CN111484983B - 分泌中和腐败梭菌α毒素单克隆抗体杂交瘤细胞株及应用 - Google Patents

分泌中和腐败梭菌α毒素单克隆抗体杂交瘤细胞株及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了分泌中和腐败梭菌α毒素单克隆抗体杂交瘤细胞株及应用。属于生物技术领域。本发明筛选到一株分泌中和腐败梭菌α毒素单克隆抗体的杂交瘤细胞株，保藏编号为CGMCCNo.19400，并利用该杂交瘤细胞株制备单克隆抗体3D8，建立了腐败梭菌α毒素抗体的阻断ELISA检测方法。与现有技术相比，本发明取得的有益效果为：单克隆抗体3D8在小鼠体外能够中和腐败梭菌天然毒素，其中和效价可到达2个小鼠MLD/0.1mL；利用单克隆抗体3D8建立了一种腐败梭菌α毒素抗体的阻断ELISA检测方法，该方法对腐败梭菌α毒素抗体的最低检测中和效价可达到0.625个小鼠MLD/0.1mL。

Description

分泌中和腐败梭菌α毒素单克隆抗体杂交瘤细胞株及应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，更具体的说是涉及分泌中和腐败梭菌α毒素单克隆抗体杂交瘤细胞株及应用。
背景技术
腐败梭菌是一种能够引起人以及牛、羊、马、猪、水貂、鸡等多种动物发病的厌氧菌，对人类的健康和畜禽养殖业危害极大。该菌的主要感染途径是创伤感染，从而引起机体的恶性水肿。此外，该菌可通过消化道感染引起羊的一种以突然发病、病程短、多呈急性死亡、真胃发生出血性炎症为主要特征的急性致死性传染病-羊快疫。因此，对腐败梭菌病的早期诊断尤为重要，而与该菌致病性有直接关系的腐败梭菌α毒素(CSA)是诊断该病的重要指标。
由于腐败梭菌引起的疾病具有发病急、死亡率高等特点以及没有特效治疗药物等原因，疫苗免疫成为了预防该菌感染的主要途径。目前，通过灭活腐败梭菌培养物上清而制备的商品化天然类毒素疫苗是预防该菌感染的主要疫苗，但该类疫苗制备过程繁琐，抗原成分复杂，有效抗原(CSA)含量较低。鉴于CSA与致病性的直接关系，利用原核表达技术获得了重组CSA及其无毒突变体，并验证了以上重组蛋白对腐败梭菌天然毒素具有优良的抗原保护性，是腐败梭菌病亚单位疫苗的重要候选抗原。然而，由于缺乏腐败梭菌α毒素的快速检测方法，导致我国腐败梭菌相关疫苗的效检方法只能选择操作繁琐的血清中和法或免疫攻毒法。此外，目前腐败梭菌相关研究和疫苗检验中，抗体阴性动物的筛选只能选择传统的血清中和法，但该方法不仅操作繁琐，且敏感度较低(最低检测线为1个小鼠MLD/0.1mL)。为此，急切需要建立快速、灵敏、特异的腐败梭菌α毒素的检测方法。
单克隆抗体的制备是建立优良ELISA检测方法的基础，而免疫原是单克隆抗体制备的关键。以可溶性表达的重组CSA及其无毒突变体的抗原保护性均高于以包涵体形式表达的重组CSA及其无毒突变体。此外，将CSA分为N端和C端分别表达后，重组蛋白几乎丧失了抗原保护性，这说明保持CSA的天然构象是其抗原保护性的关键。然而，虽然可溶性表达的重组CSA具有与天然CSA最相近的特性，但该重组毒素具有很强的毒力，需要进行灭活处理。
综上，如何提供一种应用于腐败梭菌α毒素抗体的阻断ELISA检测的单克隆抗体及检测方法是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了分泌中和腐败梭菌α毒素单克隆抗体杂交瘤细胞株及应用。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种杂交瘤细胞株，所述杂交瘤细胞株为鼠源杂交瘤细胞，命名为CP3D8，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为2020年03月31日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.19400。
一种杂交瘤细胞株的筛选方法，包括如下步骤：
(1)重组腐败梭菌α毒素(rCSA)、重组腐败梭菌α毒素无毒突变体(rCSAm4△11)以及腐败梭菌天然毒素的制备；
(2)以重组腐败梭菌α毒素(rCSA)作为免疫抗原免疫小鼠，取免疫后小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0细胞融合，得到融合细胞；
(3)以重组腐败梭菌α毒素无毒突变体(rCSAm4△11)为包被抗原对所述融合细胞进行筛选，得到阳性杂交瘤细胞；
