CN113462675B - 一种ApuA蛋白抗原多肽及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物医药技术领域，尤其涉及一种ApuA蛋白抗原多肽及应用。本发明通过对猪链球菌ApuA蛋白氨基酸序列的二级结构、亲疏水性和抗原性等进行分析，选择的肽段具有特异性好、免疫原性佳的特点；本发明通过人工合成所述抗原多肽，再与载体蛋白偶联，将偶联物免疫新西兰大白兔制备的兔多克隆抗体，抗体效价较为理想，可特异性识别猪链球菌全蛋白质组中的ApuA蛋白，对猪链球菌胞外或胞内其他6种同源蛋白质没有结合作用。

Description

一种ApuA蛋白抗原多肽及应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，尤其涉及一种ApuA蛋白抗原多肽及应用。
背景技术
猪链球菌是一种具有荚膜的革兰氏阳性球菌，其自然定植部位位于猪的上呼吸道，特别是鼻腔和扁桃体，亦包括消化道和生殖道，属于条件性致病菌。感染猪、康复猪或健康猪均可携带病原体。病原可通过口、鼻和伤口传染，常引起断奶仔猪或育肥猪呼吸困难、发绀或消减等症状，病程发展严重后，以脑膜炎、肺炎、关节炎、败血症等为主要的临床特征，给全世界的养猪业造成了巨大的经济损失。猪链球菌也能通过伤口或消化道感染人，导致脑膜炎、心内膜炎、化脓性关节炎或中毒性休克综合症等，危害公共健康。
猪链球菌在宿主体内的定植、扩散和致病过程都与碳源代谢息息相关。所有异养型细菌必须从外界摄取碳水化合物，以保证其生命活动和生长繁殖。因此对于病原菌来说，在宿主体内的首要目的是获取营养物质而不是引起损伤。在人或猪的口咽腔，包括唾液中，葡萄糖的含量会在进食30分钟内急剧减少，而淀粉等α-葡聚糖的含量可以长时间维持在较高的浓度。研究表明，猪链球菌在宿主口咽腔和食道定植时，可利用宿主口咽腔内丰富的α-葡聚糖及其降解产物作为碳源，在此微环境中与宿主的免疫系统之间维持着平衡关系，菌群之间或细菌内部的营养竞争决定菌群是否能稳定定植。平衡被打破时，猪链球菌干扰宿主粘膜的免疫系统，突破上皮细胞屏障，引起疾病的产生。血液中有较高丰度的葡萄糖，但是在宿主的其他器官中，葡萄糖较为缺乏，损害或死亡细胞释放出的动物糖原是猪链球菌重要的碳来源。在高峰度的α-葡聚糖环境中，猪链球菌许多毒力基因(Sly、GAPDH、Hyl等)的表达大幅上调，使细菌更容易侵入宿主上皮细胞或在软组织中扩散。因此，α-葡聚糖的利用和代谢影响着猪链球菌在宿主体内的生存和定植，参与细菌的生长和毒力调控。在A群链球菌或肺炎链球菌中，一系列α-葡聚糖代谢通路中的酶或组分是细菌的重要毒力因子，均可促进细菌在宿主口咽腔的定植，帮助细菌粘附和侵入宿主上皮细胞。
ApuA是锚定在猪链球菌细胞壁外的唯一的双功能淀粉酶(amylopullulanase)，具有切割α-1,4-糖苷键和α-1,6-糖苷键的双重活性，可水解胞外α-葡聚糖，为猪链球菌提供葡萄糖、麦芽糖和麦芽三糖等麦芽糊精等碳水化合物。ApuA由猪链球菌的apuA基因编码，含有2094个氨基酸(aa)，分子量大小约为230kDa。其蛋白质N端有典型的α-淀粉酶结构域，可识别并切割α-1,4-糖苷键；中段有普鲁兰酶结构域，可识别并切割α-1,6-糖苷键；蛋白质C端具有保守的LPNTG基序，为细胞壁锚定序列。实验表明，ApuA可促进猪链球菌对人喉癌上皮细胞(Hep-2)、猪气管上皮细胞(NPTr)和粘膜的粘附作用，是猪链球菌重要的粘附素之一。在本申请发明人早期的研究中，发现ApuA也是猪链球菌重要的毒力因子，缺失apuA基因的猪链球菌2型菌株，对小鼠脑部、肺部的组织病理损伤情况较野生株明显减轻(一株2型猪链球菌apuA基因敲除突变株及其应用，专利申请号：201910227948.3)。
