Pro Thr Val Lys Leu Lys Phe Gly Lys Asn Gly Met Ser Ala Glu
275 280 285
Glu His Leu Lys Asp Leu Tyr Ser His Lys Asn Ile Asn Gly Tyr Ser
290 295 300
Glu Trp Asp Trp Lys Trp Val Asp Glu Lys Phe Gly Tyr Leu Phe Lys
305 310 315 320
Asn Ser Tyr Asp Ala Leu Thr Ser Arg Lys Leu Gly Gly Ile Ile Lys
325 330 335
Gly Ser Phe Thr Asn Ile Asn Gly Thr Lys Ile Val Ile Arg Glu Gly
340 345 350
Lys Glu Ile Pro Leu Pro Asp Lys Lys Arg Arg Gly Lys Arg Ser Val
355 360 365
Asp Ser Leu Asp Ala Arg Leu Gln Asn Glu Gly Ile Arg Ile Glu Asn
370 375 380
Ile Glu Thr Gln Asp Val Pro Gly Phe Arg Leu Asn Ser Ile Thr Tyr
385 390 395 400
Asn Asp Lys Lys Leu Ile Leu Ile Asn Asn Ile His His His His His
405 410 415
His

Claims (2)

1.一种腐败梭菌α毒素（CSA）基因工程疫苗，其特征在于，所述疫苗含有采用大肠杆菌表达的重组腐败梭菌CSA蛋白作为抗原；
所述该重组腐败梭菌CSA蛋白同时失去了细胞结合活性和形成细胞穿孔的活性，编码该蛋白的基因序列经过了密码子优化，更易于在大肠杆菌中实现高效表达与可溶性表达，该重组蛋白为无毒突变体，大大降低了疫苗生产过程中的生物安全风险；
所述重组腐败梭菌CSA蛋白，与野生型成熟腐败梭菌CSA毒素相比，不仅含有4个氨基酸突变，所述突变为第54位半胱氨酸突变为亮氨酸，第264位天冬酰胺突变为丙氨酸，第269位组氨酸突变为丙氨酸，第310位色氨酸突变为丙氨酸，而且含有11个氨基酸的缺失，所述氨基酸的缺失为第212位～第222位；同时，在突变蛋白的C端加上6组氨酸标签便于蛋白的纯化；所述重组腐败梭菌CSA蛋白的核酸序列如SEQ ID No.1所示；
所述表达重组腐败梭菌CSA蛋白的大肠埃希氏菌被命名为大肠埃希氏菌（Escherichia coli）BLc1株；该菌株已于2018年01月18日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCCNo.15236。
2.如权利要求1所述腐败梭菌CSA基因工程疫苗的制备方法，其特征在于，用所述表达重组腐败梭菌CSA蛋白的大肠埃希氏菌BLc1株作为疫苗生产菌株，经发酵培养、诱导表达、菌体破碎、上清蛋白分离纯化后，加双相油佐剂混合制成。
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