(4)用腐败梭菌天然毒素对所述阳性杂交瘤细胞的细胞上清进行血清中和实验，并采用有限稀释法进行3～5次亚克隆筛选，得到有中和腐败梭菌α毒素杂交瘤细胞株。
优选的，所述重组腐败梭菌α毒素、所述重组腐败梭菌α毒素无毒突变体的制备方法如下：
(1)人工合成获得基因片段Gcsa以及基因片段Gcsam4△11；
所述基因片段Gcsa的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述基因片段Gcsam4△11的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
(2)将基因片段Gcsa和基因片段Gcsam4△11分别克隆至原核表达载体pET-30a(+)中进行表达与纯化，从而获得重组腐败梭菌α毒素(rCSA)以及重组腐败梭菌α毒素无毒突变体(rCSAm4△11)。
①利用纯度为90％以上的rCSA作为免疫抗原确保了在最大程度上保持CSA的天然构象，同时又避免了腐败梭菌天然α毒素繁琐的纯化步骤和生物安全隐患；②利用纯度为90％以上的rCSAm4△11作为包被抗原进行阳性克隆与亚克隆的筛选，既确保包被抗原的纯度，又解决了rCSA具有高毒力的安全隐患；③利用腐败梭菌天然毒素进行单克隆抗体的血清中和试验，从而获得对腐败梭菌天然α毒素具有中和抗性的单克隆抗体杂交瘤细胞株。
一种杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体。
优选的，命名为单克隆抗体3D8，能够中和腐败梭菌α毒素。
单克隆抗体在腐败梭菌α毒素抗体的阻断ELISA检测中的应用。
本发明利用灭活的rCSA作为免疫原免疫小鼠，用rCSAm4△11进行腐败梭菌α毒素单克隆抗体杂交瘤细胞株的筛选以及后续ELISA检测方法的建立，从而在最大程度上保持CSA天然构象的同时，极大地避免了不必要的生物安全隐患。
优选的，可用于自然环境中腐败梭菌的检测、腐败梭菌α毒素抗体阴性动物的筛选或腐败梭菌类疫苗的效力检验。
优选的，所述包被抗原为重组腐败梭菌α毒素无毒突变体。
优选的，抗腐败梭菌α毒素多克隆抗体的工作稀释度为1:10，单克隆抗体3D8的工作浓度为0.03125μg/mL。
优选的，抗腐败梭菌α毒素多克隆抗体的作用时间为1h，酶标二抗的稀释浓度为1:10000，酶标二抗的反应时间为1h。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明取得的有益效果为：(1)首次获得分泌中和抗性的腐败梭菌α毒素单克隆抗体杂交瘤细胞株，该杂交瘤细胞株能够稳定、高效的分泌中和活性的单克隆抗体，并能实现大规模批量生产，该单克隆抗体在小鼠体外能够中和腐败梭菌天然毒素，其中和效价可到达2个小鼠MLD/0.1mL，从而为临床预防和治疗腐败梭菌发病动物特效药物的制备提供重要材料。(2)首次利用具有中和抗性的腐败梭菌α毒素单克隆抗体建立了一种腐败梭菌α毒素抗体的阻断ELISA检测方法，该方法对腐败梭菌α毒素抗体的最低检测中和效价可达到0.625个小鼠MLD/0.1mL，低于血清中和法的最低检测线(1个MLD/0.1mL)。(3)样品操作简便、成本低廉、反应快速、特异性强、敏感性高，从而不仅能够为腐败梭菌病的诊断提供参考，也为腐败梭菌抗体阴性动物的筛选和相关疫苗效力检验替代方法的研究提供了基础。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1附图为本发明实施例1中纯化的rCSA的SDS-PAGE鉴定图，图中：M:Proteinmarker；1:BSA(1μg)；2:纯化的rCSA；
图2附图为本发明实施例1中纯化的rCSAm4△11的SDS-PAGE鉴定图，图中：M:Proteinmarker；1:BSA(1μg)；2:纯化的rCSAm4△11；
图3附图为本发明实施例4中纯化的单克隆抗体3D8的SDS-PAGE鉴定图，图中：M:Protein marker；1:纯化的单克隆抗体3D8；
图4附图为本发明实施例5中腐败梭菌α毒素多克隆抗体的作用时间优化结果；
图5附图为本发明实施例5中酶标二抗稀释浓度优化结果；
图6附图为本发明实施例5中酶标二抗反应时间优化结果。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明所需其他药剂为常规实验药剂，采购自市售渠道；未提及的实验方法为常规实验方法，在此不再一一赘述。
实施例1rCSA、rCSAm4△11以及腐败梭菌天然毒素的制备
(1)rCSA和rCSAm4△11的表达与纯化