ApuA介导猪链球菌粘附和侵入宿主、帮助细菌在体内获取碳水化合物，以及作为毒力因子的作用机理，目前还有待深入研究。ApuA作为锚定在猪链球菌细胞壁外的功能性蛋白酶，也是亚单位疫苗候选蛋白之一。此外，作为一个双功能淀粉酶，ApuA在酶学方面的功能和潜力也值得深入发掘。因此，制备ApuA蛋白的特异性抗体意义非常重大，不仅可为该蛋白在细菌致病性机制方面的功能研究提供支撑，同时也为开发ApuA蛋白质的酶活功能、研发亚单位疫苗奠定基础。但是，ApuA蛋白分子量过大，用全长基因来构建表达载体、诱导蛋白表达和纯化的过程中，必须面对基因片段过长导致的载体构建困难、蛋白质产量低、蛋白质纯度不高等问题；使用ApuA肽段的来制备多抗时，因ApuA多个结构域与猪链球菌体内或其他细菌中的蛋白同源性过高，必须面对抗体的非特异性问题。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种ApuA蛋白抗原多肽及应用，目的在于解决现有技术中的一部分问题或至少缓解现有技术中的一部分问题。选择具有序列和空间结构特异性的ApuA多肽作为免疫原来制备ApuA的多克隆抗体能够很好地解决背景技术中存在的问题。
本发明是这样实现的，一种ApuA蛋白抗原多肽，所述抗原多肽的氨基酸序列为TGKSYQAIEKDGKW，如SEQ ID NO.1所示。本发明中的多肽TGKSYQAIEKDGKW在不同猪链球菌中高度保守，具有良好的特异性，与猪链球菌体内6个ApuA的同源淀粉酶或普鲁兰酶没有序列相似性，与其他种属细菌的ApuA的同源淀粉酶或普鲁兰酶也没有序列相似性。
本发明还提供了如上述的一种ApuA蛋白抗原多肽在制备抗ApuA的多克隆抗体中的应用。
本发明还提供了一种抗ApuA的多克隆抗体，以序列SEQ ID NO.1所示的抗原多肽为抗原制备而成。
本发明还提供了如上述的抗ApuA的多克隆抗体在制备检测猪链球菌的检测试剂或试剂盒中的应用。
本发明还提供了如上述的抗ApuA的多克隆抗体在非诊断目的的猪链球菌ELISA检测中的应用。
本发明还提供了一种ELISA检测试剂盒，包含如上述的ApuA蛋白抗原多肽，或抗ApuA的多克隆抗体。
本发明还提供了如上述的抗ApuA的多克隆抗体在非诊断目的的猪链球菌Westernblot检测中的应用。
本发明还提供了一种Western blot检测试剂盒，包含如上述的ApuA蛋白抗原多肽，或抗ApuA的多克隆抗体。
本发明还提供了如上述的ApuA蛋白抗原多肽，在非诊断目的的猪链球菌抗体ELISA检测或Western blot检测中的应用。
进一步地，所述ApuA蛋白抗原多肽C端添加一个半胱氨酸，通过所述半胱氨酸将所述ApuA蛋白抗原多肽偶联牛血清白蛋白。
本发明还提供了如上述的ApuA蛋白抗原多肽在制备猪链球菌的疫苗中的应用。
进一步地，所述疫苗为包含ApuA蛋白的亚单位疫苗
本发明还提供了一种预防猪链球菌的疫苗，利用如上述的ApuA蛋白抗原多肽制备而成。
综上所述，本发明的优点及积极效果为：
(1)本发明通过对猪链球菌ApuA蛋白氨基酸序列的二级结构、亲疏水性和抗原性等进行分析，选择的肽段具有特异性好、免疫原性佳的特点。本发明通过人工合成该抗原多肽，再与载体蛋白偶联，将偶联物免疫新西兰大白兔制备的兔多克隆抗体，抗体效价较为理想，可特异性识别猪链球菌全蛋白质组中的ApuA蛋白，对猪链球菌胞外或胞内其他6种同源蛋白质没有结合作用。
(2)依据本发明提供的猪链球菌ApuA蛋白特异性抗原多肽所制备的抗体，可用于开展ELISA、Western Blot等分子生物学实验，为进一步研究猪链球菌ApuA蛋白在粘附宿主、致病、酶活等方面的功能提供了技术支撑，也为研发包含ApuA蛋白的亚单位疫苗奠定基础。
附图说明
图1是ApuA蛋白二级结构、亲疏水性及抗原性的分析结果；
图2是Western blot检测结果。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明，各实施例及试验例中所用的设备和试剂如无特殊说明，均可从商业途径得到。此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