(11)根据已知的腐败梭菌α毒素的基因序列，经密码子优化后，在基因的3’端加上6个组氨酸标签的编码系列。用化学合成的方法，通过人工合成获得基因片段Gcsa以及含有4个氨基酸突变(C54L，N264A，H269A和W310A)和11个氨基酸(第212位～第222位)缺失的基因片段Gcsam4△11。
所述基因片段Gcsa的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述基因片段Gcsam4△11的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
(12)将基因片段Gcsa和基因片段Gcsam4△11分别克隆至原核表达载体pET-30a(+)中，从而获得原核表达质粒pET-Gcsa和pET-Gcsam4△11。
(13)将原核表达质粒pET-Gcsa和pET-Gcsam4△11分别转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，获得重组表达rCSA的基因工程菌大肠埃希氏菌(E.coli)BL/CSA株和重组表达rCSAm4△11的基因工程菌大肠埃希氏菌(E.coli)BLc1株。
(14)将BL/CSA株和BLc1株接种于100mL含有卡那霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养4h后，加入终浓度为0.5mmol/L的IPTG溶液诱导培养4h。菌液培养完成后离心收集菌体，按每克菌体加10mL裂解液[0.02mol/L Tris缓冲液(pH值7.2)，0.3mol/L NaCl]的比例重悬菌体，在冰水浴中超声破碎菌体30min，破碎条件为：工作9s，间歇9s，超声功率为400W。将破碎后的菌液于4℃，以12000r/min离心30min，弃去沉淀，收集上清液。按照Ni-IDA亲和层析介质试剂盒说明书分别对两种上清中的目的蛋白进行纯化，最终获得了纯度均在90％以上的rCSA(图1)和rCSAm4△11(图2)。
(2)腐败梭菌天然毒素的制备以及对小鼠最小致死量(MLD)的测定
将腐败梭菌C55-1毒株(购自中国兽医药品监察所,CVCC60022)接种到厌气肉肝汤培养基中，37℃静置厌氧培养24h，复苏后以相同的方式再接种新的厌气肉肝汤培养基传代一次，最后以2％的接种量接种厌气肉肝汤培养基，37℃静置厌氧培养22h后，取培养物在8000r/min条件下离心30min，用0.22μm滤器过滤除菌，即获得腐败梭菌天然毒素，分装后置于-70℃低温保藏备用。
从冰箱中取出腐败梭菌天然毒素待冰融化后，用明胶磷酸盐缓冲液进行1:10、1:15、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40稀释后，分别尾静脉注射小鼠，每滴度注射2只，0.2mL/只，观察3日。能使小鼠2/2死亡的最小量为腐败梭菌天然毒素对小鼠的最小致死量(MLD)。经测定，1:10～1:25稀释的腐败梭菌天然毒素均能使小鼠2/2死亡，将腐败梭菌天然毒素的1个小鼠MLD定为0.008mL，即腐败梭菌天然毒素每毫升中含有125个小鼠MLD(125MLD/mL)。
上述厌气肉肝汤培养基的制备方法参照《中华人民共和国兽用生物制品规程》(2000年版)。
实施例2分泌中和腐败梭菌α毒素单克隆抗体杂交瘤细胞株的筛选以及单克隆抗体腹水的制备
(1)BALB/c小鼠的免疫及抗体效价测定
用灭活后的rCSA为免疫抗原免疫6～8周龄BALB/c小鼠，共免疫4次，每次间隔2周。首次免疫用免疫抗原加等体积弗氏完全佐剂，乳化后，经颈背部多点皮下注射途径免疫BALB/c小鼠，50μg/只；二次免疫和三次免疫则将弗氏完全佐剂换成弗氏不完全佐剂，其他与首次免疫相同；三次免疫后7～10天，尾部小量采血，将纯化的rCSAm4△11以2μg/mL包被酶标板用间接ELISA法测定血清效价，选取效价高于1:10000的小鼠在融合前三天加强免疫，直接用免疫抗原腹腔注射，剂量为50μg/只。最后一次免疫后3～5天取效价最高小鼠脾细胞用于细胞融合。
(2)细胞融合和杂交瘤细胞株的筛选
取生长状态良好的骨髓瘤细胞SP2/0与上述效价最高小鼠脾细胞利用PEG1450进行化学法融合，运用以rCSAm4△11为包被抗原的间接ELISA方法筛选阳性杂交瘤细胞，同时用实施例1制备的腐败梭菌天然毒素对阳性杂交瘤细胞的细胞上清进行血清中和实验，并采用有限稀释法进行3～5次亚克隆筛选后，得到3株有中和腐败梭菌α毒素杂交瘤细胞株，命名为CP1F4、CP3D8和CP1G6，按照IsoQuickTMStrips and Kits for Mouse MonoclonalIsotyping试剂盒说明书进行鉴定，该三株杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体亚型分别是G2a、G2a和G2b。
(3)具有中和腐败梭菌α毒素单克隆抗体腹水的制备
选用6～8月龄、健康的经产BALB/c小鼠，腹腔注射弗氏不完全佐剂致敏，0.5mL/只。7d后注射杂交瘤细胞株，具体操作为：收集上述步骤(2)三株对数生长期杂交瘤细胞CP1F4、CP3D8、CP1G6以及SP2/0细胞，800r/min条件下离心10min，用DMEM培养液将细胞洗涤一次后，重悬，调整细胞密度为106个/mL后，每只小鼠腹腔注射0.5mL。用酒精棉轻揉小鼠腹部，使细胞均匀分散于腹腔中；7～14天后，待小鼠腹部明显鼓胀时，用20mL注射器的针头无菌刺入小鼠腹部下围鼓胀处，轻轻揉压，使腹水流出或滴出；用15mL离心管收集腹水，3000r/min条件下离心10min，标记为1F4、3D8和1G6以及骨髓瘤细胞SP2/0的腹水对照(S)，分装后置于-20℃保存备用。
实施例31F4、3D8和1G6以及骨髓瘤细胞SP2/0的腹水对照(S)的体外中和试验结果
按照《中华人民共和国兽药典》(2015年版三部)规定的血清中和法进行。
分别取1F4、3D8和1G6三种腹水0.4mL与0.8mL的腐败梭菌天然毒素(含有不同小鼠MLD，如4、8、12等)混合，置37℃作用40分钟后，静脉注射16～20g小鼠2只，0.3mL/只，同时取腹水对照(S)0.4mL与0.8mL的腐败梭菌天然毒素(含有4小鼠MLD)混合作为攻毒对照，观察72h。结果显示，攻毒对照组小鼠72h内2/2死亡，而1F4、3D8和1G6三种腹水中和活性分别可到达1、2和1个小鼠MLD/0.1mL。为此，选择中和活性最高的3D8进行后续实验。
实施例43D8腹水的纯化及检测
选用Protein A(GE Healthcare 17-5079-01)亲和柱纯化方法进行纯化，纯化步骤如下：
样品预处理：用偶联缓冲液(20mM磷酸钠缓冲液，pH7.0)以1:3稀释腹水，12000rpm条件下4℃离心10min后，选用0.22μm滤膜过滤，除去脂肪、细胞残渣及小颗粒物质，得预处理样品。
平衡：用5～10倍柱体积的偶联缓冲液平衡柱子，保持流速为2s/滴。
上样：用注射器把预处理样品注入柱子上端接口，收集流出液于50mL离心管中，保持流速为4s/滴。
洗杂：用5倍柱体积的偶联缓冲液过柱，保持流速为2s/滴。
洗脱：用5倍柱体积洗脱缓冲液(0.1M柠檬酸钠缓冲液，PH9.0)洗脱单克隆抗体，收集于上述离心管中，保持流速为4s/滴，得到纯化的单克隆抗体。
样品的检测：对纯化的单克隆抗体进行SDS-PAGE鉴定，结果如图3所示，结果表明经Protein A亲和柱纯化的方法获得了纯度很高的单克隆抗体3D8；采用BCA法进行单克隆抗体浓度的测定，其浓度可达2.8mg/mL。
实施例5基于单克隆抗体3D8的一种腐败梭菌α毒素抗体的阻断ELISA检测方法的建立
1、抗腐败梭菌α毒素多克隆抗体的制备：
选取新西兰大白兔作为免疫动物，用灭活后的rCSA作为抗原与等体积双相油佐剂(206佐剂)完全混匀后背部皮下多点注射0.2mg/只，间隔两周免疫一次，三免后两周用不加佐剂的灭活后的rCSA加强免疫，0.2mg/只，15d后兔心脏采血获得血清。
2、一种腐败梭菌α毒素抗体的阻断ELISA检测方法条件的确定
(1)抗腐败梭菌α毒素多克隆抗体和单克隆抗体3D8的最佳工作浓度
用PBS将纯化后的rCSAm4△11稀释至2ug/mL，100μL/孔，4℃封闭过夜，用PBST洗涤三次，加入含5％脱脂奶粉的PBST溶液作为封闭液，200μL/孔，4℃封闭过夜；
用PBST溶液洗涤3次，将96孔酶标板拍干，置于-20℃保存备用。
从-20℃冰箱取出包被好的96孔酶标板，置于室温30min，加入不同稀释度的抗腐败梭菌α毒素多克隆抗体(稀释液选用PBS，稀释度依次为原液、1:5、1:10、1:20、1:40和1:80)，100μL/孔，同时加入相应稀释度的阴性血清，37℃孵育1h。
用PBST溶液洗涤3次，加入不同稀释度的纯化的单克隆抗体3D8(稀释液选用PBS，浓度从0.5μg/mL起2倍系列稀释至0.015625μg/mL)，100μL/孔，37℃孵育1h。
加入用PBS缓冲液1:10000体积比稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG，37℃孵育1h，PBST溶液洗涤3次；