根据本申请包含的信息，对于本领域技术人员来说可以轻而易举地对本发明的精确描述进行各种改变，而不会偏离所附权利要求的精神和范围。应该理解，本发明的范围不局限于所限定的过程、性质或组分，因为这些实施方案以及其他的描述仅仅是为了示意性说明本发明的特定方面。实际上，本领域或相关领域的技术人员明显能够对本发明实施方式作出的各种改变都涵盖在所附权利要求的范围内。
为了更好地理解本发明而不是限制本发明的范围，在本申请中所用的表示用量、百分比的所有数字、以及其他数值，在所有情况下都应理解为以词语“大约”所修饰。因此，除非特别说明，否则在说明书和所附权利要求书中所列出的数字参数都是近似值，其可能会根据试图获得的理想性质的不同而加以改变。各个数字参数至少应被看作是根据所报告的有效数字和通过常规的四舍五入方法而获得的。本发明中，“约”指给定值或范围的10％以内，优选为5％以内。
本发明下述各实施例中未特别限定温度时，则均为常温条件。常温是指四季中自然室温条件，不进行额外的冷却或加热处理，一般常温控制在10～30℃，最好是15～25℃。
本发明中涉及的基因、蛋白或其片段可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母)中产生。
本发明披露了一种ApuA蛋白抗原多肽及应用。下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。
实施例1猪链球菌ApuA蛋白特异性抗原多肽的设计与合成
1.获取GenBank数据库中猪链球菌2型ApuA蛋白的氨基酸序列(登录号：CAZ52647.1)及相关信息，该蛋白长度为2094个氨基酸(amino acid，aa)。
2.对ApuA氨基酸序列的二级结构、亲疏水性和抗原性等进行分析，得到3个综合评价较高的多肽片段(图1)：Pep1(TGKSYQAIEKDGKW，SEQ ID NO.1)、Pep2(VYDKDNGYYETKLD，SEQ ID NO.2)和Pep3(IQQKDYSFKDLKNQ，SEQ ID NO.3)。Pep1特异性好，未发现该片段在猪链球菌或其他细菌中存在同源现象；而Pep2和Pep3未能避开猪链球菌或其他细菌中的同源蛋白质或蛋白超家族，特异性较差。经过上述分析，选择Pep1(871-884aa)作为ApuA蛋白的特异性抗原多肽。
3.多肽的合成、与载体蛋白的偶联委托北京华大蛋白质研发中心有限公司完成：合成过程中在该多肽C端人为添加一个半胱氨酸(C)，用于与载体蛋白偶联，偶联后的多肽序列为C*TGKSYQAIEKDGKW。通过半胱氨酸，将Pep1多肽偶联匙孔血蓝蛋白(keyhole limpethemocyanin，KLH)偶联，即Pep1-KLH，用于动物免疫；通过半胱氨酸将Pep1多肽偶联牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin，BSA)偶联，即Pep1-BSA，用于效价检测。
实施例2动物免疫
1.实验动物为2.0kg左右的新西兰大白兔；免疫之前耳静脉取阴性血，室温静置2小时后，5000rpm离心10分钟，制备阴性血清，-80℃保存。弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂购自Sigma公司。
2.免疫程序见表1。取400μg或200μg Pep1-KLH免疫原(3mg/mL)，用生理盐水稀释到200-500uL，再加入等体积弗氏佐剂(初次免疫用弗氏完全佐剂，加强免疫用弗氏不完全佐剂)，用振荡器将抗原和佐剂混匀，形成油包水乳液。
表1具体免疫程序
免疫次数 天数 抗原剂量
初次免疫 第1天(2021.04.21) 400μg蛋白+弗氏完全佐剂
第一次加强免疫 第15天(2021.05.05) 200μg蛋白+弗氏不完全佐剂
第二次加强免疫 第27天(2021.05.17) 200μg蛋白+弗氏不完全佐剂
第三次加强免疫 第37天(2021.05.27) 200μg蛋白+弗氏不完全佐剂
第四次加强免疫 第49天(2021.06.08) 200μg蛋白+弗氏不完全佐剂
3.取混匀好的免疫原，对大白兔进行背部皮下注射免疫，每次注射8-10个点。
4.按上述程序免疫完成后，用戊巴比妥钠(30mg/kg)肌肉注射兔子。等兔子麻醉后绑定，用手术器械剪开其脖子上的外层皮毛，于气管侧面下方找到颈动脉，止血钳夹紧动脉管并剪断放血，收集阳性血；室温静置1小时后，5000rpm离心10分钟，经过两次离心后收取血清。
实施例3 ELISA效价检测
1.包被：用包被液(碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液，pH 9.6)稀释Pep1-BSA抗原至终浓度2μg/mL，加入酶标板中，每孔100μL，4℃过夜。
2.封闭：用洗涤液PBS-T(含0.05％吐温的PBS缓冲液)洗涤3次，加入含1％脱脂奶粉的PBS缓冲液封闭，每孔200μL，37℃孵育2小时。
3.洗涤：弃去封闭液，用洗涤液洗涤3次，拍干。
4.一抗孵育：用封闭液将兔多抗血清从200倍开始2倍梯度稀释至102400倍，空白对照为封闭液，阴性对照为用封闭液200倍稀释的兔阴性血清；加入到酶标板孔中，每孔100μL，37℃孵育1小时。
5.洗涤：弃去一抗，用洗涤液洗涤3次，拍干。
6.二抗孵育：用封闭液将羊抗兔IgG/HRP(购自Abcam公司)稀释20000倍，加入到酶标板孔中，每孔100μL，37℃孵育1小时。
7.洗涤：弃去二抗，用洗涤液洗涤3次，拍干。
8.显色：加入显色液(1％A液+10％B液)，每孔100μL，37℃放置15分钟。A液：含1％TMB的DMSO溶液；B液：含0.1％H2O2的柠檬酸缓冲液。
9.终止：每孔加入50μL终止液(2M硫酸)终止反应。
10.读数：使用酶标仪在450nm波长条件下测定吸光值，记录保存数据，结果见表2。
11.分析数据：效价为1/2最大吸光度度值所对应的稀释倍数，确定抗ApuA的兔多克隆抗体的效价可达6400。
表2 ELISA实验结果
抗体稀释比例 200 400 800 1600 3200 6400 12800 25600 51200 102400 空白 阴性
OD<sub>450</sub>值 1.388 1.388 1.289 1.207 0.94 0.725 0.497 0.293 0.127 0.108 0.054 0.235
实施例4 Western blot鉴定
1.样品制备：将猪链球菌2型菌株SC19和apuA基因缺失突变株ΔapuA(一株2型猪链球菌apuA基因敲除突变株及其应用，专利申请号：201910227948.3)用含5％犊牛血清的TSB培养液培养至对数前期，各取500μL培养液到1.5mL离心管中，于4℃以12,000×g离心5分钟，弃上清。每管加入100μL的1倍的蛋白上样缓冲液(含DTT)，重悬后于沸水中煮5分钟，于4℃以12,000×g离心10分钟，取上清。
猪链球菌SC19是猪链球菌2型强毒株，于2005年分离自四川省SS2疫区的感染猪只，全基因组测序已经完成(GenBanK登录号：NZ_MNPY01000000)，且已有多篇相关研究文献发表(Tan MF et al.,2017,MicrobiologyOpen；Tan MF et al.,2015,Plos one；Zhang TFet al.,2016,Scientific Reports等)。
2.电泳：配制8％的SDS-PAGE胶，按蛋白质Marker、SC19全菌蛋白样、ΔapuA全菌蛋白样的顺序加样，进行蛋白质电泳。
3.转印：待SDS-PAGE电泳结束后，准备剪裁好的PAGE胶、滤纸和PVDF膜，利用Bio-Rad Western Blot半干转膜仪，通过半干转的方法进行蛋白转印操作。