最后加入可溶性TMB底物显色液50μL/孔，室温条件避光反应20min，用2M H2SO4溶液终止反应，450nm处读取吸光值。具体结果见表1。
选择阴性对照孔的OD值接近1.0，同时阳性血清阻断率≥50％时所对应的稀释度为最佳工作浓度。
最终确定抗腐败梭菌α毒素多克隆抗体的工作稀释度为1:10，单克隆抗体3D8的工作浓度为0.03125μg/mL。
表1单克隆抗体3D8工作浓度和抗腐败梭菌α毒素多克隆抗体工作稀释度的确定
Figure BDA0002456579120000091
(2)最佳检测条件的优化
根据抗腐败梭菌α毒素多克隆抗体和单克隆抗体3D8的最佳工作浓度，在不同的反应条件下，进一步对以下反应条件进行优化，选择阴性对照孔的OD值接近1.0，同时阳性血清阻断率≥50％时所对应的条件为最佳条件。
1)多抗作用时间
抗腐败梭菌α毒素多克隆抗体的工作稀释度为1:10，单克隆抗体3D8的工作浓度为0.03125μg/mL，多抗作用时间分别为30min、1h、90min，其余步骤同(1)。
结果如图4所示，最终确定多抗作用时间为1h。
2)酶标二抗的稀释浓度
抗腐败梭菌α毒素多克隆抗体的工作稀释度为1:10，单克隆抗体3D8的工作浓度为0.03125μg/mL，酶标二抗的稀释浓度分别为1:10000、1:5000，其余步骤同(1)。
结果如图5所示，最终确定酶标二抗的稀释度为1:10000。
3)酶标二抗的反应时间
抗腐败梭菌α毒素多克隆抗体的工作稀释度为1:10，单克隆抗体3D8的工作浓度为0.03125μg/mL，酶标二抗的反应时间分别为30min、1h，其余步骤同(1)。
结果如图6所示，最终确定酶标二抗的反应时间为1h。
(3)结果判定标准的确定
运用建立的抗体阻断ELISA检测90份兔血清样品，同时设阳性和阴性对照，测定OD450，计算平均值
Figure BDA0002456579120000101
和标准差(S)＝9.3158％。当样品阻断率
Figure BDA0002456579120000102
则血清判为阳性；当
Figure BDA0002456579120000103
则为阴性，对于介于二者间的判为可疑，需要重检一次，如仍为可疑则判为阳性。
(4)腐败梭菌α毒素抗体的阻断ELISA检测特异性检测
以A、B、C和D型产气荚膜梭菌天然毒素、破伤风天然毒素、诺维梭菌天然毒素、肉毒梭菌天然毒素的抗血清，以及相应的重组毒素(rCPA、rCPB、rETX、rTTC、rTTC-Tcnanc、rMBP-BoHC)的抗血清进行1:10稀释后，进行ELISA检测。结果显示以上血清的阻断率均小于20.80％，呈阴性(表2)，表明无交叉反应，而与腐败梭菌天然毒素的抗血清以及本实验制备的抗腐败梭菌α毒素多克隆抗体(均为1:10稀释)的阻断率均大于50％，说明本方法特异性好。
表2腐败梭菌α毒素抗体的阻断ELISA检测特异性检测
Figure BDA0002456579120000111
注：“N”代表天然毒素；“r”代表重组毒素。
(5)腐败梭菌α毒素抗体的阻断ELISA检测方法的应用
1)与血清中和法的比较
利用血清中和法对实施例5制备的抗腐败梭菌α毒素多克隆抗体进行检测，具体的检测方法为：
按照《中华人民共和国兽药典》(2015年版三部)规定的血清中和法进行，取抗腐败梭菌α毒素多克隆抗体0.4mL分别与0.8mL的腐败梭菌天然毒素(含有不同小鼠MLD，如5、10、20、25等)混合，置37℃作用40分钟后，然后静脉注射16～20g小鼠2只，0.3mL/只，同时设置攻毒对照，观察72h。结果显示，该抗腐败梭菌α毒素多克隆抗体对腐败梭菌天然毒素的中和效价可达到25个小鼠MLD/0.1mL。
根据已建立好的腐败梭菌α毒素的抗体阻断ELISA检测操作程序，对抗腐败梭菌α毒素多克隆抗体进行稀释，稀释度依次为1:20、1:40、1:80和1:160，同时设置阴性血清对照，反应完毕后测定OD450值，结果显示该方法对腐败梭菌α毒素抗体的最低检测稀释度为1:40，其对应的最低检测中和效价可为0.625MLD/0.1mL。
2)临床样本的检测
采用本发明提供的腐败梭菌α毒素的抗体阻断ELISA检测方法对临床收集的120份绵羊和131份山羊血清进行检测，检测结果如表3所示，结果说明本发明提供的腐败梭菌α毒素的抗体阻断ELISA检测敏感性明显高于传统的血清中和法，且绵羊的腐败梭菌α毒素抗体阳性率高于山羊的阳性率。
表3临床样本的检测结果
Figure BDA0002456579120000121
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
序列表
<110> 中国兽医药品监察所
<120> 分泌中和腐败梭菌α毒素单克隆抗体杂交瘤细胞株及应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1254
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
actaatctgg aggaaggtgg ttacgcgaat cataacaacg catctagcat taagatcttc 60
ggctacgaag ataacgagga tctgaaagcc aagatcattc aggacccaga gttcattcgc 120
aactgggcaa acgtggcaca cagcctgggt ttcggttggt gcggtggcac cgcgaaccca 180
aacgtgggcc agggtttcga gttcaaacgc gaggttggtg caggtggcaa ggtgtcctac 240
ctgctgtctg ctcgctataa cccaaacgac ccgtacgcca gcggttatcg tgctaaagat 300
cgcctgtcca tgaagatttc taacgtgcgt ttcgttatcg acaacgattc tatcaaactg 360
ggcactccga aggttaagaa actggctccg ctgaacagcg ccagcttcga tctgattaac 420
gagagcaaga ccgagtctaa actgtccaag acctttaact acactacctc taagaccgtg 480
tccaagactg acaacttcaa attcggcgag aagatcggcg taaagacctc tttcaaggta 540
ggtctggaag ctatcgctga cagcaaagtg gagacttcct ttgagttcaa cgcggagcag 600
ggttggtcca ataccaactc tactaccgaa accaaacagg agtccactac ttacactgcg 660
actgtttctc cgcaaactaa gaaacgtctg tttctggacg tactgggcag ccagattgac 720
attccatacg aaggtaagat ctacatggaa tacgacatcg aactgatggg ctttctgcgc 780
tatactggta atgcacgtga agatcatact gaggaccgtc caaccgtgaa actgaaattc 840
ggcaagaacg gtatgtctgc tgaagagcat ctgaaagacc tgtattctca caagaacatc 900
aacggctata gcgaatggga ttggaaatgg gttgatgaga agtttggcta cctgtttaag 960
aactcctatg atgctctgac cagccgcaag ctgggtggca ttatcaaagg ttccttcacc 1020
aacatcaacg gtactaagat cgttatccgt gaaggcaaag aaattccgct gccggacaag 1080
aaacgtcgtg gcaaacgctc tgtagattct ctggacgcac gtctgcaaaa tgaaggtatc 1140
cgtattgaga acattgaaac ccaggacgtg ccaggtttcc gcctgaactc tatcacctac 1200
aacgataaga aactgattct gatcaacaac atccatcacc atcatcacca ctaa 1254
<210> 2
<211> 1221
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
actaatctgg aggaaggtgg ttacgcgaat cataacaacg catctagcat taagatcttc 60
ggctacgaag ataacgagga tctgaaagcc aagatcattc aggacccaga gttcattcgc 120