4.漂洗：将电转后的PVDF膜用TBS-T缓冲液(0.01M TBS，pH7.5)漂洗3次，每次5分钟。
5.封闭：按0.1-0.15mL/cm2的PVDF膜面积加入封闭液(含5％脱脂奶粉的TBS-T缓冲液)，37℃摇动孵育1小时。
6.漂洗：将封闭后的PVDF膜用TBS-T缓冲液漂洗3次，每次5分钟。
7.一抗孵育：用TBS-T缓冲液将兔多克隆抗体血清稀释1000倍，按0.1-0.15mL/cm2的PVDF膜面积加入，37℃摇动孵育2小时。
8.漂洗：将一抗孵育后的PVDF膜用TBS-T缓冲液漂洗4-6次，每次5分钟。
9.二抗孵育：加入10mL用TBS-T缓冲液稀释的二抗(5000倍)，37℃摇动孵育1小时。
10.漂洗：将二抗孵育后的PVDF膜用TBS-T缓冲液漂洗4-6次，每次5分钟。
11.显色：用Bio-Rad ECL显色试剂盒对PVDF膜进行显色，对结果进行拍照。
实验结果如图2所示。本发明中的抗ApuA的兔多克隆抗体可在猪链球菌2型野生菌裂解液中检测到230KDa左右的蛋白条带，与ApuA蛋白分子量大小相符，且条带清晰明确；而apuA基因缺失突变株ΔapuA的裂解液中则没有检测到这个分子量大小的条带。同时，本实施例中用全菌蛋白质进行Western blot检测，全菌胞内共有6个同源蛋白质(表3)，而图2显示仅检测到一条230KDa左右的蛋白条带，且与ApuA蛋白分子量大小相符，这说明本发明中的抗ApuA的兔多克隆抗体具有较高的特异性。
表3 ApuA在猪链球菌中的6个同源蛋白质
Figure BDA0003184642220000071
本发明依据猪链球菌ApuA蛋白特异性抗原多肽制备的兔多克隆抗体，效价较为理想，可特异性识别猪链球菌ApuA蛋白，具有良好的免疫原性和特异性。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 江西省农业科学院畜牧兽医研究所
<120> 一种ApuA蛋白抗原多肽及应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 14
<212> PRT
<213> 猪链球菌(Streptococcus suis)
<400> 1
Thr Gly Lys Ser Tyr Gln Ala Ile Glu Lys Asp Gly Lys Trp
1 5 10
<210> 2
<211> 14
<212> PRT
<213> 猪链球菌(Streptococcus suis)
<400> 2
Val Tyr Asp Lys Asp Asn Gly Tyr Tyr Glu Thr Lys Leu Asp
1 5 10
<210> 3
<211> 14
<212> PRT
<213> 猪链球菌(Streptococcus suis)
<400> 3
Ile Gln Gln Lys Asp Tyr Ser Phe Lys Asp Leu Lys Asn Gln
1 5 10

Claims (6)

1.一种ApuA蛋白抗原多肽，其特征在于：所述抗原多肽的氨基酸序列为TGKSYQAIEKDGKW，如SEQ ID NO.1所示。
2.如权利要求1所述的一种ApuA蛋白抗原多肽在制备抗ApuA的多克隆抗体中的应用。
3.如权利要求1中所述的ApuA蛋白抗原多肽在制备预防猪链球菌的疫苗中的应用。
4.一种预防猪链球菌的疫苗，其特征在于：利用如权利要求1中所述的ApuA蛋白抗原多肽制备而成。
5.如权利要求1中所述的ApuA蛋白抗原多肽在非诊断目的的猪链球菌抗体ELISA检测或Western blot检测中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述ApuA蛋白抗原多肽C端添加一个半胱氨酸，通过所述半胱氨酸将所述ApuA蛋白抗原多肽偶联牛血清白蛋白。
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