aactgggcaa acgtggcaca cagcctgggt ttcggttggc tgggtggcac cgcgaaccca 180
aacgtgggcc agggtttcga gttcaaacgc gaggttggtg caggtggcaa ggtgtcctac 240
ctgctgtctg ctcgctataa cccaaacgac ccgtacgcca gcggttatcg tgctaaagat 300
cgcctgtcca tgaagatttc taacgtgcgt ttcgttatcg acaacgattc tatcaaactg 360
ggcactccga aggttaagaa actggctccg ctgaacagcg ccagcttcga tctgattaac 420
gagagcaaga ccgagtctaa actgtccaag acctttaact acactacctc taagaccgtg 480
tccaagactg acaacttcaa attcggcgag aagatcggcg taaagacctc tttcaaggta 540
ggtctggaag ctatcgctga cagcaaagtg tggtccaata ccaactctac taccgaaacc 600
aaacaggagt ccactactta cactgcgact gtttctccgc aaactaagaa acgtctgttt 660
ctggacgtac tgggcagcca gattgacatt ccatacgaag gtaagatcta catggaatac 720
gacatcgaac tgatgggctt tctgcgctat actggtgcgg cacgtgaaga tgcaactgag 780
gaccgtccaa ccgtgaaact gaaattcggc aagaacggta tgtctgctga agagcatctg 840
aaagacctgt attctcacaa gaacatcaac ggctatagcg aatgggattg gaaagctgtt 900
gatgagaagt ttggctacct gtttaagaac tcctatgatg ctctgaccag ccgcaagctg 960
ggtggcatta tcaaaggttc cttcaccaac atcaacggta ctaagatcgt tatccgtgaa 1020
ggcaaagaaa ttccgctgcc ggacaagaaa cgtcgtggca aacgctctgt agattctctg 1080
gacgcacgtc tgcaaaatga aggtatccgt attgagaaca ttgaaaccca ggacgtgcca 1140
ggtttccgcc tgaactctat cacctacaac gataagaaac tgattctgat caacaacatc 1200
catcaccatc atcaccacta a 1221

Claims (8)

1.一种杂交瘤细胞株，其特征在于，所述杂交瘤细胞株为鼠源杂交瘤细胞，命名为CP3D8，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为2020年03月31日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.19400。
2.如权利要求1所述的一种杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体。
3.如权利要求2所述的单克隆抗体，其特征在于，命名为单克隆抗体3D8，能够中和腐败梭菌α毒素。
4.如权利要求2所述的单克隆抗体在制备腐败梭菌α毒素抗体的阻断ELISA检测试剂中的应用。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述试剂可用于自然环境中腐败梭菌的检测、腐败梭菌α毒素抗体阴性动物的筛选或腐败梭菌类疫苗的效力检验。
6.如权利要求4所述的应用，其特征在于，包被抗原为重组腐败梭菌α毒素无毒突变体。
7.如权利要求4所述的应用，其特征在于，抗腐败梭菌α毒素多克隆抗体的工作稀释度为1:10，单克隆抗体3D8的工作浓度为0.03125μg/mL。
8.如权利要求4所述的应用，其特征在于，抗腐败梭菌α毒素多克隆抗体的作用时间为1h，酶标二抗的稀释浓度为1:10000，酶标二抗的反应时间为1h。
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